JPH08510385A

JPH08510385A - 細胞増殖調節剤

Info

Publication number: JPH08510385A
Application number: JP7500426A
Authority: JP
Inventors: ボウユム，アルネ
Original assignee: ニコムドファーマエイ／エス
Priority date: 1993-06-01
Filing date: 1994-06-01
Publication date: 1996-11-05
Also published as: GB9311252D0; NO954880L; NO954880D0; EP0703787A1; WO1994027632A1; AU6803694A

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞増殖、特に造血の阻害に用いるシチジンジアミナーゼおよびその強化剤に関するとともに、特に白血球減少状態における細胞増殖を刺激するためおよび血中に幹細胞を移動させるためのシチジンジアミナーゼ阻害剤の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞増殖調節剤本発明は細胞増殖の制御、特に造血および／または顆粒球形成の制御に関する。特に本発明は細胞増殖を制御するためのシチジンデアミナーゼおよび／またはその調節剤の使用に関する。哺乳動物の身体は非常に多様な構造および機能を有する細胞を含有し、そして分化および発達のメカニズムは多くの研究の焦点となっている。連続的な入替りを行う細胞のシステムにとって、このメカニズムには通常、分裂しこのシステムに新たな細胞を一定して供給する多分化能性幹細胞の貯蔵所が包含されることが知られている。最初は同種であるが、“貯蔵所”から供給された幹細胞はすぐにどれかの、または他の形態に委ねられ、そして次に必要とされる機能細胞に発達する。かかる幹細胞システムの例には骨髄中の造血系、および上皮および表皮系がある。成熟顆粒球および顆粒球抽出物（GRE）が顆粒球形成に影響する cellular growth in adult organisms”Academic Press（London）， Haematol 38：318（1987）and Helgestadら、Acta Physiol Scand 133：41（198 8）参照）。しかしながら、インビトロで得られる結果は、採用された実験計画の如何によることが示唆されている（Helgestadら、上記参照）。刺激または阻害による細胞増殖の調節は、細胞分裂の天然の制御が機能不全となった疾病または状態、例えば癌（特に白血病）またはエイズに対する治療として関心を持たれ続けている。酵素シチジンデアミナーゼ（CDD）は、哺乳動物細胞においてシトシンからウラシルへの変換をもたらす。この反応はまた、デオキシシチジレートデアミナーゼおよび配列特異的シチジンデアミナーゼ（アポリポプロテインB mRNAの編集に関与）を含む他の酵素によっても触媒される。 CDDはヒト組織から単離されており、そしてその供給源には肝臓、脾臓および胎盤が包含される（Ho，Cancer Res 33：2816-2820（1973）およびCacciamaniら、Arch Biochem Biophys 290：285（1991）参照）。さらに、Chabnerら（J Clin Invest 53：922-931（1974））は正常な顆粒球および白血病顆粒球からのCDDの部分的精製および特性決定について報告した。CDD（E.C.3.5.4.5）の高度精製 Chemother Pharmacol 30：7-11（1992）参照）。 CDDは現在は同一であると考えられる４個のサブユニットからなる52KDタンパク質であることが知られている。CDDは、広く使用されている抗癌剤であるシチジンアラビノシド（Ara-C）の脱アミノ化を招来するので、この酵素は癌治療の分野で関心を持たれ続けている。この脱アミノ化反応の生成物はウリジンアラビノシド（Ara-U）であり、これは、Ara-Cより治療効果がずっと低いばかりでなく、神経毒を惹起すると考えられている。Ara-C化学療法においては、活性薬剤はシチジンデアミナーゼにより継続して分解されるので、この化合物を体内で治療上有効なレベルに維持するためにしばしば多量のAra-Cが投与される。しかしながら、小脳機能不全および末梢神経障害を含む中枢神経系毒性がAra-Cの大量投薬により治療された患者で観察されている。治療上有効なレベルを維持するのに必要なAr a Cの量を最小限に抑えるために、CDD阻害剤テトラヒドロウリジン（THU）が化学療法様式の一部として投与されている（Kreisら、Leukemia５（11）：991-998 （1991）参照）。THUはCDDを競合的に阻害することにより作用し、従ってこの酵素により脱アミノ化されるAra-Cの量を低下させる。ゼブラリン（Zebularine）、5-F-ゼブラリンおよびジアゼピノンリボシドのような他のCDD阻害剤をAra-Cまたはその類似体5-アザ-2’-デオキシシチジンと組み合わせた化学療法での使用が 7-11（1992）参照）。前記論議した各研究では、CDD阻害剤の投与が、細胞分裂阻害をひき起こす薬剤、すなわちAra-Cおよび5-アザ-2'-デオキシシチジンの分解を阻止するための補添物としてのみ提案された。今、例えば成熟顆粒球により生産されたシチジンデアミナーゼ（CDD）がヒトおよびマウスの顆粒球−マクロファージ前駆細胞（GM-CFC）の増殖およびコロニー形成を直接阻害するように作用することが見出された。従って本発明は細胞増殖の調節、特に造血の調節例えば造血幹細胞増殖または顆粒球形成の阻害に使用するための酵素シチジンデアミナーゼ（CDD）またはその機能的（官能的）フラグメントを提供する。従って例えは、それらの細胞分裂サイクルを中断させることによる抗癌化学療法または放射線療法の期間中は造血幹細胞を保護することが望ましいかも知れない。シチジンデアミナーゼを含有する組成物は、本発明のもう一つの観点を構成する。シチジンデアミナーゼは少なくとも部分的に精製された形態にあるのが好ましい。実質的に精製されたシチジンデアミナーゼも好ましい。一般的に、阻害の度合いは存在する濃度の如何によるが、シチジンデアミナーゼの作用は阻害的である。特に高濃度CDDで阻害効果の低下が観察されている。すなわちベル形状薬量−応答曲線が得られる。使用されるシチジンデアミナーゼは、任意の好都合な供給源に由来することができる。従って例えば、この酵素は肝臓または脾臓のような身体臓器から単離されうる（Ho（1973），Chabner（1974）およびCacciamani（1991）、上記参照）。しかしながらより好都合には、この酵素は、天然にCDDを産生するか、または組換えDNAでの形質転換の結果としてCDDを産生する細胞の培養物から単離されうる。特に好ましい態様において、酵素CDDは、シチジンデアミナーゼをコードするDNAベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞の培養増殖物から生産され、このシチジンデアミナーゼ遺伝子は適当なプロモーターおよび／またはレギュレーター配列により制御される。シチジンデアミナーゼの収穫および精製は、任意の好適な方法によることができる。適当な精製法および分離法は当業者によく知られており、そして遠心分離、沈殿、透析、アフィニティクロマトグラフィーおよびカラムクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーが包含される。ヒト顆粒球は単核細胞の９〜１０倍の大量のCDDを含有する。慢性骨髄性白血病のある顆粒球では、この量は正常値の３６％まで低下する。細胞当たりの低下は、急性骨髄性白血病ではさらに大きい。最近の所見では、正常細胞と白血病細胞におけるCDDの量はほぼ等しいが、白血病細胞では、CDD活性が低下していることが示される。多数の白血病細胞がこのようにCDDの低下またはCDDからの活性ペプチド基の低下により説明されうる。それゆえCDDは、これら症状の治療に使用できる。チミジンは、粗製顆粒球抽出物について以前に観察されたように、CDDの補助因子として必要とされる（Helgestadら、上記および胞を含有する寒天培地において、CDDの阻害効果はチミジン濃度１０^-6Mで検出可能であった。従って、本発明はまた、細胞増殖の調節、詳細には造血、特に例えば慢性骨髄性白血病における顆粒球形成の調節に使用するための、シチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメントと、シチジンデアミナーゼの活性を増強する１種またはそれ以上の補助因子との組み合わせをも提供する。かかる補助因子にはヌクレオシドまたはその類似体、詳細にはピリミジンヌクレオシドおよびその類似体、特にチミジン、デオキシシチジン、デオキシウリジンおよびそれらのホスフェート誘導体からなるリストから選択されるものが包含される。チミジンが特に好ましい。チミジンが５×１０^-3〜１×１０^-6Mの濃度範囲で存在することが好都合である。チミジンまたは他の補助因子は、CDDと同時にまたはCDDに引き続いて投与されうる。チミジンは勿論体内に天然に存在し、そしてそれゆえ細胞分裂の阻害を達成するのにチミジンを投与することは全く必須要件ではないかもしれない。 Ensmingerら（Cancer Res37：1857（1977））は、ヒト血漿中における平均（メジアン）チミジン濃度０．２×１０^-6Mを報告した。この濃度はインビトロで必要とされたそれより低いと思われるが、体内の特定部位例えば骨髄におけるチミジン濃度は局所的に高まっている可能性があると考えられる。骨髄においては、例えば多数の赤芽球核が正赤芽球から押し出され、そして次にマクロファージにより飲み込まれ、そこでDNA分解が起こって、このようにしてとりわけチミジンを生成する。チミジンそれ自体が細胞増殖の阻害を惹起することが報告されている（Blumen reichら、in Cancer Research 44：2203-2207（1984）、Chiutenら、in Cancer Research 40：818-822（1980）およびLeyvaら、in J．Cancer Res．Clin．Oncol ．107：211-216（1984）参照）。比較的高い量（血漿中ミリモル濃度を生ずる）のチミジンは癌患者に幾らかの緩解を生じたが、それが有効な抗癌療法であることは示されず、そして悪心、嘔吐および肝臓毒のような副作用を誘発した。細胞分裂に及ぼすチミジンの阻害作用は、酵素リボヌクレオチドレダクターゼのアロステリック阻害によるものと考えられた。理論的考察にしばられるのを望むわけではないが、CDDの阻害作用を説明するのに幾通りかのメカニズムが提示できる。可能性の一つはCDDとチミジンの組み合わせが、DNA合成に必要なデオキシシチジン前駆物質を涸渇させるのに相乗作用を有するというものである。チミジンは、CDDを直接活性化するか、またはCDD の桔抗体を中和する可能性がある。以前の研究では、過剰のチミジン（単独）がリボヌクレオチドレダクターゼを阻害すると考えられるデオキシチミジントリホスフェート（dTTP）のレベルを増大させうることが指摘されている（Reichard， Biochemistry 26：3245（1987）およびO'Dwyerら、Cancer Res 47：3911（1987 ）参照）。リボヌクレオチドレダクターゼの阻害は、シチジンのデオキシシチジンへの変換を阻止または低減させるであろう。前記指摘されたとおり、CDDはテオキシシチジンを脱アミノ化し、ここでもまたこの代謝産物濃度を低下させる。チミジンおよびCDDは別々に隔離された状態では、二義的効果しか有しないが、それらの組合せはデオキシシチジントリホスフェート（dCTP）（これはDNAの前駆物質一つである）のかなりの欠乏をひき起こすことができ、それにより細胞が分裂し損なうことになる。別の仮説ではCDDは細胞表面上の特異的なレセプターに結合し、この結合またはメカニズムの次の段階が、補助因子チミジンにより増強される。CDDのそのレセプターへの結合が次に細胞分裂を阻止または阻害するシグナルの伝達をひき起こす可能性がある。このように、チミジンはシチジンデアミナーゼの作用を増強するよう作用し、そして比較的高濃度例えば３〜６×１０^-5Mでは、チミジンはCDDがより強力な阻害作用すなわち正常な細胞増殖の５０〜９０％抑制を示すようにする。細胞増殖のCDD−仲介による阻害を増強する他の調節剤には、ヌクレオシド類のデオキシシチジンおよびデオキシウリジンが包含される。デオキシシチジンおよびデオキシウリジンは両者共、CDDの阻害作用の増強において、チミジンと置き代えることができる。加えて、ヌクレオシド類のデオキシシチジンおよびチミジンの混合物は、CDDにより示される細胞分裂阻害の促進において、相乗的に作用する。チミジンモノホスフェートおよびチミジントリホスフェートのようなチミジンホスフェートはチミジンと同様に作用する。これらはデオキシシチジンモノホスフェートデアミナーゼ（dCMPD）の阻害剤であり、そして5-フルオロデオキシウリジン（5-FdU）および5-フルオロデオキシウリジンモノホスフェート（F-dUMP）のようなdCMPDの他の阻害剤も同様に作用する。 CDDおよびその強化剤は、抗癌剤との組み合わせ療法において使用できる。CDD およびCDD強化剤の使用により、対象とする細胞例えば骨髄はサイクルから取り出され、それによって抗癌剤の作用に対して保護（すなわち感受性を少なくする）できよう。我々の実験においては、チミジンはむしろ低濃度で使用したが、それにもかかわらず、１．６×１０⁵顆粒球（／ml）からの顆粒球抽出物（GRE）中のCDDとの組み合わせにおいて、２０〜３０％阻害（p＜０．０１）（４〜８×１０^-5Mチミジン）を生じた。高GRE濃度（１０⁶細胞／ml）では、チミジン（８×１０^-5M）は何ら阻害を生じなかった。FdUMPはそれ自体最高濃度で抗増殖作用を有したが、しかしこの作用は、チミジンと組み合わせた場合は部分的に消失した。FdUMPの最も目立つ作用は、高濃度ＧＲＥと一緒であっても阻害を誘発する能力である。他の実験では、単核ヒト血球をウシ胎児血清中または同じ個体の血清（自己由来血清）中、２種類の異なるチミジン濃度で培養した。ウシ胎児血清培養物と比較して、３．３×１０^-5Mチミジン含有培養物中におけるヒト血清によるコロニー形成に対しては、顕著な作用が存在し、コロニー数が５０％低減し、そして１６×１０^-5Mでは９０％低下が観察された。チミジンの作用は培養物中にTHUを添加することにより大きく阻止された。チミジン増加はウシ胎児血清培養物中におけるコロニー形成に何の作用も及ぼさなかったが、GRE（CDD含有）の添加により強い阻害が生じ、これはTHUにより除くことができた。従ってヒト血清がCDDを含有し、このCDDがチミジンを添加した場合にコロニー形成の阻害を誘発すると思われる。従って、薄層クロマトグラフィーによって、CDD活性は新鮮ヒト血清中で容易に検出されうることが示された。ウシ胎児血清中には何ら評価しうる活性は見出されなかった。しかしながら、これらの血清は凍結／解凍にかけられており、これらはCDD活性を減少させる傾向がある。いずれの場合にも、これらの所見はCDDが白血球生産の調節において、生理学的役割を果たしていることを示唆するであろう。前記考察から、THUはCDDを不活化することにより細胞増殖を刺激することが要求されるいくつかの疾患の治療に使用できるということになる。さらに、チミジンおよび他のCDDエンハンサーは組織液におけるCDDの阻害作用を増強するためにある種の疾患で使用できる。あるいはまた、チミジンおよびCDDは組み合わせて使用することもできる。大量のチミジンが悪性疾患の治療に使用されているがあまり成功していない。しかしながら慢性顆粒球性白血病のようなある種の疾患には、チミジン投薬がCDDの阻害作用を増強し、それにより顆粒球の生産が比較的低レベルで維持され得よう。従って本発明はシチジンデアミナーゼにより仲介される細胞増殖の調節、例えは慢性骨髄性白血病に使用するためのCDD強化性ヌクレオシドまたはその類似体を提供する。チミジン、デオキシシチジンおよびデオキシウリジンが好適なヌクレオシドの例である。これらは、それらのホスフェート誘導体の形態で使用できる。チミジン、またはチミジンとデオキシシチジンとの組み合わせが好ましい。ヌクレオシドまたはその類似体は、好都合には１０^-6〜１０^-4M、例えば５×１０^-4〜５×１０^-5Mの濃度を生ずるように添加される。 CDDそれ自体の阻害剤、例えば前記論議した阻害剤THUも細胞増殖阻害を制御または阻止するために本発明に従って使用できる。特に、CDD阻害はCDDによる細胞増殖の阻害を制御または阻止するのに使用できる。同じ様式で細胞増殖に影響するCDDの他の阻害剤には、ゼブレール（Zebulaire）、5-F-ゼブレール、5-クロロメルクリシチジン、CV6、2-アジド-2-デオキシシチジン、5,6-ジデヒドロ-ウリジンおよびジアゼピノンリボシドが包含される。加えてCDDに対する抗体も、それらがCDDの活性部位に結合するかまたはそれを妨害する場合には、CDD阻害剤として使用されうる。すでに論議されたように、抗白血病薬物Ara-CとのTHUの使用はすでに調査されている（Kreisら、上記）。CDDを競合的に阻害するＴＨＵの作用がその研究で評価されているが、 THUは単純にCDDによる当該薬物（Ara-C）の望ましからぬ脱アミノ化を阻止するために投与された。しかしながらCDDが細胞増殖それ自体に影響するとは認められていなかった。 CDD阻害剤は、一般に白血球減少状況の調節において、そしてより詳細には抗癌治療または骨髄移植後に使用でき、また感染症の治療に関連して使用できる。 CDD阻害剤は、白血球の数および／またはそれらの活性を増大させると考えられる。すでに言及したdCMPDはCDDの拮抗体であり、従ってCDD阻害剤として作用することが認識されよう。もう一つの観点では、本発明は従って細胞増殖、特にCDDにより仲介される細胞増殖の調節におけるCDD阻害剤の使用を提供する。本発明のもう一つの観点は、細胞増殖、特にCDDにより仲介される細胞増殖の調節のための薬剤の製造における、THUのようなCDD阻害剤の使用を提供する。さらに他の観点では、本発明は造血幹細胞の血液中への流動化のための薬剤の製造における１種またはそれ以上のCDD阻害剤の使用を提供する。さらに他の観点では、本発明は（ａ）所望の場合はCDD強化性ヌクレオシドまたはその類似体と組み合わせてもよいシチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメント、または（ｂ）シチジンデアミナーゼの阻害剤を包含する医薬組成物を提供する。本発明による医薬組成物においては、通常の製剤上受容できる不活性担体、希釈剤、添加剤、香味剤および／または着色剤が勿論必要に応じて存在できる。好適なアジュバントおよび付形剤は当業者に知られていよう。さらにもう一つの観点においては、本発明はヒトまたはヒト以外の動物の身体にシチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメントを投与することからなる、細胞増殖を調節するためのヒトまたはヒト以外の動物体の治療方法を提供する。シチジンデアミナーゼまたはその官能性誘導体はまたシチジンデアミナーゼの活性を増強する１種またはそれ以上の補助因子と組み合わせて使用することもできる。本発明によって提供される細胞増殖を調節するためのもう一つの処置法は、１種またはそれ以上のシチジンデアミナーゼ阻害剤を投与することからなる。図面において：図１顆粒球抽出物（GRE）の存在下のコロニー形成阻害における、単独またはチミジンと組み合わせたデオキシシチジンの異なる濃度の作用を示す；図２チミジンまたはデオキシウリジンの存在または非存在でGREの添加により、コロニー形成がどのように影響されるかを示す。図３異なるチミジン濃度でのコロニー数とGRE投与量との関係を描く；図４ GREの異なるモノQフラクションに関する濃度変動時のコロニー形成阻害を示す；図５場合によりAra-Cを１０^-7Mおよび１０^-5Mの濃度で含んだ、GRE投与量対コロニー数に関する棒グラフである；図６ GREの存在および非存在でアザシチジンの濃度により、どのようにコロニー数が影響されるかを示す棒グラフである；図７マウスBMCおよびヒト血球のコロニーが、どのようにGRE処理され、かつ異なる濃度のTHUで影響されたかを示す；図８モノQ後のGREの異なるフラクションに関するコロニー形成阻害とCDD活性（デオキシウリジン濃度により測定）を示す；図９ GREの異なるモノQフラクションに関するMTTアッセイ結果を示す；図１０異なる濃度で（GREのモノQ精製の）フラクション５に関するMTTアッセイの結果を示す。本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。材料および方法化学物質：チミジン、シチジン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、およびシトシンアラビノシドはsigma から得た。テトラヒドロウリジンは、Calbiochemic（La Jolla，Ca）から得た。比活性１．０７TBq／ミリモルのデオキシ［5^-3H］-シチジンはAmershamから得た。マッコイ（McCoy's）5A培地、RPMI 1640およびCMRL 1066培地はFlowから得た。CMRL 1066培地は、添加剤と一緒に用いられた（Helgestadら、上記）。Lympho prepはNycomed AS，Osloにより提供された。マウスインターロイキン３は、Genz yme（Cambridge，Ma）から得た。そしてマウス顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）は、Pepro Tech Inc．（Rocky Hill，NJ）から得た。細胞：骨髄細胞（BMC）は、雌のＢ₆Ｄ₂マウス（Bomholdt gaard，DenMark）の大腿骨から得た。単核細胞および顆粒球は、ヒト血液から、そして軟膜サンプルは、Lymphoprep（Boyumら、Scand． J．Immuno 34：697（1991））を用いて分離した。単核細胞から血小板を除去するのに低速遠心分離（６０ｇ、１０分）が包含される。顆粒球フラクション中の挟雑赤血球は、細胞を０．８３％NH₄Cl中室温で７分間インキュベートすることにより溶解させた。遠心分離（６００ｇ、７分）後、上清を除去し、細胞を０．９％NaCl中に再懸濁し、そして計数した。NFS 60細胞、早期マウス骨髄細胞系、 C6細胞系、繊維芽細胞型マウス細胞、およびヒト膀胱癌細胞系（5637）は、Dr． Andrew King，SmithKline Beechham（Pa，USA）のご厚意により提供された。これらの細胞、およびマウスＬ−細胞（NCTC Clone 929）を１０％FCSを含むRPMI 1640培地中で培養し、そして週１回または２回継代培養した。L-細胞からの上清をマクロファージCSF源として用いた。癌細胞系（CM 5637）により馴化した培地は、ヒトG-CSFの豊富な供給源である（Welteら、PNAS 82：1526（1985））。NFS 60細胞は２％（ｖ／ｖ）CM 5637の存在下に培養した。顆粒球抽出物（GRE）：NH₄Cl処理および洗浄後に得られた顆粒球ペレットを水中に２００×１０⁶細胞／ml濃度で４〜５分間懸濁させた。遠心後に上清を集め、使用時まで−２０℃で保存した。GM−CFCアッセイ：マウスBMC（５×１０⁴／プレート）をCMRL 1066培地および１６％ウシ胎児血清中の０．３％寒天（Bacto-agar，Difco）中で培養した。CM 56 37（０．１ml／１ml培養プレート）を刺激剤として用いた。湿潤空気中３７℃および７．５％CO₂で７日間インキュベーションした後に、コロニー（＞５０細胞）を計数した。単核ヒト血球（５×１０⁵／ml）は、１６％FCS含有マッコイ5A培地またはCMRL 1066培地中の０．３％寒天にて１４日間培養した。刺激剤は何ら添加しなかった。４０細胞を越える集合体をコロニーとして計数した。培養は三つ一組で実施した。MTT−アッセイ：樹立細胞系の増殖は、比色法（Mosmann，J Immunol Meth 65：5 5（1983））により測定した。細胞を１５×１０^-5Mチミジンおよび５％FCS（Hyc lone，Logan，Utah）含有CMRL 1066培地１００μｌ中にて、２×１０⁴細胞／ウェルの濃度でマイクロタイタープレート（Costar 3596，Cambridge，Mass.）中に播種した。種々の希釈度の試験サンプル５０μｌを各ウェルに加えた。空気中５％CO₂の湿潤雰囲気中３７℃で４日間インキュベーションした後に、リン酸塩緩衝食塩水中５mg／ml濃度のMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5- ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；Tiazolyl Blue）（Sigma）１５μｌを加え、そして培養物をさらに３時間インキュベートした。次いで１００μｌのイソプロパノールを全ウェルに加えた。マイクロタイタープレートを室温で３０分間振盪し、そして次に残留する暗青色結晶をピペット操作により溶解させた。ウェルの光学濃度をDynatec MR 700マイクロプレートリーダーにて、試験波長５７０ nmおよび標準波長６３０nmで読みとった。シチジンデアミナーゼアッセイ：反応混合物は５０mM Hepes，pH７．５；０．１ mMデオキシ［5^-3H］-シチジン（比活性１８．５MBq／ミリモル）；および最終容量５μｌとなるまでのタンパク質フラクションを含有し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。等モル量（各５mMの１μｌ）の未標識デオキシシチジンおよびデオキシウリジンの添加により反応を停止させ、続いてポリエチレンイミン薄層シート（プラスチック裏打ち、Schleicher & Schull）上に適用した。このクロマトグラムをイソプロパノール／０．１M HCl（７：２）中で展開させるとデオキシウリジンのRf値０．７３およびデオキシシチジンのRf値０．５１がそれぞれ得られる。デオキシウリジンを含有するスポットおよびデオキシシチジンを含有するスポットをUV（２５４nm）により可視化し、そして各スポット中の放射能をシンチレーションカウンティングにより計測した。タンパク質クロマトグラフィー：GRE（４ml、タンパク質約４０mg）を６mlのバッファーA（５０mM NaCl；５０mM HEPES、pH７．５；１mM EDTA）で希釈し、そしてバッファーAで予め平衡化したDEAE−Sephacel（Pharmacia）カラム（１．３ ×２．６cm）に適用した。このカラムを１０mlのバッファーＡで洗浄し、そして４００mM NaCl（５０M HEPES、１mM EDTA）６mlで溶離した。溶出液をPD−10カラム（Pharmacia）を用いてバッファーAへのバッファー交換にかけ、そしてモノ Qアニオン交換カラム（０．７×５．５cm）FPLCシステム、Pharmacia）にかけた。カラムをバッファーA ２０mlで洗浄し、そして１０００mM NaClまでの直線状グラジエントを用いて流速０．２５ml／分で溶離した。フラクション（１mlずつ）を滅菌濾過し、そしてGM−CFCアッセイで阻害活性について検査するかまたは前記示したようにしてシチジンデアミナーゼ活性について検査した。活性フラクションをゲル濾過（１．５×２５cm Ultrogel AcA 34）によりさらに精製し、そしてバッファーB（４００mM KCl；５０mM HEPES、pH７．５；１mM EDTA、２５％グリセリン、１mMメルカプトエタノール）を用いて溶離した。フラクション（１ mlずつ）を滅菌濾過し、そして前記したようにしてGM−CFC阻害剤およびシチジンデアミナーゼ活性についてアッセイした。ゲルカラムはミオグロビン（１７．５KD）、オバルブミン（４７KD）およびブルーデキストラン（ボイド量を反映）を用いて同一流下条件下で予め検量した。統計：スチューデントt-テストまたはWilcoxonの非パラメーターテストを統計的計算に用いた。実施例１ヒト血液からの顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（GM−CFC）の阻害ヒト血液からの顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（GM−CFC）の増殖を１０⁶顆粒球からの抽出物（GRE）が阻害する能力に及ぼすチミジン（３×１０^-5M）およびデオキシシチジンの別々の作用および組み合わせた作用を調査した。単核ヒト血球（５×１０⁵）を寒天中のマッコイ培地中で培養し、第１４日目にコロニーを計数した。対照培養は平均３０（１８〜５８）個のコロニーを有した。５回の実験の平均値（±SD）は対照値の％として示される。各実験において培養は三つ一組で実施した。チミジンまたはデオキシシチジン単独は、コロニー数に何ら見かけ上影響がなかった。結果を図１に示す。図１に示されるように、チミジンおよびデオキシシチジンは、加算的作用（p ＜０．０５）を有した。またデオキシシチジンは２×１０^-4M濃度、すなわち強い阻害を生ずるに要するチミジン濃度より１０倍高い濃度で、顆粒球抽出物のための補助因子として、チミジンと交換し得ることも示される。実施例２顆粒球抽出物添加または無添加でのチミジンまたはデオキシウリジンによるGM− CFCの阻害ヒト血液GM−CFCを寒天培養中で成長させた。チミジンまたはデオキウリジンを単独または１０⁶GRE（顆粒球抽出物）と共にマッコイ培地に添加した。GM−CF Cに及ぼす阻害作用を観察した。マッコイ培地はヌクレオシドを含有しない。CMR L 1066培地（４．０×１０^-5Mのチミジン含有）との比較も実施した。図２に示す結果は、３つの実験の平均値（±SD）である。図２はデオキシウリジンが同じ細胞阻害を達成するのにチミジンよりおよそ１０倍高い濃度で、顆粒球抽出物の補助因子としてチミジンと交換し得ることを示している（チミジン１０^-5Ｍに比較して５×１０^-4Mのデオキシウリジンが必要）。高濃度（１〜５×１０^-4M）のデオキシウリジンはGM−CFCに何ら抑制作用を及ぼさないことが示された。対照的に、最低デオキシウリジン濃度（１０^-4）はコロニー形成を増強した（p＜０．０１）。他方、高濃度（５×１０^-4M）のチミジンは顆粒球抽出物の非存在下で阻害作用を及ぼした。実施例３ GREによるマウス骨髄細胞の阻害マウス骨髄細胞（BMC）を寒天中、CMRL 1066培地にて７日間培養した。５６３７細胞系の培養物からの上清を刺激剤として用いた。顆粒球抽出物を漸時増加させながら加えた。平均値（±SD）は二つ一組の培養３つから得た。マウス骨髄細胞は以前にGREおよびチミジンに対して感受性であるここでは、４×１０^-5Mチミジンがメチルセルロース中で培養された細胞に強い（約８０％）阻害をひき起こすのに充分であることが見出された。寒天培養において同程度の阻害を得るには、チミジン濃度は３〜４倍増大させねばならないことが比較研究で見出された。図３に示す結果は、寒天中のマウス GM−CFCを強く阻害するには、チミジン濃度１３×１０^-5Mを必要としたことを示している。実施例４異なる刺激剤により誘発されたコロニー形成に及ぼすGREの作用 Lymphoprepを用いて分離されたマウスBMCの低密度フラクションを１３×１０^- ⁵ Mチミジンを添加したマッコイ培地中で培養した。組換えIL-3（100単位／ml）r GM-CSF（10ng／ml）、L-CSF（0.1ml／プレート）およびCM 5637（0.1ml／プレート）が刺激剤として用いられた。平均値（±SD）は２つの別々の実験からのものである。実施例５ GM-CFC阻実活性を有するＧＲＥのフラクションの単離４ml GRE（８００×１０⁶細胞から、約４０mgタンパク質）をDEAE−Sephacel およびアニオン交換クロマトグラフィー（モノQ、“材料および方法”参照）を用いて分離し、１３×１０^-5Mチミジン含有寒天中、CMRL 1066培地にて培養されたマウス骨髄におけるGM−CFCに及ぼす阻害活性について検査した。フラクション１は１０００mM NaClを用いる溶離の開始を示す。溶離は３０分で完了した。１０回の分離の平均値（±SD）を図４に示す。アニオン交換クロマトグラフィー後に、フラクション４と５の阻害活性が最高濃度（フラクションの希釈度１／５０）ではより低いことが観察された。この現象はフラクション６では観察されなかったが、粗製顆粒球抽出物に関しては、以前に報告されている実施例６ GREによるシトシンアラビノシド（Ara-C）およびアザシチジンの害作用の阻止ヒト血液からのGM−CFCを培養し、そしてGRE、Ara-CおよびAra-C含有GREの阻害作用を調査した。その結果を図５に示す。 Ara-Cの代わりにアザシチジンを用いた実験を平行して行い、その結果を図６に示す。１０^-7M濃度では、Ara-CはGM−CFCにおける細胞分裂をほとんど完全に抑制した。この抑制は１０⁵顆粒球からの抽出物の添加により軽減された。対照実験では、同じバッチからのGREはチミジン補添培養（CMRL 1066）中のGM−CFC を抑制することが示された。同様に、粗製GREはアザシチジンの阻害作用を阻止した−図６参照（p＜０．０１）。実施例７マウス骨髄細胞およびヒト血球によるコロニー形成のGRE誘発性抑制に及ぼすテトラヒドロウリジン（THU）の効果３．３×１０^-5M（ヒト細胞）または１３×１０^-5M（マウス細胞）チミジンのいずれかを含むCMRL 1066培地にて寒天中で細胞を培養した。２×１０⁵細胞からのGREを１培養プレート毎に添加した。図７は４件のマウス細胞実験および３件のヒト細胞実験からの平均値（±SD）による結果を示す。ヒトおよびマウスGM−CFCに及ぼす粗製GREの阻害作用は、４×１０^-6M THUにより完全に消失した。THUはCDDの特異的な阻害剤であることが知られており、そしてそれゆえこれらの結果は、CDDが観察される阻害作用の原因物質であることを示している。THUそれ自体は、コロニー形成には何ら注目に値する作用は及ぼさなかった。実施例８ GREフラクションにおけるCDD活性の調査デオキシシチジンをデオキシウリジンに変換する能力について検査することにより、GRE中におけるCDDの存在を直接調査した。モノQ分離および分離（実施例５参照）からの活性フラクションをゲル濾過によりさらに分離した。図８はゲル濾過後のシチジンデアミナーゼの溶離プロフィルおよびGRE中における阻害活性を示す。マウスGM−CFCに及ぼす阻害活性を同じフラクションで測定した。最も活性なフラクションをCDDおよび阻害活性について再検査して、ほとんど同一の結果が得られた。黒塗り（closed）記号はテトラヒドロウリジン（THU）での実験を示す。分子量標準物の溶出位置を示してある。成長阻害剤およびCDD活性は、いずれもMr 50 KDの単一ピークで溶出し、これは以前にCacciamaniら、Arch Biochem Biophys 290：285（1991）により報告されたヒトCDDの分子量と一致し、同時精製されることが見出された。 THUは４×１０^-5Mの濃度ですべての活性フラクションの阻害能および脱アミノ化能を中和した。実施例９ GREのモノQフラクションによるマウスGM−CFC、NFS 60およびC6の阻害 NFS ６０細胞およびC6細胞をマイクロタイタープレート中で（２０，０００細胞／ウェル）４日間培養し、そして細胞成長を比色定量法（MTT）で測定した。G M−CFCは寒天コロニーアッセイでモニターした。アニオン交換クロマトグラフィー（モノQ）後に得られたフラクションを増殖培地で８００倍に最終希釈した後にNFS ６０およびGM−CFC培養物に加え、かつ５０倍に希釈した後にC6細胞に加えた。図９は１つの代表的な実験からの三つ一組の培養の平均（±SD）から得た結果を示す。結果は２回確認し、１回の実験は異なるGREフラクションセットを用いた。コロニー形成に関する阻害活性は、マウスGM−CFCおよび骨髄細胞系NFS ６０に同程度に影響することが判明した。NFS ６０細胞系に関するコロニー形成阻害は、THU添加によって排除された（結果は示されず）。これと対照的に、繊維芽細胞系、C6の増殖はGREフラクションによっては抑制されず、このことはCDDには何らかの細胞特異性が存在する可能性があることを示している。実施例１０モノQ精製から得られたフラクション５の薬量−応答曲線実施例９からの最も活性なフラクション（フラクション５−図９参照）をマウスGM-CFC、NFS ６０およびC6細胞に関するその細胞複製阻害能について幾通りかの濃度で検査した。NFS細胞およびC6細胞をマイクロタイタープレート（２０，０００細胞／ウェル）で４日間培養し、そして細胞成長をMTTアッセイで測定した。GM−CFCは寒天コロニーアッセイでモニターした。図１０は１つの代表的実験からの三つ一組の培養の平均値（±SD）の結果を示す。この結果は２つの追加実験で確認された。図１０は異なる希釈度でのフラクション５の投与量−応答曲線を示す。GM−CF CおよびNFS ６０細胞に及ぼす阻害作用は高濃度のフラクション５ GREで部分的に軽減され、従ってベル形状応答曲線を与えた。実施例１１骨髄細胞をマッコイ培地中で７日間培養し、そして次にコロニーを計数した。２種の顆粒球抽出物を調製し、その第１番目は１．６×１０⁵顆粒球／mlから、第２番目は８×１０⁶顆粒球／mlから得た。チミジンおよび／または5-フルオロ-2-デオキシウリジン−モノホスフェート（FdUMP）単独の、またはこれと前記２種の顆粒球抽出物の一方と一緒の、コロニー増殖に及ぼす作用を検査した。結果を表２に示す。チミジンとFdUMPを組み合わせた場合には、チミジンの濃度は０．８×１０^-4Mの一定に保ち、そしてFdUMP濃度は表２に示されるように変動させた。 TとFdUMPを組み合わせた場合、Tの濃度は一定（０．８×１０^-4M）に保たれ、そしてFdUMP濃度は左カラムに示されるように変動された。４〜８×１０^-5Mの低濃度にもかかわらず、チミジンはGRE １とで２０〜３０％阻害（p＜０．０１）を生じた。GREの濃度がより高い場合（GRE 2）、チミジンがひき起こす阻害はより少なかった。FdUMPそれ自体は高濃度で抗増殖作用を有したが、しかしこの作用はチミジンも存在する場合は消失した。 GRE ２（高顆粒球抽出物濃度）と一緒のFdUMPは有意な細胞増殖阻害を生じた。実施例１２単核ヒト血球をウシ胎児血清（FCS）中またはその血球提供者からの自己由来血清中で培養した。細胞は２種の異なるチミジン濃度（３．３×１０^-5Mチミジンまたは１６×１０^-5チミジン）で培養した。４０細胞をこえる集合体をコロニーとして計数した。THUおよび／またはGREを添加し、そしてコロニー数に及ぼす作用を対照値の％として評価した。培養物は三つ一組で操作し、そして表３は２つの実験からの平均値（±SD）を示す。対照として用いられたFCS培養における平均コロニー数は２５９±６１であった。高い方のチミジン濃度ではFCS培養物に対し、何らの作用も及ぼさなかった。両方の培養タイプにおいて、２×１０⁵細胞／プレートからのGREを添加するとコロニー形成に強い阻害を生じた。しかしながらこれはTHUの添加により逆転された。実施例１３血液中の造血前駆細胞に及ぼすテトラヒドロウリジン（THU）の作用をマウスでインビボにて検査した。マウス（DBA系統）当たり０．６mg量を−４時間（THU×１）または−２０および−４時間（THU×２）の時点で腹腔内注射し、そして０時間の時点で心臓穿刺により血液を集めた。白血球数を測定し、そして１×１０⁵個の細胞をCMRL 1066 培地中の０．３３％寒天１ml中に播種し、そして空気中７．５％CO₂および３７℃にて指定時間インキュベートした。結果を表４に示す。播種した白血球からのコロニー数の増大が、対照動物と比較してTHU処理したマウスから採取した血液で観察された。THUはこのように血液中の造血前駆細胞の数を増加させることが明らかである。

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Claims

【特許請求の範囲】１．細胞増殖の調節に使用するためのシチジンデアミナーゼおよびその機能的フラグメントから選択された化合物。２．細胞増殖を調節するための薬剤の製造へのシチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメントの使用。３．シチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメントがシチジンデアミナーゼの活性を増強する１種またはそれ以上の補助因子と組み合わせて使用するためのものである請求の範囲第１項または第２項記載の化合物または使用。４．造血が阻害される請求の範囲第１〜３項のいずれか１項記載の化合物または使用。５．顆粒形成が阻害される請求の範囲第４項記載の化合物または使用。６．慢性骨髄性白血病における細胞増殖が阻害される請求の範囲第５項記載の化合物または使用。７．補助因子がシチジンデアミナーゼ強化性ヌクレオシドまたはその類似体である請求の範囲第３〜６項のいずれか１項記載の化合物または使用。８．強化性ヌクレオシドまたはその類似体が、ピリミジンヌクレオシドまたはその類似体からなる群から選択される請求の範囲第７項記載の化合物または使用。９．ピリミジンヌクレオシドまたはその類似体がチミジン、デオキシシチジン、デオキシウリジンおよびそれらのホスフェート誘導体からなる群から選択される請求の範囲第８項記載の化合物または使用。 10．ヌクレオシドがチミジンである請求の範囲第９項記載の化合物または使用。 11．チミジンが５×１０^-3M〜１×１０^-6Mの範囲の濃度で存在する請求の範囲第１０項記載の化合物または使用。 12．細胞増殖の調節に使用するためのシチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメントおよびシチジンデアミナーゼの活性を増強する１種またはそれ以上の補助因子を組み合わせて含む組成物。 13．シチジンデアミナーゼにより仲介される細胞増殖の調節用薬剤の製造への１種またはそれ以上のシチジンデアミナーゼ強化性ヌクレオシドまたはその類似体の使用。 14．強化性ヌクレオシドまたはその類似体がチミジン、デオキシシチジン、デオキシウリジンおよびそれらのホスフェート誘導体からなる群から選択される請求の範囲第１３項記載の使用。 15．チミジンおよびデオキシシチジンが使用される請求の範囲第１４項記載の使用。 16．ヌクレオシドまたはその類似体が濃度１０^-4〜１０^-6Mとなるまで添加される請求の範囲第１３〜１５項のいずれか１項記載の使用。 17．前記濃度が５×１０^-4〜５×１０^-5Mの範囲にある請求の範囲第１６項記載の使用。 18．細胞増殖を調節するための薬剤の製造における１種またはそれ以上のシチジンデアミナーゼ阻害剤の使用。 19．細胞増殖がシチジンデアミナーゼにより仲介される請求の範囲第１８項記載の使用。 20．造血幹細胞の血液中への流動化のための薬剤の製造における１種またはそれ以上のシチジンデアミナーゼ阻害剤の使用。 21．前記阻害剤がテトラヒドロウリジン（THU）である請求の範囲第１８〜２０項のいずれか第１項記載の使用。 22．細胞増殖が骨髄移植後または化学療法後のような白血球減少状況で刺激される請求の範囲第１８〜２１項のいずれか１項記載の使用。 23．（ａ）所望の場合はシチジンデアミナーゼ強化性ヌクレオシドまたはその類似体と組み合わせてもよいシチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメント、または（ｂ）シチジンデアミナーゼの阻害剤を少なくとも１種の生理学的に受容できる担体または付形剤と一緒に含む医薬組成物。 24．ヒトまたはヒト以外の動物の身体にシチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメントを投与することからなる、細胞増殖を調節するためのヒトまたはヒト以外の動物体の治療方法。 25．前記方法が、シチジンデアミナーゼまたはその機能的フラグメントと組み合わせて、シチジンデアミナーゼの活性を増強する１種またはそれ以上の補助因子を前記身体に投与することからなる請求の範囲第２４項記載の治療方法。 26．ヒトまたはヒト以外の動物の身体に１種またはそれ以上のシチジンデアミナーゼ阻害剤を投与することからなる、細胞増殖を調節するためのヒトまたはヒト以外の動物の身体の治療方法。 27．細胞増殖の調節において同時に、別々にまたは連続して使用するための組み合わせ製剤として、シチジンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの活性を増強するコファクターを含有する組成物。