JPH08505762A - 神経幹細胞の遺伝子修飾 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試験管中でニューロン、神経膠星状細胞、及び乏突起神経膠細胞に分化することができる、遺伝子修飾した、表皮細胞成長因子反応性神経幹細胞を開示する。幹細胞を試験管中で増殖することができ、たくさんの細胞をさまざまな神経性疾患を処置するための移植に用いることができる。幹細胞は、ヒト又は他の動物より得ることができ、成長因子の存在下で試験管中で培養でき、先行技術で知られた技術を用いて所望のＤＮＡで遺伝子修飾することができる。また、前駆細胞は、所望の遺伝子がそのゲノムに挿入された遺伝子導入動物から誘導できる。

Description

【発明の詳細な説明】 神経幹細胞の遺伝子修飾関連出願 本願は、U.S.S.N.08/010,829号（出願日1993年１月29日）、U.S.S.N.07/726,8 12号（出願日1991年７月８日）、U.S.S.N.07/961,813号（出願日1992年10月16日 ）、及びU.S.S.N.07/967,622号（出願日1992年10月28日）の特許出願の一部継続 出願である。上記の出願の内容は、参考文献として特に本明細書中に組み込まれ る。発明の背景 本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の処置に有用な遺伝子修飾細胞（geneti cally modified cell）の製造方法に関する。特に、本発明は、成長因子反応性 （growth factor responsive）神経幹細胞の遺伝子修飾、並びに、成長因子反応 性神経幹細胞から誘導される分化神経細胞及び神経膠細胞の遺伝子修飾、並びに 、神経退化性疾患（neurodegenerative disorder）を処置するためのこれらの細 胞の使用に関する。 ＣＮＳ疾患は、神経退化性疾患（例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン 病）、急性脳創傷（acute brain injury）（例えば、卒中、頭部創傷、及び脳性 麻痺）、及びＣＮＳ機能障害（例えば、うつ病、てんかん、及び精神分裂病）の ような非常な苦痛を含む。近年、神経退化性疾患は、その疾患のために非常に危 険な状態にある初老の人々が増大していることから、重大な関心事となっている 。アルツハイマー病、多発硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、及び パーキンソン病を含む、この病気は、ＣＮＳの特定の位置の神経細胞の退化と関 係があり、それらの細胞又は脳領域が意図する機能を実行できないようになる。 神経退化性疾患に加えて、急性脳創傷は、しばしば神経細胞を欠失し、影響を受 けた脳領域が不適当に機能し、かつ、それに続く行動異常をもたらす。多分、Ｃ ＮＳ機能障害の大部分（影響を受けた人々の数に関して）は、神経細胞の欠失に よって特徴づけられるのではなく、むしろ存在する神経細胞の異常な機能による 。これは、ニューロンを不適当に剌激すること、又は神経伝達物質の異常な合成 、遊離、及び調製によるものであろう。これらの機能障害は、うつ病及びてんか んのような疾患を十分に研究し、特徴づけた結果であり、ノイローゼ及び精神 病のような疾患をよく理解していない結果であろう。 現在までのところ、ＣＮＳ疾患の処置は、主に医薬化合物を投与することによ りなされている。不幸なことに、このタイプの処置は、薬物を血液脳関門を横切 って運ぶ限定された能力、及びそれらの薬物を長期間投与する患者に必要な薬物 耐性を含む、多くの複雑化の要因を伴っている。例えば、パーキンソン病患者の ドーパミン作用性の活性の部分的回復が、レボドパ（levodopa）によって達成さ れるが、このレボドパは、血液脳関門を横切ることができるドーパミン前駆体で ある。しかし、患者は、レボドパの効果に耐性ができる。ゆえに、その効果を維 持するために即座に投与量の増加が必要となる。さらに、動きが増加し、かつ制 御できないような、レボドパに関連する、多くの副作用がある。 最近、神経学的組織移植の概念が、パーキンソン病のような神経退化性疾患の 処置に適用されている。神経移植により、薬物の常時投与の必要性をなくすだけ でなく、血液脳関門により生じる複雑な薬物送達システム（drug delivery syst em）の必要性をもなくすこととなる。 神経伝達物質を通常製造する欠失した細胞を置き換えるために、遺伝子修飾細 胞を、神経学的組織移植に用いている。例えば、繊維芽細胞（fibroblast）を、 チロシンヒドロキシラーゼ（繊維芽細胞にドーパミンを製造させる）のためのｃ ＤＮＡを含むレトロウィルスベクターで遺伝子修飾し、パーキンソン病の動物モ デルに移植した（ガーゲ（Gage）ら、米国特許第5,082,670号）。 遺伝子修飾繊維芽細胞をＣＮＳ疾患の処置に用いることにより、パーキンソン 病の動物モデルのある行動欠損（behavioral deficit）が改善する見込みがあり 、ＣＮＳへの必要な伝達物質を供給する新規なアプローチを表すが、パーキンソ ン病の処置として、及び、一般に神経退化性疾患及び脳創傷を処置する治療上の アプローチとして、いくつかの重大な欠点がある。第１に、ＣＮＳは主に３つの 細胞タイプ、即ち、ニューロン、神経膠星状細胞、及び乏突起神経膠細胞から成 る。繊維芽細胞は存在しない。ＣＮＳ内に外来性細胞（foreign cell）を移植す ること、並びに宿主細胞の機能におけるその直接及び間接の効果をいまなお研究 しなければならない。しかし、膜結合因子の発現、並びに、成長因子及びプロテ アーゼのような溶解性分子の遊離によって、その周囲の組織の通常の挙動を変化 させ るようである。これは、ニューロンへの直接の作用により、又は神経膠細胞の通 常の機能の変化により、神経剌激パターンの崩壊が生じるのであろう。 繊維芽細胞がＣＮＳに移植されるときに生じる他の関心事は、繊維芽細胞分裂 の内因性阻害をほとんど制御できないので、移植細胞が腫瘍を形成するかもしれ ないという可能性である。一方、外因性シグナルは、細胞が企てる分裂の回数を 制御するのに大きな役割を有する。移植繊維芽細胞の分裂におけるＣＮＳ環境の 効果、及び繊維芽細胞腫瘍形成の高い可能性は、長期間研究されていない。 繊維芽細胞をＣＮＳに移植する際の第３の関心事は、神経膠星状細胞、乏突起 神経膠細胞、又はニューロンが組込まれるように、繊維芽細胞がＣＮＳ細胞と組 込むことができないことである。繊維芽細胞は、内因的には、神経細胞様方法を 拡張し、宿主組織を有するシナプスを形成する能力に限られている。しかし、遺 伝子修飾及びＣＮＳへの繊維芽細胞の移植は、ある分子をＣＮＳへ伝達するため の現在の技術における改善であるが、繊維芽細胞が組込めず、ＣＮＳ組織として 機能しないこと、ＣＮＳ細胞におけるそれらの潜在的な負の効果、及び増殖につ いてのそれらの限定された内因性制御により、急性又は慢性ＣＮＳ損傷又は疾患 の処置のための移植にそれらを実務上用いることを制限する。 遺伝子修飾及び移植のために好適な組織は、ＣＮＳ細胞、即ちニューロン、神 経膠星状細胞、乏突起神経膠細胞であろう。ＣＮＳ細胞の１つの供給源は、ヒト 胎児性組織からのものである。いくつかの研究により、胎児性ＣＮＳ組織の移植 を受けた後にパーキンソン病の患者に改善が見られた。ヒトの患者の尾状器官及 び被殻にドーパミン細胞を含む未発達中脳組織を移植することにより、パーキン ソン病が進んだ何人かの患者に長期にわたる臨床上の利益があることが、フリー ド（Freed）ら（N Engl J Med 327巻:1549-1555（1992年））によってわかった 。同様な成功がスペンサー（Spencer）ら（N Engl J Med 327巻:1541-1548頁（1 992年））によっても示された。ウィナー（Widner）ら（N Engl J Med 327巻:15 56-1563頁（1992年））は、胎児性中脳組織の両側性移植を受けたMPTP誘導パー キンソン症候群の患者に長期間の機能向上があることがわかった。 上記の研究は励みになるが、病気の処置のために流産した胎児の組織を用いる ことは、倫理的な考慮と政治的な障害が生じる。また他の考慮もある。胎児の ＣＮＳ組織は、１以上の細胞タイプから成り、よって、組織の明確な供給源とは ならない。さらに、胎児組織を十分かつ常時に供給することが、移植に対して入 手可能なのか否かという重大な疑問がある。例えば、MPTP誘導パーキンソン症候 群（ウィナー、上述）の処置において、１人の患者の脳の移植に、６〜８体の胎 児からの組織が用いられた。また、胎児組織を調製する間、雑菌混入の潜在性の 問題もある。さらに、組織が既にバクテリア又はウィルスで感染されており、使 用する各々の胎児について、費用のかかる診断検査が必要となるかもしれない。 しかし、診断検査をしても、感染した組織が全てわかるわけでもない。例えば、 ＨＩＶフリーの組織の診断は保証できない。その理由は、一般にウィルスに対す る抗体が感染後数週間まで現れないからである。 胎児組織の代わりに、無制限量で入手可能であり、移植のための組織の、明確 かつ再現性ある供給源を有することがより好ましいであろう。神経組織は最小の 分裂をするので、これらの基準に容易には合致しない。神経膠星状細胞は分裂す る能力を保持し、多分、外来性遺伝子での感染を分析できるが、神経細胞とシナ プスを形成する能力は限定され、外来性遺伝子生成物の発現及び遊離の外因性調 節も結局限定される。 乏突起神経膠細胞についても、同じような問題のいくつかを受ける。また、成 熟乏突起神経膠細胞は分裂せず、乏突起神経膠細胞の始原細胞（即ち、Ｏ２Ａ細 胞）への感染を制限する。しかし、乏突起神経膠細胞始原細胞の限られた増殖能 力のため、これらの細胞の感染及び収穫（harvesting）は、実務上の供給源とは ならない。 ニューロンの外来性遺伝子による感染、及びＣＮＳへの移植は、方法を拡張さ せ、シナプスを作り、環境によって調節される能力を考慮すると、理想的であろ う。しかし、分化したニューロンは分裂せず、化学的及び物理的手段による外来 性遺伝子でのトランスフェクションは効力がなく、又はそれらは長期間安定では ない。試験管中で（in vitro）第１の神経前駆体をレトロウィルス・ベクターで 感染させることは、実用的ではない。その理由は、神経芽細胞が大量のニューロ ン（ニュ-ロンが組込まれ、外来遺伝子を発現する）の選択をする分裂が限られ るように制御されるか、ほとんど不可能だからである。ガン遺伝子のレトロウィ ルス運搬体により神経前駆体を不死化する可能性、及びそれに続く所望の遺伝子 の感染は、移植細胞による腫瘍形成の潜在性のため、好ましくない。 非常にたくさんの分裂ができないニューロンに伴う問題を克服する、ある試み が、神経細胞系を確立したロネット（Ronnett）らによって開示されている（Sci ence 248巻 、603-605頁（1990年））。細胞系は悪性ではないが、一側性のメガ レンセファリィ（megalencephaly）、ニューロンの低度な増殖、及びニューロン の移動乱れを有する患者から得た大脳皮質組織から誘導される。しかし、この細 胞系の特性が与えられているが、一旦細胞が宿主CＮＳに移植されると、分裂を 止めることができるのかということに関して疑問である。 外来性遺伝子をＣＮＳに導入する他のアプローチが、モアシャッド（Morshead ）及びファン・デア・コイ（Van Der Koy）（J.of Neurosci、12（1）巻、249-2 56頁（1992年））によって示唆される。上衣下（subependymal）細胞を、E.coli β−ガラクトシダーゼのための遺伝子を有する複製欠乏組替えレトロウィルスで 感染させた。³Ｈチミジン及びＢｒｄＵ組み込みを用いて、ＣＮＳのこの領域に 連続有糸分裂があることがわかった。増殖細胞は、細胞が無限増殖的に非対称な 幹細胞に分裂するという事実をベースとした幹細胞であることを、モアシャッド （Morshead）及びファン・デア・コイ（Van Der Koy）は示唆する。即ち、分裂 細胞はある多能性（multipotential）細胞を生じるが、他の娘細胞の運命は細胞 死である。この考えの基礎となるのは、分裂速度が一定であるのに、ＣＮＳの領 域での細胞数が相対的に増加しないことによる。 内因性幹細胞が無限増殖的に分裂するという事実から、それらをレトロウィル ス・インフェクションを経る遺伝子修飾の好適なターゲットとできる。しかし、 これらの細胞は、密度が約５細胞／１００立方ミクロン未満でしかＣＮＳ内に存 在せず、分裂速度及び分裂数は、後成的調製下で少なくとも部分的であるようで ある。よって、上衣下幹細胞を内因性増殖させる上での大きな制限は、その細胞 がＣＮＳに固定数で存在し、新しい遺伝子の導入が制御困難であるということに ある。第２の大きな制限は、げっ歯類及び霊長類において細胞が空間的に上衣下 層に限定されており、幹細胞又はその子孫がＣＮＳの他の領域に移動できないこ とにある（スマート（Smart）、J．of Comp．Neurology、116巻、325-347頁 （1961年）；ルイス（Lewis）、Nature、217巻、974-975頁（1968年））。同じ 細胞は、他のＣＮＳ領域に記載されておらず、もし存在しても、それらを同定で きない。 先行技術において、非ＣＮＳ組織移植が宿主組織に完全に組込むことができな いということ、及び非腫瘍性で、組込み可能なＣＮＳ細胞を、移植のために信頼 できる供給源から無制限量での利用可能性がないことは、多分、神経移植におけ る最大の制限である。発明の要約 神経細胞の培養方法及び移植方法を含む、先行技術に伴う前述の欠点を考慮し て、遺伝子修飾され、ニューロン及び神経膠細胞へと分化することができ、ホ乳 類のＣＮＳに組込むことができる、神経移植のための、非形質導入細胞が無制限 量で、かつ信頼できる供給源として、当業界に必要であることは明らかである。 よって、本発明の目的は、移植のための遺伝子修飾した、及び後成的調節した 細胞の信頼できる供給源を提供することにある。また、この細胞は、ＣＮＳへの 移植において、さらにニューロン及び神経膠細胞に分化し、存在するＣＮＳ構造 に組込まれる。 本発明の他の目的は、遺伝子修飾のために大量に扱うことができる細胞の豊富 な供給源を提供することにある。 また、本発明の他の目的は、ＣＮＳ内のほとんどいかなる場所へも即座に移植 することができる遺伝子修飾細胞を提供することにある。 本発明のこれらの目的及び他の目的、並びに本発明の特徴は、以下の説明及び 請求の範囲から、当業者にとってみれば明らかであろう。 ＣＮＳ疾患の処置に有用な遺伝子修飾細胞の製造方法を開示する。この方法は 、（a）ドナー組織から神経幹細胞を単離する工程、（b）該神経幹細胞を前駆細 胞を得るための成長因子を１以上含む培地で増殖する工程、及び（c）幹細胞及 び前駆細胞を遺伝子修飾して、ＣＮＳ疾患の処置に有用な細胞を製造する工程を 有する。 他の態様として、ＣＮＳ疾患の処置に有用な遺伝子修飾細胞の製造方法は、（ a）遺伝子導入ドナーから神経幹細胞を単離する工程、（b）該神経幹細胞を成長 因子を１以上含む培地で増殖してＣＮＳ疾患の処置に有用な前駆細胞を得る工程 を有する。 ＣＮＳ疾患の処置に有用な生物学的活性物質を製造する遺伝子修飾前駆細胞を 、患者のＣＮＳに移植するＣＮＳ疾患処置方法も開示する。 前述の参考文献は、特許を請求する本発明を開示するものではなく、先行技術 としてのものである。この参考文献は背景情報のために提供する。図面の簡単な説明 図１：β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むレトロウィルスを感染させた遺伝子 修飾前駆細胞の写真。遺伝子を含む細胞は、特徴的な青色の反応生成物を示す。 図２：含β−ガラクトシダーゼ前駆細胞が移植された、新生マウスの皮質のセ クションの移植後２−４週間の写真。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む移植細 胞は特徴的な青色の反応生成物を示す。好適な態様の説明 神経幹細胞（ＮＳＣ）が報告され、それの潜在的な使用が、レイノルズ（Reyn olds）及びワイス（Weiss）、Science255巻：1707頁（1992年）に記載されてい る。これは本明細書中に参考文献として組み込まれる。『幹細胞』の語は、無制 限の増殖が可能で、多くの始原細胞（始原細胞は、その代わりに、分化した又は 分化可能な娘細胞を生じることができる）を発生可能な能力を有する幹細胞を生 じることが可能な未分化細胞をいう。『神経幹細胞』（ＮＳＣ）の語は、本発明 の幹細胞をいい、適当な培養条件下での子孫をいい、神経膠細胞及び神経始原細 胞を含む。ＮＳＣが神経芽細胞を生じること（レイノルズ（Reynolds）及びワイ ス（Weiss）、Restorative Neurology & Neuroscience 4巻：208頁（1992年）、 参考文献として本明細書に組み込まれる）がわかった。ＮＳＣは、大部分の大膠 細胞タイプ（神経膠星状細胞及び乏突起神経膠細胞）を生じることも知られてい る。 神経幹細胞は、ヒト又は他の動物の供給源からの成人又は胎児の神経組織を含 む、さまざまなドナー組織から生成することができ、レイノルズ（Reynolds）及 びワイス（Weiss）（上記）の方法により培養できる。『ドナー』の語は、本発 明で用いた神経幹細胞の供給源であるヒト又は他の動物をいう。ある状況では、 ドナーは遺伝子導入動物である。『遺伝子導入動物』の語は、ＤＮＡのセグメン トがすべての細胞のゲノム（生殖細胞を含む）に物理的に組込まれ、そのためＤ ＮＡを子孫に伝達できる、ヒト以外の動物をいう。 本発明の神経幹細胞は、成長因子反応性である。ある所定の無血清培地、及び 表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）などのような成長因子又はミトゲン（mitogen）の 存在下で成長させた場合、その細胞は分裂が誘発され、未分化細胞のクラスター を生じる。『神経球（neurosphere）』の語が用いられ、細胞のクラスターをい う。少なくとも細胞のいくつかは、ネスチン（＋）表現型（nestin（+）phenoty pe）である。クラスターは、幹細胞及び／又は始原細胞を有し、分化細胞を含ん でも、含まなくともよい。『始原細胞』の語は、神経幹細胞から誘導された未分 化細胞をいい、適当な条件下での神経膠細胞及び/又は神経始原細胞を含む子孫 をいう。 本明細書で用いるとき、『前駆細胞』の語は、成長因子又は成長因子の組合せ を含む培地で増殖した神経幹細胞から誘導された、本明細書の生細胞（living c ell）をいい、『前駆細胞』の語は始原細胞及び幹細胞の両者を含む。神経球の 細胞は後に前駆細胞とよばれる。前駆細胞は代表的には神経球の形態で成長する が、培地の条件によって異なる成長パターンを示すことができる。本明細書で用 いるとき『成長因子』の語は、タンパク質、ペプチド、ミトゲン、又は成長、増 殖、分化、又は栄養効果（trophic effect）を有する他の分子をいう。また、成 長因子の語は、成長因子のいかなる組合せも含む。そのような成長因子には、神 経成長因子（ＮＧＦ）、酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧ Ｆ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、甲状腺剌激ホルモン放出ホルモン（Ｔ ＲＨ）、ＥＧＦ、ＥＧＦ様リガンド、アンフィレグリン（amphiregulin）、形質 転換成長因子アルファ及びベータ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、インシュリン様成長 因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。 前駆細胞は非形質転換一次細胞であるが、それらは無限増殖性細胞系の特徴を 有する。ＥＧＦのような成長因子の存在下の未分化状態で、細胞は無限増殖的に 分裂し、ゆえに、遺伝子修飾の優れたターゲットとなる。本明細書で用いるとき 『遺伝子修飾』の語は、外因性ＤＮＡの導入による、安定な又は一過性の前駆細 胞の遺伝子型の変形をいう。ＤＮＡは合成、又は天然由来のものであるのがよく 、遺伝子、遺伝子の部分、又は他の有用なＤＮA配列を含んでもよい。本明細書 で 用いるとき『遺伝子修飾』の語は、天然ウィルス作用、天然遺伝子再結合などに より生じるような、天然で生じる変形を含まないことを意味する。外因性ＤＮＡ は、ウィルスベクター（レトロウィルス、修飾ヘルペスウィルス、ヘルペスウィ ルス、アデノウィルス、及びアデノ随伴ウィルスなど）、又は直接ＤＮＡトラン スフェクション（リポフェクション（lipofection）、リン酸カルシウム・トラ ンスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、及びエレクトロポレーションなど） によって前駆細胞に導入することができる。本発明の遺伝子修飾細胞は、完全に 分化し、多くの分化プロトコールを用いて再現できるようにニューロン又は大膠 細胞を製造する能力を有するという、さらに付加した利点を有する。 他の態様として、前駆細胞は、遺伝子導入動物から誘導され、よって、ある意 味では、すでに遺伝子修飾されている。遺伝子導入動物を発生させるのに現在い くつかの方法が用いられる。最もしばしば用いられる技術は、ＤＮＡを単個細胞 の受精卵に直接微量注射する方法である。他の技術には、レトロウィルス仲介転 移（retroviral-mediated transfer）、又は胎児性幹細胞内の遺伝子転移（gene transfer in embryonic stemcell）が挙げられる。これら及びその他の技術は、 ホーガン（Hogan）ら、Manipulatingu the Mouse Embryo、A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory Ed，1986年）に詳しく、これは本明細書に参 考文献として組み込まれる。これらの遺伝子導入動物の使用には、健康な神経球 をトランスフェクションする必要がないという事実を含む、ある利点を有する。 遺伝子導入動物から誘導される前駆細胞は、安定した遺伝子発現を示すであろう 。遺伝子導入動物を用いることにより、新しい遺伝子的組合せを発生することが できる。遺伝子導入動物は、神経細胞により発現された、いかなる有用な遺伝子 もそのゲノムに組込むことができる。有用なＤＮＡの例を、遺伝子修飾前駆細胞 について以下に議論する点で挙げる。 ＣＮＳに細胞移植する際の重要な難題は、宿主内に移植後のドナー細胞の同定 である。トリチウム・ラベル、蛍光染料、デキストラン、及びリポーター遺伝子 を運ぶウィルスベクターを含むドナー細胞をマークするために多くの計略がなさ れている。しかし、これらの方法は、毒性、安定性、又は長期間にわたる希釈と いう固有の問題を受ける。遺伝子導入動物から誘導した神経細胞を用いることに より、移植神経細胞の同定を達成できる改善した手段が提供できる。遺伝子導入 マーキングシステムにより、細胞ラベルのための、より安定した、効果的な方法 を提供する。このシステムで、例えば膠細胞繊維性酸性タンパク（ＧＦＡＰ）及 びミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）のプロモーター要素が、遺伝子導入マウス のE.coliβガラクトシダーゼのレポーター遺伝子の発現を指示することができる 。これらのシステムで、レポーター遺伝子の細胞特異性発現が、神経膠星状細胞 （ＧＦＡＰ-lacＺ）中及び乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ-lacＺ）中で、発生調節さ れたように生じる。 一旦増殖すると、神経球細胞を、単細胞サスペンジョンへ機械的に分離し、一 晩おくことができる培地中のペトリ皿上に置く。前駆細胞をその後遺伝子修飾す る。前駆細胞が遺伝子導入細胞から発生する場合、細胞の所望の特性に依存して 、その後、それをさらに遺伝子修飾するか、又は修飾しない。細胞のいかなる有 用な遺伝子修飾も本発明の範囲内にある。例えば、前駆細胞を修飾し、例えば神 経伝達物質又は成長因子などの生物学的活性物質を製造させるか、又はその製造 を増加させる。遺伝子修飾は、組替えレトロウィルスでのインフェクション又は 先行技術で既知の方法（マニアチス（Maniatis）ら、Molecular Cloning:A Labo ratory Manual、Cold Spring Harbo rLaboratory，N.Y．（1982年）を参照のこ と）を用いたトランスフェクションによって行われる。簡単には、キメラ遺伝子 構築物はウィルス、例えばレトロウィルス長末端繰り返し（ＬＴＲ）、シミアン ウィルス（ＳＶ４０）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）；又は、チロシン・ヒ ドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）、フェニ ルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ）、コリンアセチル トランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、膠細胞繊維性酸性タンパク（ＧＦＡＰ）、神 経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）、ニューロフィラメント（ＮＦ）タンパク（ＮＦ −Ｌ、ＮＦ−Ｍ、及びＮＦ−Ｈなど）のような、所望のタンパク質をコードする 構造遺伝子の発現を指示するホ乳類細胞特異性プロモーターを含むであろう。ま た、ベクターには、実験遺伝子でコインフェクト（coinfect）されたとき、ゲネ チシン（geneticin）（Ｇ４１８）、タンパク質合成阻害剤への耐性を授与する 、E.coliアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような薬物選択 マーカー が含まれるであろう。 遺伝子修飾が生物学的活性物質の製造のためであるとき、その物質は、一般に 、任意のＣＮＳ疾患の処置に有用なものであろう。例えば、ある成長因子生成物 を分泌するような細胞を遺伝子修飾するのが好ましいであろう。本明細書で用い るとき、『成長因子生成物』の語は、タンパク質、ペプチド、ミトゲン、又は成 長、増殖、分化、又は栄養効果を有する他の分子をいう。ＣＮＳ疾患の処置に有 用な成長因子生成物には、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（brai n-derived neurotrophic factor）（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（neurotr ophin）（ＮＴ−３、ＮＴ−４／ＮＴ−５）、毛様体神経栄養因子（ciliary neu rotrophic factor）（ＣＮＴＦ）、アンフィレグリン、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、Ｅ ＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、及びインターロイキンが挙げら れるが、これらに限定されない。 細胞が修飾され、ｐ７５低親和性ＮＧＦr、ＣＮＴＦr、ニューロトロフィン受 容体のtrkファミリー（trk、trkＢ、trkＣ）、ＥＧＦr、ＦＧＦr、及びアンフィ レグリン受容体を含むある成長因子受容体（r）を発現することができる。細胞 を処理して、セロトニン、L-ドーパ、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフ リン、タキキニン、Ｐ物質、エンドルフィン、エンケファリン、ヒスタミン、N- メチルD-アスパーテート（ＮＭＤＡ）、グリシン、グルタミン、γ−アミノブチ ル酸（ＧＡＢＡ）、及びアセチルコリンなどのような、さまざまな神経伝達物質 又はその受容体を製造することができる。有用な神経伝達物質−合成遺伝子には 、ＴＨ、ドーパ・デカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）、ＤＢＨ、ＰＮＭＴ、グルタミ ン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ＣｈＡ Ｔ、及びヒスチジンデカルボキシラーゼが挙げられる。さまざまな神経ペプチド をコードする遺伝子（ＣＮＳ疾患の処置に有用であると証明できる）には、物質 Ｐ、神経ペプチド−Ｙ（ＮＰ−Ｙ）、エンケファリン、バソプレシン、血管作用 性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、グルカゴン、ボンベシン、コレシストキニン（ＣＣ Ｋ）、ソマトスタチン、及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）など が挙げられる。 成功した、トランスフェクトした／インフェクトした細胞を選択した後、それ らを９６個のくぼみのあるプレート中で限界希釈を用いてクローンして、所望の 生物学的活性物質の存在を分析した。所望の物質を高レベルで発現するクローン を成長させ、それらの数をＴフラスコ中で拡大した。特異的な細胞系をその後凍 結保存する（cyropreserve）ことができる。遺伝子修飾前駆細胞系は、細胞／遺 伝子治療に用いることができ、よって、遺伝子修飾細胞によって製造した生物学 的活性分子の必要な患者のＣＮＳに移植することができる。遺伝子修飾前駆細胞 の多くのクローンが得られるであろう。あるものは、神経細胞を優先的に生じる であろうし、他のものは神経膠細胞を生じるであろう。 また、遺伝子修飾前駆細胞は、移植の前に試験管内で（invitro）さまざまな 分化プロトコールを受けることができる。例えば、増殖できる培地から遺伝子修 飾前駆細胞を取り除き、その細胞のニューロン又は大膠細胞への分化を誘発する 成長因子又は成長因子の組合せを含む培地で処理してもよい。分化プロトコール は、同時係属中の出願U.S.S.N.07/967,622号（出願日1992年10月28日）に述べら れている。用いたプロトコールは、所望の遺伝子修飾細胞のタイプに依存するで あろう。ポリ−L-オルニチン又はポリ−L-リジンをコートしたフラスコなどを含 む固定基質（fixed substrate）に前駆細胞を置くことによって、分化を誘発す ることができる。 さまざまなマーカーが、分化細胞を同定するのに用いられる。乏突起神経膠細 胞を生じる乏突起神経膠前駆細胞は、表現型Ａ２Ｂ５（＋）、Ｏ４（＋）／Ｇａ ｌＣ（−）、ＭＢＰ（−）、及びＧＦＡＰ（−）を有することができる［この表 現型に限定されない］。乏突起神経膠細胞（ＣＮＳ内で軸索を周囲におくミエリ ンを形成する神経膠細胞である）は、表現型ガラクトセレブロサイド（＋）、ミ エリン塩基性タンパク（＋）、及び膠細胞繊維性酸性タンパク（−）［ＧａｌＣ （＋）、ＭＢＰ（＋）、ＧＦＡＰ（−）］を有する。 ニューロンは、次の表現型マーカーを１以上有することができる。ニューロン 特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）、ニューロフィラメント（ＮＦ）タンパク、タウ-1 、及びＭＡＰ-2である。多くの古典的な神経伝達物質酵素のあらゆるものの発現 をベースとして、ニューロンを同定することができる。また、形態的基準及び電 気生理学的記録のような他の機能的な測定をベースとして、ニューロンを同定す る ことができる。そのような同定は、上記の表現型マーカーの１以上の同定と組合 わせて行われる。 タイプＩ神経膠星状細胞は、平坦な原形質/繊維芽細胞様の形態を有する神経 膠細胞である。これらの細胞は、表現型ＧＦＡＰ（＋）、Ａ２Ｂ５（−）、Ｇａ ｌＣ（−）、及びＭＢＰ（−）を有する。タイプＩＩ神経膠星状細胞（星状突起 軸受形態（stellate process-bearing morphology）を示す神経膠細胞である） は、表現型ＧＦＡＰ（＋）、Ａ２Ｂ５（＋）、ＧａｌＣ（−）、及びＭＢＰ（− ）を有する。 一旦、細胞が分化すると、所望のタンパク質の発現について、それらを再度分 析する。所望の表現型を有する細胞を単離することができ、遺伝子修飾細胞によ り発現したタンパク質又は生物学的活性分子の必要な患者に移植することができ る。 前駆細胞をＣＮＳに移植する、いかなる好適な方法も用いることができ、これ により、細胞が適当にＣＮＳに組込まれる。ダンカン（Duncun）ら、J．Neurocy tology、17巻、351-361頁（1988年）（本明細書中に参考文献として組込まれる ）により用いた方法により、注入法は例示され、ヒトに用いるためにスケールア ップされ、修飾されたものが好ましい。ゲイグ（Gage）ら、米国特許第5,082,67 0号（本明細書中に参考文献として組込まれる）により教示される、ＣＮＳへの 繊維芽細胞のような細胞サスペンジョンの注入のための方法は、前駆細胞の注入 にも用いることができる。さらなるアプローチ及び方法が、Neural Grafting in the Mammalian CNS（ビヨーク（Bjorkund）及びシュテネビ（Stenevi）、eds. 、（1985年））（本明細書中に参考文献として組込まれる）に見出すことができ る。注入した遺伝子修飾細胞の数は、治療の効果を提供するのに必要な量であり 、処置する条件により変化するであろう。一般に、遺伝子修飾神経前駆細胞は、 １０細胞／１００立方ミクロンを越えた濃度で脳の中に存在するであろう。 前駆細胞が患者に注入され、非宿主組織（即ち、同種移植又は異種移植）から 誘導されるとき、移植の長寿を保証するために免疫抑制技術が必要となる。局所 免疫抑制は、グルーバー（Gruber）、Transplantation54巻、1-11頁（1992年） に開示されており、これは本明細書中参考文献として組込まれる。ロッシーニ （Rossini）、米国特許第5,026,365号（本明細書中参考文献として組込まれる） は、局所免疫抑制に好適な被包方法を開示する。 免疫抑制の技術を使用する代わりに、遺伝子置換又は胎児性幹細胞の相同再結 合を用いるノックアウト（knockout）法が、スミシーズ（Smithies）ら（Nature 、317巻、230-234頁（1985年））により教示され、細胞系の遺伝子置換又はノッ クアウトに拡張した（H.Zheng35ら、PNAS、88巻、8067-8071頁（1991年））。双 方ともに本明細書中参考文献として組込まれる。この方法は、主要組織適合性遺 伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子の切除（ablation）のための前駆細胞に適用するこ とができる。ＭＨＣ発現を欠く前駆細胞は、豊富な神経細胞個体群を、患者を免 疫抑制する必要性がなく、同種、及び多分異種の組織適合性障害を越えて移植す ることができる。ドナー細胞の抗原性を減少させる再結合法の使用のための概論 及び引用は、グルーバー（Gruber）（上記）によって開示されている。表面改質 による移植の免疫原性の減少への具体的なアプローチが、ファウストマン（Faus tman）WO92/04033（1992年）に開示されており、これは本明細書中参考文献とし て組込まれる。 神経組織の固体組織フラグメント及び細胞サスペンジョンは、全体として免疫 原性であるので、移植内の個々の細胞タイプは、度合が低いがそれら自身免疫原 性であることが可能である。例えば、バートレット（Bartlett）ら（Prog．Brai n Res．82巻 、153-160頁（1990年））（本明細書中参考文献として組込まれる） は、ＭＨＣ発現の基礎にある免疫床分離を使用することにより、移植のための胎 児性神経上皮細胞の特定生物型群（subpopulation）を前もって選択することに よって、神経同種移植拒絶を排除している。このように、免疫抑制技術を用いな い患者によって、同種及び異種移植拒絶の機会を減少させる、他のアプローチが 提供された。 ヒトの移植に関する試験結果から、パーキンソン病の脳に胎児中脳組織同種移 植が生存することが比較的低いことがわかった（フリード（Freed）ら及びスペ ンサー（Spencer）ら、上述）。移植材料の生存が低いのは、同じ病気関連因子 によって生じ、元が同じである神経退行による。環境（患者自身のニューロンに 毒性がある）が、移植した組織又は細胞と同じように毒性があると予想すること ができる。これを支持するものとして、ＭＰＴＰ損傷したヒトに胎児中脳組織を 移植したことから提供された重要な機能の向上の報告がある（ワイドナー（Widn er）ら、上述）。パーキンソン病の脳の状況と異なり、ＭＰＴＰ誘導パーキンソ ン症候群は、パーキンソン病に伴う突発性プロセスを発生せずに、主に黒質のド ーパミン作動性ニューロンの機能欠損にある。パーキンソン病の脳と異なり、Ｍ ＰＴＰ損傷したヒトの脳は、移植の際の神経毒性が全くないようである。 最近、新規なクロム親和性顆粒アミン運搬体（ＣＧＡＴ）ｃＤＮＡが、リュー （Liu）ら（Cell,，70巻、539-551頁（1992年））によって記載されており（こ れは本明細書中に参考文献として組込まれる）、この物質が、試験管内で（in v itro）ＣＨＯ細胞中の神経毒ＭＰＰ＋への耐性を示す。黒質からのドーパミン作 動性ニューロンは、ＭＰＰ＋によって特異的に殺されるので、前駆細胞中のＣＧ ＡＴ遺伝子発現により、前駆細胞をパーキンソン病の脳に移植後、細胞の生存度 を向上させることができる。 本明細書中に記載する発明をより十分に理解するために、次に実施例を記載す る。この実施例は、例示のためだけであり、発明の範囲を限定するために述べる ものではない。実施例 実施例１ 前駆細胞の増殖 生後１４日（Ｅ１４）ＣＤ１アルビノマウス（チャールズ・リバー）を断頭し 、脳及び線条体（striata）を無菌法を用いて除去した。その組織を炎研磨した （fire-polished）パスツールピペットで分離し、ダルベッコ修飾イーグル培地 （ＤＭＥＭ）：Ｆ−１２栄養素混合物（Gibco）が１：１の混合物からなる無血 清培地に移した。その細胞を５分間８００r.p.m.で遠心し、上澄みを吸引し、細 胞をＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に測定のため再懸濁した。 この細胞を、グルコース（０．６％）、グルタミン（２ｍＭ）、重炭酸ナトリ ウム（３ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（4-［2-ヒドロキシエチル］−1-ピペラジンエタン スルホン酸）緩衝液（５ｍＭ）、並びに、インシュリン（２５μｇ／ｍｌ）、ト ランスフエリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレッ シン（６０μＭ）、及び塩化セレン（３０ｎＭ）（グルタミン［Gibco］を除き 、すべてシグマ（Sigma）から購入）を含む所定のホルモン混合物及び塩混合物 （血清と置換するため）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）からなる無血清培 地（後に『完全培地』という）に懸濁させた。さらに、培地は、ＥＧＦ（マウス 下あご腺から精製した、Collaborative Research）又はＴＧＦα（ヒト組替え、 Gibco）を１６−２０ｎｇ／ｍｌ含んでいた。基質の前処理をせずに、細胞を７ ５ｃｍ²組織培養フラスコ（コーニング（Corning））中に０．２×１０⁶細胞／ ｍｌで移し、３７℃、湿度１００％、９５％空気／５％ＣＯ₂のインキュベータ ー中に入れた。 細胞を、最初の４８時間内で増殖し、３−４日までに試験管内で（days in vi tro（ＤＩＶ））、小さなクラスター（神経球として知られている）を形成し、 ４−６ＤＩＶ間で基質から離した。 ７ＤＩＶ後、神経球を除去し、２−５分間４００r.p.m.で遠心し、ペレットを 炎研磨したパスツールピペットで、個々の細胞に機械的に分離し、完全培地２ｍ ｌに移した。 １×１０⁶細胞を、ＥＧＦ含有完全培地２０ｍｌを有する組織培養フラスコ７ ５ｃｍ²に移した。幹細胞の増殖、及び新しい神経球の形成が再初期化された。 無制限量の幹細胞を発生させるために、この手順を６−８日毎繰り返した。 実施例２ バクテリアル・β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むレトロウィルスでの前駆細 胞の遺伝子修飾 前駆細胞を実施例１で記載されるように増殖した。神経球（４−５日経過）の 大きなパス-1フラスコを振って、フラスコからその球を取り除いた。そのフラス コを３−５分間４００r.p.m.で回転させた。神経球を乱さないように、培地の約 半分を除去した。その球及び残りの培地を除去し、ファルコン（Falcon）１２ｍ ｌ遠心管に入れ、３−５分間６００r.p.m.で回転させた。残りの培地を除去し、 数百マイクロリッターを残した。 バクテリアル・β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んだレトロウィルスを、セプ コ（C.Cepko）によって製造したＣＲＥ ＢＡＧ２細胞系により、複製不足な状 態で、充填させ、分泌させた。ＣＲＥ細胞が集密になった１日後、細胞をＰＢＳ で洗浄し、レトロウィルスをＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＨＭ／20ng/ml ＥＧＦ中で４ 日間収集した。ウィルス含有培地を０.４５μｍシリンジフィルタ（syringe fil ter）で濾過した。神経球をウィルス含有培地に再懸濁し、大きなフラスコに移 し、３７℃で一晩インキュベーター中に放置した。翌日、フラスコの内容物を１ ２ｍｌ遠心管に移し、８００r.p.m.で遠心した。細胞をＥＧＦ含有培地／ＨＭに 再懸濁し、単細胞に分離させ、数を計測した。細胞を、全体積２０ｍｌ中、５０ ，０００細胞／ｍｌとなるように、大きなフラスコに再度移した。 ４日後、形質転換細胞をＧ４１８で濃度３００μｇ／ｍｌで選択した。形質転 換球を、２４個のくぼみがあるプレート中のポリオルニチンでコートしたカバー ガラス上に置いた。神経球をそのプレートに付着した後、細胞を４℃で５分間グ ルタルアルデヒド０．１％で固定した。細胞を固定した後、細胞をＰＢＳで１０ 分間２度洗浄した。その後細胞をＰＢＳ中のトリトン（Triton（登録商標））0. 1％で１０−１５分間室温で洗浄した。Ｘ−Ｇａｌ １ｍｇ／ｍｌ溶液を各々の くぼみに加え、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、細胞をＰＢＳで１０分間３ 度洗浄し、いかなる反応生成物をも観察した。積極的な反応により、伝達遺伝子 を含む細胞を示す、青色となった。 実施例３ 遺伝子導入マウスからの前駆細胞の調製 遺伝子導入マウスを、ＭＢＰのプロモーターがE.coli β−ガラクトシダーゼ （ｌａｃＺ）の発現を指示する、ＭＢＰ−ｌａｃＺキメラ遺伝子の標準前核注入 を用いて製造した。遺伝子導入動物をｌａｃＺに特異なオリゴヌクレオチドを用 いるＰＣＲによって同定した。 神経球を、実施例１で述べた方法を用いてＥ１５遺伝子導入マウス及びＤＮＡ ネガティブ同腹子（negative littermate）から調製した。神経球を、ＥＧＦ２ ０ｎｇ／ｍｌの存在下所定の培地で増殖させ、３５週間経過させた。経過後、神 経球を取り込み、ゆっくりと８００ＲＰＭで遠心し、機械的に炎研磨したパスツ ールピペットで粉砕することによって分離させた。さまざまな経過期間で、培地 の条件を変化させることにより、細胞を誘発して、乏突起神経膠細胞、神経膠 星状細胞、及びニューロンに分化させた。フリーフローティング（free-floatin g）幹細胞クラスターをゆっくりと遠心し、ＥＧＦを用いない、１％仔ウシ血清 を有する同じベースの所定の培地に再懸濁させ、ポリオルニチン処理したカバー ガラス上に置いて、細胞接触を促進させた。クラスターはガラスにしっかりと付 着し、細胞はゆっくりと、又は分裂するのをやめて、分化し始めた。 さまざまな細胞タイプの同定を、ニューロン（MAP-2、NF-L、及びNF-M）、神 経膠星状細胞（GFAP）、及び乏突起神経膠細胞（A2B5、O₁、O₄、Gal C、及びMBP ）に特異的な抗体を用いる免疫蛍光顕微鏡検査法を用いて行った。植え付け後１ 〜１４日後、カバーガラス上の細胞を、通常ヤギ血清５％、及びＨＥＰＥＳ緩衝 液２５ｍＭ、ｐＨ7.3（ＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ、ＮＧＳ）で希釈した、第１の抗体 、O₁、O₄、Gal C、及びA2B5（上澄み）で、室温で３０分間固定せずに培養した 。第１の抗体に続いて、ＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ、ＮＧＳで希釈した、ローダミン結 合した第２の抗体（シグマ（Sigma））中で、カバーガラスをゆっくり５回洗浄 した。カバーガラスをその後、ＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ中で５回洗浄し、−２５℃で 酸性アルコール（５％氷酢酸／９５％エタノール）で固定した。その後、カバー ガラスをＭＥＭ−ＨＥＰＥＳで５回洗浄し、顕微鏡の検鏡板に固定し、蛍光顕微 鏡を用いて検査するか、又はＧＦＡＰ、ネスチン（nestin）、ＭＢＰ、又はプロ テオリピドタンパク質（ＰＬＰ）に対して生じたラビットポリクローナル抗血清 で免疫反応させた。第２ラウンドの免疫ラベリング（immunolabeling）にさらさ れたとき、カバーガラスを、第１に、１時間、0.9％ＮａＣｌを有するリン酸緩 衝液0.1Ｍ中の５％通常ヤギ血清（ＮＧＳ）で培養し、その後、室温で１−２時 間ＮＧＳで希釈した第１のラビット抗体中で培養した。カバーガラスをＰＢＳで ３回洗浄し、その後、ＮＧＳで希釈した、適当な第２の抗体結合体で培養し、Ｐ ＢＳで再度洗浄し、最後にシティフルオロ・アンチフェーダント装着媒体（Citi fluor antifadent mounting medium）を有する顕微鏡のスライドガラス上に載せ 、蛍光顕微鏡により検査した。それらを最初にモノクローナル抗体の上澄みで培 養しない場合、カバーガラスを２０分間ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ pＨ7.4）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、１００％エタノールで透過させ、ＰＢＳで 再度洗浄し、ＰＢＳ中５％ＮＧＳで１時間培養した。第１の抗体及び第 ２の抗体結合体を上記概説したように適用した。 遺伝子導入動物から誘導した神経幹細胞は、ニューロン、神経膠星状細胞、及 び乏突起神経膠細胞への分化の潜在能力が非遺伝子導入幹細胞と区別がつかなか った。ＭＢＰプロモーターは、細胞特異的で、かつ発育的に適当なように、β− ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子の発現を指示した。乏突起神経膠細胞が遅 い継代ＭＢＰ−ｌａｃＺ神経球（２０継代）から誘導され、β−ガラクトシダー ゼ遺伝子を発現したとき、遺伝子導入発現は、著しく安定である。よって、遺伝 子導入でマークした神経球は、神経膠細胞移植のための細胞の優れた供給源であ るようである。 実施例４ リン酸カルシウム・トランスフェクションを用いる前駆細胞の遺伝子修飾 前駆細胞を実施例１に記載したように増殖した。細胞をその後リン酸カルシウ ム・トランスフェクション技術を用いてインフェクトした。標準リン酸カルシウ ム・トランスフェクションの場合、細胞を機械的に単細胞サスペンジョンに分離 し、組織培養処理皿に５０％集密度（５０，０００−７５，０００細胞／ｃｍ² ）で置き、一晩接触させた。 修飾リン酸カルシウム・トランスフェクション法を次のように行った。無菌Ｔ Ｅ緩衝液（トリス１０ｍＭ、ＥＤＴＡ0.25ｍＭ、ｐＨ7.5）中のＤＮＡ（１５− ２５μg）をＴＥで４４０μ１に希釈し、２Ｍ ＣａＣｌ₂（１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩 衝液でｐＨ5.8までにした）６０μ１をこのＤＮＡ／ＴＥ緩衝液に加えた。全体 積５００μ１の２×ＨｅＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液；２７５ｍＭ ＮａＣｌ、 １０ｍＭ ＫＣｌ、1.4ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１２ｍＭデキストローゼ、４０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝粉末、ｐＨ6.92）をこの混合物に滴下した。この混合物を２ ０分間室温に放置した。細胞を１×ＨｅＢＳで簡潔に洗浄し、リン酸カルシウム 沈澱したＤＮＡ溶液1ｍｌを各々のプレ-トに加え、細胞を３７℃で２０分間培養 した。この培養に続いて、完全培地１０ｍｌを細胞に加え、プレートをインキュ ベーター（３７℃、9.5％ＣＯ₂）内にさらに３−６時間置いた。ＤＮＡ及び培地 を培養期間の最後に吸引により除去し、細胞を完全成長培地で３回洗浄し、その 後インキュベーターに戻した。 実施例５ ＮＧＦを発現する遺伝子修飾前駆細胞 組替えレトロウィルス又は直接ＤＮＡトランスフェクション技術を用いて、ラ ットＮＧＦ遺伝子の発現を指示する、ヒト・サイトメガロウィルスＣＭＶプロモ ーターから成るキメラ遺伝子を神経球細胞へ導入した。さらに、ベクターは、ウ ィルスプロモーターを追い払うE.coliネオマイシン抵抗遺伝子を含む。Ｇ４１８ 選択の２週間後、細胞を、９６個のくぼみを有するプレ-ト中に限界希釈を用い てクローンし、得られたクローンを、ニューロトロフィン受容体（ｔｒｋファミ リー）ホスホリル化バイオアッセイを用いてニューロトロフィンタンパク質発現 を分析した。 ＮＧＦを高レベルで発現するクローンを、分化前にＴフラスコ中で拡大させた 。その後、細胞をＥＧF含有完全培地から取り除き、血清の組合せ及び成長因子 の混合物で処理し、神経膠星状細胞の分化を誘発した。神経膠星状細胞を再度Ｎ ＧＦ発現のために分析し、分化細胞が栄養因子を発現しつづけるように保証した 。ＮＧＦを分泌する神経膠星状細胞をその後、コリン作動性ニューロンを保護す るために、障害後即座にフィンブリン／脳弓障害のラットの脳に注入した。ＮＧ Ｆを分泌しないコントロールの神経膠星状細胞を同様に障害のある動物に注入し た。障害モデルにおけるコリン作動性ニューロンを節約すること（sparing）は 、ＣｈＡＴ（これらのコリン作動性ニューロンのマーカー）の免疫細胞化学を用 いて評価した。 実施例６ ＣＧＡＴを発現する遺伝子修飾前駆細胞 前駆細胞を実施例１のように増殖した。この細胞を機械的に分離して、プラス チック皿に置き、ＣＧＡＴ ｃＤＮＡを含むレトロウィルスでインフェクトした 。ＣＧＡＴ ｃＤＮＡの発現（リュー（Liu）ら、上述）は、構成プロモ-ター（ ＣＭＶ、又はＳＶ４０、又はレトロウィルスＬＴＲ）又は細胞特異性プロモータ ー（ＴＨ、又は他のドーパミン作用性もしくはカテコールアミン作用性細胞特異 性調節要素など）によって、指示される。細胞をＣＧＡＴタンパク質の発現のた めにスクリーンした。選択された細胞をその後、試験管中（invitro）で成長 因子又は成長因子の組合せを用いて分化させ、ドーパミン作用性又は前ドーパミ ン作用性ニューロンを製造することができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｋ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/04 38/22 38/27 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/24 9455−4Ｃ 37/43 9455−4Ｃ 37/36 (72)発明者 ハーマン ジョセフ ピー アメリカ合衆国 ロードアイランド州 02806 バーリントン エイカー アベニ ュー 71 (72)発明者 ビートグ エドワード イー アメリカ合衆国 ロードアイランド州 02903 プロヴィデンス 815 パーク ロ ウ ウェスト 50 センター プレイス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（a）ドナーの組織から神経幹細胞を単離する工程、（b）単離した神経幹細 胞を前駆細胞を製造するために第１の成長因子を含む培地で増殖する工程、及び （c）前記前駆細胞を遺伝子修飾する工程を有する遺伝子修飾細胞の製造方法。 ２．前記第１の成長因子が、神経成長因子、酸性繊維芽細胞成長因子、塩基性繊 維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、甲状腺剌激ホルモン放出ホルモン、表 皮細胞成長因子、アンフィレグリン、形質転換成長因子アルファ、形質転換成長 因子ベータ、インシュリン様成長因子、及びこれらの混合物からなる群から選ば れる請求項１記載の方法。 ３．前記第１の成長因子が、表皮細胞成長因子である請求項１記載の方法。 ４．前記工程（b）の前駆細胞が、神経球内にある請求項１記載の方法。 ５．請求項１記載の方法によって製造される遺伝子修飾前駆細胞。 ６．前記前駆細胞が、成長因子生成物を製造するように遺伝子修飾される請求項 １記載の方法。 ７．前記成長因子生成物が、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロ フィン、毛様体神経栄養因子、アンフィレグリン、塩基性繊維芽細胞成長因子、 酸性繊維芽細胞成長因子、表皮細胞成長因子、形質転換成長因子アルファ、形質 転換成長因子ベータ、血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子、及びイン ターロイキンからなる群から選ばれる請求項６記載の方法。 ８．前記前駆細胞が、成長因子受容体を発現するように遺伝子修飾される請求項 １記載の方法。 ９．前記成長因子受容体が、神経成長因子受容体、毛様体神経栄養因子受容体、 ニューロトロフィン受容体、表皮細胞成長因子受容体、繊維芽細胞成長因子受容 体、及びアンフィレグリン受容体からなる群から選ばれる請求項８記載の方法。 10．前記前駆細胞が、神経伝達物質を製造するように遺伝子修飾される請求項１ 記載の方法。 11．前記神経伝達物質が、セロトニン、L-ドーパ、ドーパミン、ノルエピネフリ ン、エピネフリン、タキキニン、Ｐ物質、エンドルフィン、エンケファリン、 ヒスタミン、N-メチルD-アスパーテート、グリシン、グルタメート、γ−アミノ ブチル酸、及びアセチルコリンからなる群から選ばれる請求項１０記載の方法。 12．前記前駆細胞が、神経伝達物質合成遺伝子を含むように遺伝子修飾される請 求項１記載の方法。 13．前記神経伝達物質合成遺伝子が、チロシン・ヒドロキシラーゼ、ドーパ・デ カルボキシラーゼ、フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフエラーゼ、グ ルタミン酸・デカルボキシラーゼ、トリプトファン・ヒドロキシラーゼ、クロリ ンアセチルトランスフェラーゼ、ヒスチジン・デカルボキシラーゼからなる群か ら選ばれる請求項１２記載の方法。 14．前記前駆細胞が、神経ペプチドを製造するように遺伝子修飾される請求項１ 記載の方法。 15．前記神経ペプチドが、物質P、神経ペプチド−Ｙ、エンケファリン、バソプ レシン、血管作用性小腸ペプチド、グルカゴン、ボンベシン、コレシストキニン 、ソマトスタチン、及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドからなる群から選ばれ る請求項１４記載の方法。 16．前記前駆細胞が、クロム親和性顆粒アミン伝達物質を製造するように遺伝子 修飾される請求項１記載の方法。 17．さらに、（d）遺伝子修飾前駆細胞を分化する工程を有する請求項１記載の 方法。 18．前記遺伝子修飾細胞を、血清を含む培地で分化する請求項１７記載の方法。 19．前記工程（d）で製造される前記分化細胞が乏突起神経膠細胞である請求項 １７記載の方法。 20．前記工程（d）で製造される前記分化細胞が神経膠星状細胞である請求項１ ７記載の方法。 21．前記工程（d）で製造される前記分化細胞がニューロンである請求項１７記 載の方法。 22．前記遺伝子修飾細胞が第２の成長因子を含む培地内で分化する請求項１７記 載の方法。 23．前記第１の成長因子が、神経成長因子、酸性繊維芽細胞成長因子、塩基性繊 維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、甲状腺剌激ホルモン放出ホルモン、表 皮細胞成長因子、アンフィレグリン、形質転換成長因子アルファ、形質転換成長 因子ベータ、インシュリン様成長因子、及びこれらの混合物からなる群から選ば れる請求項１７記載の方法。 24．請求項１７記載の方法によって製造される遺伝子修飾分化細胞。 25．（a）ドナーの組織から神経幹細胞を単離する工程、（b）単離した神経幹細 胞を前駆細胞を製造するために第１の成長因子を含む培地で増殖する工程、（c ）前記前駆細胞を分化する工程、及び（d）前記分化細胞を遺伝子修飾する工程 を有する遺伝子修飾細胞の製造方法。 26．遺伝子修飾前駆細胞の培地であって、該細胞が、a）ネスチンを積極的に染 色し、b）乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、及びニューロンへの分化が可能 である遺伝子修飾前駆細胞の培地。 27．前駆細胞から誘導され、培地中で生存する遺伝子修飾乏突起神経膠細胞。 28．前駆細胞から誘導され、培地中で生存する遺伝子修飾神経膠星状細胞。 29．前駆細胞から誘導され、培地中で生存するニューロン。 30．（a）ドナーの組織から神経幹細胞を単離する工程、（b）単離した神経幹細 胞を前駆細胞を製造するために成長因子を含む培地で増殖する工程、（c）前記 前駆細胞を遺伝子修飾する工程、及び（d）前記遺伝子修飾細胞をＣＮＳ疾患を 有する患者のＣＮＳに移植する工程を有するＣＮＳ疾患の処置方法。 31．前記工程（d）の移植の前に、前記工程（c）の前記遺伝子修飾細胞を分化す る請求項３０記載の方法。 32．前記工程（c）の前記遺伝子修飾の前に、前記工程（b）の前駆細胞を分化す る請求項３０記載の方法。 33．ＣＮＳに移植される前記細胞が、１０細胞/１００立方ミクロンを越えた密 度を有する請求項３０記載の方法。 34．１０細胞/１００立方ミクロンを越えた密度で患者の脳に存在する移植遺伝 子修飾前駆細胞の収集。 35．（a）遺伝子導入ドナーの組織から神経幹細胞を単離する工程、及び（b）単 離 した神経幹細胞を前駆細胞を製造するために成長因子を含む培地で増殖する工程 を有する神経前駆細胞の製造方法。 36．前記成長因子が、神経成長因子、酸性繊維芽細胞成長因子、塩基性繊維芽細 胞成長因子、血小板由来成長因子、甲状腺剌激ホルモン放出ホルモン、表皮細胞 成長因子、アンフィレグリン、形質転換成長因子アルファ、形質転換成長因子ベ ータ、インシュリン様成長因子、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請 求項３５記載の方法。 37．前記成長因子が表皮細胞成長因子である請求項３５記載の方法。 38．前記前駆細胞を誘発し分化する請求項２５記載の方法。 39．遺伝子導入動物から誘導され、培地中で生存する神経幹細胞。 40．遺伝子導入動物から誘導され、培地中で生存する分化した幹細胞。