JPH08509231A

JPH08509231A - 修飾加水分解植物タンパク質ミクロスフィア及びその製法と用途

Info

Publication number: JPH08509231A
Application number: JP6523596A
Authority: JP
Inventors: ジェイミルステイン，サム; バラントセビッチ，イブグエニ
Original assignee: エミスフェアーテクノロジーズインク
Priority date: 1993-04-22
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 1996-10-01
Also published as: AU6668594A; ZW17893A1; CA2160692A1; ZA939608B; EP0696192A4; WO1994023702A1; EP0696192A1

Abstract

(57)【要約】修飾加水分解植物タンパク質ミクロスフィア及びその調製方法、並びに、製薬剤の経口移送システムとしてのその用途を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】修飾加水分解植物タンパク質ミクロスフィア及びその製法と用途この発明は、修飾された加水分解植物タンパク質類および該タンパク質類から製造されたミクロスフィアに関する。ミクロスフィアは活性剤を放出可能にカプセル化し、哺乳類への経口投与に適している。かかるミクロスフィアの製法もまた開示する。発明の背景哺乳類に製薬剤及び治療薬剤を移送（デリバリ）する利用可能な手段は、体によって課される化学的もしくは物理的障害またはその双方によってしばしば厳しく制限される。例えば、多くの生物学的活性剤の経口移送は、腸の極端なｐＨ、強力な消化酵素による障害、活性成分に対する胃腸膜の不透過性などの化学的及び物理化学的障害の存在がなければ、選択経路になり得る。経口投与に適していないことが知られている数多くの製薬剤の中には、生物学的に活性なペプチド類及びタンパク質類、例えばインシュリンがある。これらの薬剤は腸において酸加水分解及び／またはタンパク分解酵素によって急速に破壊される。これらの攻撃を受けやすい製薬剤のための効果的な経口薬剤移送方法及びシステムを開発することに多くの研究が費やされている。提案された解決方法には次のようなものがある。（ａ）腸壁の透過性を増大させるための、例えばレゾルシノール類と非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン＝オレイル＝エーテル、ｎ−ヘキサデシル＝ポリエチレン＝エーテルのようなアジュバントの併用投与；また（ｂ）酵素分解を避けるための、膵臓トリプシン抑制剤のような酵素抑制剤、ジイソプロピルフルオロフォスファート（ＤＦＦ）及びトラシルオール（trasyl ol）の併用投与である。しかしながら、薬剤移送システムにおけるこのような物質の使用は、（ａ）有効量で用いられたときの本質的な毒性：もしくは（ｂ）活性成分の保護もしくはその吸収の促進の失敗；または（ｃ）薬剤との不都合な相互作用の何れかの理由から制約される。薬剤移送システムとしてのリポソーム類もまた開示されている。これらはカプセル化された製薬剤の周りの脂質層を提供する。ヘパリンを含有するリポソームの使用が米国特許第４，２３９，７５４号に開示され、数件の研究がインシュリンを含有するリポソームの使用に向けられている；例えばPatel等（1976）のFEB S Letters Vol．62，p60及び橋本等（1979）のEndocrinol.Japan,Vol.26,p337である。しかし、リポソーム類の使用はなお開発段階にあり、（ａ）乏しい安定性：（ｂ）不十分な棚寿命；（ｃ）低ＭＷ（＜３０）０００）の被移送体（カーゴ）に限られていること；（ｄ）製造の困難性；（ｅ）被移送体との不都合な相互作用を含む絶えない問題がある。さらに最近になって、ミクロスフィアを形成する人工アミノ酸ポリマー類もしくはプロテイノイド類が製薬剤をカプセル化するために開示されている。例えば、米国特許第４，９２５，６７３号（’６７３特許）は、その開示の全体を参照としてここに取り込むものであるが、そのようなミクロスフィア構造並びにその製造方法と用途を記載している。’６７３特許のミクロスフィアは多数の活性剤をカプセル化するために有用であるが、脂肪親和性薬剤のようなより広範囲の活性剤をカプセル化することができるミクロスフィアキャリアに対する必要性が従来からあった。加えて、’６７３特許において用いられているプロテイノイド類の製造方法では、分離が困難な高分子量（ＭＷ）（＞１０００ダルトン）と低ＭＷ（＜１０００ダルトン）のペプチド状ポリマーの複合混合物となる。さらに、得られる低ＭＷミクロスフィア形成プロテイノイド類は少量である。従って、低分子量ミクロスフィア形成プロテイノイド類を製造する改善方法もまた望まれている。発明の概要本発明は、修飾された加水分解植物タンパク質ミクロスフィア及びかかるミクロスフィァの製造方法に関する。発明は、安価な加水分解植物タンパク質、例えば大豆タンパク質から製造することができる安定したミクロスフィア、及びそのようなミクロスフィアの簡単でかつ経済的な製造方法を提供する。発明に従って製造されたミクロスフィアは、改善された安定性並びに哺乳類への生物学的活性物質の移送性能を示す。発明によれば、修飾された加水分解植物ミクロスフィアは、アルカリ水溶液に加水分解植物タンパク質を溶解させ、加水分解タンパク質中に存在するフリーアミン残基と反応する化学修飾剤を添加することによって製造される。次いで、反応混合物から修飾植物タンパク質が沈澱するまで該混合物のｐＨを下げる。回収されたタンパク質は即座にミクロスフィアを形成し、製薬剤のような種々の被移送体をカプセル化するために用いることができる。ミクロスフィアは非毒性で、哺乳類に経口的にもしくは非経口的に投与することができる。本発明により考えられているものは、またこれらの組成物を含む投薬製剤である。図面の説明図１は、実施例４に記載されたミクロスフィアカプセル化インシュリンもしくはそのままの（非カプセル化）インシュリンを経口投与したラットから採取されたラット血清において検出されたグルコースレベルを示す。図２は、カルシトニン及び実施例５に記載された本発明に係る植物タンパク質ミクロスフィアにカプセル化されたカルシトニンの経口投与後のラット血清カルシウムレベルを示す。図３は、修飾前の加水分解植物タンパク質のＨＰＬＣトレースを示す。図４は、ＨＰＬＣトレース中のベンゼン＝スルフォニル＝クロリドでの修飾後の加水分解植物タンパク質における変化を示す。発明の詳細な説明明細書において引用する全ての特許、特許出願及び文献の全体を参照としてここに取り込む。矛盾があるときは、定義を含めて、本開示内容が優先する。本発明の修飾植物タンパク質ミクロスフィアは、タンパク質中に存在するフリーのアミノ残基と反応する化学修飾剤と加水分解植物タンパク質を反応させることによって製造することができる。修飾された植物タンパク質は、次いで、薬剤（ドラッグ）のような活性成分をカプセル化するミクロスフィアに変換される。本発明によって得られる多くの利点には、（ａ）容易に入手でき安価な出発材料の使用、及び（ｂ）ミクロスフィア生成修飾タンパク質を製造し分離する低コストの方法であることがある。全体の修飾プロセスは実施が簡単で、工業的に規模を拡大した生産にも適している。本発明の組成物は、例えば鳥のような動物；例えば霊鳥類、特にヒトのような哺乳類；及び昆虫に生物学的活性剤を投与するのに有用である。本発明の方法によれば、酸もしくは酵素で加水分解された植物タンパク質が発明を実施する際に有用である。植物タンパク質は、一般に、約３ないし約８ミリ当量／ｇ、好ましくは約４ないし約６ミリ当量／ｇの範囲の滴定可能なカルボン酸基（ＣＯＯＨ）、約３ないし約９ミリ当量／ｇ、好ましくは約４ないし約７ミリ当量／ｇＮＨ₂の範囲の完全にフリーのアミノ基（ＮＨ₂）を含有する。植物タンパク質の分子量は約１００Ｄと約２０００Ｄの範囲、好ましくは約２００と約５００Ｄの範囲である。加水分解植物タンパク質は種々の商業的製造元から入手できる。そのような製造元の非限定的な例としては、Ajinomoto USA，Inc（Teaneck，NJ 07666，USA）、Central Soya Co.，Inc（Fort Wayne，IN，USA）；Champlain Industries，In c.（Clifton，NJ，USA）及びClifton Co.，Radnor，PA 19089，USAの年刊刊行物である「Food Engineering Master」に挙げられた会社がある。この発明を実施する場合に特に好ましい加水分解植物タンパク質は、Ajinomoto USAからAJI-EKI の商品名で入手できる。この製品は脱脂肪大豆ミール（粉）から誘導された酸加水分解液状大豆タンパク質である。必要に応じて、加水分解植物タンパク質溶液の乾燥タンパク質抽出物を発明の修飾植物タンパク質を製造するために用いることもできる。乾燥タンパク質抽出物は、加水分解植物溶液を適当な溶剤、例えばメタノールで抽出し、次いで溶剤抽出物を蒸発させることによって製造することができる。植物タンパク質は、次いで、金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウムもしくはカリウムのアルカリ水溶液に溶解させ、約５０℃と約７０℃の間の範囲の温度、好ましくは約５０℃と約６０℃の間の範囲の温度で、約１０分と約４０分の間、好ましくは約１５分間、加熱する。植物タンパク質において滴定可能なＮＨ₂の１ミリモル当りに用いられるアルカリ量は、一般に、約２ミリモルと約３ミリモルの間、好ましくは約２．２ミリモルと約２．５ミリモルの間の範囲である。溶液のｐＨは約８と約１３の間、好ましくは約９と約１０の間の範囲である。その後、攪拌しながらアミン修飾剤を反応混合物に添加する。アミン修飾剤はタンパク質中に存在するフリーなアミノ（ＮＨ₂）残基と反応することができる組成物である。本発明を実施する際に有用なアミン修飾剤の非限定的な例としては、ベンゼン＝スルフォニル＝クロリドのようなスルフォン化剤及び塩化ベンゾイルのようなアシル化剤がある。用いられる加水分解植物タンパク質の量との関係でのアミン修飾剤の量は、植物タンパク質中のフリーの全ＮＨ₂の当量に基づく。従って、約０．３と約１．２の間の当量の修飾剤が、植物タンパク質中の全ＮＨ₂基の各モル当量について用いられ、好ましくは、約０．６と約１．０の間の当量の修飾剤が、加水分解植物タンパク質中の全ＮＨ₂基の各モル当量について用いられる。発明の実施にあっては、植物タンパク質と修飾剤の混合物は、一般に約５０℃ と約７０℃の間の範囲の温度、好ましくは約６０℃と約６５℃の間の範囲の温度で、約２分と約５分の間の時間、維持される。反応は、混合物のｐＨを適当な酸、例えば濃塩酸で、ｐＨが約２と約３の間に至るまで調整することによって急冷される。混合物は室温で放置すると分離して、不透明な上層と暗色の粘性ある下層を形成する。上層は除去して修飾植物タンパク質を下層から濾過により回収する。そのままの修飾植物タンパク質を、次いで約９と約１３の間のｐＨ、好ましくは約１１と約１３の間のｐＨで、水に溶解させる。不溶の物質を濾過して除去し、濾過液を真空乾燥させる。修飾タンパク質の収率は、一般に約３０と約６０％の範囲、通常は約４５％である。本発明の修飾植物タンパク質はアルカリ水溶液（ｐＨ＞９．０）に可溶で；エタノール、ｎ−ブタノール及び１：１（ｖ／ｖ）トルエン／エタノール溶液に部分的に可溶で、中性の水に不溶である。修飾後に植物タンパク質に残る滴定可能な官能基は次の通りである：約１．５ないし約３．５ミリ当量／ｇの範囲、好ましくは約２．３ミリ当量／ｇのカルボン酸基（ＣＯＯＨ）、約０．３ないし約０．９ミリ当量／ｇの範囲、好ましくは約０．５ミリ当量／ｇのアミノ基（ＮＨ₂ ）である。修飾植物タンパク質の分子量は約２００Ｄと約２０００Ｄの間の範囲、好ましくは約２００と約５００Ｄの間の範囲である。本発明の修飾植物タンパク質は活性製薬剤をマイクロカプセル化するためにすぐに用いることができ、また該タンパク質を常法で濃縮もしくは乾燥させることができ、将来の使用のために貯蔵することができる。修飾植物タンパク質は、メタノール／ｎ−プロパノール混合物を移動相として用いた、アルミナのような固体カラム支持体での分留により；トリフルオロ酢酸／アセトニトリル混合物を移動相として用いて逆相カラム支持体で；及び水を移動相として用いてイオン交換クロマトグラフィで精製することができる。アニオン交換クロマトグラフィを用いるときは、連続０−５００ｍＭ塩化ナトリウム勾配を用いる。修飾植物タンパク質は、また、メタノール、ブタノールもしくはイソプロパノールのような低級アルコールで抽出して、低分子量の汚染物質を除去することによって精製することもできる。次の手順を用いて、精製修飾植物タンパク質からミクロスフィアを調製することができる。修飾植物タンパク質を脱イオン化水中に、約７５と約２００ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは１００ｍｇ／ｍｌの濃度で約２５℃と約６０℃の間の範囲の温度、好ましくは約４０℃で溶解する。溶液中に残る粒状物質は、濾紙上での重力濾過のような常法で除去することができる。その後、約４０℃の温度に維持されたタンパク質溶液を、約０．０５Ｎと約２Ｎの間、好ましくは約１．７Ｎの酸濃度を持つ酸水溶液（これもまた約４０℃）と１：１（Ｖ／Ｖ）で混合する。生じた混合物をさらに約４０℃で、ミクロスフィアの形成が光学顕微鏡で観察されるまで、インキュベートする。この発明の実施において、好ましい添加の順序は、酸水溶液にタンパク質溶液を加えるものである。適当な酸としては、（ａ）タンパク質に、例えば化学分解のような悪影響を及ぼさず；（ｂ）ミクロスフィアの形成に干渉せず；（ｃ）被移送体のミクロスフィアカプセル化と干渉せず；被移送体に不都合な相互作用を及ぼさない酸ならば如何なるものでもよい。この発明で使用できる好ましい酸としては、酢酸、クェン酸、塩酸、リン酸、リンゴ酸及びマレイン酸がある。発明の実施に際して、ミクロスフィアの生成プロセスに先だって、ミクロスフィア安定化剤を酸水溶液中もしくはタンパク質溶液中に含有させることが好ましい。かかる添加剤の存在により、ミクロスフィアの溶液における安定性並びに分散性が促進される。添加剤は約０．１と５％（Ｗ／Ｖ）の範囲、好ましくは約０．５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で用いることができる。ミクロスフィア安定化剤の適切で非限定的な例としては、アカシアゴム、ゼラチン、ポリエチレングリコール及びポリリジンが挙げられる。上記の条件下で、キャリア（担体）が、被移送体がキャリア基質に分散している中空もしくは中実の基質形ミクロスフィアか、液体もしくは固体の被移送体をカプセル化するカプセル形のミクロスフィアを形成する。キャリアミクロスフィアが可溶物質、例えば上述の酸水溶液における製薬剤の存在下で形成されるならば、この物質はミクロスフィア中に取り込まれる。このようにして、ペプチド類、タンパク質類、多糖類並びに帯電有機分子、例えば経口経路では乏しいバイオアベイラビリティしか通常は持たない抗菌剤を含有させることができる。ミクロスフィアに含有させることができる製薬剤の量は、ミクロスフィア形成溶液中の薬剤濃度並びにキャリアに対する被移送体の親和性を含む多数の因子に依存する。これらの条件下で、修飾植物タンパク質分子は直径が１０ミクロン未満の中空ミクロスフィアを形成する。もし可溶物質、例えば上記酸水溶液中の製薬剤の存在下でタンパク質ミクロスフィアが形成されるならば、この物質はミクロスフィアの中空部内にカプセル化され、球形構造となっているタンパク質壁内に収容される。このようにして、ペプチド類、タンパク質類及び多糖類、並びに帯電有機分子、例えば経口経路では乏しいバイオアベイラビリティしか持たないキノロン類もしくは抗菌剤をカプセル化することができる。ミクロスフィアによってカプセル化することができる製薬剤の量は、カプセル化溶液中の薬剤濃度並びにキャリアに対する被移送体の親和性を含む多数の因子に依存する。ここに開示されたキャリアとの使用に適した生物学的活性剤としては、これらに限定するものではないが、ペプチド類、特に、胃腸粘膜をそれ自体は通過しないか、ほんのゆっくり通過する、及び／または胃腸管内の酸及び酵素による化学開裂を受け易い小ペプチドホルモン類；多糖類、特にムコ多糖類；炭水化物類；脂質類；もしくはそれらの任意の組合せをがある。例としては、限定されるものではないが、ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；インターフェロン；インターロイキン−Ｉ；インシュリン；ヘパリン、特に低分子量ヘパリン；カルシトニン；エリトロポイエチン；心房性自然（naturetic ）因子；抗原類；モノクローナル抗体類；ソマトスタチン；アドレノコルチコトロピン；ゴナドトロピン放出ホルモン；オキシトシン；バソプレシン；クロモリンナトリウム（ナトリウムもしくは二ナトリウムクロモグリケート）；バンコマイシン；デフェロキサミン（ＤＦＯ）；もしくはこれらの任意の組合せである。また、本発明のキャリアは殺虫薬などのような他の活性剤を移送するために用いることができる。組成物における活性剤の量は、典型的には、薬理的もしくは生物学的に有効な量である。しかしながら、組成物が投薬製剤、例えば、カプセル、タブレットもしくは液体で用いられるときは、投与ユニット形態は多数のキャリア／生物学的活性剤組成物を含有したり、分配された薬理的もしくは生物学的有効量を含有しているので、薬理的もしくは生物学的な有効量未満で有り得る。全有効量は、生物学的活性剤の薬理的もしくは生物学的活性量な全量を含む漸加単位で投与される。投薬製剤は、賦形剤；希釈薬；崩壊剤（disintegrants）；潤滑剤（lubricant s）；可塑剤；着色剤；限定されないが、水、１，２−プロパンジオール、エタノール、オリーブオイル、もしくはそれらの任意の組合せを含有する投薬ビヒクルを含有することができる。発明の修飾植物タンパク質ミクロスフィアは薬理的に無害であり、活性剤の生理学的もしくは生物学的性質を変えない。さらに、カプセル化プロセスは活性剤の薬理的性質を変えない。如何なる製薬剤もタンパク質ミクロスフィア内にカプセル化できるが、ミクロスフィアが目標領域（すなわち、ミクロスフィアの内容物が放出される領域）に達する前に、それが投与される哺乳類の体内で遭遇する条件によって破壊されるかもしくは効果が減じられ、胃腸管に僅かに吸収される化学もしくは生物学的薬剤を移送するのに特に貴重である。発明のタンパク質ミクロスフィアは、ある製薬剤、例えば、胃腸粘膜をそれ自体は通過しないか、ほんのゆっくり通過する、及び／または胃腸管内の酸及び酵素による化学開裂を受け易い小ペプチドホルモン類の経口投与に特に有用である。このような薬剤の非限定的な例としては、ヒトもしくはウシ成長ホルモン、インターフェロン及びインターロイキン−ＩＩ、カルシトニン、心房性自然（natu retic）因子、抗原類及びモノクローナル抗体類がある。ミクロスフィアの粒子径は、胃腸管の目標領域への活性剤の放出を決定する上に重要な役割を果たしている。約０．１ミクロン以下と約１０ミクロンの間、好ましくは約５．０ミクロンと約０．１ミクロンの間の直径のミクロスフィアと、カプセル化活性剤は、胃腸管内の目標領域に活性剤を効果的に放出するのに十分に小さい。小径のミクロスフィアは適切なキャリア流体（例えば等浸透圧食塩水）に懸濁させ、循環系内にもしくは皮下に注射することによって、非経口的に投与することができる。選択する投与の態様は、当然に、投与される活性剤の要求に応じて変わる。大きなタンパク質ミクロスフィア（＞１０ミクロン）は経口移送システムとして有効性が少なくなりがちである。修飾植物タンパク質を活性剤を含む水もしくは水溶液に接触させることによって形成されるミクロスフィアの寸法は、種々の物理的もしくは化学的パラメータ、例えばカプセル化溶液のｐＨ、容量オスモル濃度もしくはイオン強度を操作することによって、またカプセル化プロセスに用いる酸の選択によって制御することができる。本発明の植物タンパク質誘導ミクロスフィアは、胃において迅速に破壊されるペプチドホルモン、例えばインシュリン、及び多糖類、例えばヘパリンの経口投与に適している。それらは、また、アスピリン及びＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬）類のような胃刺激源から胃を保護するのに適している。そのようなアスピリン含有ミクロスフィアが経口投与されると、それらは胃腸粘膜を通過し、最初に胃を横切って腸被覆が溶解した後に腸管からの血液流に入らなければならない従来の腸被覆アスピリンよりも、はるかに迅速にアスピリンを放出する。発明のミクロスフィアは、タブレット、ペレット、カプセル、及び水もしくは食用油のような液体中に懸濁させるのに適した顆粒の形態の固体として単独で経口投与することができる。同様に、ミクロスフィアは、一以上の生理学的に適合するキャリアもしくは附形剤を含有する組成物中に処方することができ、経口で投与することができる。これらの組成物は、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、及びスターチ、メチルセルロースのようなフィラーのような通常の成分を含有してもよい。また、小ミクロスフィア（１０μｍ未満の寸法）を非経口経路で投与することができる。次の実施例は発明を例証するものであるが、発明の範囲の限定を意図するものではない。実施例１：ベンゼンスルフォニル＝クロリドでの大豆タンパク質の修飾ａ．大豆タンパク質の抽出酸加水分解液体大豆タンパク質溶液（AJI-EKI，Ajinomoto USA，Inc.）の３．２Ｌを真空で減圧して１４４０ｇの固体粉末を得た。この固体をメタノールで３回抽出した（１回の抽出当り２Ｌ）。プールした抽出物からメタノールを蒸発によって除去した。暗褐色の粉末として得た大豆タンパク質の収量は６０８ｇであった。大豆タンパク質粉末の官能基を常法を用いて滴定した。例えば、「タンパク質化学の分析方法の実験マニュアル」Ｖｏｌ．１−３、編者P．Alexander及び R.J．Block，Pergamon Press，1960及び1961を参照のこと。大豆タンパク質は次の官能基を含有していた：３．７ミリ当量／ｇのＣＯＯＨ；０．４４ミリ当量／ｇのフリ−Ｎ−末端ＮＨ₂；及び３．４８ミリ当量／ｇの全フリ−ＮＨ₂。大豆タンパク質の分子量は１００ないし２０００Ｄの範囲であった。ｂ．大豆タンパク質の修飾工程（ａ）の乾燥大豆タンパク質（６００ｇ）全フリ−ＮＨ₂の２．５当量）を３Ｌの２Ｎ水酸化カリウム水溶液（２．２５モル以上）に溶解し、溶液を６０ ℃ で３０分間加熱した。次いで、ベンゼンスルフォニル＝クロリド（４６０ｇ、２．６０モル）を混合物に滴下して加え、反応混合物が６５℃を越えないように反応温度を監視した。攪拌しながら４時間の間６３℃で反応を継続した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで２０％のＨＣｌ水溶液でｐＨ３．０に酸性化させ、修飾大豆タンパク質を沈澱させた。次に修飾大豆タンパク質を蒸留水（１Ｌ）で２回洗浄し、ｐＨが８．５−９になるまで、２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に溶解させた。溶液を濾過して粒状物質を除き、濾液を真空で減圧乾燥して乾燥修飾生成物（２５７ｇ、収率＝２４％）を得た。生成物は次の滴定可能な基を有していた：２．３ミリ当量／ｇのＣＯＯＨ；０．２ミリ当量／ｇのフリ−Ｎ−末端ＮＨ₂；及び０．３ミリ当量／ｇの全フリ−ＮＨ₂。実施例２：塩化ベンゾイルでの大豆タンパク質の修飾この実施例においては、市販の大豆タンパク質の加水分解水溶液（AJI-EKI，A jinomoto USA，Inc.）をさらに抽出することなく用いた。溶液のタンパク質は次の官能基を含有していた：２．６ミリ当量／ｍｌのＣＯＯＨと２．０ミリ当量／ｍｌのＮＨ₂。大豆タンパク質の分子量はおよそ６．５ｋＤであった。大豆溶液（２４０ｍＬ、０．５当量のフリーＮＨ₂）に、１０７ｍＬの１０Ｎ水酸化カリウム水溶液を加え、次いで２００ｍＬの蒸留水を加えた。次に、溶液を氷浴（５℃）に入れ、塩化ベンゾイル（７０ｇ、０．０５モル）を１０ないし２５℃の範囲の温度で滴下して加えた。次いで反応混合物を室温で４．５時間の間攪拌した。次いで、濃ＨＣｌで反応混合物のｐＨを１３．２から２．８まで下げた。１時間放置した後に、沈澱した修飾大豆タンパク質を濾過して集め、蒸留水で洗浄した。次いで、大豆タンパク質を２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に溶解させて溶液（ｐＨ１２．６）を得、これを次いで蒸発させて４８ｇの乾燥生成物（％収率＝４１％）を得た。実施例３：修飾大豆タンパク質での空のミクロスフィアの調製この実施例は、空の修飾大豆タンパク質ミクロスフィアの調製及び洗浄の方法を例示する。手順１．薬剤：ａ．実施例１に記載したように調製された修飾タンパク質粉末ｂ．無水クエン酸（ＵＳＰ）ｃ．アカシアゴムＮＦｄ．脱イオン水ｅ．氷酢酸２．装置：ａ．ｐＨ計ｂ．エッペンドルフピペット（０−１００ｕｌ）及びチップｃ．水浴、４０℃ ｄ．液体窒素ｅ．凍結乾燥フラスコ３．溶液の調製：ａ．タンパク質溶液−１００ｍｇの修飾大豆タンパク質を１ｍｌの脱イオン水（もしくはその多数）に溶解する。必要ならばＷｈａｔｍａｎ＃１フィルター紙で濾過し、水浴に４０℃で保つ。これが溶液Ａである。ｂ．１．７Ｎクエン酸を０．５％アカシアに混合−１リットルの脱イオン水に５ｇのアカシアと１０９ｇのクエン酸を溶解。４０℃でインキュベート。これが溶液Ｂである。４．ミクロスフィアの調製：ａ．４０℃の水浴中で手で溶液Ｂを渦巻かせながら、溶液Ａの全量を溶液Ｂに一度に迅速に加える。実施例４：カプセル化インシュリン含有大豆タンパク質ミクロスフィアの調製この実施例は、インシュリンミクロスフィアの調製と洗浄の方法を記載する。手順１．薬剤：ａ．実施例１に記載したように調製された修飾タンパク質粉末ｂ．ヘパリンｃ．無水クエン酸（ＵＳＰ）ｄ．アカシアゴムＮＦｅ．脱イオン水ｆ．乾燥剤ｇ．液体窒素２．装置：ａ．磁気攪拌器ｂ．ビュレットｃ．顕微鏡ｄ．臨床遠心分離機ｅ．分離膜チューブ（Spectrum６、１０ｍｍ、５０，０００ＭＷ切断）ｆ．ｐＨ計ｇ．凍結乾燥器（Labconco #75035）ｈ．凍結乾燥フラスコ（１５０−３００ｍＬ）ｉ．回転式シェルフリーザｊ．イソプロパノール／乾燥氷浴もしくは液体Ｎ₂ ｋ．乳鉢及び乳棒ｌ．貯蔵容器（５００ｍＬ）ｍ．エッペンドルフピペット（０−１００ｕＬ）ｎ．分離チューブ用のプラスチック閉止体（Spectrum）ｏ．０．４５μｍアクロディスク付き２ｍＬ注射器３．溶液の調製：ａ．タンパク質溶液Ａ＊（８０ｍｇ／ｍｌ）（＊＝またはその複数）：１６０ｍｇの修飾大豆タンパク質を加えて脱イオン水で１ｍｌに溶解する。２ｍｌの注射器を用いて１０ｍｌ試験管に０．４５μｍアクロディスクを通して濾過する。４０℃に保つ。ｂ．溶液Ｂ（１％ゴムを含む１．７Ｎクエン酸）：１０ｇのアカシアと１０９ｇのクエン酸を１リットルの脱イオン水に溶解する。ｃ．１５０ｍｇ／ｍＬで溶液Ｂにヘパリンを溶解して４０℃に保つ。４．ミクロスフィアの調製：ａ．４０℃の水浴中で手で溶液Ｃをゆっくりと渦巻かせながら、溶液Ａの全量を溶液Ｃに迅速に加える。５．ミクロスフィアの洗浄：ａ．懸濁液を注射器（ニードルなし）で分離チューブに移し、プラスチック閉止体でシールする。チューブは７０％を越えて一杯にしてはいけない。ｂ．沈降し、及び／または表面に凝集した無定形物質を全て除去する。ｃ．酢酸溶液を磁気攪拌器で攪拌しながら、（ミクロスフィア１ｍｌ当り２０ｍＬの酢酸溶液を用いて）酢酸に対してミクロスフィア懸濁液を分離（透析）する。ｄ．１時間毎に酢酸溶液を置き換える。合計で３時間の間分離を継続する。６．凍結乾燥：ａ．１部のトレハロース（シグマ(Sigma)）を９部の透析ミクロスフィア溶液内に加える。およそ１９０ｒｐｍで回転するように調節され、液体窒素浴に入れられたシェルフリーザを用いて凍結乾燥フラスコ内でミクロスフィアをフラッシュ凍結させる。ｂ．２４時間の間、もしくは自己冷却がなくなることによって認められる乾燥状態まで凍結乾燥させる。ｃ．乾燥ミクロスフィアの重量を記録する。ｄ．乳鉢と乳棒を用いて微細な粉末にすりつぶす。ｅ．琥珀色の容器に移して、乾燥剤でシールし、室温で保存する。７．再懸濁化：ａ．凍結乾燥粉末の重量を計測して粉末中のタンパク質の量を算出する。ｂ．０．８５Ｎのクエン酸を凍結乾燥粉末に４０℃で加える。タンパク質の最終濃度は８０ｍｇ／ｍｌである。実施例５：ラットにおけるインシュリンミクロスフィアの評価この実施例では、実施例３によって調製されたインシュリンミクロスフィアをラットで評価した。１２匹のラットを次のような２つのグループに分けた：１．経口インシュリンミクロスフィア：経口栄養による、３ｍｇインシュリン／ｋｇ体重の投与（６匹のラット）；２．そのままのインシュリン（非カプセル化）：経口栄養による、３ｍｇインシュリン／ｋｇ体重の投与（６匹のラット）。ラットの経口栄養投与を行った。インシュリンミクロスフィアを投与の直前に調製し、グループ１のラットはそれぞれミクロスフィア懸濁液の適切な投与を受けた。グループ２のラットは非カプセル化インシュリンの投与を受けた。各々のラットからおよそ０．５ｍｌの血液を、投与の直前（「０」時間）と投与の１ないし６時間後で採取した。血液サンプルからの血清を−２０℃で貯蔵した。ラットから採られた解凍血清のグルコースレベルを常法で分析した。図１に示すように、カプセル化インシュリンを受けたグループ１のラットでは、血清グルコースレベルの急激な減少が観察された。これに対して、グループ２のラットの血清グルコースレベルはｔ＝０から僅かに増大した。この結果から、非カプセル化インシュリンと比較して、カプセル化インシュリンが、経口投与したときに、より大なる生物学的効果を示したことが分かる。実施例６：ミクロスフィアカプセル化カルシトニンの調製大豆タンパク質ミクロスフィアでのサケカルシトニンのカプセル化を実施例３に記載した同じ方法で実施した。カルシトニンはＳａｎｄｏｚ（Ｂａｓｉｌ）スィス）から得られ、１％ゴムを加えた１．７Ｎのクエン酸溶液に１５０ｍｇ／ｍＬカルシトニン溶液を加えたものを実施例３に記載されたようにして調製した。実施例７：ラットでのカルシトニンミクロスフィアの評価この実施例では、実施例５によって調製したカルシトニンミクロスフィアをラットで評価した。１２匹のラットを次のような２つのグループに分けた：１．経口カルシトニンミクロスフィア：経口栄養による、６０μｇカルシトニン／ｋｇ体重の投与（６匹のラット）；２．経口非カプセルミクロスフィア：経口栄養による、６０μｇカルシトニン／ｋｇ体重の投与（６匹のラット）（比較例）。ラットの経口栄養投与を行った。カルシトニンミクロスフィアを投与の直前に調製し、グループ１のラットはそれぞれミクロスフィア懸濁液の適切な投与を受けた。グループ２のラットは非カプセル化カルシトニンの投与を受けた。各々のラットからおよそ０．５ｍｌの血液を、投与の直前（「０」時間）と投与の１ｈ、２ｈ及び３ｈ後で採取した。血液サンプルからの血清を−２０℃で貯蔵した。グループ１と２のラットから採られた解凍血清のカルシウムレベルを常法で分析した。図２に示すように、カプセル化カルシトニンを受けたグループ１のラットでは、血清カルシウムレベルの急激な減少が観察された。これに対して、グループ２のラットのカルシウムレベルはｔ＝０から僅かに減少した。この結果から、非カプセル化カルシトニンと比較して、カプセル化カルシトニンが、経口投与したときに、より大なる生物学的効果を示したことが分かる。

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Claims

【特許請求の範囲】１．アミン反応性修飾剤で修飾された加水分解植物タンパク質を含む、被移送体カプセル化用ミクロスフィア。２．上記加水分解植物タンパク質が酸加水分解大豆タンパク質を含む請求項１記載のミクロスフィア。３．上記ミクロスフィアが１０ミクロン以下の直径を有する請求項１記載のミクロスフィア。４．上記アミン反応性修飾剤はベンゼン＝スルフォニル＝クロリドと塩化ベンゾイルからなる群から選択される請求項１記載のミクロスフィア。５．加水分解植物タンパク質ミクロスフィア内にカプセル化された生物学的活性剤を含む組成物において、上記ミクロスフィアはアミン反応性修飾剤で修飾された加水分解植物タンパク質を含むバイオ適合性タンパク質壁を具備する組成物。６．上記アミン反応性修飾剤はベンゼン＝スルフォニル＝クロリドと塩化ベンゾイルからなる群から選択される請求項５記載の組成物。７．上記生物学的活性剤はモノクローナル抗体、インシュリン、カルシトニン、もしくはエリトロポイエチンを具備する請求項５記載の組成物。８．上記加水分解植物タンパク質は酸加水分解大豆タンパク質を具備する請求項５記載の組成物。９．修飾加水分解植物タンパク質を調製する方法において、（ａ）加水分解植物タンパク質をアルカリ水溶液と混合して溶液を生成し；（ｂ）上記溶液をアミン反応性修飾剤で処理して、修飾加水分解植物タンパク質を含有する混合物を形成し；（ｃ）上記修飾加水分解植物タンパク質を回収し、（ｄ）上記修飾加水分解タンパク質を酸水溶液でインキュベートして上記修飾加水分解植物タンパク質ミクロスフィアを形成し、（ｅ）上記タンパク質ミクロスフィアを回収する、工程を具備する方法。１０．上記アルカリ水溶液は水酸化カリウムもしくはナトリウムを含む請求項９記載の方法。１１．工程（ａ）は約３５℃と約４０℃の間の範囲の温度で行われる請求項９記載の方法。１２．上記アミン反応性修飾剤はベンゼン＝スルフォニル＝クロリドと塩化ベンゾイルからなる群から選択される請求項９記載の方法。１３．上記酸水溶液は生物学的活性剤をさらに含有する請求項１２記載の方法．１４．上記生物学的活性剤はモノクローナル抗体、インシュリン、カルシトニン、もしくはエリトロポイエチンを含む請求項１３記載の方法。１５．上記加水分解植物タンパク質は、酸加水分解大豆タンパク質を含む請求項１記載のミクロスフィア。１６．上記生物学的活性剤は、ペプチド、ムコ多糖類、炭水化物、脂質、殺虫薬、もしくはこれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項５記載の組成物。１７．上記生物学的活性剤は、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキン−ＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、エリトロポイエチン、心房性自然因子、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、アドレノコルチコトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、もしくはこれらの任意の組合せを含む、請求項５記載の組成物。１８．上記生物学的活性剤は、インターフェロン、インターロイキン−ＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、オキシトシン、バソプレシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、ＤＦＯ、もしくはこれらの任意の組合せを含む請求項１７記載の組成物。１９．上記生物学的活性剤はカルシトニンである請求項１８記載の組成物。２０．（Ａ）請求項５による組成物；及び（Ｂ）（ａ）附形剤（ｂ）希釈剤（ｃ）崩壊剤（ｄ）潤滑剤（ｅ）可塑剤（ｆ）着色剤（ｇ）投薬ビヒクル、もしくは（ｈ）これら任意の組合せを含む投薬製剤。２１．タブレット、カプセルもしくは液体を含む請求項２０による投薬製剤。２２．生物学的活性剤を該薬剤の必要時に動物に投与する方法において、請求項５に記載の組成物を上記動物に経口投与することからなる方法。２３．上記ペプチドがインシュリンである請求項５記載の組成物。２４．上記ペプチドがヒト成長因子である請求項５記載の組成物。２５．上記ペプチドがウシ成長因子である請求項５記載の組成物。２６．上記ペプチドがインターフェロンである請求項５記載の組成物。２７．上記ペプチドがインターロイキンＩＩである請求項５記載の組成物。２８．上記ペプチドが心房性自然因子である請求項５記載の組成物。２９．上記ペプチドがカルシトニンである請求項５記載の組成物。３０．上記生物学的活性剤が抗菌剤である請求項５記載の組成物。３１．上記生物学的活性剤がキノロンである請求項５記載の組成物。３２．上記生物学的活性剤が多糖類である請求項５記載の組成物。３３．上記多糖類がヘパリンである請求項３２記載の組成物。３４．上記生物学的活性剤が抗原である請求項５記載の組成物。３５．上記生物学的活性剤がモノクローナル抗体である請求項５記載の組成物。３６．上記生物学的活性剤がアスピリンである請求項５記載の組成物。３７．上記ミクロスフィアが中空で、上記生物学的活性剤がそれにカプセル化されている請求項５記載の組成物。