JPH08509727A

JPH08509727A - 抗腫瘍剤として有用なホスホルアミデート

Info

Publication number: JPH08509727A
Application number: JP6524336A
Authority: JP
Inventors: エフ．ボーチ，リチャード; ピー．シュミット，ジェームズ
Original assignee: リサーチコーポレイションテクノロジーズ，インコーポレイティド
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 1996-10-15
Also published as: US5472956A; IL109377A0; NZ266066A; CA2161548A1; AU6666194A; US5306727A; EP0697022A1; WO1994025471A1; AU674224B2

Abstract

(57)【要約】一般式（II）：〔式中、Ｒ¹及びＲ²は脱離基、たとえばハロ又はアルキルスルホニルにより置換された（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキルであり、Ｒ³及びＲ⁴はＲ¹及びＲ²と同じか又はＨであり、そしてArは複素芳香族環である〕で表わされるシクロホスファミド類似体が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】抗腫瘍剤として有用なホスホルアミデート発明の背景下記一般式（Ｉ）：で表わされるシクロホスファミド（またシトキサンとしても知られている）は、最とも広く使用される抗癌剤の１種である。それは、広範囲の種類の血液学的及び固体腫瘍を処理するために多くの他の薬物と一緒に一般的に投与される。しかしながら、その臨床学的利用性を制限する薬物のいくつかの特徴が存在する。第１に、その薬物は癌細胞に対して毒性である代謝物を生成するために肝臓において活性化を要する。第２に、その薬物は、膀胱に対して特に毒性であり、そしてまた、抗癌剤のアルキル化剤クラスに典型的な骨髄毒性を示す。第３に、シクロホスファミドは、癌を処理するために使用される用量で免疫系の可能性あるサプレッサーであり、従ってそれらの疾患によりすでに弱体化されている患者の感染に対する戦う能力を低める。最後に、シクロホスファミドの反復された使用は患者の癌細胞による薬物に対しての耐性の上昇をもたらし、従ってその薬物を無能にする。それらの欠点の少なくともいくつかを回避する試みにおいて、シクロホスファミドの構造特徴の少なくともいくらかを保持する多くの類似体が開示されて来た。たとえば、公開されたPCT出願WO89／11484号（Research Corporation Technol ogies，Inc．による）は、下記一般式：〔式中、Ｒ₁及びＲ₂はＨ又はハロアルキルであり、Ｒはニトロ置換された複素芳香族基であり、そしてＲ₃及びＲ₄は独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキル又は電子求引性基、たとえばCO₂Etである〕で表わされるホスホルアミドを開示する。それらの化合物は低酸素性細胞において所望する細胞毒性であることを開示しているが、開示される最とも活性的な化合物は、Ｒ₃又はＲ₄で少なくとも１つの電子求引性基を含み、これは必ずそれらの合成を複雑にし、そしてそれらの安定性を減じる。また、Borchなど。（アメリカ特許第4,908,356号及び第5,190,92 9号を参照のこと）。従って、安定し、そして調製しやすい、広範囲の種類の腫瘍細胞に対してひじょうに細胞毒性であるシクロホスファミドについての連続した必要性が存在する。発明の要約本発明は、下記一般式（II）：〔式中、Ｒ¹及びＲ²は独立して、ハロゲンにより置換された（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリールオキシ、シアノ、（Ｃ₁− Ｃ₄）アルコキシカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルスルホニル、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリールスルホニル、（Ｃ₁−Ｃ₄）ペルフルオロアルキルスルホニル、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルスルフィニル、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリールスルフィニルであり、又はＲ¹及びＲ²がＮと一緒に取られる場合、モルホリノ環であり；Ｒ³及びＲ⁴はＲ¹及びＲ²と同じであるか又はそれぞれＨであり；そしてArは窒素−、硫黄−又は酸素−含有複素芳香族環であり；好ましくはArはその環に１〜３個のＮ，Ｓ又は非ペルオキシドＯ原子を含む５−又は６−員の複素芳香族環であり、ここで個々の環Ｎ原子は置換されていなくても又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルにより置換されても良い〕で表わされる抗腫瘍ホスホルアミド化合物を提供する。本発明のホスホルアミド化合物は、上記シクロホスファミドに関する１又は複数の問題を回避する。第１に、本発明の化合物は、正常な好気条件下でよりも酸素欠望条件下でより細胞毒性である。従って、肝臓において細胞毒性的に活性化されるシクロホスファミドと異なって、本発明の化合物は、低酸素性細胞において選択的に細胞毒性になり得る。従って、酸素欠望性腫瘍細胞は、非−癌細胞に対して影響を及ぼさない濃度のそれらの化合物により選択的に破壊され得る。第２に、それらの化合物は膀胱に対して比較的非毒性である。第３に、本発明の化合物は、シクロホスファミドに対する耐性を進行せしめた哺乳類腫瘍の処置において効果的である。腫瘍における低酸素性細胞は一般的に放射線及び化学療法に対して耐性であり、そして従って、根絶するのにひじょうに困難である細胞集団を表わす。ほとんどの哺乳類細胞は過剰酸素の条件下で作動し、そして酸素代謝を利用する。しかしながら、低酸素性細胞は、還元環境を表わす。従って、そのような細胞の内部の還元環境により活性化されるように企画されているプロドラッグは、腫瘍細胞に特異的に細胞毒性種を運ぶことができ、そして従って、既知化合物よりも可能性ある治療利点を提供することができる。本発明の化合物は、低酸素性細胞の還元環境に暴露される場合、細胞毒性ホスホルアミデートアニオン又は類似体（シクロホスホルアミデートに由来する細胞毒性代謝物）を遊離できるプロドラッグである。本発明の化合物は、正常な好気性条件下で選択的にほとんど細胞毒性ではないが、しかし低酸素条件下で高い細胞毒性である。それらの化合物の有効性は、低酸素性細胞におけるニトロ基の還元に起因すると思われる。この還元は細胞毒性ホスホルアミドのマスタード（mustard）成分の排除を促進すると思われる。開放された後すぐに、そのホスホルアミドマスタードは、DNAアルキル化剤として作用する。従って、本発明の化合物は、“生物還元アルキル化剤”として分類され得る。本発明はまた、腫瘍の細胞の増殖を阻害するのに有効な量の式（II）の化合物を、前記腫瘍を有する哺乳類に投与することを含んで成る治療法を提供する。好ましくは、前記哺乳類はヒト癌患者であり、そして式（II）の化合物は医薬単位用量形として投与される。式（II）の化合物はまた、新生低酸素性及び好気性細胞系を同定し、そして特徴づけるためにも使用され得る。発明の詳細な記載本明細書に使用される場合、用語“アルキル”とは、直鎖又は枝分れ鎖のアルキルを包含する。好ましくは、アルキル基は、（Ｃ₂−Ｃ₃）アルキル、最とも好ましくは、エチルである。用語“アリール”とは、モノ又はビス−アルキル−置換されたアリール、たとえばトリル及びキシリル；及びAr（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、たとえばベンジル又はフェニルエチルである。好ましくは、アリールは、フェニル、トリル又はナフチルである。複素芳香族環は、４個までの環ヘテロ原子及び18個までの環原子を含む芳香族環である。代表的な複素芳香族環は、チオフェン、ベンゾチオフェン、ナフトチオフェン、トリアントレン、フラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ピラン、クロメン、キサンテン、フェノキサンチン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、トリアゾール、テトラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、ピリダジン、インドーリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、イソチアゾール、フェノチアジン、オキサゾール、イソキサゾール、フラザン、フェノキサジン及び同様のものを包含する。ニトロ（NO₂）基は、環のいづれの位置上でも置換され得るが、しかし好ましくは、環ヘテロ原子上ではない。好ましい複素芳香族環は、芳香族環に融合され得るか又はされ得ない５−又は６−員の複素芳香族環、たとえばベンゾ環を有する。好ましい、ArNO₂基は、ニトロチオフェン、たとえば２−ニトロチオフェン又は３ −ニトロチオフェン、ニトロピリジン、ニトロキノリン、ニトロイソキノリン、ニトロピロール、ニトロフラン及びニトロイミダゾールを包含する。好ましくは、環窒素原子の少なくとも１つは、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル基、最とも好ましくはメチルにより置換され、好ましいものは、１−メチル−５−ニトロ−２−イミダゾイル又は１−メチル−４−ニトロ−２−ピロール基である。ハロゲン、又はハロ基は、Ｆ，Cl，Br及びＩを包含する。臭素及び塩素は、好ましくはハロ基である。スルホン酸エステルは、−OSO₂−基であり；スルフィン酸エステルは−SO−Ｏ −基である。低級アルキルスルホニルエステルは、−OSO₂−低級アルキルであり、そして低級アルキルスルフィニルエステルは、−SO−Ｏ−低級アルキル、たとえばメシレートである。アリールスルホニルエステルは、−OSO₂−アリールであり、そしてアリールスルフィニルエステルは−SO−Ｏ−アリール（ここでアリールは１〜３個の低級アルキル基、１〜２のハロゲン又は１〜２個のニトロ基により置換され得る）、たとえばトシレート又はブロシレートである。Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁴上での置換基は好ましくは、α−置換基ではなく、そして好ましくはβ−炭素原子上に存在し、Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及び／又はＲ⁴上にβ−クロロエチル又はβ−ブロモエチルを生成する。好ましくは、Ｒ¹はＲ²と同じであり、そしてＲ³はＲ⁴と同じである。本発明の好ましい態様において、Ｒ¹＝Ｒ²＝Ｒ³＝Ｒ⁴であり、そしてすべての４つの基はβ−クロロエチル又はβ−ブロモエチルである。本発明の化合物は、下記スケムＡに示されるようにして調製され得る。式IIIのアルコキシドは、たとえばＮ，Ｎ−ビス（２−ハロエチル）ホスファミドジクロリド（IV，Ｒ³＝Ｒ⁴＝２−ハロエチル）と反応せしめられ、次にアンモニア又はアミン（R¹）（R²）NHが添加され、式（Ｖ）の化合物が形成される。それらの反応に関する詳細な工程については、PCT出願WO89／11484の例１及び２を参照のこと。広範囲の種類のアミンが段階２において使用され、本発明の化合物が生成され、このうちの多くは当業界において知られている方法により〔ビス（２−クロロエチル）〕アミンから調製され得る。式IVの化合物は、有機塩基の存在下でPUCl₃とビス（置換アミン）との反応により調製され得る。好ましくは、その反応は不活性有機溶媒、たとえば塩化メチレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ヘキサン及び同様のものの存在下で起こる。その反応は、溶媒の融点〜還流温度の範囲の温度で生じるが、しかし好ましくは、その反応は−60℃〜室温で生じる。式IIIのアルコキシドは、その対応するアルコール、すなわちO₂N−ArCH₂OHと、強塩基、たとえばアルカリ金属、アルカリ金属の水酸化物又はアミド、又は強金属有機塩基、たとえばアルコキシド、金属アルキルアミド、金属アルキルシリルアミド、たとえばリチウムビス−トリメチル−シリルアミド及び同様のもの、又はオルガノ−金属化合物、たとえば金属アルキル、たとえばｎ−ブチルリチウム及び同様のものとの反応により調製され得る。アルコール、すなわちArCH₂OHは、種々の方法、たとえばその対応するアルデヒドを、たとえばNaB H₄により還元することによって調製され得る。Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁴が２−ハロエチルである場合、三塩化リンガアルキルアミン塩基の存在下で２当量のＮ，Ｎ−ビス（２−ハロエチル）アミン塩酸塩により反応せしめられる。上記反応から生成されるアルコールが添加され、続いて酸化剤、たとえばｔ−ブチルヒドロペルオキシド、オゾン又はヨウ素が添加され、スケム（Ｂ）に示されるように、最終生成物の１種が形成される：本発明の化合物は、医薬組成物として調製され、そして哺乳類宿主、たとえばヒト癌患者に投与の選択された経路に適合される種々の形、すなわち経口又は非経口により、静脈、筋肉内又は皮下路により投与される。従って、本発明のホスホルアミデート化合物は、たとえば医薬的に許容できるビークル、たとえば不活性希釈剤又は同化できる食用キャリヤーと共に経口投与され得る。それらは硬質又は軟質のシェルゼラチンカプセルに封入され、錠剤に圧縮され、又は患者への食物と共に直接的に導入され得る。経口治療投与に関しては、活性化合物は、１又は複数の賦形剤と共に組合され得、そして摂取できる錠剤、経口用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート及び同様のものの形で使用される。そのような組成物及び製剤は、少なくとも0.1％の活性化合物を含むべきである。もちろん、組成物及び製剤もの％は変えられ得、そして便利には、一定の単位投与形の重量の約２〜約60％の間である。そのような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、効果的用量レベルが得られるような量である。錠剤、トローチ、ピル、カプセル及び同様のものはまた、次のものを含むことができる：結合剤、たとえばトラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン；賦形剤、たとえばリン酸二カルシウム；砕解剤、たとえばコーンスターチ、ホテトスターチ、アルギン酸及び同様のもの；滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム；及び甘味剤、たとえばスクロース、ラクトース又はサッカリン又は風味剤、たとえばペパーミント、ヒメコウジの油又はチェリー風味。単位投与形がカプセルである場合、それは、上記タイプの材料の他に、液体キャリヤー、たとえば植物油又はポリエチレングリコールを含むことができる。種々の他の材料がコーチングとして、又は固体単位投与形の物理的な形を変性するために存在することができる。たとえば、錠剤、ピル、又はカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラック又は糖及び同様のものにより被覆され得る。シロップ又はエリキシルは、活性化合物、スクロース、たとえば甘味剤、メチル及びプロピルパラベン、たとえば保存剤、染料及びフレーバー、たとえばチェリー又はオレンジフレーバーを含むことができる。もちろん、いづれかの単位投与形の調製に使用される材料は、医薬的に許容でき、そして使用される量で実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、持効性製剤及び装置中に導入され得る。活性化合物はまた、静脈内又は腹腔内、浸入又は注射により投与され得る。活性化合物の溶液は、水において調製され、場合によっては非毒性界面活性剤と共に混合され得る。懸濁液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物において、及び油において調製され得る。貯蔵及び使用の通常の条件下で、それらの製剤は、微生物の増殖を妨げるために保存剤を含む。注射又は浸剤使用のために適切な医薬投与形は、滅菌注射用又は浸剤用溶液又は分散液の即座の調製のために適合化される活性成分を含んで成る滅菌水溶液又は分散液又は粉末を含むことができる。すべての場合、究極的な投与形は、滅菌され、流体であり、そして製造及び貯蔵の条件下で安定性であるべきである。液体キャリヤー又はビークルは、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール及び同様のもの）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びそれらの適切な混合物を含んで成る溶媒又は液体分散媒体であり得る。適切な流動性は、たとえばリポソームの形成により、懸濁液の場合、必要とされる粒子サイズの維持により、又は界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗カビ剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザル、及び同様のものによりもたらされ得る。多くの場合、それは好ましくは、等張剤、たとえば糖、緩衝液又は塩化ナトリウムを含む。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅くする剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物への使用によりもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、上記に列挙される種々の他の成分と共に、適切な溶媒に必要とされる量で活性化合物を導入することによって調製され、必要な場合、続いてフィルター殺菌される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、その好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これは活性成分及び前もって滅菌濾過された溶液に存在するいづれかの所望する成分の粉末を生成する。化合物Ｉの有用な投与量は、インビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を同じ投与量のシクロホスファミドの活性とを比較することによって決定され得る。たとえば、特定の癌に対してシクロホスファミドよりも10〜20倍高い能力を有する本発明の化合物は、約0.25〜2.5mg／kg／日の用量で２〜５日間、静脈内投与され得、次により低い維持用量が続けられ、すなわち週１度又は２度続けられる。その用量は、患者の耐性に従って毎週調節され得る。本発明の類似体は、シクロホスファミドに敏感であることが知られている癌、 Burkitt腫瘍、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、鱗状細胞及び大細胞退生癌、肺の腺癌、Ewing肉腫、非−Hodgkinsリンパ腫、乳癌、オート細胞（oat-cell ）気管支原性癌、卵巣癌、膀胱癌、コウ丸腫瘍、子宮内膜癌、悪性黒色腫、及び急性リンパ性白血病、及び前立腺癌（但し、これだけには限定されない）を処理するために使用され得る。本発明の化合物は、単一剤として、又はそれらの癌を処理するためにシクロホスファミドと共に通常使用される他の抗癌薬物と共に投与され得る。小児用投与スケジュールはまた、シクロホスファミドの場合、効果的であることが知られているレジメから適合化され得る。本発明は、次の詳細な例によりさらに記載されるであろう。例１．ニトロアリールメチルＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（２ −クロロエチル）ホスホルアミデートの調製のための標準方法三塩化リン（5.0ml、ジクロロメタン中で2.0Ｍ、10ｍモル）を、ジクロロメタン（100ml）に添加し、そして０℃に冷却する。ビス−（２−クロロエチル）− アミン塩酸塩（3.8ｇ、21ｍモル）を、撹拌下で添加する。トリエチルアミン（8 .5ml、61ｍモル）を５分間にわたって注射器を通して滴下し、そしてその得られる混合物を10分間、撹拌する。ニトロアリールメチルアルコールを、ジクロロメタン20mlに溶解し、そしてすべてを一度に反応混合物に添加する。混合物を10分間撹拌し、そして−20℃に冷却する。ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液（3.5ml、11ｍモル）を添加し、そして浴を室温に暖める。酢酸エチル（100ml ）を添加し、そしてその混合物を濾過する。濾液を５％クエン酸（250ml）により洗浄し、そして最後に水（250ml）により洗浄し、続いて乾燥し（MgSO₄）、そして濃縮する。残留物をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー処理により精製する。Ａ．（５−ニトロ−２−チオフェニル）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ ′−テトラキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート（１）残留物をクロマトグラフィー処理し（１：19のアセトン：ジクロロメタン）、カッ色固体として１（52％）を得た。 m.p.44℃；Rf＝0.60． ¹H NMR （CDCl₃）δ 7.82（1H，d，J=3.9），7.05（1H，d，J=3.9），5.23（2H， d，J=7.8），3.68（8H，m），3.41（8H，m）． ³¹P NMR （CDCl₃）δ -8.08（s）．IR （KBr）3105，2963，2879，1541，1504，1446，1341，1220，1149，1129，102 0，982，920，890，817，762，736，659cm^-1．Ｂ．（５−ニトロ−２−フラニル）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′− テトラキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート（２）残留物をクロマトグラフィー処理し（１：19のアセトン：ジクロロメタン）、カッ色の油状物として２（49％）を得た。 Rf＝0.55 ¹H NMR （CDCL₃）δ 7.29（1H，d，J=3.7），6.68（1H，d，J=3.7），5.10（2H， d，J=9.0），6.50（8H，m），3.45（8H，m）． ³¹P NMR （CDCL₃）δ -7.57（s）．IR （neat）3139，2968，2882，1774，1728，1599，1537，1505，14 56，1400，1354，1245，1230，1150，1132，1090，1020，972，924，895，815， 760，660cm^-1．Ｃ．（１−メチル−５−ニトロ−２−イミダゾリル）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート（３）残留物をクロマトグラフィー処理し（１：19のアセトン：ジクロロメタン）、カッ色油状物として３（73％）を得た。 Rf＝0.38 ¹H NMR （CDCL₃）δ 7.99（1H，s），5.18（2H，d，J=8.2），4.07（3H，s），3. 66（8H，m），3.44（8H，m）． ³¹P NMR （CDCl₃）δ -7.69（s）．IR （KBr）2970，1536，1477，1383，1361，1350，1272，1245，1226，1196，125 0，1198，1152，1134，1090，1028，984，926，894，865，832，750cm^-1．Ｄ．（Ｎ−メチル−４−ニトロ−２−ピロロ）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ ′，Ｎ′−テトラキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート（４）残留物をクロマトグラフィー処理し（１：19のアセトン：ジクロロメタン）、そして再クロマトグラフィー処理し（１：３の酢酸エチル：ヘキサン）、カッ色油状物として４（55％）を得る。 Rf＝0.50． ¹H NMR （CDCL₃）δ 7.55（1H，d，J=1.8），6.82（1H，d，J=1.8）5.02（2H，d ，J=7.7），3.76（3H，s），3.62（8H，m），3.40（8H，m）． ³¹P NMR （CDCl₃）δ -8.28．IR （neat）3110，2960，2860，1718，1607，1528，1490，1435，1410，1341，13 02，1272，1232，1211，1145，1122，1096，1083，99 8，971，945，915，887，842，820，790，768，752，718，653cm^-1．例２．（５−ニトロ−２−チオフェニル）メチル−Ｎ，Ｎ−ビス（ブロモエチル）ホスホルアミデート（６）無水THF（20ml）中、５−ニトロ−２−ヒドロキシメチルチオフェン（10ｍモル）の溶液を、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（THF中１Ｍの溶液11m l、11ｍモル）の溶液に−78℃で添加した。その溶液を５分間撹拌し、そして無水THF（24ml）中、ビス（２−ブロモエチル）ホスホルアミドジクロリド（12ｍモル）の溶液をゆっくりと添加した。次に、その混合物を−78℃で２時間撹拌し、そして次に、−20℃に暖めた。無水アンモニアガスを、反応混合物に10分間通し、その混合物を室温に暖め、そして過剰のアンモニアを１ＮのHClにより中和した。その得られる混合物を、酢酸エチル（３×40ml）により抽出し、そして組合された抽出物を乾燥せしめ（MgSO₄）、濾過し、そして真空下で蒸発した。残留物を、溶離剤として１：20のメタノール：酢酸エチルを用いて、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー処理し、6.4ｍモルの６を得（64％）； ¹H NMR （CDCl₃）δ 7.83（1H，d），7.03（1H，d），5.20（2H，m），3.51（8H，m）， 2.89（2H，bs）； ³¹P NMR（CDCl₃）δ -9.06（s）．例３．（５−ニトロ−２−チオフェニル）メチル−Ｎ，Ｎ−ビス（クロロエチル）ホスホルアミデート（７）を、上記（６）のようにして調製した。但し、ビス（２−クロロエチル）ホスホルアミドジクロリドを、ビス（２−ブロモエチル）ホスホルアミドジクロリドの代わりに用い、46％の収率で７を得： ¹H NMR（CDCl₃ ）δ 7.91（1H，d），7.03（1H，d），5.18（2H，t），3.70（4H，m），3.44（ 4H，m），2.91（2H，bs）； ³¹P NMR（CDCl₃）δ -8.52（s）．例４．（５−ニトロ−２−フリル）メチル−Ｎ，Ｎ−ビス（クロロエチル）ホスホルアミデート（８）を、上記（６）のようにして調製した。但し、５−ニトロ−２−ヒドロキシメチルフランを、５−ニトロ−２−ヒドロキシメチルチオフェンの代わりに用い、そしてビス（２−クロロエチル）ホスホルアミドジクロリドを、ビス（２−ブロモエチル）ホスホルアミドジクロリドの代わりに用い：¹H-NMR（CDCl₃）：δ 7.26（1H，d），6.64（1H，d），5.07（1H，s），5.04（1H，s），3.67（4H，m），3.5（4H，m），3.03（2H，bs）；³¹P-NMR（C DCl₃）：δ -2.17（s）．例５．（５−ニトロ−２−フリル）メチルＮ，Ｎ−ビス（ブロモエチル）ホスホルアミデート（９）を、上記のようにして調製した。但し、５−ニトロ−２−ヒドロキシメチルフランを、５−ニトロ−２−ヒドロキシメチルチオフェンの代わりに用い、5.6ｍモルの９（56％）を得る； ¹H NMR（CDCl₃）δ 7.29（1H，d）， 6.66（1H，d），5.06（2H，d），3.51（8H，m），2.83（2H，bs）； ³¹P NMR（CD Cl₃）δ -8.63（s）．例６．ホスホルアミデートの細胞毒性Ａ．Ｂ16骨髄腫細胞に対する細胞毒性の評価のための手段指数増殖でのＢ16骨髄腫細胞（血清フリーMEM媒体10mlにおいて２〜３×10⁶個の細胞）を、薬物により２時間処理した。その細胞を分離し、洗浄し、そして10 ％ウシ胎児血清により補充されたMEM媒体に再懸濁した。細胞を、50〜50,000個の細胞／プレートの密度で60−mmの培養皿に配置し（使用される薬物濃度に依存する）、そして次に、CO₂インキュベーターにおいて37℃で８日間インキュベートした。コロニーを固定し、そしてエタノール中、0.5％結晶バイオレットにより染色し、そして計数した。生存画分の対数を、薬物濃度に対してプロットし、そしてこのプロットから、１％の対照（LC₉₉）にコロニー数を減じるのに必要とされる濃度を決定した。本発明の代表的な化合物に対するこの試験の結果を表２に示した。Ｂ．ヒト腸癌HT29細胞に対する好気性及び低酸素性選択性の評価のための手段 HT29ヒト腸癌細胞を、10％ウシ胎児血清及び25mMのHEPES緩衝液により補充されたα−MEM培地において指数増殖で維持し、そして37℃及び３％CO₂で培養した。薬物処置に関しては、10mlの培地における１〜２×10⁶個の細胞を、ガラス反応バイアルに移した。低酸素性実験に関しては、培地を、95％窒素／５％CO₂により３時間、まずガス供給し、100ppm以下の酸素の分圧を達成した。次に、それらの細胞懸濁液を、反応バイアルにおいて４時間、好気性又は低酸素性条件下のいづれかの条件下で異なった濃度で薬物により処理した。培地を除去し、細胞を洗浄し、そしてコロニー形成アッセイを、Chu and Fischer，Biochem．Pharmaco l., 17，753〜767（1968）の軟質寒天コロニ形成アッセイを用いて行なった。典型的には、指数増殖にあり、そして6.5mlのFischer'sの培地（Gibco Lab.，Gran d Island，NY）に懸濁されたHT29細胞（２〜３×10⁶個の細胞／ml）を、１mlに等数の細胞を含む６種のグループ（１つは対照及び５つは処理されたグループ）に分けた。次に、それらの細胞を、培地により希釈された種々の量の薬物により処理し、10mlの合計体積を付与し、そして37℃で４時間インキュベートした。細胞を、遠心分離（800×ｇ）により、補充されたFischer's培地（10％馬血清を含む）３mlにより３度洗浄し、吸入により培地を除去し、そして培地（５ml）にそのペレットを再懸濁した。１ml部分を用いて、Coalterカウンターにより細胞計数を決定した。残りから、細胞の懸濁液５mlを10⁵個の細胞／mlの密度で調製し、そして10²〜10⁵個の細胞を、軟質寒天に配置し、そして37℃でインキュベートした。Ｃ．親（／Ｏ）及びシクロホスファミド−耐性（／CP）MCF−７ヒト乳癌細胞に対する細胞毒性の評価のための手段 MCF−７ヒト乳癌細胞を、10％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン及びpen／strep 抗生物質により補充されたダルベッコMEM培地において37℃で及び５％CO₂の存在下で単層として増殖した。指数増殖での親MCF−７細胞又はクローン化されたシクロホスファミド−耐性サブラインを、種々の濃度の薬物により処理した。血清フリー培地における薬物又はビークルへの２時間の暴露の後、細胞を血清フリー培地により３度洗浄し、そしてコロニー形成のために３倍希釈で５個一組のうちの１つにプレートした。13日後、コロニーを結晶バイオレットによる染色により可視化し、そして少なくとも50個の細胞のコロニーを計数した。生存画分の対数を、薬物濃度に対してプロットし、そしてこのプロットから、１％の対照（LC₉₉ ）にコロニー数を減じるのに必要とされる濃度を決定した。本発明の代表的な化合物に対するこの試験の結果を、表２に示した。Ｄ．結果本明細書におけるすべての出版物、特許及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれている。多くの変更及び修飾が、本願発明の請求の範囲内で行なわれ得ることは当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/675 8314−4ＣＡ６１Ｋ 31/675

Claims

【特許請求の範囲】１．下記式：〔式中、Ｒ¹及びＲ²は独立して、ハロゲンにより置換された（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリールオキシ、シアノ、（Ｃ₁− Ｃ₄）アルコキシカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルスルホニル、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリールスルホニル、（Ｃ₁−Ｃ₄）ペルフルオロアルキルスルホニル、（Ｃ₁− Ｃ₄）アルキルスルフィニル、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリールスルフィニルであり、又はＲ¹及びＲ²がＮと一緒に取られる場合、モルホリノ環であり；Ｒ³及びＲ⁴はＲ¹ 及びＲ²と同じであるか又はそれぞれＨであり；そしてArは窒素−、硫黄−又は酸素−含有複素芳香族環であり、ここで窒素は置換されていなくても又は（Ｃ₁ −Ｃ₄）アルキルにより置換されていても良い〕で表わされる化合物。２．前記Ｒ¹及びＲ²がハロゲンにより置換されている（Ｃ₂−Ｃ₄）アルキルである請求の範囲第１項記載の化合物。３．前記Ｒ³及びＲ⁴がハロゲンにより置換されている（Ｃ₂−Ｃ₄）アルキル又はＨである請求の範囲第１又は２項記載の化合物。４．前記Arが、１〜３個のＮ，Ｓ又は非−ペルオキシドＯをその環に含む５− 又は６−員の複素芳香族環である請求の範囲第１項記載の化合物。５．前記ArNO₂が５−ニトロ−２−チオフェニル、５−ニトロ− ２−フラニル、１−メチル−５−ニトロ−２−イミダゾリル又はＮ−メチル−４ −ニトロ−２−ピロロである請求の範囲第４項記載の化合物。６．前記Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁴が同じである請求の範囲第５項記載の化合物。７．前記Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁴が２−ハロエチルである請求の範囲第６項記載の化合物。８．前記Ｒ¹及びＲ²が２−ハロエチルであり、そしてＲ³及びＲ⁴がＨである請求の範囲第５項記載の化合物。９．（５−ニトロ−２−チオフェニル）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトテキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート。 10．（５−ニトロ−２−フラニル）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート。 11．（１−メチル−５−ニトロ−２−イミダゾリル）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート。 12．（Ｎ−メチル−４−ニトロ−２−ピロロ）メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′− テトラキス（２−クロロエチル）ホスホルアミデート。 13．医薬的に許容できるビークルと共に、請求の範囲第１又は４項記載の化合物の細胞毒性有効量を含んで成る医薬単位投与形。 14．前記ビークルが液体である請求の範囲第13項記載の単位投与形。 15．前記単位投与形が非経口投与のために適合された溶液又は分散液である請求の範囲第14項記載の単位投与形。 16．前記単位投与形が錠剤又はカプセルである請求の範囲第13項記載の単位投与形。