JPH08508645A

JPH08508645A - アンチセンスポリリボヌクレオチドをコードする遺伝子の標的を定めた送達

Info

Publication number: JPH08508645A
Application number: JP6522433A
Authority: JP
Inventors: シー．キオウ，ヘンリー; エフ．イナイモ，スティーブン; ワイ．ウー，ジョージ
Original assignee: ユニバーシティオブコネティカット; ターゲテック，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-04-05
Filing date: 1994-04-04
Publication date: 1996-09-17
Also published as: AU686614B2; WO1994023050A1; CA2159916A1; AU6497894A; EP0693130A1

Abstract

(57)【要約】イン・ビボで、特定の細胞をアンチセンスポリリボヌクレオチドをコードする遺伝子の標的とし、標的細胞内でのポリリボヌクレオチドの産生を得、且つ細胞性若しくは非細胞性の遺伝子の発現の特異的な阻害を達成するための分子複合体を開示する。所望のアンチセンスポリリボヌクレオチドをコードする発現可能な遺伝子を、細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤の結合体と複合体化する。細胞特異的結合剤は、エンドサイトーシスによるリガンドの内在化を媒介する細胞表面構造に特異的である。一例は、肝細胞のアシアロ糖蛋白質レセプターである。遺伝子結合剤は、細胞外条件下で遺伝子と安定に複合体形成し且つ細胞内条件下で遺伝子をそれが細胞内で機能的であり得るように放出するポリカチオン等の化合物である。この分子複合体は、生理学的液体中で安定であり且つ可溶性であって、アンチセンス遺伝子治療において用いて、イン・ビボ又はイン・ビトロで細胞を選択的にトランスフェクトして標的細胞内でのアンチセンスリボヌクレオチドの産生及び細胞性若しくは非細胞性遺伝子の発現の阻害を与えることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】アンチセンスポリリボヌクレオチドをコードする遺伝子の標的を定めた送達発明の背景アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞における望ましくない遺伝子発現を特異的に阻止する手段である。それらを用いてＲＮＡにハイブリダイズさせてその機能を阻害することが出来、典型的には、メッセンジャーＲＮＡの機能をリボソーム又は他の蛋白質の結合を物理的にブロックすることにより阻害し、それにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。アンチセンスポリヌクレオチドは又、触媒活性を有するＲＮＡ（リボザイム）をも含み、これは、標的ＲＮＡ上の相補的配列に選択的に結合し、開裂反応を媒介することにより標的を物理的に破壊する。アンチセンスポリヌクレオチドは、小さい化学合成したＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチドであってよく、又はもっと大きいＲＮＡ例えばアンチセンス遺伝子の転写によりイン・ビトロ若しくはイン・ビボで生合成により生成したｍＲＮＡであってよい。各遺伝子のコピーからＲＮＡの数百のコピーを生成することが出来るので、細胞中のアンチセンス遺伝子の少数の分子は、細胞中への多数のアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入と同等の効果を達成する。典型的ｍＲＮＡの５０〜３００倍大きいサイズは、アンチセンスｍＲＮＡが、オリゴヌクレオチドと比べて一層大きい親和性及び特異性をもって結合することを可能にする。更に、オリゴヌクレオチドと異なり、プラスミッドに運ばれる遺伝子は、多様な補足ＤＮＡ配列を取り込んでアンチセンスポリリボヌクレオチドの発現を増大し又は調節することが出来る。例えば、プラスミッドのエピソーム式の複製を指示するオリジン配列及び／又は高レベルの発現を長期間にわたって維持するエンハンサー配列の含有は、アンチセンスポリリボヌクレオチドの長期間の産生を可能にする。この戦略は、細胞遺伝子の構成的発現を阻止し又は慢性病を治療するために特に適している。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて同様の効果を達成するためには、恐らく、連続的若しくは反復する静脈投与又は高度に安定なアンチセンス構築物が必要とされるであろう。発明の要約この発明は、イン・ビボ若しくはイン・ビトロで特定の細胞をＲＮＡ転写物をコードする遺伝子の標的とし且つその標的細胞内でそのＲＮＡの生成を得るための可溶性分子複合体に関するものである。この分子複合体は、所望のポリリボヌクレオチドをコードする発現可能な遺伝子を、細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤との結合体であるキャリアーと複合体化して含む。アンチセンス応用において、送達された遺伝子から転写されたＲＮＡを用いて細胞内に含まれるＲＮＡにハイブリダイズさせてその機能を阻害することが出来る。標的ＲＮＡは、典型的には、メッセンジャーＲＮＡである。送達された遺伝子から転写されたＲＮＡは又、触媒活性を有するＲＮＡ（リボザイム）であってもよく、これは選択的に標的ＲＮＡを破壊することが出来る。アンチセンス若しくはリボザイム媒介の阻害の標的は、細胞起源の遺伝子（例えば、細胞性オンコジーン）又は非細胞起源の遺伝子（例えば、ウイルス性オンコジーン又は感染性病原体例えばウイルス若しくは寄生虫例えばマラリア、トリパノゾーマ属住血鞭毛虫、リステリア若しくはマイコプラズマの遺伝子）であってよい。細胞特異的結合剤は、細胞表面構造に特異的であり、典型的には、結合したリガンドのエンドサイトーシスによる内在化を媒介するレセプター例えば肝細胞のアシアロ糖蛋白質レセプターに特異的である。細胞特異的結合剤は、天然若しくは合成のリガンド（例えば、蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質）であってよく、又は結合した複合体の内在化を次いで媒介する細胞表面構造に特異的に結合する抗体若しくはそのアナログであってよい。この結合体の遺伝子結合成分は、細胞外条件下で遺伝子と安定に複合体を形成し且つ細胞内条件下でその遺伝子をそれが細胞内で機能し得るように遊離するポリカチオン等の化合物である。この遺伝子とキャリアーとの複合体は安定であり、且つこのキャリアーは生理学的液体中で安定且つ可溶性である。それは、イン・ビボ投与することが出来、表面構造媒介のエンドサイトーシス経路により標的細胞によって選択的に取り込まれる。取り込まれた遺伝子は、トランスフェクトされた細胞内で発現され、遺伝子にコードされた生成物が蓄積する。この発明の可溶性分子複合体を用いてイン・ビボ若しくはイン・ビトロで細胞を特異的にトランスフェクトして所望の生成物の合成を与えることが出来る。この選択的トランスフェクションは、アンチセンス遺伝子治療及び細胞性若しくは外来性遺伝子の発現を阻害するために細胞の選択的な遺伝的変化を必要とする他の応用に有用である。送達された遺伝子から生成されたＲＮＡ転写物は、相補的ＲＮＡとハイブリダイズして、立体障害若しくは物理的開裂によってその機能を阻害し、それにより、標的遺伝子の発現をブロックする。図面の簡単な説明図１は、Ｂ型肝炎表面抗原（ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ１）に対するアンチセンスＲＮＡをコードするプラスミッド及び肝炎コア抗原遺伝子並びにＤＲＩ及びポリアデニル化部位に対するアンチセンスＲＮＡをコードするプラスミッドの構築の図式表示である。図２は、２１量体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及びアンチセンスｍＲＮＡ生成プラスミッドｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ１（アンチＣ）により媒介されたＨＢｓＡｇの減少を示している。発明の詳細な説明可溶性の、標的を定めることの出来る分子複合体を用いてポリリボヌクレオチドをコードする遺伝子を標的細胞又は組織にイン・ビボ又はイン・ビトロで選択的に送達する。この分子複合体は、標的細胞に特異的な結合剤と標的細胞に特異的な遺伝子結合剤とから作成されたキャリアーと複合体化した送達すべき遺伝子及び遺伝子結合剤を含む。この複合体は、標的細胞により選択的に取り込まれ、そこでポリリホヌクレオチドが生成される。この遺伝子（通常、ＤＮＡ形態）は、所望のポリリボヌクレオチドをコードする。典型的には、この遺伝子は、標的細胞による転写及び転写後プロセッシングに適した形態でポリリボヌクレオチドをコードする配列を含む。例えば、この遺伝子を、細胞性ＲＮＡポリメラーセによる遺伝子の転写及び細胞性蛋白質による一次ＲＮＡ転写物の安定な形態のＲＮＡ例えばｍＲＮＡへのプロセッシングに必要な適当な遺伝的制御要素に結合する。これらは、標的細胞内で操作可能なプロモーター及びエンハンサー要素並びに他の要素例えばポリアデニル化シグナル及びスプライシングシグナルを含み、これらはＲＮＡの内部及び３’末端構造を決定する。この遺伝子を、遺伝子の転写に必要な遺伝的制御要素を伴った発現ベクター又は転移遺伝因子等に含ませることが出来る。この複合体のキャリアー成分は、細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤との結合体である。細胞特異的結合剤は、例えばエンドサイトーシス過程によるその内在化を媒介する細胞表面構造に特異的に結合する。この表面構造は、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物、脂質又はこれらの組合せであってよい。それは、典型的には、リガンドのエンドサイトーシスを媒介する表面レセプターである。従って、結合剤は、レセプターに結合する天然又は合成のリガンドであってよい。リガンドは、細胞表面構造により認識されるだけ十分に露出された官能基を有する蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質又は糖ペプチドであってよい。それは又、生物体例えばウイルス、細胞（例えば、噛乳動物、細菌、プロトゾア）又は人工のキャリアー例えばリポソームの成分であってもよい。結合剤は又、細胞表面構造に結合する抗体又は抗体のアナログ例えば一本鎖抗体であってもよい。キャリアーの形成において有用なリガンドは、標的とされる特定の細胞によって変化する。肝細胞を標的とするためには、他のリガンド例えばポリペプチドホルモンを用いることも出来るが、露出した末端炭水化物基を有する糖蛋白質例えばアシアロ糖蛋白質（ガラクトース末端）を利用することが出来る。アシアロ糖蛋白質の例は、アシアロオロソムコイド、アシアロフェチュイン及び脱シアル化した水庖性口内炎ウイルスを含む。かかるリガンドは、末端シアル酸及び終りから２番目のガラクトース残基を有する糖蛋白質の化学的若しくは酵素的脱シアル化により形成することが出来る。或は、ガラクトース末端炭水化物例えばラクトース若しくはアラビノガラクタンを、還元的ラクトサミネーションにより、ガラクトースを有しない蛋白質に結合することにより、アシアロ糖蛋白質リガンドを形成することが出来る。他の細胞表面レセプターをこの分子複合体の標的とするためには、他の型のリガンド例えばマクロファージ用のマンノース（リンパ腫）、繊維芽細胞用のマンノース−６−リン酸糖蛋白質（繊維肉腫）、腸細胞用の内因性因子ビタミンＢ１２若しくは胆汁酸及び脂肪細胞用のインシュリンを用いることが出来る。或は、細胞特異的結合剤は、レセプター又はレセプター様分子例えば細胞表面上のリガンド（例えば、抗原）に結合する抗体であってよい。かかる抗体は、標準的手順により生成することが出来る。この遺伝子結合剤は、送達すべき遺伝子と複合体を形成する。遺伝子との複合体形成は、イン・ビボで、標的細胞による内在化の前の細胞外での遺伝子の有意の分離を阻止するだけ十分に安定でなければならない。しかしながら、この複合体は、細胞内の適当な条件下で開裂可能であり、それにより、遺伝子が機能的形態で放出される。例えば、この複合体は、リソソームの酸性且つ酵素に富む環境において不安定であってよい。遺伝子結合剤と発現可能な遺伝子の間の静電引力に基づく非共有結合は、細胞外での安定性を与え且つ細胞内条件下では遊離可能である。好適な遺伝子結合剤は、負に帯電したポリヌクレオチドと結合するポリカチオンである。これらの正に帯電した物質は、遺伝子と非共有結合で結合して、可溶性の、細胞内では安定であるが細胞外では遊離し得る標的を定め得る分子複合体を形成することが出来る。適当なポリカチオンは、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、塩基性蛋白質例えばヒストン、アビジン、プロタミン等である。好適ポリカチオンは、ポリリジン（例えば、３，８００〜６０，０００ダルトン）である。発現可能な遺伝子と遊離可能に結合するのに利用することの出来る他の非共有結合は、水素結合、疎水結合、静電結合を単独で又は組合せて含む（例えば、ポリヌクレオチドに結合した抗ヌクレオチド抗体、及びビオチン化ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに結合するアビジン）。キャリアーは、細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤とを化学的に結合することによって形成することが出来る。この結合は、典型的には、共有結合である。好適結合は、ペプチド結合である。これは、Jung,G等、（1981）Biochem.Biophys.Re s.Commun .101:599-606により記載されたように、水溶性カルボジイミドを用いて形成することが出来る。他の結合は、ジスルフィド結合である。結合反応は、キャリアーを形成するために用いる特定の細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤について最適化することが出来る。反応条件をデザインして結合形成を最大にし且つキャリアー成分の凝集形成を最小化することが出来る。細胞特異的結合剤の遺伝子結合剤に対する最適比は、経験的に決定することが出来る。ポリカチオンを用いた場合、これらの成分のモル比は、ポリカチオンのサイズ及び遺伝子結合剤のサイズにより変動する。一般に、この比は、約１０：１〜１：１に及ぶ（好ましくは、約５：１）。未結合の化合物及び凝集物は、分子ふるい又はイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Aquapre（商標）カチオン交換、Rai nin）によりキャリアーから分離することが出来る。一具体例において、アシアロオロソムコイドポリリジン結合体を架橋剤１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを用いて形成する。透析後、結合体を、調製用酸尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐＨ４〜５）により未結合化合物から分離する。この結合体を、更に、カルボキシメチル官能化カラム（Waters AP-1 カラム）にて精製することが出来る。１９９２年４月５日に出願した米国特許出願第０８／０４３，００８号を参照されたい（その教示を参考として本明細書中に援用する）。アンチセンス構築物をコードする遺伝子を段階的透析手順によってキャリアーと複合体化することが出来る。好適方法において、ポリカチオン例えばポリリジンで作成したキャリアーを用いる利用のために、透析手順を、２ＭＮａＣｌで透析物にて開始し、０．１５ＭＮａＣｌ溶液にて終了する。徐々に減少するＮａＣｌ濃度は、遺伝子のキャリアーへの結合を生じる。幾つかの場合特に遺伝子及びキャリアーの濃度が低いときには、透析は必要ないであろう；遺伝子とキャリアーを単純に混合してインキュベートする。この分子複合体は１コピーより多くの同一遺伝子又は１種以上の異なる遺伝子を含むことが出来る。好ましくは、遺伝子のキャリアーに対する重量比は、約１：５〜５：１、好ましくは約１：２（モル比約１：１００〜１：２００）である。特定のポリヌクレオチド及びキャリアーに対する適当な比は、米国特許第５，１６６，３２０号に記載のゲル遅延により決定することが出来る。この発明の分子複合体は、非経口投与することが出来る。好ましくは、それを静脈注射する。この複合体を、生理的に許容し得るビヒクルで溶液にて投与する。ポリリボヌクレオチドの一過的産生のために、細胞をイン・ビボでトランスフェクトすることが出来る。長期的産生のために、遺伝子を繰り返し投与することが出来る。或は、トランスフェクトした標的細胞を外科的若しくは薬理学的方法により複製するように刺激して、取り込んだ遺伝子の活性を長引かせることが出来る。例えば、１９９０年９月２５日に出願された米国特許出願第５８８，０１３号を参照されたい（その教示を参考として本明細書中に援用する）。エンドソームのリソソームへの移動若しくは融合を混乱させる薬剤例えばコルヒチン又はタキソールを用いて発現を長引かせることが出来る。１９９２年９月２４日に出願された米国特許出願第９５０，７８９号を参照されたい（その教示を参考として本明細書中に援用する）。遺伝子の送達を、キャリアーをウイルス例えばアデノウイルスに結合することによって増大させることが出来る。１９９２年９月２４日に出願された米国特許出願第９５０，４５３号を参照されたい（その教示を参考として本明細書中に援用する）。特定の細胞性若しくは外来の遺伝子の発現を阻止することが必要なアンチセンス遺伝子治療又は他の応用のために、この発明の方法を用いて、イン・ビボで遺伝子を標的細胞に選択的に送達することが出来る。送達された遺伝子から生成されたＲＮＡ転写物は、その相補的ＲＮＡとハイブリダイズして、立体障害により又は物理的間裂によってその機能を阻害し、それにより、標的遺伝子の発現をブロックする。例えば、特定の細胞を遺伝子の標的として、細胞性若しくはウイルス性オンコジーンの過剰発現により引き起こされる遺伝的異常を軽減することが出来る。更に、この方法を用いて、異常遺伝子産物が正常蛋白質を妨げる負の優性遺伝病を治療することが出来る。例えば、この方法を用いてマルファン症候群において産生された異常フィブリリン又はＩ型骨形成不全症において産生された異常コラーゲンに対するアンチセンス若しくはリボザイムを送達することが出来る。この方法を用いて、感染性病原体例えばウイルス（肝炎、ＨＩＶ）又は寄生虫例えばマラリア、トリパノゾーマ属住血鞭毛虫、リステリア若しくはマイコプラズマの遺伝子の発現を阻害することも出来る。例えば、肝炎遺伝子例えば１種以上の表面又はコア抗原をコードする遺伝子を発現ベクター中に逆向に集めて対応する遺伝子の転写をブロックするアンチセンス転写物を生成することが出来る。この発明の分子複合体は、広範囲の遺伝子を特定の細胞又は組織に送達するために適合し得る。好適具体例において、レセプター媒介のエンドサイトーシス過程による肝細胞のイン・ビホでのトランスフェクションを可能にする肝臓のアシアロ糖蛋白質レセプター系を利用することによって肝臓をこの複合体の標的とする。この発明の方法を用いて、肝細胞のウイルス感染を治療することが出来る。これは、任意の肝臓特異的な肝炎ウイルスによる感染を含む。ヒトのＢ型肝炎ウイルスによる感染は、しばしば、慢性の持続的感染を生じる。この型のウイルス感染は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療と比較してアンチセンス遺伝子治療によって一層適当に治療される。Ｂ型肝炎ウイルスゲノムは非常に小さく、広範囲で重複する３つのＲＮＡ転写物しかコードしていないので、アンチセンス遺伝子を工作して、すべてのウイルス性転写物に共通する１つ以上の大型領域にハイブリダイズし得るＲＮＡをコードするようにすることが出来る。好適具体例において、複合体を用いて、ブラスミッドが運ぶアンチセンス遺伝子を慢性的に感染した肝細胞に特異的に送達してＢ型肝炎ウイルスの産生をブロックすることが出来る。この遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルスにより産生されるすべてのＲＮＡにハイブリダイズしてすべてのウイルス性ポリペプチドの産生を阻害するアンチセンスＲＮＡ転写物の産生をコードすることが出来る。その結果生成した可溶性複合体を、非経口で、ウイルスに苦しめられている個人の標的肝細胞に、選択的に細胞をトランスフェクトし且つウイルス産生の阻害を達成するのに十分なアンチセンスＲＮＡの産生を与えるのに十分な量で投与する。この発明を下記の実施例により更に説明する。実施例材料と方法プラスミッドＤＮＡ構築９．４ＫｂのプラスミッドｐＡｄｗ−ＨＴＤは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムの２つのベッドトゥーテール（head-to-tail）コピーを含み、T.J.Liang （マサチューセッツ、Boston 在、Mas sachusetts General Hospital）により提供された。ｐＪ３Ω１．０ＨＴＤ１若しくは「アンチＳ」と呼ばれる第１の構築物を、先ずｐＡｄｗ−ＨＴＤを制限エンドヌクレアーセＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、その後、１０４４ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動及びガラスビーズ抽出（Geneclean II（登録商標）カリフォルニア、Lajolla在、Bio101）により単離することによって作成した。この断片は、プレ−Ｓ２シグナルペプチド遺伝子及び完全な表面抗原遺伝子の大部分に及ぶが、表面抗原プロモーター領域には及ばない。このＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片を、次いで、発現ベクターｐＪ３Ω（ＡＴＣＣ，３７７１９，Nuc．Acids Res .18 :1068，1990）のポリリンカー領域内のＥｃｏＲＩ及びＳｍａ１部位中に、ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動された転写がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の１Ｋｂのアンチセンスを生成し、次いで、それが、ＨＢＶプレゲノムｍＲＮＡ中の相補的配列に結合してＨＢＶ表面抗原の翻訳を阻害し、それにより、ウイルスの組み立てが混乱されるような仕方でライゲートした（図１参照）。ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３又は「アンチＣ」と呼ばれる第２の構築物をデザインして、プレコア及びコア抗原をコードするＨＢＶのプレゲノムｍＲＮＡ中の領域に相補的な０．８ＫｂのアンチセンスｍＲＮＡを生成した。コア抗原は、表面抗原と同様に、ウイルスパッケージングに必須であるコート蛋白質である。ＤＲ１と表示される１１ｂｐの直列反復配列（これはウイルスＤＮＡの合成の開始に決定的に関与している）並びにすべてのＨＢＶＲＮＡ種の共通３ ’末端を特定するユニークな開裂／ポリアデニル化シグナルも又アンチＣ断片中に含まれる（Ganem及びVarmus（1987）Ann.Rev.Biochem.56:651-693）。結果として、この領域から転写されたアンチセンスｍＲＮＡは、すべてのウイルス性蛋白質合成並びに複製をブロックする。ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３を構築するために、ｐＡｄｗ−ＨＴＤを制限エンドヌクレアーゼＦｓｐ１及びＡｐａ１で開裂して８０２ｂｐの断片を生成し、それをアガロースゲル電気泳動により分離してGene clean II（登録商標）を用いて単離した。このアンチＣ断片を、クローニングベクターｐＧＥＭ−７ｚｆ（＋）（ウィスコンシン、Madison 在、Promega）のポリリンカー領域内のＡｐａ１／Ｓｍａ１部位中にライゲートした。次いで、アンチＣ断片を、ｐＪ３Ωベクターのポリリンカー領域内のＣｌａ１及びＳｍａ１部位中にサブクローン化した。これを達成するために、ｐＧＥＭクローンを先ずＡｐａ１で切り、ＤＮＡポリメラーゼＩの大型クレノー断片を２００ｍＭｄＮＴＰ混合物と共に加えることにより平滑端化した。Ａｐａ１末端の平滑化の後に、Ｃｌａ１で消化して８１８ｂｐ断片を生成し、これを、次いで、ｐＪ３Ω発現ベクター中にライゲートした（図１）。コンピテントなＤＨ５α大腸菌（Gibco BRL）を、これらの構築物を用いて、標準的プロトコール（Sambrook等（1989）Molecular Cloning-A Laboratory Man ual ,Cold Spring Harbor Laboratory,第二版）に従ってトランスフォームした。プラスミッドＤＮＡの大規模な調製を標準的手順に従って行なった。細胞及び細胞培養ヒト肝癌、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（ニューヨーク、Bronx在、Albert Einstein C ollege of MedicineのGeorge Acs博士の提供）を、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清を補った最少必須培地（ＭＥＭ）中に維持し、成長させた。ＨｅｐＧ２．２．１５は、ＨＢＶゲノムを含むプラスミッドでトランスフォームしたＨｅｐＧ２細胞から誘導したクローン化細胞である。それは、Ｂ型肝炎表面抗原粒子、ヌクレオキャプシド及びビリオンを構成的に産生し且つ分泌する（Acs等（1987） Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 84:4641-4644）。標的を定め得るアンチセンスｍＲＮＡ生成プラスミッド及びオリゴヌクレオチドＤＮＡの調製ポリアデニル化シグナルをコードするヒトＢ型肝炎ウイルス（ａｙｗサブ型）ゲノム中の領域に相補的なアンチセンスプラスミッドｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３及び合成の２１量体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（カリフォルニア、San Diego 在、Synthetic Genetics ）を、可溶性複合体を形成するためのアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）ポリリジン結合体を用いて、Wu及びWu（1987）J.Biol.Chem.262:4429-4432；米国特許第５，１６６，３２０号に記載されたように、アガロースゲル遅延アッセイを用いて滴定した。これらの実験のために、ＤＮＡの完全な遅延を与える０．８：１（ＡＳＯＲポリリジン結合体：ＤＮＡ）の重量比を選択してアンチセンスプラスミッドＤＮＡ複合体を調製するのに利用したが、他方、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体の調製用には１．６：１の重量比を選択した。レセプター媒介エンドサイトーシスを介して細胞に送達されたアンチセンスプラスミッド及びオリゴヌクレオチド活性の測定アンチＣ構築物により転写されたアンチセンスｍＲＮＡのウイルス性遺伝子発現に対する効果を測定するために、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、使用の２４時間前に３．５×１０６／６０ｍｍディッシュにて接種した。トランスフェクションに先立って、すべての細胞を１００μＭクロロキンで１時間処理し、その後、リン酸緩衝塩溶液で３回洗った。次いで、細胞に、１００μｇのアンチセンスプラスミッド（複合体中）又は６９０μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド（複合体中）を含む新鮮なＭＥＭ（Ｃａ⁺⁺濃度を２ｍＭに増加するのに十分な塩化カルシウムを加えたもの）をかぶせ、その後、３７℃で５％ＣＯ₂にてインキュベートした（Wu及びWu （1988）Biochemistry 27:887-892のプロトコールを僅かに改変した変法）。対照として、幾つかの細胞をトランスフェクトせずに残し、１００μｇのアンチセンスプラスミッドＤＮＡ単独でトランスフェクトし又は６９０μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド単独でトランスフェクトした。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）レベルの基線を決定するために、各プレートから取り出した５０ μｌの試料についてＥＬＩＳＡ（Abbott）アッセイを行ない、製造者により記載された手順に従ってアッセイした。引き続き、培地の５０μｌの試料を６日毎に各ディッシュから取り出し、ＨＢｓＡｇについて処理した。結果ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３を、プラスミッドのＨＢｓＡｇ産生を阻害する能力を試験するために、アシアロ糖蛋白質レセプター媒介のエンドサイトーシスによりＨｅｐＧ２．２．１５細胞中に導入した。比較対照として、幾つかの細胞をユニークなＨＢＶポリアデニル化シグナル配列に対するアンチセンス２１量体オリゴデオキシヌクレオチドでも処理した。このオリゴデオキシヌクレオチドは、Wu及びWu（1992）J.Biol.Chem.267:12436-12439によりＨｅｐＧ２．２．１５ＨＢｓＡｇの発現を阻害するために使用されたものと同じものであった。未処理の細胞と比較して、ＨＢｓＡｇの発現における有意の減少が、ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３ポリリジンＡＳＯＲ複合体又はアンチセンスオリゴポリリジンＡＳＯＲ複合体の何れかを受けた細胞において認められた（図２）。両方の場合において、この阻害は、少なくとも６日間にわたって持続した。プラスミッド又はオリゴデオキシヌクレオチド単独で処理した細胞においてはＨＢｓＡｇの減少は見られず、これは、ＡＳＯＲポリリジン結合体がこれらのＤＮＡをそれらの細胞内作用部位へ送達するために必要であることを示唆している。別の実験において、ｐＪ３Ω１．０ＨＴＤ１複合体で処理した細胞は、ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３複合体で処理した細胞と比較してＨＢｓＡｇレベルの同様の減少を示した（データは示さない）。図２に示したように、ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３は、阻害のレベル並びにその遅延の両方に関して、表面抗原の発現を阻害することにおいてアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に有効であった。しかしながら、細胞に加えたプラスミッドの全量は、アンチＨＢＶオリゴヌクレオチドの全量より約７倍少ない。モルベースで計算して、ｐＪ３Ω０．８ＨＴＤ３の各分子は、ＨＢｓＡｇの発現の阻害において、およそ１４００分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相当した。我々は、これは、一度細胞中に送達された場合にアンチセンス転写物の多数のコピーを生成するプラスミッドの能力によるものであったと予想する。安定性、作用部位、細胞内保持における差異、又は各型のＤＮＡで作成した複合体の特性の差異がこの効果に寄与したということもあり得る。これは、オリゴヌクレオチドと比較して、プラスミッドベースのアンチセンス系の潜在的利点を説明する。治療投与量を達成するために、一層少量のＤＮＡを標的細胞に送達すればよい。更に、プラスミッドは、そのＲＮＡの発現に対する又はそれに影響を与えるシス作用配列例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、複製のオリジン等を含む。特定の環境に対する発現を調整するためにこれらの配列を改変し又は置換することが出来る。例えば、あるとき又はある条件下でのみアンチセンスｍＲＮＡの発現を活性化するために、誘導可能なプロモーターをプラスミッド中に取り込むことが出来る。或は、非常に短期間の一過性阻害を、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域内のコンセンサスＲＮＡ不安定化要素の利用により達成することが出来る。他の可能性は、エピソーム様式にて細胞内で維持し得るプラスミッド中に取り込まれた配列により持続的なアンチセンス媒介の阻害を生成することである。他の多くの特徴も又、プラスミッドベースのアンチセンス系に含まれ、従って、その利用には大きな柔軟性と制御が認められる。同等物当業者は、ここに説明した特定の手順に対する多くの同等物を認識し又は常例的実験によって確認することが出来るであろう。かかる同等物は、この発明の範囲内に入るものと考えられ、後述の請求の範囲によりカバーされるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/00 9359−4ＢＣ１２Ｎ 9/00 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者イナイモ，スティーブンエフ. アメリカ合衆国 06779 コネティカット, オークビル，プレインフィールドドライブ 134 (72)発明者ウー，ジョージワイ. アメリカ合衆国 06001 コネティカット, エイボン，リッジベリーロード 52

Claims

【特許請求の範囲】１．特定の細胞をアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子の標的とするための可溶性分子複合体であって、この複合体が、細胞性ＲＮＡにハイブリダイズしてその機能を阻害するＲＮＡをコードする発現可能な遺伝子を含み、このＲＮＡが細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤とを含むキャリアーと複合体化されている、上記の可溶性分子複合体。２．アンチセンスＲＮＡが、ウイルス性又は細胞性オンコジーンのＲＮＡ転写物に対するものである、請求項１に記載の可溶性複合体。３．アンチセンスＲＮＡが、病原体のＲＮＡ転写物に対するものである、請求項１に記載の可溶性複合体。４．病原体がウイルスである、請求項１に記載の可溶性複合体。５．ウイルスが肝炎ウイルスである、請求項１に記載の可溶性複合体。６．ウイルスがＨＩＶである、請求項１に記載の可溶性複合体。７．アンチセンスが、優性の負の遺伝病に関連する遺伝子に対するものである、請求項１に記載の可溶性複合体。８．アンチセンスＲＮＡがリボザイムである、請求項１に記載の可溶性複合体。９．遺伝子結合剤がポリカチオンである、請求項１に記載の可溶性分子複合体。１０．ポリカチオンがポリリジンである、請求項８に記載の可溶性分子複合体。１１．細胞特異的結合剤がエンドサイトーシスを媒介する細胞表面レセプターに結合する、請求項１に記載の可溶性分子複合体。１２．生理的に許容し得るビヒクル中に請求項１に記載の分子複合体の溶液を含む治療用組成物。１３．肝細胞をアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子の標的とするための可溶性分子複合体であって、この複合体が、肝細胞中で生成されたＲＮＡ転写物に特異的にハイブリダイズし得るアンチセンスＲＮＡをコードする発現可能な遺伝子を、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンド及びポリカチオンのキャリアーと複合体化して含む、上記の可溶性分子複合体。１４．アンチセンスＲＮＡが肝炎ウイルスのＲＮＡ転写物に対するものである、請求項１３に記載の可溶性分子複合体。１５．ポリカチオンがポリリジンである、請求項１３に記載の可溶性分子複合体。１６．遺伝子が肝細胞による遺伝子発現に必要な遺伝的制御要素と共に発現ベクター中に含まれる、請求項１３に記載の可溶性分子複合体。１７．発現ベクターがプラスミッド又はウイルス性ＤＮＡである、請求項１６に記載の可溶性分子複合体。１８．アンチセンスＲＮＡがリボザイムである、請求項１３に記載の可溶性分子複合体。１９．請求項１３に記載の分子複合体の溶液を生理学的ビヒクル中に含む治療用組成物。２０．生物の細胞中のＲＮＡ転写物の翻訳をブロックする方法であって、細胞性ＲＮＡにハイブリダイズしてその機能を阻害するＲＮＡをコードする発現可能な遺伝子を含む可溶性分子複合体を生物に投与することを含み、ＲＮＡが細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤とを含むキャリアーと複合体化している、上記の方法。２１．アンチセンスＲＮＡがウイルス性又は細胞性オンコジーンのＲＮＡ転写物に対するものである、請求項２０に記載の方法。２２．アンチセンスＲＮＡが病原体の転写物に対するものである、請求項２０に記載の方法。２３．病原体が肝炎ウイルスである、請求項２０に記載の方法。２４．遺伝子結合剤がポリカチオンである、請求項２０に記載の方法。２５．ポリカチオンがポリリジンである、請求項２４に記載の方法。２６．細胞特異的結合剤がエンドサイトーシスを媒介する細胞表面レセプターに結合する、請求項２０に記載の方法。２７．リガンドがアシアロ糖蛋白質であり、標的細胞が肝細胞である、請求項２０に記載の方法。２８．アンチセンスＲＮＡがリボザイムである、請求項２０に記載の方法。２９．分子複合体を静脈から投与する、請求項２０に記載の方法。