JPH08507079A

JPH08507079A - ヒトの癌に対するシスプラチン／タモキシフェン併用治療

Info

Publication number: JPH08507079A
Application number: JP6519322A
Authority: JP
Inventors: マクレイ，エドワド，エフ．; ハウエル，スティーヴン，ビー．
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 1996-07-30
Also published as: US6288111B1; SA94140746B1; EP0686038A1; AU6273294A; CA2156826A1; EP0686038A4; IL108722A0; WO1994018990A1; IL108722A; ZA941290B; AU692763B2; KR960700734A; NO953349L; NO953349D0; NZ262825A

Abstract

(57)【要約】本発明は広範なヒトの癌の治療に有用な新しい組成物を提供する。この新しい組成物は相乗作用を有し、細胞毒性があり、プラチナ含有抗腫瘍形成剤とタモキシフェンとによって構成されている。本発明はまた、癌を治療する方法も提供する。つまり、本発明は本発明による新しい医薬品組成物を用いた非黒色腫癌を治療するための新しい方法を提供する。本発明の他の実施例は、シスプラチンなどのプラチナ含有抗腫瘍形成剤に対して発現する抵抗性を低下、または克服する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ヒトの癌に対するシスプラチン／タモキシフェン併用治療発明の背景１．発明の分野本発明は一般的にはヒトの癌の臨床腫瘍学および薬物治療に関するものである。より具体的には、本発明はタモキシフェンとシスプラチンを併用して、シスプラチンに抵抗性のある癌とシスプラチンに抵抗性のない癌とを治療する新しい方法に関するものである。２．関連技術の説明シス−ジアミネジタロロプラチナム（II）（シスプラチン）などのプラチナ配位複合体抗腫瘍形成剤を用いての癌患者の治療は、この10年間かなり普及してきている。シスプラチンは睾丸癌、卵巣癌、および小細胞肺癌など、複数の悪性腫瘍の治療において有益であることが証明されている抗腫瘍形成剤である。その作用機序は現在の段階ではわかっていないが、シスプラチンがＤＮＡと結合して、種々のタイプの、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成の両方に影響を及ぼす可能性のあるストランド間およびストランド内架橋を形成する能力と関係している可能性がある。癌患者は、最終的には、シスプラチンなどのプラチナ配位複合体による治療には抵抗性を示すようになる。患者が転移性の癌で死亡する場合、その転移性病巣の細胞は、通常、単一の化学治療剤、あるいは複数の化学治療剤の組み合わせに対するその極度の抵抗性によって特徴づけられる。一般的に薬物に抵抗性を示す腫瘍は、一過性のものと永続的なものとに分類することができる。シスプラチンに対する抵抗のメカニズムは明らかではないが、薬物蓄積の低下、シスプラチンに結合してそれを不活性化させるメタロチオネインまたはグルタチオンの細胞内濃度の増大、あるいは、シスプラチン−ＤＮＡ内転性形成あるいは回復の低下に関係しているかもしれない。タモキシフェンは女性の乳癌の治療においては広範に用いられている抗エストロゲン剤である。乳癌におけるタモキシフェンの確認されている作用機序は干渉に結びつくエストロゲン受容体とエストロゲンに誘発される細胞成長との対立を通じてである。今日の癌治療における主要な問題のひとつは、癌細胞が化学治療剤に対して抵抗性を形成する能力をもっていることである。これは、患者は初期においてはシスプラチンなどの化学治療剤に対して反応を示すことからも、特に残念なことである。プラチナ配位複合体抗腫瘍形成剤に対する抵抗性の予防、あるいはすでに発現している抵抗性を克服する効率的で効果のある方法がなければ、先行技術は有効性を欠いたままであろう。加えて、先行技術はプラチナ配位複合体抗腫瘍形成剤の細胞毒性効果を発揮させる有効な方法がなければ、先行技術は有効性を欠いたままである。発明の要約本発明はヒトの癌治療用の物質の新規組成物を提供するものである。さらに、本発明はプラチナ化学治療剤に対する抵抗性を低下させ、および／または克服するための新しい方法を提供する。本発明はタモキシフェン（ＴＡＭ）の新しい薬理的効果、つまり、シスプラチン、あるいはシス−ジアミネジクロロプラチナム（ＤＤＰ）に対する、ヒト悪性腫瘍、黒色腫、および卵巣癌の抵抗性の発現を遅らせる能力を示すものである。ＴＡＭが抵抗性の形成の根底にあるプロセスを変えることができることは、これまで実証されていない。本発明の１実施例において、非黒色腫癌を治療するための、プラチナ抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンによって構成されており、そのプラチナ抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンが非黒色腫癌に対して相乗的な抗腫瘍形成効果を発揮することを特徴とする組成物が提供される。本発明の別の実施例においては、非黒色腫癌を有する個人に対して薬理的に有効な量のプラチナ抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンを投与するステップで構成され、上記プラチナ抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンがその非黒色腫癌に対して相乗的な抗腫瘍効果を発揮することを特徴とする、非黒色腫癌を治療するための方法が提供される。本発明のさらに別の実施例においては、プラチナ抗腫瘍形成化合物に対する抵抗性を形成しやすい個人に対してタモキシフェンを投与するステップで形成される、腫瘍性疾患を有する個人におけるプラチナ抗腫瘍形成化合物への抵抗性を低下させる方法が提供される。本発明のさらに別の実施例においては、個人に対してタモキシフェンを投与するステップで構成される、腫瘍性疾患を有する個人におけるスラチナ抗腫瘍形成剤に対する抵抗性を克服するための方法が提供される。本発明のさらに別の実施例においては、腫瘍性疾患を有する個人から骨髄を取り出すステップと、該骨髄に細胞生化学的に有効な量のプラチナ含有抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンを接触させるステップと、そして、該接触済みの骨髄を該個人に戻すステップとで構成される、骨髄内の腫瘍形成性黒色腫細胞を殺す方法が提供される。他の、そしてさらなる目的、特徴、および利点は、開示の目的で示される本発明の現時点における好ましい実施例の説明と、関連図面を参照することによって明らかになるであろう。図面の簡単な説明図面は必ずしも実寸通りではない。本発明の一定の特徴については寸法的に誇張したり、明瞭性および便利さを考えて概要図の形態で示してある。図１は患者のコンピュータ化された断層撮影の写真を示している。これら走査写真は肝臓の２つの連続したレベルを示しており、１Ａ）は治療前、１Ｂ）はＤＤＰによる１サイクル後、そして１Ｃ）はＴＡＭ／ＤＤＰのみによる１サイクル後の状態を示している。図２は別の患者のコンピュータ化断層撮影の写真を示している。これらの走査写真は胸の、２つの連続したレベルを示している。矢印は肋骨近くの軟組織を示している。２）治療前、２Ｂ）ＤＤＰのみによる２サイクル後、および２Ｃ）ＴＡＭ／ＤＤＰによる１サイグル後。図３はＴ−289ヒト黒色腫細胞におけるＤＤＰへの抵抗性形成に対するＴＡＭの影響を示している（□、ＤＤＰのみ；●、ＤＤＰ＋ＴＡＭ）。各点はトリプリケート培養から判定された不特定Ｔ−289細胞に対するＤＤＰの作用性を示している。図４は、2008ヒト卵巣癌細胞におけるＤＤＰへの抵抗性形成に対するＴＡＭの作用を示したものである（■、ＤＤＰのみ；□、ＤＤＰ＋ＴＡＭ）。各点は、それぞれトリプリケート培養で行われた、３回の実験で判定された不特定2008細胞に対するＤＤＰの平均的な作用性を示している。図５は、ヒト黒色腫Ｔ−289細胞に対するＤＤＰとＴＡＭとの間の相互作用に関する細胞破壊の関数としての組み合せ指数（ＣＩ）を示したものである。各データ・ポイントはトリプリケート培養を用いて行われた最低３回の実験の平均値を示している。垂直方向のバーは標準偏差（ＳＤ）で、バーがない場合は、ＳＤは符号のサイズ以下であった。図６は、ヒトの卵巣2008細胞に対するＤＤＰとＴＡＭの相互作用に関する細胞破壊の関数としてのＣＩを示している。各データ・ポイントは、トリプリケート培養を用いて行われた最低３回の実験の平均値を示している。垂直方向のバーは標準偏差である。図７はヒト小細胞肺癌ＵＭＣ５細胞に対するＤＤＰとＴＡＭとの間の相互作用に関する細胞破壊の関数としてのＣＩを示している。各データ・ポイントは、トリプリケート培養を用いて行われた最低３回の実験の平均値を示している。垂直方向のバーは標準偏差である。発明の詳細な説明本発明は非黒色腫を治療するための組成物を提供するものであり、上記組成物はプラチナ抗腫瘍形成化合物とタモキシフェンにより構成され、上記プラチナ抗腫瘍形成化合物とタモキシフェンは非黒色腫癌に対して相乗的な抗腫瘍性効果を発揮する。本発明の組成物および方法の説明において用いられる相乗作用、あるいは相乗的という用語は相加的な生物学的効果より大きいことを意味している。したがって、タモキシフェンがプラチナ含有抗腫瘍形成化合物と相乗作用を有すると述べる場合、その組み合わせが、いずれの形態にせよ、いずれかの薬を単独で用いた場合より大きな細胞毒性をつくりだすことを意味している。本発明による新規組成物は、広範な非黒色腫癌における抗腫瘍形成作用を相乗作用させるために用いることも可能である。好ましくは、この新規組成物は卵巣癌、小肺細胞悪性腫瘍、膀胱癌、睾丸癌、および頭部および首の鱗状細胞癌を措置に用いられる。一般的に、新規組成物によるプラチナ含有抗腫瘍形成剤は抗腫瘍形成効果を有するいかなるプラチナ配位複合体であってもよい。最も好ましくは、本発明による組成物に基づくプラチナ含有抗腫瘍形成剤はシスプラチンまたはカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）であり、テトラプラチンおよびトポテカンを含んでいても良い。一般的に、プラチナ含有抗腫瘍形成剤およびタモキシフェンの、本発明による新規組成物内における濃度は、その組み合わせによる相乗的な細胞毒性効果を可能にするような程度であればよい。好ましくは、プラチナ含有抗腫瘍形成剤の量は１μMから10μM程度である。同様に、新規組成物の成分として、あるいは本発明による方法において用いられるタモキシフェンの濃度は0.1μMから2.0μM程度の範囲である。タモキシフェンは本発明による組成物および方法において有効な、好ましい抗エストロゲンである。しかしながら、当業者なら、他の抗エストロゲンおよびタモキシフェンに類似した化合物も、本発明による組成物あるいは方法として有益であることは分かるであろう。例えば、ＤＤＰＥ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−［４ −（フェニルメチル）フェノキシ］エタナミンは抗エストロゲン結合部位およびミクロゾーム性および核内結合部位の中和剤である。ＤＤＰＥはシスプラチンと相乗作用して、相乗的な細胞毒性効果をつくりだすと共に、システムラチン抵抗性を克服することもできる。ＤＤＰＥの濃度は１μMから10 μMの範囲が望ましい。新規組成物の投与方法は経口、静脈内、その他の適切な方法であってよい。プラチナ含有抗腫瘍形成化合物はタモキシフェンと一緒に注射で投与することもできる。また、プラチナ含有抗腫瘍形成化合物はタモキシフェンとは別に投与することもできる。当業者なら、本発明による組成物および方法が相乗的な細胞毒性あるいは抵抗性の低下を実現できるいろいろな方法で投与が可能であることは分かるであろう。投与量は年齢、体重、および同時並行的に行われる治療があればそのタイプ、そして癌の特性などによる。本発明による方法において有益な組成物はカプセル、錠剤、液体、経口投与用の懸濁液またはエリキシル剤、あるいは溶液、懸濁液または乳剤などの無菌液体形態などのいずれでもよい。食塩水あるいはりん酸緩衝食塩水、あるいは、本発明の方法において用いられる化合物が適切な可溶性を示すことができる担体など、いずれも不活性担体でも用いることができる。本発明による新規組成物は、薬理的に受け入れられる担体に入れて投与することができる。薬理的に受け入れられる担体とは、本発明による組成物が溶けることができ、投与される量において個人に対して毒性を示さない溶媒であればいずれのものでも使用できる。本発明による方法において有効な本発明の新規の薬理的に有効な量とは、非黒色腫瘍に対して相乗的な細胞毒性を発揮できるプラチナ含有抗腫瘍形成剤およびタモキシフェンの量である。同様に、プラチナ含有抗腫瘍形成剤に対する抵抗性を措置するために単独で用いられた場合、薬理的に有効なタモキシフェンの量とは、腫瘍形成性疾患を有する個人においてプラチナ含有抗腫瘍形成剤に対する抵抗性を低下、あるいは克服する量である。本発明はまた、上記非黒色腫癌を有する個人に対して薬理的に有効な量のプラチナ含有抗腫瘍形成剤およびタモキシフェンを投与するステップで構成され、上記プラチナ含有抗腫瘍形成剤およびタモキシフェンが該非黒色腫癌に対して相乗的な抗腫瘍効果を発揮することを特徴としている。プラチナ含有抗腫瘍形成剤は好ましくはシスプラチンあるいはカルボプラチンである。一般的に、プラチナ含有抗腫瘍形成剤およびタモキシフェンはどのような順番で投与されても構わない。好ましくは、プラチナ含有抗腫瘍形成剤を投与する前にタモキシフェンを投与する。最も好ましくは、タモキシフェンをプラチナ含有抗腫瘍形成剤投与の24時間前に投与する。本発明はまた、腫瘍形成性疾患を有し、プラチナ含有抗腫瘍形成剤に対する抵抗性を形成しやすい個人においてプラチナ含有抗腫瘍形成剤に対する抵抗性を低下させる方法も提供する。同様に、本発明はまたタモキシフェンの投与を内容とする、腫瘍形成性疾患を有する個人においてプラチナ含有抗腫瘍形成剤に対する抵抗性を克服する方法も提供する。一般的に、本発明によるプラチナ含有抗腫瘍形成剤への抵抗性を低下、あるいは克服する方法は、いずれの腫瘍形成性疾患の措置においても有益である。好ましくは、これらの方法は、黒色腫、卵巣癌、小細胞肺悪性腫瘍、膀胱癌、睾丸癌、および頭部および首の鱗状細胞癌の治療に対して用いることができる。プラチナ含有抗腫瘍形成剤に対する抵抗性と低下、あるいは克服する方法は、一般的には、いずれのプラチナ配位複合体含有抗腫瘍形成剤に対して起きる抵抗性の措置においても用いることができる。好ましくは、プラチナ含有抗腫瘍形成化合物はシスプラチンおよびカルボプラチンによって構成されるグループから選択される。本発明の別の実施例は、腫瘍形成性疾患を有する個人から骨髄を取り出すステップと、該骨髄を細胞レベルで有効な量のプラチナ含有抗腫瘍形成剤およびタモキシフェンと接触させるステップと、そして、該接触済み骨髄をその個人に戻すステップとによって構成される、骨髄内の非黒色腫瘍形成細胞を破壊する方法である。実施例１ＤＤＰおよびタモキシフェン組み合わせのイン・ビボでの利用患者を最初ＤＤＰだけで措置する臨床テストが実施された。ＤＤＰだけの投与に対して抵抗性を示すと認められた場合、ＴＡＭの添加がすでに形成されているＤＤＰ抵抗性を克服できるかどうかを判定するために、ＤＤＰとＴＡＭの組み合わせで措置された。 1990年６月から1992年３月まで、それまでＤＤＰまたはＴＡＭによる措置を受けたことがなかった24名の患者が治療を受けた。記入が求められたデータには、黒色腫に関する組織学的データ、判定可能な疾患に関するデータ、署名付き提供情報に関する同意（signed informed consent）、および措置を受ける前４週間に受けた抗腫瘍治療に関するデータなどである。患者に対しては、正常な血液および腎機能、東部協同オンコロジー・グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンス状態が０−２の範囲、そして推定生き残り期間が最低３か月間であることが求められた。重度静脈血栓症あるいは肺塞栓症を有する患者は除外された。完全な反応は、少なくとも４週間で、疾患のすべての証拠が完全に消失することと定義された。部分的な反応は標的患部の平均的直径の50％以上の現象が最低４週間継続することとされた。混合的反応は一部の標的患部の直径が50％以上減少するのに対して、他の患部は安定しているか、あるいはサイズが増大した場合と定義された。安定的減少とは他の患部が成長、あるいは出現せずに、標的患部のサイズが50％以下で減少するか、あるいは25％以下で増大することと定義された。進行性疾患とは、標的患部のサイズが25％以上増大することと定義された。患者は、その患者がＤＤＰを１サイクル受けたあと進行性疾患を持つか、あるいはＤＤＰだけで２サイクル治療を受けた後、安定した疾患を持つようになった場合、ＤＤＰに対して抵抗性があると判断された。ＤＤＰ、100mg/mlを十分な量の0.9％塩化ナトリウム溶液に混合して、最終的濃度が最高１mg/mlとなるようにし、２時間かけて投与された。20mEqの塩化カリウムおよび２ｇ硫化マグネシウムを含んだ５％デキストロース／0.45％食塩水１リットルで構成される前処理用水和剤が４時間をかけて投与された。また、20mE qの塩化カリウムおよび２ｇの硫化マグネシウムを含む５％デキストロース／0.4 5％食塩水２リットルで構成される後処理水和物が150ml／時間の量で投与された。患者は３週間に１度ずつ措置された。ＴＡＭが投与されたサイグルで、最初の日に40mg.p．o．４回投与量が投与され、その後、毎日20mg p．o．投与された。最初の７名の患者は、嫌悪感および吐き気を抑えるために、ロラゼパム、メタタロプラミド、ベナドリル、およびデキサメタコンの組み合わせで措置された。次の患者はオンダンセントロンをベースとする処方を受けた。患者は最初ＤＤＰだけで措置し、３週間毎に反応の評価を行った。ＤＤＰだけの処方で病状が進行した患者は、ＤＤＰだけの２サイクルの処置で病状が安定した患者と同様、ＤＤＰ＋ＴＡＭでの処方の候補者とした。ＤＤＰだけの処置で反応を示した患者に対しては、完全な反応が達成されるか、あるいは進行性の疾患が併発するまで続けられた。治療前の特徴を表１に示す。２名の患者のみが以前に化学療法を受けたことがあり（そのうちの１名は免疫治療も受けていた）、たった患者のには前に放射線治療を受けていた。患者の多くの動作状態（performance state）は良好で転移パターンは黒色腫を示していた。反応データを表２に示す。24名の患者全員に対して、ＤＤＰだけでの反応の評価が行われた。ひとりの患者は完全な反応を示したが、２名の患者は部分的な反応を示しただけであった。完全な反応は15か月間以上続いた。部分的な反応を示した患者のうちの１名は治療後６か月以上も安定した状態を示したが、他の患者は４か月の治療後に病状が進んだので、ＴＡＭ／ＤＤＰの措置に切り替えた。ＤＤＰだけで完全な反応を示した患者は病状の唯一の部位としていくつかの皮下の小結節をもっていただけであった。肺および後部腹膜リンパ腺疾患をもっていた患者では部分的な反応が観察された。最初にＤＤＰのみで措置を受けた24名のうちの20名がＴＡＭとＤＤＰとの組み合わせで措置を受けた。２名の患者は毒性の点から受け入れられなかったので、組み合わせによる治療を拒絶し、それぞれＤＤＰだけの治療を受けた。完全な反応を示した患者はさらに治療を受けず、部分的な反応を示した２名の患者のうちの１名は治療後６か月以上安定した状態を示し、組み合わせによる治療を受けなかった。20名の患者の内の19名について反応の評価が行われた。１名の患者は、ＴＡＭとＤＤＰとの組み合わせによる治療は受けたが、反応の評価を行う前に自殺してしまった。評価を受けた19名の患者の内、17名は進行性の疾患を持っており、２名はＤＤＰだけの治療を受けている間、病状は安定していた。３名の患者は部分的な反応を示したが、他の３名は混合した反応を示し、全体的な反応率は35％であった。これにより、何の反応も示されない（ｐ＜0.001）というゼロ仮定（null hypoth esis）の可能性を排除することが可能になった。１名の患者は、ＴＡＭおよびＤＤＰによる４サイクルの治療で部分的な反応を示し、そして、後外科的処理は不要である病状であった。ＴＡＭとＤＤＰに対する反応は肝臓（図１）、骨、および軟組織（図２）疾患を有する患者において用いられた。部分的な反応は６−８週間継続した。反応を示さなかったり、反応を示した後、再度病状が進行した患者、そして、混合した反応を示した人々はＴＡＭ／ＤＤＰ／カルムスチン／ダカルバジンの４つの薬による措置を受けた。この処方で措置を受けた12名の患者の間に反応は認められなかった。ＤＤＰ／ＴＡＭの組み合わせによる治療で直面した毒性を表３に示す。ＤＤＰだけか、あるいはＤＤＰとＴＡＭとの組み合わせによる血液毒性は軽微で、グレード３または４の好中球減少症あるいは血小板減少症は示されなかった。ＤＤＰだけの措置にＴＡＭを追加した場合、特に毒性の増大は認められなかった。同様に、腎臓毒性は一般的には認められず、ＴＡＭの投与によって影響を受けなかった。この処方は、嫌悪感および吐き気を示す一部の患者には、一定の困難を伴った。ＴＡＭの投与は嫌悪感や吐き気を増大させることはなかったが、この問題は患者側の立場から見ると、最も対処が難しい問題であった。入院期間中、オンドンセトロンを添加すると嫌悪感と吐き気は劇的に減少した。耳に対する毒性および抹消神経症は認められなかった。これはＤＤＰ２ないし３投与量を受けた患者はほとんどいなかったという事実に起因する可能性が最も高い。音楽家であった１名の患者は聴覚に受け入れがたい異常が生じたために１回の投与後ＤＤＰに基づく治療を継続することを拒否した。２番目の患者は全部で545mgのＤＤＰを投与された後、補聴器を必要とした。静脈血栓あるいは肺塞栓症を示した患者はいなかった。本発明はＤＤＰだけによる治療にＴＡＭを追加することにより、悪性腫瘍を有する患者のかなりの部分で、すでに形成されている抵抗性を克服することができることを明確にするものである。ＴＡＭおよびＤＤＰの組み合わせによって措置された患者の多くは、ＤＤＰによる治療１サイクル後に進行性の病状を示すか、あるいは２サイクル後に安定した病状を示すという点で、ＤＤＰだけによる治療に対して抵抗性があるとされていた。反応が期待できなかった状況下での31％という全体的な反応率は統計的には有意である（ｐ＜0.001）。ＴＡＭの追加の結果として得られる反応はＴＡＭの独立した抗腫瘍効果によるものではなかった。ＴＡＭだけで措置を受けた203名の黒色腫患者のうちで報告された反応率は６％に過ぎなかった。抵抗性を示す腫瘍をもった患者において予想されるように、ＤＤＰだけでの治療の失敗後に実施されるＴＡＭとＤＤＰとの組み合わせに対する臨床的な反応は、質および継続性の観点から興味深いものであった。１名の患者においては、部分的な反応から残り全ての病巣を外科的に手術して取り去ることが可能になり、この患者は12か月強の期間完全な快癒状態にある。他の２例の部分的反応は、それぞれ、６週間、および８週間持続された。混合的な反応を示した患者は明らかにＤＤＰだけの治療では標的患部は病状の進行を示したが、それらの患部はＴＡＭ／ＤＤＰの組み合わせによる治療には反応を示し、他の患部は進行するか、あるいは安定状態を保った。したがって、ＴＡＭはＤＤＰに抵抗性を示す腫瘍をイン・ビボで反応性を与えることはできるにもかかわらず、反応性を示す患者の割合と、反応の程度を最大限に高めるために、投薬スケジュールは個々の患者に合わせて工夫しなければならないことは、当業者には明らかであろう。実施例１の調査のデザイン自体が反応に対してずれており、別の設定をすれば、反応率はさらに高かったであろう。すべての患者は、彼らが明らかに抵抗性を示すようになるまでＤＤＰだけで措置を受けた。ＤＤＰに対する抵抗性は急速に発現する。イン・ビトロで抵抗性を示す細胞を１ログ（log）破壊するのに必要な濃度を患者内でつくりだすことは可能であろうが、イン・ビトロで抵抗性を克服するのに必要な濃度を、標準的な容量である１日あたり20mgで患者の体内につくりだすのは不可能である。10mg.p．o．のＴＡＭを１日２度ずつ繰り返し投与すると、0.29μM程度の定常的な血漿濃度をつくりだすことはできる。しかしながら、イン・ビトロのデータでは、ＤＤＰに抵抗性を示す患者においては1.0μM 以上の血漿濃度が必要であることが示されている。したがって、当業者であれば、ＤＤＰ／ＴＡＭの組み合わせに対する反応率は、最初により高い濃度のタモキシフェンで措置を受けた患者の方が高く、ＤＤＰに対する抵抗性はＤＤＰとＴＡＭの両方の用量を増大させることによって克服できるであろうことはすぐ分かるであろう。実施例２タモキシフェンおよびＤＤＰのイン・ビトロでの効果ＴＡＭとＤＤＰとの間の相乗効果は、他のヒトの悪性腫瘍、ヒト小細胞肺癌株ＵＭＣ−５およびヒト卵巣癌細胞株2008でも観察された。Ｔ−289黒色腫細胞においても観察されたように、ＵＭＣ−５細胞（ＣＩ₃₀−0.38）および2008細胞（ＣＩ₃₀−0.63）の両方で、ＴＡＭとＤＤＰとの間の強い相乗効果が認められた。ＴＡＭがＤＤＰに対する抵抗性を克服する上で、ＤＤＰと相乗作用を示すのであれば、ＴＡＭは同様のメカニズムによってＤＤＰに対する抵抗性の発展を遅らせることもあり得るであろう。ＴＡＭは、細胞培養体に同時に与えることによって、Ｔ−289と2008細胞の両方でＤＤＰに対する抵抗性の発展を遅らせることができる。Ｔ−289黒色腫細胞は体外移植組織腫瘍から得られたもので、７年以上経過したものであった。2008細胞は子宮漿腺癌種（タイプ・サイト）を有する患者から取り出した卵巣癌細胞株である。細胞は10％仔ウシ胎児血清、50μg/mlゲンタマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、10nMヒドロコルチゾン、５μg/mlインシュリン、５μg/mlヒト・トランスフェリン、10nMエストラジオール、および５ng/mlセレニウムによって補強された75cm²フラスコを用いてＲＰＭＩ 1640内で培養された。実施例３ＤＤＰに対する抵抗性の誘発ＤＤＰに対する抵抗性は、ＤＤＰを常時存在させる状態で、さらにＴＡＭを併用した場合と、しない場合との両方の条件下でＴ−289および2008細胞の両方を成長させることによって誘発された。最初の選別はＩＣ⁹⁰に等しい濃度、つまり、コロニー形成を抑制する濃度で行われた。したがって、最初の濃度は0.1，0.2 5および0.5μM ＤＤＰ、および1.0，2.5および5.0μM ＴＡＭであった。これらの細胞は群を形成するまで成長させられ（約７日）、その時点でうまく群を形成した培養を１：４に分割して、同じ濃度のＤＤＰ±ＴＡＭに再び接触させた。３回の選別を行った後、これらの細胞を徐々に高い濃度のＤＤＰ±ＴＡＭに接触させた。各選別を行う度に一定の細胞を取り出して、薬品を含まない培養液内部で３週間成長させ、ＤＤＰに対する感受性を判定するための群形成アッセイで用いられた。実施例４コロニー形成アッセイ細胞は完全な培養液（2008）、あるいは、１％アガロース層（Ｔ−289）上に層状化された0.2％アガロース／培養液を含む組織培養皿に入れた。この培養皿にＤＤＰを少しずつ濃度を高めてＤＤＰを加え、５％のＣＯ₂存在下、37℃の温度で10日間培養された。10日間後、コロニーを数え、各ＤＤＰ濃度は薬品を加えない比較用培養皿の割合で示してある。図３は、ヒト黒色腫Ｔ−289細胞におけるＤＤＰ±ＴＡＭに対する抵抗性の発現を経時的に示している。この細胞株は比較的成長が遅く（２倍化に要する時間が４８−７２時間）、薬品に露出させる度に正常な成長速度を取り戻すためにかなりの時間を要した。ＤＤＰに対する抵抗性は選別の200日後に明らかになり、その時点で、ＤＤＰだけで措置された細胞はＤＤＰに対して2.3倍の抵抗性を示した。ＤＤＰ＋ＴＡＭで措置された細胞では1.5倍の抵抗性が示されただけであった。その後、ＤＤＰに対する抵抗性は、ＤＤＰだけで措置された細胞においては、ＤＤＰ＋ＴＡＭで措置された細胞と比較して、2.75倍の速度でＤＤＰに対する抵抗性が現れた。抵抗性発現の速度における違いは統計的には有意であった（ｐ＜0.01）。実施例５ＤＤＰに抵抗性を示す細胞へのタモキシフェンの作用 2008細胞株はより早い速度で成長し（23時間で２倍化）、このことは選別実験を実施し易くなった。図４はＤＤＰに対する抵抗性が、この細胞株においては時間の線形関数として発現したことを示している。ＤＤＰに対する感受性の違いは、最低のＤＤＰ濃度での選別後（38日目）明らかとなり、そして３回の選別後、統計的に有意となった（103日目）。ＤＤＰに対する抵抗性形成の速度は、３回繰り返されたこの実験のすべてでＴＡＭによって低下された。ＤＤＰだけが存在する場合と、ＤＤＰ＋ＴＡＭが存在する場合の、抵抗性形成速度の平均的な比率は3.46±1.42（ｐ＜O.05）であった。したがって、Ｔ−289黒色腫細胞株と2008卵巣癌細胞株の両方で、細胞をＤＤＰとＴＡＭの両方に同時に接触させると、抵抗性形成の速度とその抵抗性の程度の両方が低下した。ＤＤＰに対する抵抗性形成のＴＡＭに誘発される遅れは、両方の薬品を投与された培養体において、破壊された細胞が多数あり、体細胞抵抗性発生変異を起こす可能性のある細胞が少なかったからではない。実施例３では、細胞培養体は、次の措置を行う前に正常な成長速度を回復して、群状態に達するようにされた。したがって、同じ数の細胞が各ステップで選択的な圧力に露出された。したがって、薬の選択によって選別毎に細胞破壊が多くなったことはＤＤＰに対する抵抗性の発現におけるＴＡＭによって誘発された遅延には直接かかわりはない。本発明は、ＴＡＭおよびＤＤＰ間の相互作用の複雑な性質についてより深い洞察を与えてくれる。ＴＡＭは、卵巣癌および小細胞肺癌などのようなＤＤＰに対して感受性のある腫瘍においてばかりでなく、従来ＤＤＰに対して抵抗性がある腫瘍と考えられている腫瘍である黒色腫においても、ＤＤＰとの相乗効果がある。同様に、ＴＡＭはＤＤＰに対して感受性のあるタイプの腫瘍とＤＤＰに対して抵抗性のあるタイブの腫瘍との両方におけるＤＤＰに対する抵抗性の発現を遅らせることができる。患者の体内で実現できるＴＡＭおよびＤＤＰの濃度で、抵抗性発現に対する相乗効果と遅れの両方が観察された。本発明では、メジアン効果分析の手法を用いて、ＤＤＰおよびＴＡＭの間の相互作用の性質について調べられた。これら２つの薬品の間では、ヒト黒色腫細胞株の破壊に関してだけでなく、イン・ビトロでのヒト卵巣および小細胞肺癌細胞株に対しても、高度に相乗的な相互作用が存在する。実施例６コロニー形成アッセイＴ−289黒色腫細胞株および2008細胞株は実施例３で用いられたものと同じである。ＵＭＣ５小細胞肺癌細胞株もヒト由来のものである。細胞は実施例２の場合と同様に培養された。１時間対薬品露出を用いてのコロニー形成アッセイは、１皿あたり20,000個の細胞の割合で60mm組織培養中に蒔種し、それらが付着するように２時間放置して行われた。これらの皿に薬品を入れて、１時間培養して、その後、皿を洗浄し、細胞をトリプシン化によって収穫し、その後１度洗浄して薬品を取り除き、その後、0.2％低溶解温度アガロースを37℃を含んだ５mlの完全な培養液中に再懸濁させた。この細胞懸濁液を良くかき混ぜ、その後、予め用意された、固体化１％アガロースの基層を含む35mm皿にトリプリケート（３倍体）で１皿あたり１mlの割合で分注した。この細胞を含んだ層を室温で固体化させ、その後、培養皿を５％ＣＯ₂の存在下、37℃で培養させた。５日後に、124 μ_m以上のコロニーをカウントした。継続的な露出を用いたコロニー形成アッセイは細胞を0.2％アガロース内に細胞数4000個/mlの割合で細胞を懸濁させ、それらを薬品を含んだチューブに分注し、その後、それらを35mm皿に入れることによって行われた。実施例７メディアン効果分析ＴＡＭとＤＤＰとの間の相互作用の性質を判定するためにメディアン効果分析が用いられた。ＣＩは細胞破壊の高められたレベルでのコロニー形成アッセイを用いて判定された。薬品はＩＣ₅₀の比率と同じ比率で、つまり、細胞破壊が50％となるＣＩで、組み合わせられ、それぞれの薬品に対する値はグロノジェニック・アッセイによって判定された。組み合わせは、各実験で各薬品を単独で用いた場合の細胞毒性と比較された。各データ・ポイントはそれぞれトリプリケート培養を用いて行われた最低３回の実験の平均値を示している。実施例８黒色腫細胞に対するＴＡＭ／ＤＤＰの作用図５は、Ｔ−289黒色腫細胞株に対するＤＤＰとＴＡＭの相互作用に関するＣＩを図示したものである。細胞破壊50％でのＣＩが0.26±0.02（ＳＤ）（ｐ＜0. 01）であることは、ＴＡＭとＤＤＰとの間の著しい相互作用を示している。実施例９卵巣癌細胞に対するＴＡＭ／ＤＤＰの作用図６は、ヒト卵巣癌細胞株2008に対するＤＤＰとＴＡＭの組み合わせのＣＩプロットを示している。この組み合わせは細胞破壊が低い範囲で相乗作用を発揮し、0.63±0.07（ＳＤ）（ｐ＜0.01）のＣＩ₅₀を達成した。というのは、細胞破壊のレベルが高かった（生存コロニーが少数であった）ことに関連したマウンティング・エラーと、相互作用が、各薬品を単独で使用した場合の曲線と組み合わせの場合の曲線とがよく適合している容量−反応領域でしか分析できないからである。ＣＩプロットは曲線の中央部分で最も信頼性が高く、細胞破壊が80％以上の領域では、比較的信頼性が低い。実施例10 小細胞肺癌株に対するＴＡＭ／ＤＤＰの作用ＵＭＣ小細胞肺癌株に対するＤＤＰおよびＴＡＭの組み合わせのＣＩプロットを図７に示す。このＣＩプロットも相互作用の相乗効果の高さを示しており、0. 38±0.13（ＳＤ）（ｐ＜0.01）のＣＩ₅₀値を達成した。本発明はヒトの黒色腫、卵巣癌および小細胞肺癌細胞株に対する細胞毒性に関してのＴＡＭとＤＤＰとの間の高度に相乗的な相互作用を示している。メディアン効果分析は、２つの細胞毒性薬剤間の相互作用の性質の確認と、種々の細胞破壊レベルでの相互作用の強度の定量化との両方のための数学的に厳密な方法を提供する。メディアン効果分析は、これら３つのヒト細胞株に対して、この相互作用が相乗的であることを示した。その相乗作用の強度は、黒色腫株（ＣＩ50 0.26）と小細胞肺癌株（ＣＩ500.38）の両方に対して、卵巣癌株（0.63）に対してよりも高かった。この相乗的な相互作用の他のいくつかの特徴は、臨床的な意義を持っている可能性を示唆している。３つの細胞株のすべてに対して、相乗効果は、細胞破壊が最低のレベルでも明らかに存在した。このように、ＴＡＭは、腫瘍に対するＤＤＰ伝達が最低限何とか十分であるような状況下でも、イン・ビボで腫瘍細胞のＤＤＰに対する感受性を高めている。第２に、これら薬品の標準的な用量で措置された患者の血漿液内で簡単に実現できるＤＤＰおよびＴＡＭ両方の濃度で、相乗作用が観察された。本発明が上に述べた課題を実行し、上記目的および利点、およびそれらと本質的に付随した目的および利点を達成するのによく適合していることは、当業者なら容易に理解できるであろう。これら実施例、およびここに述べられている方法、手順、措置、分子、および特殊な化合物は現在の段階での好ましい実施例を示すものであり、具体例であって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。特許請求の範囲で定義されるような本発明の精神を逸脱しない変更やその他の使用法は、当業者には自ら明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハウエル，スティーヴン，ビー. アメリカ合衆国 92014 キャリフォーニア，デルマー，ノウガレスドライヴ 13612

Claims

【特許請求の範囲】１．プラチナ抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンにより構成され、上記プラチナ抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンが非黒色腫癌に相乗効果を発揮することを特徴とする非黒色腫癌治療用の組成物。２．該非黒色腫癌が、卵巣癌、小細胞肺悪性腫瘍、睾丸癌、膀胱癌および頭部および首の鱗状細胞癌により構成されるグルーブから選択されることを特徴とする請求項１の組成物。３．該プラチナ抗腫瘍形成化合物がシスプラチンとカルボプラチンとにより構成されることを特徴とする請求項１の組成物。４．該シスプラチンが該組成物中に１μMから10μM程度の範囲で含まれていることを特徴とする、請求項３の組成物。５．該カルボプラチンが該組成物中に５μM程度から20μM程度の範囲で含まれていることを特徴とする請求項３の組成物。６．該タモキシフェンが該組成物中に0.1μM程度から１μM程度の量で含まれていることを特徴とする請求項１の組成物。７．該タモキシフェンが該組成物中に0.1μM程度から１μM程度の量で含まれており、さらに該プラチナ含有抗腫瘍形成化合物がシスプラチンであり、該組成物中に含まれているシスプラチンの量が１μM程度から10μM程度であることを特徴とする請求項１の組成物。８．さらに薬理的に受け入れ可能な担体を含んでいる請求項１の医薬品組成物。９．さらに薬理的に受け入れ可能な担体を含んでいる請求項８の医薬品組成物。１０．該非黒色腫癌を有する個人に対し薬理的に有効な量のプラチナ抗腫瘍形成化合物とタモキシフェンの組み合わせを投与するステップで構成され、該プラチナ抗腫瘍形成化合物とタモキシフェンが該非黒色腫癌に対して相乗効果を発揮することを特徴とするイン・ビボで非黒色腫癌を措置するための方法。１１．該非黒色腫癌が、卵巣癌、小細胞肺悪性腫瘍、膀胱癌、睾丸癌、および頭部と首の鱗状細胞癌とにより構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項10の方法。１２．該プラチナ抗腫瘍形成化合物がシスプラチンとカルボプラチンとによって構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項10の方法。１３．該シスプラチンが１μM程度から30μM程度の量で投与されることを特徴とする請求項12の方法。１４．該カルボプラチンが５μMから20μM程度の量で投与されることを特徴とする請求項12の方法。１５．該タモキシフェンが0.1μMから１μM程度の量で投与されることを特徴とする請求項10の方法。１６．該タモキシフェンが0.1μMから１μM程度の量で該組成物中に含まれ、該プラチナ含有抗腫瘍形成化合物がシスプラチンであり、該シスプラチンが該組成物中に１μMから10μM程度の量で含まれていることを特徴とする請求項10の方法。１７．上記プラチナ抗腫瘍形成化合物投与の前にかなりのタモキシフェン血漿液レベルが達成されるように、該タモキシフェンが該プラチナ抗腫瘍形成化合物より前に投与されることを特徴とする請求項10の方法。１８．腫瘍形成性疾患を有する個人から骨髄を取り出し、該骨髄を細胞レベルで有効な量のプラチナ含有抗腫瘍形成化合物およびタモキシフェンと接触させ、そして該接触済み骨髄を該個人に戻すステップによって構成されることを特徴とする骨髄内の非黒色腫抗腫瘍形成細胞を破壊する方法。１９．抗腫瘍形成疾患を有する個人において、該個人がプラチナ抗腫瘍形成化合物に対する抵抗性形成の影響を受けやすいことを特徴とする、該個人に対してタモキシフェンを投与するステップで構成されるプラチナ抗腫瘍形成化合物に対する抵抗性を低下させる方法。２０．該疾患が黒色腫、卵巣癌、小細胞肺悪性腫瘍、睾丸癌、膀胱癌および頭部と首の鱗状細胞癌により構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項19の方法。２１．該プラチナ抗腫瘍形成化合物がシスプラチンとカルボプラチンとによって構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項19の方法。２２．該タモキシフェンが0.1μMから１μM程度の量で投与されることを特徴とする請求項19の方法。２３．該個人にタモキシフェンを投与するステップで構成される、腫瘍形成性疾患を有する個人におけるプラチナ抗腫瘍形成剤に対する抵抗性を克服する方法。２４．該疾患が黒色腫、卵巣癌、小細胞肺悪性腫瘍、睾丸、膀胱および頭部および首の鱗状細胞癌より構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項23の方法。２５．該プラチナ抗腫瘍形成化合物がシスプラチンとカルボプラチンとによって構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項23の方法。２６．該タモキシフェンが0.1μMから１μM程度の量で投与されることを特徴とする請求項23の方法。