JP2005015469A

JP2005015469A - リモシトリンおよび５−デスメチルシネンセチンに関連する化合物を用いた腫瘍性疾患を抑制する組成物および方法

Info

Publication number: JP2005015469A
Application number: JP2004156046A
Authority: JP
Inventors: Najla Guthrie; ガスリー，ナジュラ; John A Manthey; マンシー，ジョン，エイ．; Robert M Horowitz; ホロウィッツ，ロバート，エム．
Original assignee: USDA-ARS-OTT; KGK Synergize Inc
Current assignee: USDA-ARS-OTT; KGK Synergize Inc
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2005-01-20
Also published as: EP1119353A4; AU6291699A; WO2000019998A1; EP1119353A1; CA2346333A1; JP2003509334A

Abstract

【課題】新生物細胞の処置および心臓血管疾患の低減において、リモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンを使用する方法および組成物を提供すること。
【解決手段】治療上有効な量のリモシトリンを含む組成物を必要とされる個体に投与することを含んでなる、個体において癌の増殖を予防または抑制する方法であって、前記リモシトリンが、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン、リモシトリン-3,5,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテート、3,5,7,4'テトラメトキシリモシトリンまたは3,7,4'-トリメトキシリモシトリンを含む、前記方法。
【選択図】なし

Description

１．序文
本発明は、新生物細胞および新生物疾患、特に乳癌を、リモシトリン化合物から誘導した化合物を用いて予防および治療するための組成物および方法に関する。また、本発明は、アテローム硬化症、血栓症、炎症性疾患、アレルギーまたはウイルス性疾患を予防および治療するための組成物および方法に関する。これらの化合物は、天然および/または合成のフラボノイドの群に属し、限定するものではないが、5-デスメチルシネンセチンおよびリモシトリン誘導体化合物である3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン、3,7,4'-トリメトキシリモシトリン、3,5,7,4'-テトラエトキシリモシトリンまたはリモシトリン-3,5,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテートが含まれる。

２．背景
リモシトリン類似体は、植物中に天然に存在するかまたは化学的に合成される柑橘類由来のフラボノイドの群に属する。5-デスメトキシシネンセチンは、シネンセチンから化学的に合成されるが(Tatum, J. H.ら、1972, Phytochemistry II: 2283-2288)、マンダリンの葉にも微量に生じることが報告されている(Sugiyama, S.ら、1993, Chem. Pharm. Bull. 41: 714-719)。フラボノイドは、植物起源の食物に偏在するポリフェノール化合物である。フラボノイドの主要な食物供給源は、野菜、果物ならびに茶および赤ワインなどの飲料である(Hertog, M. G. L.ら、1993, J. Agric. Food Chem 41: 1242-1246)。

植物は、寄生生物、草食動物、病原体および酸化的細胞障害に対する防御としてフラボノイドを進化させた。またフラボノイドは、果実および野菜の色に寄与する（Cook, N. C. ら、1996, J. Nutr. Biochem. 7: 66-76）。米国における食物性フラボノイドの平均摂取量は、グリコシドとして表すと一日あたり1gであり、そのうち約170 mgはアグリコンとして表され、フラボノール類、フラボノン類およびフラボン類からなる(Kuhnau, J., 1976, World Rev. Nutr. Diet 24: f117-191)。従って、フラボノールおよびフラボンの摂取量はβ-カロチン(１日あたり2〜3 mg)およびビタミンE（１日あたり7〜10 mg）などのその他の食物性抗酸化剤の摂取量を上回り、ビタミンＣの摂取量（１日あたり70〜100 mg）の約1/3に等しい(Nutrient intakes. Individuals in 48 states. Year 1977-1978. Report No. 1-2. Consumer Nutrition Division, Human Nutrition Information Service. Hyattsville, M. D.: U. S. D. A. 1984)。フラボノイドは、最も効力の高い食物性抗酸化剤であることが示されており、大量の食物消費を考慮すると、フラボノイドはヒトの食物の抗酸化可能性に大きく寄与する。フラボノール類およびフラボン類の主要な食物供給源は、紅茶、タマネギ、リンゴ、ハーブおよび香辛料、チョウジまたは黒胡椒である(Hertog, M. G. Lら、1992, J. Agric. Food Chem. 40: 2379-2383)。

２．１．疫学的研究
疫学的研究は、果実および野菜の消費量と様々な部位における癌のリスクとの間の逆の相関、ならびに脂肪および総カロリー摂取量などの食物因子と癌のリスクとの間の正の相関を確実に示す(Block, G．ら、1992, Nutr. Cancer 17: 1-29)。上昇し、いまだ上昇している食物関連癌死亡者の数とともに、北アメリカでは栄養補助食品の使用がますます普及してきた。本明細書で使用する用語「栄養補助食品（nutraceutical）」は、食物または食物の一部であると考えられ、かつ疾患の予防および治療を含む医薬上および健康上の利益をもたらす任意の物質として定義する。最近までは、天然の薬物は主に限定された集団に提供されていた。しかし、現在では多くの保健機関が代替療法を新たに考慮している。米国の栄養補助食品に対する潜在的市場は、2500億ドルと見積もられており、これは従来の医薬品市場の４倍である。現在のところ、増強剤として使用される栄養補助食品の売り上げシェアは、3000億ドルと見積もられる米国の加工食品および飲料産業の0.5％近く、すなわち15億ドルの市場であると考えられる。

平均すると、果実および野菜を最も摂取する協力者は、その摂取量が最も少ない協力者に比べて消化管および呼吸器官における癌のリスクが15％低い。果実および野菜の摂取は、癌に罹る率が低いことの原因となるその他のライフスタイルのマーカーとなりうるが、果実および野菜は、癌を予防するケルセチンなどのフラボノイドを含有しうる(Steinmetz, K. A.ら、1991, Cancer Causes Control 2: 325-357)。

ケルセチンと心臓血管疾患との関係は、予測疫学および異文化生態学において研究されてきた。フラボノールおよびフラボン摂取量は、冠状動脈性心疾患による死亡率と逆の相関を有し、最初の心筋梗塞発生率とも程度は劣るが、関係を有する。これらの効果は、血中コレステロール、ボディマス指数、血圧、喫煙ならびに抗酸化ビタミン、アルコールおよび脂肪の摂取量など、冠状動脈性心疾患の公知の危険因子とは無関係である。フラボノールおよびフラボン（主にケルセチン）の摂取量は、発作のリスクとも逆の関係を有する(Hertog, M. G. L. ら、 1993, Lancet 324 ; 1007-1011 ; Keli, S. O.ら、1996, Arch. Inter. Med. 154: 637-642)。しかし、4000種もの異なるフラボノイドが記載されており、農業に有効な影響を及ぼすため、さらに具体的には、これらの栄養補助食品を抗癌剤、抗血栓症剤、抗冠状動脈性心疾患薬、抗心筋梗塞薬、および/または抗発作薬として使用するために、有効な成分を同定することは至難の技である。

２．２．癌の増殖および化学療法
癌は、適切でない組織が蓄積する疾患である。化学療法剤は一つの特徴を共有する。すなわち、化学療法剤は、通常、正常細胞よりも悪性細胞を、より効率的に殺傷するかまたは損傷を与える。しかし、化学療法剤が正常細胞を害するという事実は、その潜在的毒性を意味する。動物腫瘍研究およびヒト臨床試験から、薬物の組み合わせが、単一の薬物に比べ、より速い目的応答速度およびより長い生存期間をもたらすことが示されている。従って、組合せ薬物治療は、現在使用される化学療法のほとんどにおいて基本となっている(DeVita, V. T. ら、1995, Cancer 35: 98)。

癌治療には、腫瘍細胞増殖、癌細胞の身体のその他の部位への転移性播殖、浸潤、腫瘍誘導性新生血管形成、ならびに宿主免疫応答および細胞傷害性の増大を含む種々の因子の阻害が必要とされる。従来の癌化学療法剤は、腫瘍細胞に対するその細胞傷害性に基づいて選択されていた。しかし、いくつかの抗癌剤は、患者の免疫系に不利な影響を及ぼす。従って、腫瘍の進行を導く可能性のある因子に対して非細胞傷害性の防御をもたらすような、癌の治療法または処置を開発できれば、非常に有益であろう。

ホルモン療法ならびに化学療法は、進行した乳癌の制御に有効であるため、原発性乳癌における乳房切除への補助として使用されてきた。エストロゲン受容体+ (ER+)またはエストロゲン受容体- (ER-)腫瘍を有する患者は、補助化学療法の恩恵をうける。しかし、乳癌における乳房切除の補助剤として単独で使用されるタモキシフェンは、疾患とは無関係の総合的な生存の延長において利点を示す(Cummings, F. J. ら、1985, Ann. Intern. Med. 103; 324)。癌細胞および癌疾患の治療のための様々な方法が存在する一方で、当技術分野では、特に乳癌などの疾患状態における新生物細胞の複製を、少なくとも減少させることがなお必要とされている。また、心臓血管疾患の発症率を低減させる方法も当技術分野で必要とされている。

本発明は、関連技術とは異なり、新生物細胞の処置および心臓血管疾患の低減において、リモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンを使用する方法および組成物を提供する。

３．発明の概要
本発明は、新生物疾患を予防および/または治療する方法に関し、該方法はリモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンの組成物を使用して癌に対するリスクが高い個体または癌に罹患した個体を治療することを含む。

本発明はまた、乳癌を予防および/または治療する方法に関し、該方法は乳癌に対するリスクが高い個体においてリモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンの組成物を使用することを含む。

本発明はまた、アテローム硬化症、心筋梗塞、発作、または血栓症を予防および/または治療する方法に関し、該方法は、リモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンの組成物を、それを必要とする個体に使用することを含む。

本発明はさらに、抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗ウイルス活性および/またはエストロゲン様活性を誘導する方法に関し、該方法はリモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンの組成物を、それを必要とする個体に使用することを含む。

本発明はまた、乳癌に罹患した個体におけるリモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンならびにタモキシフェンの使用に関する。

本発明はまた、新生物疾患を予防および/または治療する方法に関し、該方法は、癌に罹患した患者において、有効な用量のリモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンの１種以上の組み合わせを、単独でまたは従来の化学療法、ホルモン療法および/もしくは放射線療法または手術と共に、使用することを含む。

本発明はまた、低密度リポタンパク質の酸化ならびに血小板凝集および粘着を阻害する方法に関し、該方法は、有効な用量のリモシトリン化合物の組成物の使用を含む。

本発明はまた、癌細胞に有効量のリモシトリン化合物を投与してin vitroおよびin vivoにおける癌細胞の増殖を低減させる方法に関する。

４．発明の詳細な説明
本発明の方法は、癌を予防および／または治療するために、癌を発症するリスクが高いおよび／または癌を有すると同定された個体に、有効量のリモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチン、タモキシフェンまたは化学療法剤のうちの１つまたはこれらを組み合わせて投与することを包含する。

これらの化合物が腫瘍細胞増殖を抑制する能力、腫瘍細胞の転移性拡大を阻害する能力、または化学療法剤により誘発される免疫抑制を与える能力は、新生物疾患の予防および治療に有効性を付与する可能性がある。これらの可能性ある作用機構は、本発明の範囲を少しも制限するものではなく、単に説明目的および／または例示目的で示すものである。

また本発明の方法は、冠状動脈性心疾患を予防および治療するために、有効量のリモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンをアテローム硬化症もしくは血栓症の高いリスクおよび／またはアテローム硬化症、卒中、心筋梗塞もしくは血栓症への罹患を同定された個体に投与することを含む。

フラボノイドが血小板凝集および粘着を阻害する能力は、アテローム硬化症、卒中、心筋梗塞および血栓症の予防および治療に有効性を付与する可能性がある。これらの可能性ある作用機構は、本発明の範囲を少しも制限するものではなく、単に説明目的および／または例示目的で示すものである。

癌
癌は、心疾患に続き、米国における主な死因の第２位であり（Boring, C. C.ら、1993, CA Cancer J. Clin. 43: 7）、米国人の３人に１人の割合で発症し、４人のうち１人が癌で亡くなっている。癌は、腫瘍細胞とその周囲（例えば正常な隣接細胞）との間のコミュニケーションの破壊として考察されうる。増殖刺激および増殖阻害シグナルはいずれも、組織内の細胞間で日常的に交換されている。通常、細胞は刺激シグナルの不在下では分裂せず、そして同様に、阻害シグナルの存在下では分裂が中止する。癌性もしくは新生物性状態において、細胞はこれらのシグナルを「無効」にする能力および正常細胞が増殖しない条件下で増殖する能力を獲得する。

妨害されない細胞増殖の他に、細胞は腫瘍成長が起こるためには複数の形質を獲得しなければならない。例えば、腫瘍発生の初期段階において、細胞は宿主免疫系を回避しなければならない。さらに腫瘍の嵩が増加するので、腫瘍は栄養を補給し代謝廃棄物を排除する脈管系を獲得しなければならない。さらにまた、細胞は隣接組織を侵略する能力を獲得しなければならず、そして最終的に、細胞は遠位の部位に転移する能力を獲得する場合が多い。

乳癌は、大部分の先進国において主要な健康問題である。1996年には、新たに184,300の乳癌の侵襲性症例が米国の女性において発生したと見積もられている。北アメリカの女性において、乳癌のリスクを３〜４倍高めることに関連する特徴には、（1）乳癌に罹患した一親等の女性の家族のメンバー（母親および姉妹）、（2）事前（prior）乳癌、（3）未経産、（4）最初の妊娠が30歳以上であること、ならびに（5）早い初潮または遅い閉経（Sattin, R. W.ら、1985, JAMA 253: 1908）が含まれる。国際的研究によって、一人当たりの脂肪およびアルコールの消費量と乳癌の発生率との間の正の相関が示されている（CarrollおよびSchatazkin A.ら、1987, N. Engl. J. Med. 316: 1169）。いくつかの研究は、新鮮な果物と野菜およびビタミンEの消費量と、乳癌を含む癌を発症するリスクの低減とを関連づけている（Steinmetz, K. A.ら、1991, 癌 Causes Control 2: 427-442）。一般的にこの防御作用は、上記食品に含まれるビタミンCおよびβカロチンの抗酸化能に起因するものであるが、フラボノイドなどの他の光化学成分に関連する可能性がある。新生物疾患の予防および治療のための、リモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンの類似体の単独または癌化学療法剤と組み合わせた使用は報告されていない。近年、癌の予防および治療に使用される慣用の治療法は、栄養補助食品とみなされるまたは食品もしくは食品の一部とみなされるが健康上の利益を提供する物質により補強されることが増えている。食事成分として、メトキシル化フラボンは、細胞毒性が非常に低いと期待されるため、癌の治療剤および／または予防剤として、メトキシル化およびエトキシ化フラボンはポリヒドロキシル化フラボンと比較して毒性がかなり低い。したがって、本発明のメトキシル化およびエトキシル化リモシトリン類似体および5-デスメチルシネンセチンはまた、他の食事用抗癌フラボノイド以上の重要な利点を有するだろう。

本発明は、限定するものではないが、２種の天然に存在するメトキシル化リモシトリン類似体（3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリンおよび3,7,4'-トリメトキシリモシトリン）ならびに２種の合成リモシトリン類似体（リモシトリン3,7,4'-トリメチルエーテル 5 アセテートおよびリモシトリン3,5,7,4'-テトラエチルエーテル）を含む、いくつかの種々のリモシトリン化合物を提供する。

さらに本発明は、構造的に関連する化合物である5-デスメチルシネンセチンを提供する。

本発明の組成物および方法により予防および／または治療しうる癌には、限定されるものではないが、ヒト肉腫および癌腫、例えば癌腫としては、大腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、繊維癌腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにＨ鎖病などが挙げられる。かかる癌の特定の例に関しては以下の節に記載する。

４．１．アテローム硬化症血栓症および卒中
米国において、アテローム硬化症の合併症は、全死因の約1/2および35〜65歳の人の死因の約1/3を占める。アテローム硬化症または動脈における大きなおよび中程度のサイズのじゅく状斑の発達は、硬化症の最も一般的な形態である。根本的な原発性の病原性変化、例えば、年齢、血漿コレステロールレベルの上昇、動脈高血圧、タバコの喫煙、高密度リポタンパク質（HDL）コレステロールレベルの減少、または早発性冠状動脈疾患の家族歴に関係なく、多くの因子がアテローム硬化症の加速現象に関与している。

冠状動脈疾患に起因する死のリスクは、総血清コレステロールレベルが180 mg/dl以上であることと連続的かつ段階的に関連している（Stamler、J.ら、1986, JAMA 256: 2823）。米国の成人のうち約1/3は、該レベルが240 mg/dlを上回り、それゆえ、コレステロールレベルが180mg/dlより低い人が冠状動脈疾患を発症するリスクの２倍のリスクを負っている。アテローム硬化症の加速現象は、主にLDLの上昇、またはβ画分（コレステロール中に多く存在し、トリグリセリド中にほとんど存在しない）の上昇と相関する。HDLまたはα画分の上昇は、アテローム硬化症と負の相関にある（Castelli, W. P.ら、1986, JAMA 256: 2835）。HDLは防御作用を発揮し、HDLコレステロールに対する総コレステロールの比率は、いずれか単独のレベルよりも冠状動脈疾患のより良い予測因子となる。総コレステロールレベルは、「望ましい」（＞200 mg/dl）、「ボーダーラインより高い」（200〜239 mg/dl）、または「高い」（＞240 mg/dl）に分類される（Report of the National Education Program Expert Panel on Detection、Evaluation、and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults, 1988, Arch. Intern. Med. 148: 36）。

コレステロール代謝と冠状動脈疾患の研究における進展は、予防療法の重要性をますます強調し始めている。成人における高血中コレステロールの検出および治療のための新たなガイドラインは、高コレステロールレベルまたはボーダーラインより高いレベルを有し、かつ２つ以上のさらなるリスク因子を有する患者はLDLの測定を行うべきであることを推奨している。次に、LDLコレステロールレベルは、「ボーダーラインより高い」（130〜159 mg/dl）または「高リスク」（＞160 mg/dl）に分類する。食事療法は、LDLが高リスクのレベルである患者およびボーダーラインより高いリスクのレベルを有しかつ２つ以上のさらなるリスク因子を有する患者に対し推奨される。薬物療法は、LDLレベルが189 mg/dl以上である患者全員、およびLDLコレステロールレベルが159〜189 mg/dlであり、さらに２以上のリスク因子を有する患者に推奨される。血清コレステロールレベルを低減させるために使用されてきた多くの薬物には、コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブレート、ゲムフィブロジルおよびロバスタチンがある。高コレステロール症(hypercholestrolemia)の治療に関して、リモシトリンまたは5-デスメチルシネンセチンの単独またはコレステロール低下薬と組み合わせた使用は報告されていない。

血小板-血管相互作用は、血栓症の発症に関与している。フラボノイドは血小板凝集および粘着を阻害する（Frankel, E. N.ら、1993, Lancet 341:1103-1104）。フラボノイドは、トロンボキサン形成と拮抗し、血小板サイクリックAMPレベルを上昇させる。このことは、さらにフラボノイドが遊離ラジカルを捕捉し、それらの抗酸化作用が抗血栓作用に関与するため重要である（Gryglewski, R. J.ら、1987, Biochem. Pharmacol. 36: 317-322）。薬物療法は、血栓症および虚血性心疾患を患う患者に推奨される。医薬療法には、限定するものではないが、アスピリン、ならびにアスピリンとβアドレナリン遮断薬（例えば、プロプラノノール、ナドロール、チモロールなど）、硝酸塩（例えば、ニトログリセリン）およびカルシウムチャネル遮断薬（例えば、ベラパミル、ニフェジピン、ジルチアゼムなど）とを組み合わせた使用が含まれる。

本発明において、レモンフラボノイドリモシトリン3',8-ジメトキシ-3,5,7,4'-テトラヒドロキシフラボンから４種の化合物を合成した。リモシトリンは、リモシトリン-3-0-グルコシドとしてレモンの皮中に存在し、3-グルコシドから酵素加水分解により（Horwitz R. M.ら、1960, J. Org. Chem. 25: 21885-21887）、またはDryer D. L.ら（1964, Tetrahedron 20: 2977-2983）が報告している化学合成法により製造しうる。

２種のリモシトリン類似体（4,3,7-トリメトキシリモシトリンおよび3,5,6,4'-テトラメトキシリモシトリン）もまた、オレンジの皮中に存在する（Tatum J. H.ら、1972, Phytochemistry 11: 2283-2288）。

本発明は、いくつかの異なるリモシトリン類似体、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン（3,5,7,8,3', 4'ヘキサメトキシフラボンまたはリモシトリン3,5,7,4'-テトラメチルエーテル）、3,7,4'-トリメトキシリモシトリン（すなわちリモシトリン-3,7,4' トリメチルエーテル）、3,5,7,4'-テトラエトキシリモシトリン（すなわちリモシトリン 3,5,7,4'-テトラエチルエーテル）、リモシトリン-3,7,4' トリメチルエーテル 5-アセテート、3,7,4' トリメトキシリモシトリン（すなわち5-ヒドロ-3,7,8,3',4'ペンタメトキシフラボン）；ならびに5-デスメチルシネンセチン（すなわち5-ヒドロキシ-6,7,3',4'-テトラメトキシフラボン）を提供する。

フラボノイドは、例えば中心部においてヘテロ環ピランまたはピロン環Cを介して連結された２つのベンゼン環AおよびBである、ジフェニルピランの共通骨格を有している。この基本構造によって、種々の環における多数の置換パターンおよび変形が可能となり、フラボノール、フラボン、カテキン、フラバノン、アントシアニジンおよびイソフラボノイドを生じる（Kuhnau, J., 1976, World Rev. Nutr. Diet 24: 117-191）。

リモシトリン類似体および 5-デスメチルシネンセチンの基本構造は、上記フラボノイド構造と類似している。特定の類似体を下記に示す。

４．２．用量および製剤
リモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンと構造的に関連する化合物を、新生物疾患および／または心血管疾患、アテローム硬化症、血栓症、心筋梗塞もしくは卒中の予防および治療のためにヒトに投与する医薬製剤に製剤化しうる。

リモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチン化合物の多くは、薬学的に適合性のある対イオンと共に化合物として、可溶性でありうる形態で提供されうる。

治療用化合物または医薬組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、髄腔内、経口、直腸経由、局所的に、またはエーロゾルにより投与しうる。

経口投与に適した製剤には、有効化合物を食塩水、水もしくはPEG 400などの希釈剤に溶解した液体溶剤；予め定めた量の有効剤を固体、顆粒もしくはゼラチンとして含有するカプセル剤または錠剤；適切な媒質中の懸濁剤；ならびにエマルジョンが挙げられる。

非経口投与に適した製剤には、緩衝剤、抗酸化剤および保存剤を含有する水性および非水性の等張性滅菌水が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の密閉容器中に配合しうる。

リモシトリンの経口投与のための患者の用量は、1〜1000 mg/日、一般的には1〜500 mg/日、そして典型的には1〜100 mg/日である。体重が70 kgの患者に関して、通常の用量は、0.01〜15 mg/kg/日、一般的には0.01〜7.0 mg/kg/日、典型的には0.01〜2.0 mg/kg/日である。

合成リモシトリン類似体の経口投与のための患者の用量は、200〜5000 mg/日、一般的には1000〜2000 mg/日、そして典型的には500〜1500 mg/日である。患者の体重に関しては、通常の用量は3〜70 mg/kg/日、一般的には14〜30 mg/kg/日、典型的には7〜21 mg/kg/日である。

投与量および投与間隔は、抗増殖性、抗酸化性および抗転移性効果を維持するのに十分な活性部分の血漿レベルをもたらすように個々に調整しうる。

あるいは、経口経路ではなく、例えば、化合物を直接腫瘍に注射することにより、多くの場合デポー製剤もしくは除放性製剤の形態で局所に化合物を投与してもよい。

医薬化合物のための種々の送達系を使用することができ、それには限定するものではないが、リポソームおよびエマルジョンが含まれる。また医薬組成物は、適切な固体状もしくはゲル状相の担体または賦形剤を含んでもよい。かかる担体または賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。

更に、標的化薬物送達系、例えば、腫瘍特異的抗体でコーティングしたリポソームの形態で薬物を投与しうる。該リポソームは、腫瘍にターゲティングされて腫瘍によって選択的に取り込まれ得る。

局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は血漿濃度とは関係ない場合もあり得る。

５．実施例：MDA-MB-435細胞およびMCF-7エストロゲン受容体（ER）陽性ヒト乳癌細胞におけるカンキツ類リモシトリンの作用
リモシトリン類似体がMDA-MB-435エストロゲン受容体陰性ヒト乳癌細胞の増殖および成長に及ぼす作用を、[³H]チミジンの取り込みを測定してin vitroで研究した。

材料
Horowitz, R. M.ら（J. Org. Chem. 26: 2899-2902）に記載の方法に従って、レモンフラボノイドリモシトリンから以下の化合物を合成した：4'3,7-トリメトキシリモシトリン（5-ヒドロキシ-3,7,8,3'4'-ペンタメトキシフラボン）；3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン（3,5,7,8,3', 4'-ヘキサメトキシフラボン）；3,5,7,4'-テトラ-O-エチルリモシトリン；およびリモシトリン-3,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテート。23個の化合物すべてを、MDA-MB-435 ER-veおよびMCF-7 ER+ve細胞において試験した（表1参照）。組織培養培地およびウシ胎児血清をGibco, Burlington, ONから購入した。[³H]チミジンはICN, Irvine, CAから購入した。

細胞培養
MDA-MB-435エストロゲン受容体陰性ヒト乳癌細胞を、10%（v/v）ウシ胎児血清を補充した最少必須培地中で37℃に維持した。該培地を5% CO₂の加湿雰囲気で平衡化した。

保存培養液を2×10⁴細胞/mlの濃度で接種し、48〜72時間増殖させた。MCF-7エストロゲン受容体陽性ヒト乳癌細胞を、10%（v/v）ウシ胎児血清、1 mMピルビン酸ナトリウム、10μg/mlウシインシュリンおよび1%（v/v）抗生物質-抗真菌剤（0.85%食塩水中の10,000ユニット/mlペニシリンGナトリウム、10,000μg/ml硫酸ストレプトマイシンおよび25μg/mlアンフォテリシンB）を補充した最少必須培地中で慣例的に維持した。細胞を集密的状態になるまで37℃にて空気中に5% CO₂を含有する加湿雰囲気において増殖させ、クエン酸塩水中の2%トリプシンを用いて毎週継代した。

DNAへの[ ³ H]チミジンの取り込み
MDA-MB-435細胞を、2×10⁴個の細胞/ウエルで、96ウエル平底培養プレート中の総容量200μlの培地において平板培養し、試験化合物と共にまたは試験化合物なしで37℃で48時間インキュベートした。次に[³H]チミジン（0.5μCi/ウエル）を添加し、その４時間後に、セミオートマチック12ウエル細胞回収機を用いて細胞をガラスファイバー製濾紙上に回収した。濾紙上の放射性活性を液体シンチレーションカウンター中のScintiverseを用いて計数した。MCF-7細胞を、96ウエル平底組織培養プレート中に2×10⁴個の細胞/ウエルの濃度で接種し、37℃にて５日間インキュベートした。続いて化合物を種々の濃度で添加した。プレートを37℃にて2日間インキュベートした。次にトリチウム標識チミジン（0.5μCi）を各ウエルに添加して、各濃度において分裂している細胞数を測定した。４時間後、培地および過剰の放射性標識を除去した。トリプシン含有クエン酸塩水を添加し、細胞をガラスファイバー製濾紙上に回収し、放射性活性を計数した。分裂細胞の割合（％）は、対照細胞のcpm数に対して処理細胞のcpm数を比較して決定した。

細胞の生存率
MTTアッセイ（Hansen, M.B.ら、J, Imm. Meth., 119, 203-210）により細胞の生存率を測定した。このアッセイにおいて、テトラゾリウム塩であるMTTは、生存細胞において活性なデヒドロゲナーゼにより青色ホルマザン生成物に変換される。生じた青色の強度が細胞生存率の尺度である。MDA-MB-435細胞（8×10⁴個の細胞/ウエル）を、96ウエルプレート中の総容量200μlの培地中に種々の濃度の化合物と共に接種した。MTT（5 mg/mlで25μl）を各ウエルに添加した。３時間後、100μlの抽出バッファー（DMF（1/1）水溶液に溶解した20% SDS（pH4.0）からなる）を添加した。生成した青色をDynatech MRXマイクロプレートリーダーにおいて590 nmにて測定した。MCF-7 細胞系についても同様のアッセイ手法を使用する。細胞生存の割合（％）は、対照の吸光度と処理細胞の吸光度とを比較して決定した。

結果
結果は３回行った実験の平均である。２種類の合成類似体、リモシトリン3,5,7,4'-テトラエチルエーテルおよびリモシトリン 3,7,4'-トリメチルエーテル5-アセテートが最も有効であった。これらの化合物はそれぞれ、エストロゲン受容体陰性（ER-）ヒト乳癌細胞においてIC₅₀が0.5および0.9ppmであり、エストロゲン受容体陽性（ER+）ヒト乳癌細胞においてIC₅₀が0.08および0.05ppmであった。3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリンは、ER-細胞において匹敵する程度の活性を有したが、ER+細胞においてはそれほど有効ではなかった（それぞれIC₅₀が0.8および0.2ppm）。3,7,4'トリメトキシリモシトリンは、ER-細胞においてIC₅₀が3.1ppmで最も有効でなく、ER+細胞においては0.5であった（表1）。ER+腫瘍の治療に幅広く使用されている薬物であるタモキシフェンは、ER+細胞においてIC₅₀が0.04ppmであるが、ER-細胞においては有効ではなかった（IC₅₀＝90ppm）。タモキシフェンは、患者によっては重篤な副作用を有し、毒性を有することが見出されている。これらの結果は、リモシトリン化合物がER-細胞およびER+細胞両方の強力な阻害剤であり、タモキシフェンが有する毒性および副作用の問題を有することはないだろうということを示すものである。

本発明は、本発明の１つの態様の例示を意図する実施例に開示した実施形態により範囲を限定されるものではなく、機能的に等価な方法はいずれも本発明の範囲内に入る。

実際に、当業者であれば、本明細書の記載から本明細書に説明および記載したもの以外の本発明の種々の変更が明らかだろう。かかる変更は本発明の特許請求の範囲内に入ることを意図する。

本明細書において種々の刊行物を引用したが、これらの開示はその全文を参照により本明細書に組み入れる。

Claims

個体において癌の増殖を予防または抑制する方法であって、治療上有効な量のリモシトリンを含む組成物を、必要とされる個体に投与することを含み、前記リモシトリンが、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン、リモシトリン-3,5,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテート、3,5,7,4'テトラメトキシリモシトリンまたは3,7,4'-トリメトキシリモシトリンを含む、前記方法。
１種以上のリモシトリンをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
有効量の化学療法剤をさらに含んでなる、請求項１又は２に記載の方法。
有効量のタモキシフェンをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
癌が、大腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、繊維癌腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病；慢性白血病；真性赤血球増加症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記組成物を経口、静脈内、腹腔内、皮下または筋内に投与する、請求項１に記載の方法。
癌の予防または治療のためにヒト被検者へ投与するために、少なくとも２種の柑橘類リモシトリンを含む組成物。
治療上有効な量のリモシトリンを含む組成物を、必要とされる個体に投与することを含んでなる、個体のアテローム硬化症を予防または抑制する方法。
前記リモシトリンが、リモシトリン3,5,7,4'-テトラエチルエーテル、リモシトリン-3,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテート、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリンまたは3,7,4'-トリメトキシリモシトリンを含む、請求項８に記載の方法。
治療上有効な量の少なくとも２種のリモシトリンを投与することをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
治療上有効な量のコレステロール低下薬を投与することをさらに含んでなる、請求項８又は１０に記載の方法。
治療上有効な量のリモシトリンを含む組成物を、必要とされる個体に投与することを含んでなる、個体の血栓症を予防または抑制する方法。
柑橘類リモシトリンが、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン、リモシトリン-3,5,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテート、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリンまたは3,7,4'-トリメトキシリモシトリンを含む、請求項１２に記載の方法。
治療上有効な量の少なくとも２種のリモシトリンを投与することをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
治療上有効な量の抗血栓症薬を投与することをさらに含んでなる、請求項１２又は１４に記載の方法。
癌の予防または治療のためにヒト被検者へ投与するための、少なくとも２種のリモシトリンを含む組成物。
治療上有効な量のリモシトリンを含む組成物を、必要とされる個体に投与することを含んでなる、個体の冠状動脈性心疾患を予防または抑制する方法。
柑橘類リモシトリンが、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン、リモシトリン-3,5,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテート、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリンまたは3,7,4'-トリメトキシリモシトリンを含む、請求項１７に記載の方法。
治療上有効な量の少なくとも２種のリモシトリンを投与することをさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
治療上有効な量のコレステロール低下薬を投与することをさらに含んでなる、請求項１７又は１９に記載の方法。
冠状動脈性心疾患の予防または治療のためにヒト被検者へ投与するための、少なくとも２種のリモシトリンを含む組成物。
血栓症の予防または治療のためにヒト被検者へ投与するための、少なくとも２種のリモシトリンを含む組成物。
癌細胞に有効量のリモシトリン化合物を投与して癌細胞の増殖を抑制することを含んでなる方法。
リモシトリン化合物が、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリン、リモシトリン-3,5,7,4'-トリメチルエーテル-5-アセテート、3,5,7,4'-テトラメトキシリモシトリンまたは3,7,4'-トリメトキシリモシトリンおよびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
in vitroで投与する、請求項２３に記載の方法。
5-デスメチルシネンセチンをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
有効量の化学療法剤をさらに含んでなる、請求項２６に記載の方法。
有効量のタモキシフェンをさらに含んでなる、請求項２６に記載の方法。
２種以上の有効量のリモシトリンをさらに含んでなる、請求項２６に記載の方法。
癌が、ヒト肉腫および癌腫、例えば癌腫としては、大腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、繊維癌腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病；慢性白血病；真性赤血球増加症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
前記組成物を経口、静脈内、腹腔内、皮下または筋内に投与する、請求項２６に記載の方法。
治療上有効な量のリモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンを含む組成物を、必要とされる個体に投与することを含んでなる、個体のアテローム硬化症を予防および抑制する方法。
治療上有効な量のコレステロール低下薬を投与することをさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
治療上有効な量のリモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンを含む組成物を必要とされる個体に投与することを含んでなる、個体の血栓症を予防および抑制する方法。
治療上有効な量の抗血栓症薬を投与することをさらに含んでなる、請求項３４に記載の方法。
癌の予防または治療のためにヒト被検者へ投与するための、少なくとも１種のリモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンを含む組成物。
治療上有効な量のリモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンを含む組成物を必要とされる個体に投与することを含んでなる、個体の冠状動脈性心疾患を予防および抑制する方法。
治療上有効な量のコレステロール低下薬を投与することをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
冠状動脈性心疾患の予防または治療のためにヒト被検者へ投与するための、リモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンを含む組成物。
血栓症の予防または治療のためにヒト被検者へ投与するための、リモシトリンおよび5-デスメチルシネンセチンを含む組成物。