NO322466B1 - Fremgangsmate for genetisk modifikasjon av nervestamceller, og nervestamcellekultur. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for produksjon av genetiske modifiserte celler som er nyttige for behandling av sentralnervesystem (CNS) forstyrrelser. Oppfinnelsen vedrører spesielt genetisk modifisering av vekstfaktorresponsive nervestamceller og differensierte nerveceller og gliaceller avledet fra vekstfaktorresponsive nervestamceller og anvendelse av disse cellene for behandling av neurodegenerative forstyrrelser.

CNS forstyrrelser omfatter mange tilfeller så som neurodegenerative sykdommer (for eksempel Alzheimers og Parkinsons), akutt hjerneskade (for eksempel slag, hodeskader, cerebral palsy) og et stort antall CNS feilfunksjoner (for eksempel depresjon, epilepsi og schizofreni). I de senere årene er neurodegenerative sykdommer blitt av betydning på grunn av den økende eldre populasjonen som har en stor risiko for å få disse forstyrrelsene. Disse sykdommene, som innbefatter Alzheimers sykdom, multippel sklerose, Huntingtons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og Parkinsons sykdom, har vært koblet til degenerasjon av neuralceller i bestemte beliggenheter av CNS som har ført til den manglende evnen som disse cellene eller hjerneregionen har til å utføre deres antatte funksjon. I tillegg til neurodegenerative sykdommer resulterer akutte hjerneskader ofte i tap av neuralceller, uhensiktsmessig virkning av den påvirkede hjerneregionen og påfølgende unormal adferd. Sannsynligvis er det største området med CNS feilfunksjon (med hensyn på antall påvirkede mennesker) ikke kjennetegnet ved tap av neuralceller, men unormalt virkende eksisterende neuralceller. Dette kan være forårsaket av uhensiktsmessig aktivering av neuroner, unormal syntese, frigjøring og prosessering av neurotransmittere. Disse feilfunksjonene kan være et resultat av studerte og karakteriserte forstyrrelser så som depresjon og epilepsi, eller mindre kjente forstyrrelser så som nevrose og psykose.

Frem til nå har behandling av CNS forstyrrelser hovedsakelig vært via administrering av farmasøytiske forbindelser. Denne behandlingsform har vært befengt med mange komplikasjoner inkludert den manglende evnen til å transportere medikamenter over blod-hjernebarrieren og medikamenttoleranse som blir ervervet hos pasienten som mottar disse medikamentene over lengre tid. Delvis gjenopprettelse av dopaminerg aktivitet hos Parkinsons pasienter er blitt oppnådd med levodopa, som er en dopa-minforløper som har evne til å krysse blod-hjernebarrieren. Pasienter blir derimot tolerante overfor virkningene av levodopa og derfor er jevnt økende doseringer nød-vendig for å opprettholde virkningene. Det er et antall bivirkninger assosiert med levodopa så som øket og ukontrollerbar bevegelse.

Nylig er konseptet som omfatter neurologisk vevstransplantasjon blitt anvendt for behandling av neurodegenerative sykdommer så som Parkinsons sykdom. Neuraltransplantasjon kan avverge behovet for konstant medikamentadministrering og også kompliserte medikamentleveringssystemer som oppstår på grunn av blod-hjernebarrieren.

Genetisk modifiserte celler er blitt anvendt i neurologisk vevtransplantasjon for å erstatte tapte celler som normalt produserer en neurotransmitter. Fibroblaster er f. eks blitt genetisk modifisert med en retroviral vektor inneholdende et cDNA for tyrosinhydroksylase som muliggjør at de produserer dopamin, og implantert i dyremodeller av Parkinsons sykdom (Gage et al, US patent nr 5.082.670).

Idet anvendelse av genetisk modifiserte fibroblaster for å behandle CNS forstyrrelser har vært lovende for å forbedre noen adferdsmangler i dyremodeller av Parkinsons sykdom, og representerer en ny metode for å tilføre et nødvendig neurotransmitter til CNS, er dette forbundet med betydelige ulemper ved behandling av Parkinsons sykdom og generelt som en terapeutisk metode for behandling av neurodegenerative sykdommer og hjerneskader. CNS består hovedsakelig av tre celletyper, neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Fibroblaster er ikke tilstede. Implantering av en fremmed celle i CNS og dets direkte og indirekte virkninger på funksjonen til vertcellene er enda ikke blitt studert. Det er derimot sannsynlig at ekspresjon av membranbundete faktorer og frigivelse av oppløselige molekyler så som vekstfaktorer og proteaser vil endre den normale adferden til det omgivende vevet. Dette kan resultere i ødeleggelse av neuro-nalutløsende mønstre ("neuronal firing patterns") enten ved en direkte virkning på neuroner eller ved en endring i den normale virkningen til gliacellene.

En annen bekymring som oppstår når fibroblaster blir implantert i CNS er muligheten for at de implanterte cellene kan føre til tumordannelse på grunn av den intrinsiske inhi-bisjonen av fibroblastdeling som blir dårlig kontrollert. Ekstrinsiske signaler spiller derimot en vesentlig rolle for å kontrollere antall delinger som cellen vil gjennomgå. Virkningen av CNS miljøet på deling av implanterte fibroblaster og den høye sann-synligheten for en fibroblasttumordannelse har ikke blitt studert over lengre tid.

En tredje bekymring ved transplantasjon av fibroblaster til CNS er at fibroblaster ikke har evne til å integrere med CNS celler som astrocytter, oligodendrocytter eller neuroner. Fibroblaster er intrinsisk begrenset i deres evne til å utøve neuronallignende prosesser og danne synapser med vertsvevet. Til tross for at den genetiske modifikasjonen og implantasjonen av fibroblaster til CNS representerer en forbedring i forhold til gjeldende teknologi for avlevering av visse molekyler til CNS, så begrenser den manglende evnen som fibroblaster har til å integrere og virke som CNS vev, deres potensielle negative virkninger på CNS celler og deres begrenset intrinsiske kontroll av proliferasjonen, deres praktiske anvendelse for implantasjon for behandling av akutt eller kronisk CNS skade eller sykdom.

Et foretrukket vev for genetisk modifikasjon og implantasjon utgjør CNS celler, som neuroner, astrocytter eller oligodendrocytter. En kilde for CNS celler er fra humant føtalt vev. Flere studier har vist forbedringer hos pasienter med Parkinsons sykdom etter at de har mottatt implantater av føtalt CNS vev. Implantater av embryonalt mesencefalisk vev inneholdende dopaminceller til ceudat og putamen hos humane pasienter er blitt vist av Freed et al (N Engl J Med 327:1549-1555 (1992)) og gir langtids kliniske fordeler til noen pasienter med langt fremskredet Parkinsons sykdom. Lignende suksess ble vist av Spencer et al (N Engl J Med 327:1541-1548 (1992)). Widner et al (N Engl J Med 327:1556-1563 (1992)) som har vist langtids funksjonelle forbedringer hos pasienter med MPTP-indusert Parkinsonisme som har mottatt bilateral implantering av føtalt mesencefalisk vev.

Ovennevnte studier er lovende, men anvendelse av abortert føtalt vev for behandling av sykdommer fører til etiske betrakninger og politiske hindringer. Det er også andre betenkeligheter. Føtalt CNS vev består av mer enn en celletype og er følgelig ikke en veldefinert vevskilde. Det hersker også stor tvil om en tilstrekkelig og konstant tilførsel av føtalt vev vil være tilgjengelig for transplantasjon. For behandling av MPTP-indusert Parkinsonisme (Widner, ovenfor) ble vev fra 6 til 8 fostre anvendt for implantering i hjernen til en enkelt pasient. Det er også et tilleggsproblem når det gjelder mulighet for kontaminering under føtal vevpreparering. Vevet kan allerede være infisert med en bakterie eller virus og derfor trenge omfattende diagnostisk testing for hvert foster som blir anvendt. Selv diagnostisk testing behøver ikke å kunne bestemme alle typer infiserte vev. Diagnostikk av HlV-fritt vev er ikke garantert på grunn av at antistoffer mot virus generelt ikke er tilstede før flere uker etter infeksjon.

I stedet for føtalt vev er det mer foretrukket å anvende en veldefinert reproduserbar vevstype for transplantasjon enn det som er tilgjengelig i ubegrensede mengder. På grunn av at neuralt vev gjennomgår minimale delinger så oppfyller det ikke disse kri-teriene. Astrocytter har beholdt evnen til å dele seg og er sannsynligvis mottakelig for infeksjon med fremmede gener, men deres evne til å danne synapser med neuralceller er begrenset og følgelig også deres ekstrinsiske regulering av ekspresjonen og frigivelse av det fremmede genproduktet.

Oligodendrocytter har noen av de samme problemene. I tillegg deler ikke modne oligodendrocytter seg hvilket begrenser infeksjonen av oligodendrocyttene til deres forløperceller (dvs. 02A celler). På grunn av begrenset proliferativ evne som oligoden-drocyttforløperne har representerer infeksjon og høsting av disse cellene ikke en praktisk kilde.

Infeksjon av neuroner med fremmede gener og implantering i CNS vil være ideelt på grunn av deres evne til å danne utløpere og synapser, og bli regulert av omgivelsene. Differensierte neuroner deler seg ikke og transfeksjon med fremmede gener ved kjemiske og fysiske midler er ikke tilstrekkelig og de er heller ikke stabile over lange tidsperioder. Infeksjon av primære neuronalforløpere med retrovirale vektorer in vitro er heller ikke praktisk på grunn av at neuroblaster blir intrinsisk kontrollert til å gjennomgå et begrenset antall delinger og gjør seleksjon av et stort antall neuroner, som inkorporerer og uttrykker det fremmede genet, nesten umulig. Muligheten for å udødeliggjøre neuralforløpere ved retroviral overføring av onkogener og påfølgende infeksjon av et ønsket gen er ikke foretrukket på grunn av mulighet for tumordannelse av de implanterte celler.

Et forsøk på å løse problemene assosiert med manglende evne som neuronene har til å gjennomgå et signifikant antall delinger er beskrevet av Ronnett et al som har etablert en neuronal cellelinje (Science, 248:603-605 (1990)). Cellelinjen er ikke-malign, men er avledet fra cerebral corticalvevet oppnådd fra en pasient med unilateral megalencefali, en lav-grads proliferasjons- og migreringsforstyrrelse til neuronene. Ved karak-tertrekkene til denne cellelinjen kan det stilles spørsmålstegn ved om cellene ville stoppe å dele seg når de eventuelt var blitt implantert i en verts CNS.

En annen metode for å innføre fremmede gener i CNS er foreslått av Morshead og Van Der Koy, (J. ofNeurosci. 12(l):249-256 (1992)). Subependymalceller ble infisert med et replikasjonsmanglende rekombinant retrovirus inneholdende genet for E.coli P-galaktosidase. Det ble funnet ved anvendelse av ^H-tymidin og BrdU inkorporering at det er en kontinuerlig mitotisk deling i denne regionen av CNS. Morshead og Van Der Koy foreslo at prolifererende celler er stamceller basert på det faktumet at cellene kontinuerlig deler seg på en asymmetrisk stamcellemåte, dvs. de delende cellene gir opphav til en multipotent celle, mens skjebnen til den andre datteren er celledød. Denne ideen er basert på at det er en konstant delingsrate og det er ingen relativ økning i celleantallet i den regionen av CNS.

Det faktum at endogene stamceller kontinuerlig deler seg gjør dem til egnede mål for genetisk modifikasjon via retroviral infeksjon. Disse cellene eksisterer derimot innenfor CNS i en tetthet som er mindre enn omtrent S celler/100 kubik mikron og deres rate og antall delinger står i det minste delvis under epigenetisk kontroll. En vesentlig begrensning ved endogene prolifererende subependymalstamceller er at de er tilstede i CNS i et bestemt antall og innføring av nye gener vil være vanskelig å kontrollere. En annen vesentlig begrensning er at hos gnagere og primater ser cellene ut til å være rom-melig hemmet til subependymallaget og verken stamcellen eller avkommet derav mi-grerer til andre regioner av CNS (Smart, J. of Comp. Neurology, 116:325-347 (1961); Lewis, Nature, 217:974-975, (1968)). Lignende celler er ikke beskrevet i andre CNS regioner og dersom de eksisterer er de ikke karakterisert.

Den manglende evnen ifølge tidligere teknikk som ikke-CNS vevstransplantater har til fullstendig å integrere i vertsvevet, og den begrensede tilgang på ikke-tumorigene, integrerbare CNS celler fra en pålitelig kilde for transplantasjon utgjør kanskje de største begrensningene ved neurotransplantasjon.

I lys av ovennevnte mangler ved tidligere teknikk, inkludert fremgangsmåter for neu-ralcelledyrking og transplantasjon er det innlysende at det fortsatt eksisterer et behov innenfor dette området for en pålitelig kilde for ubegrensede antall ikke-transformerte celler for neurotransplantasjon som kan bli genetisk modifisert og som har evne til å differensiere til neuroner og gliaceller, og som har evne til å integrere i pattedyr-CNS.

Det er følgelig en hensikt ifølge denne oppfinnelsen å tilveiebringe en pålitelig kilde for genetiske modifiserte og epigenetiske regulerte celler for transplantasjon som ved transplantasjon i CNS blir ytterligere diffrensiert til neuroner og gliaceller og integreres i den eksisterende CNS strukturen.

Det er en annen hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe en mangfoldig kilde for celler som er sterkt manipulerbare for det formålet som omfatter genetisk modifikasjon.

Det er en ytterligere hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe genetiske modifiserte celler som lett kan bli implantert nesten hvor som helst i CNS.

Disse og andre hensikter og trekk ifølge oppfinnelsen vil fremkomme for fagfolk etter den detaljerte beskrivelsen og de vedlagte kravene.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for å produsere ikke-tumorigene, genetisk modifiserte multipotente nervestamceller fra sentralnervesystemet (CNS), kjennetegnet ved følgende trinn: (a) isolering av multipotente CNS-nervestamceller fra nervevev, der nervestamcellene ikke er immortalisert med en onkogen, og der CNS-nervestamcellene er i stand til å produsere avkom som kan differensiere til neuroner, astrocytter og oligodencdrocytter; (b) proliferering av nevnte multipotente CNS-nervestamceller i et serumfritt kulturmedium inneholdende en vekstfaktor som induserer multipotent CNS-nervestamcelleproliferering,

(c) ytterligere formering av de prolifererende celler, og

(d) genetisk modifisering av de formerte celler ved å introdusere et eksogent polynukleotid til de prolifererte celler, der de prolifererende celler er genetisk modifisert til å produsere et vekstfaktorprodukt, en vekstfaktor reseptor eller til å uttykke en neurotransmitter.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en kultur omfattende genetisk modifiserte multipotente nervestamceller fra sentralnervesystemet (CNS) som ikke er immortalisert med et onkogen, og som: (a) farger positivt for nestin; (b) er i stand til å produsere avkom som har evne til å differensiere til

oligodendrocytter, astrocytter og neuroner; og

(c) er ikke-tumorigene,

der cellekulturen oppnås ved trinnene:

(a) isolering av multipotente CNS-nervestamceller fra nervevev, unntatt humant embryonalt vev/humane embryonale celler, der nervestamcellene ikke er immortalisert med et onkogen, og der CNS-nervestamcellene er i stand til å produsere avkom som har evnen til å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter; (b) proliferering av nevnte multipotente CNS-nervestamceller i et serumfritt dyrkningsmedium inneholdende en vekstfaktor som induserer multipotent CNS-nervestamcelleproliferering,

(c) ytterligere formering av de prolifererende celler, og

(d) genetisk modifisering av de formerte celler ved å introdusere et eksogent polynukleotid til de prolifererende celler, der de prolifererende celler er genetisk modifisert til å produsere et vekstfaktorprodukt, en vekstfaktor reseptor eller til å uttykke en neurotransmitter.

Ingen av de foregående referansene antas å beskrive foreliggende oppfinnelse og antas ikke å være innenfor teknikkens stand. Referansene er gitt for bakgrunnsinformasjon.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

FIG 1: Et fotografi av genetisk modifiserte forløperceller infisert med et retrovirus inneholdende p-galaktosidasegenet. Celler inneholdende genet utviser et karakteristisk blått reaksjonsprodukt. FIG 2: Et fotografi av en 2-4 uker postimplantasjonssnitt fra nyfødt musecortex hvori p-galaktosidase-inneholdende forløperceller ble implantert. Implanterte celler inneholdende p-galaktosidasegenet utviser et karakteristisk blått reaksjonsprodukt.

Nervestamcelle (NSC) er blitt beskrevet og deres potensielle anvendelse er blitt beskrevet av Reynolds og Weiss, Science 225:1707 (1992), inkorporert heri som referanse. Betegnelsen "stamcelle" referer til en udifferensiert celle som har evne til ubegrenset proliferasjon og som gir opphav til flere stamceller som har evne til å danne et stort antall forløperceller som igjen kan gi opphav til differensierte, eller differensierbare datterceller. Betegnelsen "nervestamcelle" (NSC) refererer til stamcellene ifølge foreliggende oppfinnelse hvor avkommet under hensiktsmessige dyrkningsbetingelser innbefatter både gliaceller og nerveforløperceller. Det har blitt vist at NSC gir opphav til neuroblaster (Reynolds og Weiss, Restorative Neurology & Neuroscience 4:208 (1992), inkorporert heri som referanse). Det er også vist at NSC gir opphav til vesentlig makrogliacelletyper (astrocytter og oligodendrocytter).

Nervestamceller kan bli dannet fra forskjellige donorvev, inkludert voksent eller føtalt nervevev fra mennesker eller andre dyrekilder, og dyrket ifølge fremgangsmåten til Reynolds og Weiss (ovenfor). Betegnelsen "donor" refererer til mennesket eller dyret som er kilden for nervestamcellene som blir anvendt i foreliggende oppfinnelse. I noen situasjoner vil donoren være et transgent dyr. Betegnelsen "transgent dyr" refererer til ikke-humane dyr hvor et DNA segment er blitt fysisk integrert i genomet til alle cellene, inkludert kjønnscellene, slik at DNA kan bli overført til avkommet.

Nervestamcellene ifølge foreliggende oppfinnelse er vekstfaktorresponsive. Når de dyrkes i et definert serumfritt medium og i nærvær av en vekstfaktor eller et mitogen så som epidermal vekstfaktor (ÉGF) eller lignende induseres cellene til å dele seg og gir opphav til sammenhopninger av udifferensierte celler. Betegnelsen "neurosfære" blir anvendt for å angi sammenhopninger av celler. I det minste noen av cellene er av nestin (+) fenotype. Sammenhopningen består av stamceller og/eller forløperceller og kan innbefatte differensierte celler. Betegnelsen "forløperceller" refererer til udifferensierte celler avledet fra nervestamceller og avkommet kan under hensiktsmessige betingelser innbefatte gliaceller og/eller neuronale forløperceller.

Som anvendt heri refererer betegnelsen "forløperceller" til levende celler som er avledet fra nervestamceller som blir proliferert i et kulturmedium inneholdende en vekstfaktor eller kombinasjon av vekstfaktorer og innbefatter både forløper- og stamceller. Cellene fra neurosfæren blir referert til som forløperceller. Forløpercellene blir vanligvis dyrket i form av neurosfærer, men kan utvise forskjellige vekstmønstre avhengig av kulturbetingelsene. Betegnelsen "vekstfaktor" som anvendt heri refererer til et protein, peptid, mitogen eller annet molekyl som har en vekst, proliferativ, differensierende eller trofisk effekt. Betegnelsen vekstfaktor omfatter også en hvilken som helst kombinasjon av vekstfaktorer. Slike vekstfaktorer innbefatter nervevekstfaktor (NGF), sur og basisk fibroblastvekstfaktor (aFGF, bFGF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), tyrotropin-frigjort hormon (TRH), EGF, en EGF-lignende ligand, amflregulin, transformerende vekstfaktor alfa og beta (TGFct, TGFp), insulinlignende vekstfaktorer (IGF) og lignende.

Til tross for at forløpercellene er ikke-transformerte primærceller har de samme trekk som en kontinuerlig cellelinje. I udifferensiert tilstand i nærvær av en vekstfaktor så som EGF deler cellene seg kontinuerlig og er derfor gode mål for genetisk modifikasjon. Betegnelsen "genetisk modifikasjon" som anvendt heri refererer til stabil eller forbigående endring av genotypen til en forløpercelle ved innføring av eksogent DNA. DNA kan være syntetisk, eller naturlig avledet, og kan inneholde gener, deler av gener og andre nyttige DNA sekvenser. Betegnelsen "genetisk modifikasjon" som anvendt heri er ikke ment å innbefatte naturlig forekommende endringer så som de som oppstår ved naturlig viral aktivitet, naturlig genetisk rekombinasjon eller lignende. Eksogent DNA kan bli innført i en forløpercelle ved virale vektorer (retrovirus, modifisert herpes viral, herpes-viral, adenovirus, adeno-assosiert virus og lignende) eller direkte DNA transfeksjon (lipofeksjon, kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-dekstran, elektroporasjon og lignende). De genetiske modifiserte cellene ifølge foreliggende oppfinnelse har den ytterligere fordelen at å ha en kapasitet til å fullstendig differensiere for å produsere neuroner eller makrogliaceller på en reproduserbar måte ved anvendelse av et antall differensieringsprotokoller.

Forløperceller kan være avledet fra transgene dyr og er følgelig allerede genetisk modifiserte. Det er flere metoder som for tiden blir anvendt for å danne transgene dyr. Den teknikken som blir mest anvendt er direkte mikroinjeksjon av DNA inn i enkeltcellede befruktede egg. En annen teknikk innbefatter retroviral-formidlet overføring eller genoverføring i embryonale stamceller. Disse teknikkene og andre er beskrevet av Hogan et al i Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Ed, 1986), inkorporert heri som referanse. Anvendelse av disse transgene dyrene har visse fordeler som innbefatter det faktum at det ikke er behov for å transfektere friske neurosfærer. Forløperceller avledet fra transgene dyr vil utvise stabil genekspresjon. Ved anvendelse av transgene dyr er det mulig å avle nye genetiske kombinasjoner. Det transgene dyret kan ha integrert i genomet et hvilket som helst nyttig gen som blir uttrykt av neuralceller. Eksempler på nyttig DNA er gitt nedenfor i diskusjonen av genetisk modifiserte forløperceller.

En signifikant utfordring for cellulær transplantasjon i CNS er modifikasjon av donorcellene etter implantering i verten. Et antall strategier er blitt anvendt for å markere donorceller, inkludert tritierte markører, fluorescerende fargestoffer, dekstraner og virale vektorer inneholdende reportergener. Disse fremgangsmåtene har iboende problemer som omfatter toksisitet, stabilitet eller fortynning over tid. Anvendelse av nerveceller avledet fra transgene dyr kan tilveiebringe en forbedret metode hvorved identifikasjon av transplanterte nerveceller kan bli oppnådd. Et transgent markeringssystem gir en mer stabil og effektiv fremgangsmåte for cellemerking. I dette systemet kan promotorelementer, for eksempel for glialt fibrillært surt protein (GFAP) og myelinbasiskprotein (MBP) dirigere ekspresjon av E.coli P-galaktosidasereportergenet i transgene mus. I disse systemene oppstår cellespesifikk ekspresjon av reportergenet i astrocytter (GFAP-lacZ) og i oligodendrocytter (MBP-lacZ) på en utviklingsmessig-regulert måte.

Når de har formert seg, blir neurosfærecellene mekanisk dissosiert til en enkelt cellesuspensjon og sådd ut på petriskåler i et medium hvor de får feste seg over natten. Forløpercellene blir deretter genetisk modifisert. Dersom forløpercellene blir dannet fra transgene dyr, kan de bli utsatt for ytterligere genetisk modifikasjon avhengig av egenskapene som er ønskelig for cellene. En hvilken som helst nyttig modifikasjon av cellene hører inn under rammen av foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan forløpercellene bli modifisert for å produsere eller øke produksjonen av en biologisk aktiv forbindelse så som en neurotransmitter eller vekstfaktor eller lignende. Den genetiske modifikasjonen blir utført enten ved infeksjon med rekombinante retroviruser eller transfeksjon ved anvendelse av fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet (se Maniatis et al, i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982)). De kimære genkonstruksjonene vil inneholde virale, for eksempel retroviral lang terminal gjentakelse (LTR), simianvirus 40 (SV40), cytomegalovirus (CMV); eller pattedyrceller-spesifikke promotere så som tyrosinhydroksylase (TH), dopamin P-hydroksylase (DBH), fenyletanolamin-N-metyltrasferase (PNMT), cholinacetyltransferase (ChAT), glial fibrillært surt protein (GFAP), neuron-spesifikk enolase (NSE), neurofilament (NF) proteiner (NF-L, NF-M, NF-H og lignende) som dirigerer ekspresjonen av strukturelle gener som koder for det ønskede proteinet. I tillegg vil vektorene innbefatte en medikamentseleksjonsmarkør, så som E.coli aminoglykosidfosfotransferasegenet, som når koinfisert med det eksperimentelle genet utviser motstand mot genetisin (G418), en proteinsynteseinhibitor.

Når den genetiske modifikasjonen er for produksjon av en biologisk aktiv forbindelse, vil forbindelsen generelt være en som er nyttig for behandling av en gitt CNS forstyr-relse. Det kan for eksempel være ønskelig å genetisk modifisere celler slik at de utskiller et visst vekstfaktorprodukt. Som anvendt heri refererer betegnelsen "vekstfaktorprodukt" til et protein, peptid, mitogen eller et annet molekyl som har en vekst, proliferativ, differensierende eller trofisk effekt. Vekstfaktorprodukter som er nyttige for behandling av CNS forstyrrelser innbefatter, men er ikke begrenset til, nervevekstfaktor (NGF), hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofiner (NT-3, NT-4/NT-5), cilliær neurotrofisk faktor (CNTF) amfiregulin, bFGF, aFGF, EGF, TGFp, PDGF, IGF og interleukiner.

Celler kan også bli modifisert for å uttrykke en viss vekstfaktorreseptor (r) inkludert, men ikke begrenset til, p75 lav affinitet NGFr, CNTFr, trk familien av neurotrofin-reseptorer (trk, trkB, trkC), EGFr, FGFr og amfiregulinreseptorer. Celler kan bli omdannet for å produsere forskjellige neurotransmittere eller reseptorer derav så som serotonin, L-dopa, dopamin, norepinefrin, epinefrin, takykinin, forbindelse-P, endorfin, enkefalin, histamin, N-metyl-D-aspartat (NMDA), glysin, glutamat, y-aminosmørsyre (GABA), acetylcholin og lignende. Nyttige neurotransmitter-syntetiserende gener innbefatter TH, dopadekarboksylase (DDC), DBH, PNMT, glutaminsyredekarboksylase (GAD), tryptofanhydroksylase, ChAT og histidindekarboksylase. Gener som koder for forskjellige neuropeptider, som viser seg å være nyttig for behandling av CNS forstyrrelser, innbefatter forbindelse-P, neuropeptid-Y (NP-Y), enkefalin, vasopressin, vasoaktivt tarmpeptid (VIP), glukagon, bombesin, kolesytokinin (CCK), somatostatin, calcitonin generelatert peptid (CGRP) og lignende.

Etter at vellykkede transfekterte/infiserte celler er valgt blir de klonet ved anvendelse av begrenset fortynning i 96 multibrønnskåler og analysert for tilstedeværelse av ønsket biologisk aktiv forbindelse. Kloner som uttrykker høye nivåer av den ønskede forbindelsen blir dyrket og deres antall ekspandert i T-flasker. Den spesifikke cellelinjen kan deretter bli frysetørket. Genetisk modifisert forløpercellelinje kan bli anvendt for celle/genterapi og dermed bli implantert inn i CNS til en mottaker som trenger det biologisk aktive molekylet produsert ved genetisk modifiserte celler. Multiple kloner av genetisk modifiserte forløperceller vil bli oppnådd. Noen kan gi opphav til neuronalceller og noen til gliaceller.

Alternativt kan de genetisk modifiserte forløpercellene bli utsatt for forskjellige differensieringsprotokoller in vitro før implantering. For eksempel kan genetisk modifiserte forløperceller bli fjernet fra dyrkningsmediet som muliggjør proliferasjon og behandlet med et medium inneholdende en vekstfaktor eller kombinasjon av vekstfaktorer som induserer differensiering av cellene til neuroner eller makroglialceller. Differensieringsprotokollene er angitt i patentsøknad U.S.S.N. 07/967.622 inngitt 28. oktober 1992. Anvendt protokoll vil avhenge av type av genetisk modifisert celle som er ønskelig. Differensiering kan også bli indusert ved å så forløpercellene på et bestemt substrat, inkludert poly-L-ornitin eller poly-L-lysinbelagte flasker eller lignende.

Forskjellige markører blir anvendt for å identifisere de differensierte cellene. Oligo-dendrocyttforløperceller som gir opphav til oligodendrocytter kan ha fenotypen A2B5 (+), 04(+)/GalC(-), MBP(-) og GFAP(-) [men er ikke begrenset til denne fenotypen]. Oligodendrocytter, som er gliaceller som dannet myelinet som omgir aksoner i CNS har fenotypen galaktocerebrosid (+), myelinbasisprotein (+) og glialfibrillært surt protein (-)

[GalC(+), MBP(+), GFAP(-)].

Neuronene kan ha en eller flere av følgende fenotypemarkører: neuronspesifikk enolase (NSE), neurofilament (NF) proteiner, tau-1 og MAP-2. Neuroner kan også bli identifisert basert på ekspresjonen av et hvilket som helst av et antall klassiske neu-rotransmitterenzymer. I tillegg kan neuronet bli identifisert basert på morfologiske kriterier og andre funksjonelle mål så som elektrofysiologiske registreringer. En slik identifikasjon kan bli utført i kombinasjon med identifikasjon av en eller flere feno-typiske markører angitt ovenfor.

Type I astrocytter er gliaceller som har en flat protoplasma/fibroblast-lignende morfologi. Disse cellene har fenotypen GFAP(+), A2B5(-), GalC(-) og MBP(-). Type II astrocytter, som er gliaceller som utviser en stellatprosessbærende morfologi, har fenotypen GFAP(+), A2B5(+), GalC(-), og MBP(-).

Når cellene er blitt differensierte, blir de på nytt analysert for ekspresjon av det ønskede proteinet. Celler med ønsket fenotype kan bli isolert og implantert i mottakeren som trenger proteinet eller det biologisk aktive molekylet som blir uttrykt av den genetiske modifiserte cellen.

En hvilken som helst egnet metode for implantering av forløpercellene til CNS kan bli anvendt slik at cellene hensiktsmessig integrerer i CNS. Injeksjonsmetoder er eksemplifisert ved de som blir anvendt av Duncan et al J. Neurocytology, 17:351-361

(1988), inkorporert heri som referanse og oppskalert og modifisert for anvendelse i mennesker er foretrukket. Fremgangsmåten beskrevet av Gage et al, US patent nr 5.082.670, inkorporert heri som referanse, for injeksjon av cellesuspensjoner så som fibroblaster til CNS kan også bli anvendt for injeksjon av forløpercellene. Ytterligere metoder rinnes i Neural Grafting in the Mammalien CNS, Bjørklund og Stenevi, eds.

(1985), inkorporert heri som referanse. Antall genetisk modifiserte celler som blir injisert vil være det som er nødvendig for å tilveiebringe en terapeutisk effekt og vil variere avhengig av tilstanden som blir behandlet. Generelt vil genetiske modifiserte neuralforløperceller være tilstede i hjernen i en konsentrasjon som er høyere enn 10 celler/100 kubikkmikron.

Når forløpercellene skal bli injisert i mottakeren og er avledet fra ikke-vertsvev (dvs. allograft eller xenograft), kan immunsuppresjonsteknikker være nødvendig for å sikre overlevelse av transplantatet. Lokal immunsuppresjon er beskrevet av Gruber, Transplantation 54:1-11 (1992), inkorporert som referanse, Rossini, US patent nr 5.026.365, inkorporert heri som referanse, som beskriver innkapslingsmetoder egnede for lokal immunsuppresjon.

Som et alternativ til å anvende immunsuppresjonsteknikker, kan fremgangsmåter for generstatning eller fjerning ved anvendelse av homolog rekombinasjon i en embryonal stamcelle, beskrevet av Smithies et al (Nature, 317:230-234 (1985), og utvidet til generstatning eller fjerning i cellelinje (H. Zheng et al, PNAS, 88:8067-8071 (1991)), begge inkorporert heri som referanse, bli anvendt på forløperceller for fjerning av vevsforlikelighets (MHC) gener. Forløperceller som mangler MHC ekspresjon vil muliggjøre transplantasjon av anrikede neuralcellepopulasjoner over allogeneiske, og kanskje til og med xenogeneisk, vevsforlikelighetsbarrieren uten behov for immunsuppresjon av mottakeren. Generell oversikt og sitater for anvendelse ved rekombinante metoder for å redusere antigenisiteten til donorcellene er beskrevet av Gruber (ovenfor). Eksempler på metoder for å redusere immunogenisiteten til transplantater ved overflatemodifikasjon er beskrevet av Faustman WO 92/04033

(1992), inkorporert heri som referanse.

Til tross for at faste vevsfragmenter og cellesuspensjoner fra neuralt vev er immunogene som en helhet kan det være mulig at individuelle celletyper innenfor transplantatet i seg selv er immunogene i mindre grad. For eksempel har Bartlett et al (Prog. Brain Res. 82:153-160 (1990)) inkorporert heri som referanse, opphevet neural allograftavstøtning ved preseleksjon av en subpopulasjon av embryonale neuroepitelceller for transplantasjon ved anvendelse av immunkuleseparasjon på grunnlag av MHC ekspresjon. En annen metode er følgelig gitt for å redusere muligheten av allo- og xenograft avstøtning hos mottakeren uten anvendelse av immunsuppresjonsteknikker.

Resultater av humane transplantasjonsforsøk har demonstrert at føtal mesencefal vev-sallograft overlevelse i Parkinsons hjerne er relativt dårlig (Freed et al og Spencer et al, ovenfor). Den dårlige overlevelsen til det transplanterte materialet kan være forårsaket av de samme sykdoms-assosierte faktorene som resulterte i den opprinnelige neurode-generasjonen. Man kan anta at omgivelsene, som var toksiske for mottakerens egne neuroner, på samme måte kan være toksiske for transplantert vev eller celler. Støtte for dette fås fra rapporter som omfatter betraktelig funksjonell forbedring frembrakt av implantert føtalt mesencefalisk vev hos mennesker med MPTP-lesjoner (Widner et al, ovenfor). Ulikt situasjonen i hjernen ved Parkinsons sykdom så er MPTP-indusert Parkinsonisme hovedsakelig et funksjonelt tap av dopaminerge neuroner fra substantia nigra uten underliggende ideopatiske prosesser assosiert med Parkinsons sykdom. Til forskjell fra hjernen ved Parkinsons sykdom er menneskehjernen ved MPTP-lesjon uten neurotoksiske forbindelser ved tidspunkt for implantering.

Nylig er et nytt kromaffingranulat amintransporter (CGAT)-cDNA blitt beskrevet av Liu et al (Cell, 70:539-551 (1992)), inkorporert heri som referanse som gir motstand mot neurotoksin MPP+ i CHO cellene in vitro. På grunn av at dopaminerge neuroner fra substantia nigra spesifikt blir drept av MPP+, kan CGAT genekspresjon i forløpercellene forbedre levedyktigheten til cellene etter at de er implantert i Parkin-sonhjernen.

For å forstå oppfinnelsen bedre er følgende eksempler gitt.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Formering av forløperceller

Embryonal dag 14 (E14) CDi albinomus (Charles River) ble avlivet og hjernen og striata ble fjernet ved en steril prosedyre. Vevet ble mekanisk dissosiert med en flammebehandlet Pasteur pipette i serumfritt medium bestående av en 1:1 blanding av Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) og F-12 næringsblanding (Gibco). Cellene ble sentrifugert ved 800 rpm i 5 minutter, supernatanten sugd av og cellene resuspendert i DMEM/F-12 medium for telling.

Cellene ble suspendert i et serumfritt medium, nedenfor referert til som "fullstendig medium", bestående av DMEM/F-12 (1:1) som innbefatter glukose (0,6 %), glutamin (2 mM), natriumbikarbonat (3 mM), HEPES (4-[2-hydroksyetyl]-l-piperazinetansul-fonsyre) buffer (5 mM) og en definert hormonblanding og saltblanding (for å erstatte serium) som innbefatter insulin (25 ug/ml), transferrin (100 ug/ml), progesteron (20 nM), putrescin (60 uM) og selenklorid (30 nM) (alle fra Sigma med unntakelse av glutamin [Gibco]). I tillegg inneholdt mediet 16-20 ng/ml EGF (renset fra underkjevekjertelen fra mus, Collaborative Research) eller TGF aM) og selenklorid (30 nM) (alle fra Sigma med unntakelse av glutamin [Gibco]). I tillegg inneholdt mediet 16-20 ng/ml EGF (renset fra underkjevekjertelen fra mus, Collaborative Research) eller TGFa (humant rekombinant, Gibco). Cellene ble sådd ut i en konsentrasjon på 0,2 x 10<6> celler/ml i 75 cm<2> vevskulturflasker (Corning) uten forbehandling med substrat og oppbevart i en inkubator ved 37°C, 100 % fuktighet, 95 % luft/5 % C02-

Cellene prolifererte i løpet av de første 48 timene og innen 3-4 dager in vitro (DIV) ble det dannet sammenhopninger, kjent som neurosfærer, som løsnet fra substratet mellom 4-6 DIV.

Etter 7 DIV ble neurosfærene fjernet, sentrifugert ved 400 rpm i 2-5 minutter og pelleten ble dissosiert mekanisk til individuelle celler med en flammebehandlet glass Pasteur pipette i 2 ml fullstendig medium. 1 x IO* celler ble på ny sådd ut i en 75 cm<2> vevskulturflaske med 20 ml EGF-inneholdende fullstendig medium. Proliferasjon av stamcellene og dannelse av nye neurosfærer ble reinitiert. Denne prosedyren kan bli gjentatt hver 6-8 dager for å danne et ubegrenset antall stamceller. ;EKSEMPEL 2 ;Genetisk modifikasjon av forløperceller med et retrovirusinneholdende bakterielt (3-galaktosidasegen ;Forløperceller formerte seg som beskrevet i eksempel 1. En stor pass-1 flaske av neurosfærer (4-5 dager gammelt) ble ristet for å løsne sfærene fra flasken. Flasken ble sentrifugert ved 400 rpm i 3-5 minutter. Omtrent halvparten av mediet ble fjernet uten å forstyrre neurosfærene. Sfærene og det gjenværende mediet ble fjernet, plassert i et Falcon 12 ml sentrifugerør og sentrifugert ved 600 rpm i 3-5 minutter. Det gjenværende mediet ble fjernet og noen få hundre mikroliter ble etterlatt. ;Et retrovirus som inneholdt det bakterielle P-galaktosidasegenet ble pakket og utskilt, på en replikasjonsmanglende måte, av CRE BAG2 cellelinje produsert av C. Cepko. En dag etter at CRE cellene nådde konfluens ble cellene vasket med PBS og retroviruset ble samlet i DMEM/F12/HM/20 ng/ml EGF i 4 dager. Det virusinneholdende mediet ble filtrert gjennom et 0,45 nm sprøytefilter. Neurosfærene ble resuspendert i virusinneholdende medium, overført til en stor flaske og hensatt i en inkubator over natten ved 37°C. Neste dag ble innholdet i flasken overført til et 12 ml sentrifugerør og sentrifugert ved 800 rpm. Cellene ble resuspendert i EGF-inneholdende medium/HM, dissosiert til enkeltceller og telt. Cellene ble sådd ut på ny i en stor flaske ved 50.000 celler/ml i totalt 20 ml. ;Fire dager senere ble transformerte celler selektert med G418 i en konsentrasjon på 300 Hg/ml. Transformerte sfærer ble sådd ut på et polyornitinbelagt objektglass i en 24-brønnskål. Etter at neurosfærene adhererte til skålen ble cellene fiksert ved 0,1 % glutaraldehyd i 5 minutter ved 4°C. Etter at cellene var fiksert ble de vasket to ganger med PBS i 10 minutter. Cellene ble deretter vasket med 0,1 % Triton<R> i PBS i 10-15 minutter ved romtemperatur. En 1 mg/ml X-Gal oppløsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert over natten ved 37°C. Etter inkubasjon over natten ble cellene vasket tre ganger med PBS 10 minutter hver og observert for eventuelle reaksjonsprodukter. En positiv reaksjon resulterte i en blå farge som indikerte at cellene inneholdt det overførte genet. ;EKSEMPEL 3 ;Preparering av forløperceller fra transgene mus ;Transgene mus ble produsert ved anvendelse av standard pronukleær injeksjon av MBP-lacZ chimerisk gen hvor promotoren for MBP leder ekspresjonen av E.coli P-galaktosidase (lacZ). Transgene dyr ble identifisert ved PCR ved anvendelse av oligonukleotider spesifikke for lacZ. ;Neurosfærer ble dannet fra E15 transgene mus og DNA negative dyr fra samme kull ved anvendelse av prosedyrene angitt i eksempel 1. Neurosfærene formerte seg i definert kulturmedium i nærvær av 20 ng/ml EGF og ble analysert hver uke i 35 uker. For passering av cellene ble neurosfærene høstet, forsiktig sentrifugert ved 800 rpm og mekanisk dissosiert ved triturering ved hjelp av en flammebehandlet Pasteur pipette. Ved forskjellige passasjerer ble cellene indusert til å differensiere til oligodendrocytter, astrocytter og neuroner ved å endre dyrkningsbetingelsene. Frittflytende stamcelleopphopninger ble forsiktig sentrifugert, resuspendert i samme grunndefinerte medium uten EGF og med 1 % føtalt bovint serum og sådd ut på polyornitinbehandlete glassplater for å fremme festing av celle. Sammenhopningene blir godt festet til glasset og cellene reduserer eller stopper delingen og begynner å differensiere. ;Identifikasjon av forskjellige celletyper ble oppnådd ved anvendelse av immunofluore-scensmikroskopi med antistoffer spesifikke for neuroner (MAP-2, NF-L og NF-M), astrocytter (GFAP) og oligodendrocytter og oligodendrocyttforløpere (A2B5, 0\, O4, Gal C og MBP). 1 til 14 dager etter utsåing ble cellene på objektglassene inkubert ufikserte, i 30 minutter ved romtemperatur med primære antistoffer (Ol, 04, GalC og A2B5 (supematanter) fortynnet i minimalt essensielt medium med 5 % normalt geiteserum og 25 mM HEPES buffer, pH 7,3 (MEM-HEPES, NGS). Etter behandling med de primære antistoffene ble objektglassene forsiktig vasket fem ganger i rhodaminkonjugerte sekundære antistoff (Sigma) fortynnet i MEM-HEPES, NGS. Objektglassene ble deretter vasket fem gangmer i MEM-HEPES og fiksert med sur alkohol (5 % iseddiksyre/95 % etanol) ved -20°C. Objektglassene ble deretter vasket fem ganger med MEM-HEPES og enten montert og undersøkt ved anvendelse av fluorescensmikroskopi eller immunoreagert med kaninpolyklonalt antisera dannet mot GFAP, nestin, MPB eller proteolipidprotein (PLP). Når utsatt for en annen runde med immunmerking ble objektglassene inkubert først i 1 time med 5 % normalt geiteserum (NGS) i 0,1 M fosfatbuffer med 0,9 % NaCl ved pH 7,4 (PBS) og deretter inkubert i kaninprimære antistoffer fortynnet i NGS i 1-2 timer ved romtemperatur. Objektglassene ble vasket tre ganger ved PBS og deretter inkubert med hensiktsmessig sekundære antistoffkonjugater fortynnet i NGS, vasket på ny med PBS og deretter til slutt plassert på glassmikroskopobjektglass med Citifluor fadingsreduserende monteringsmedium og undersøkt ved anvendelse av et fluorescensmikroskop. I de tilfellene hvor de ikke først ble inkubert med de monoklonale antistoffsupematantene ble objektglassene fiksert i 20 minutter med 4 % paraformaldehyd i PBS (pH 7,4), vasket med PBS, permeabilisert med 100 % etanol, vasket på ny med PBS og inkubert med 5 % NGS i PBS i 1 time. De primære antistoffene og sekundære antistoffkonjugatene ble applisert som angitt ovenfor. ;Nervestamceller avledet fra transgene dyr kunne ikke skilles fra ikke-transgene stamceller i deres evne til differensiering til neuroner, astrocytter og oligondendrocytter. MBP promotoren dirigerte ekspresjonen av P-galaktosidasereportergenet på en cellespesifikk og utviklingsmessig hensiktsmessig måte. Den transgene ekspresjon er meget stabil idet oligodendrocytter avledet fra sene passasjer av MBP-lacZ neurosfærer (20 passasjer) uttrykker P-galaktosidasegenet. Transgent markerte neurosfærer antas å være en meget god cellekilde for gliacelletransplantasjon. ;EKSEMPEL 4 ;Genetisk modifikasjon av forløperceller ved anvendelse av kalsiumfosfattransfeksjon ;Forløpercellene formerte seg som beskrevet i eksempel 1. Cellene blir deretter infisert ved anvendelse av en kalsiumfosfattransfeksjonsteknikk. For standard kalsiumfosfattransfeksjon blir cellene mekanisk dissosiert til en enkelt cellesuspensjon og sådd ut på vevskulturbehandlende skåler ved 50 % konfluens (50.000-75.000 celler/cm<2>) og hensatt over natt slik at cellene festet seg. ;Den modifiserte kalsiumfosfattransfeksjonsprosedyren blir utført som følger: DNA (15-25 ug) i steril TE buffer (10 mM Tris, 0,25 mM EDTA, pH 7,5) fortynnet til 440 ul med TE og 60 ul 2 M CaCl2 (pH til 5,8 med 1 M HEPES buffer) blir tilsatt til DNA/TE bufferen. Totalt 500 ul 2 x HeBS (HEPES-buffret saltvann; 275 mM NaCl, 10 mM KC1, 1,4 mM Na2HPC>4,12 mM dekstrose, 40 mM HEPES bufferpulver, pH 6,92) blir dråpevis tilsatt til denne blandingen. Blandingen ble hensatt ved romtemperatur i 20 minutter. Cellene blir forsiktig vasket med 1 x HeBS og 1 ml kalsiumfosfatpresipitert DNA oppløsning blir tilsatt til hver plate og cellene inkubert ved 37° i 20 minutter. Etter denne inkubasjonen blir 10 ml fullstendig medium tilsatt til cellene og skålene plassert i en inkubator (37°C, 9,5 % CO2) i ytterligere 3-6 timer. DNA og mediet blir fjernet ved avsuging ved avsluttet inkubasjonsperiode og cellene blir vasket tre ganger med fullstendig vekstmedium og deretter returnert til inkubatoren. ;EKSEMPEL 5 ;Genetisk modifiserte forløperceller som uttrykker NGF ;Ved anvendelse av enten rekombinant retrovirus eller direkte DNA transfeksjonsteknikk blir kimære gen bestående av human cytomegalovirus CMV promotor som dirigerer ekspresjonen av rotte NGF genet innført i neurosfæreceller. I tillegg innbefatter vektoren E.coli neomycinresistensgenet fra en viral promotor. Etter 2 uker med G418 seleksjon blir cellene klonet ved anvendelse av begrenset fortynning i 96 multibrønnskåler og de resulterende klonene blir analysert for neurotrofinproteinekspresjon ved anvendelse av en neurotrofmreseptor (trk familie) autofosforyleirngsbioanalyse. ;Kloner som uttrykker høye nivåer av NGF formeres i T-flasker før differensiering. Cellene blir deretter fjernet fra EGF-inneholdende fullstendig medium og behandlet med en kombinasjon av serum og en cocktail av vekstfaktorer for å indusere astro-cyttdifferensieringen. Astrocyttene blir på ny analysert for NGF ekspresjon for å forsikre at de differensierte cellene fortsetter å uttrykke de trofiske faktorene. Astrocytter som utskiller NGF blir deretter injisert i fimbria-/fomiksskadet rotthjeme øyeblikkelig etter skadene for å beskytte cholinergiske neuroner. KontroUastrocytter som ikke utskiller NGF blir injisert i dyr med lignende skade. De cholinergiske neuronene i le-sjonsmodellen blir vurdert ved anvendelse av immuncytokjemi for ChAT som er markøren til disse cholinergiske neuronene. ;EKSEMPEL 6 ;Genetisk modifiserte forløperceller som uttrykker CGAT ;Forløperceller formeres som i eksempel 1. Cellene blir mekanisk dissosiert og sådd ut på plastskåler og infisert med et retrovirus inneholdende CGAT cDNA. Ekspresjon av CGAT cDNA (Liu et al, ovenfor) blir ledet av en konstitutiv promotor (CMV eller SV40, eller en retroviral LTR) eller en cellespesifikk promotor (TH eller annet dopaminergisk eller katecholaminergisk cellespesifikt regulatorisk element eller lignende). Cellene blir screenet for ekspresjon av CGAT proteinet. Selekterte celler kan deretter bli differensiert in vitro ved anvendelse av en vekstfaktor eller en kombinasjon av vekstfaktorer for å produsere dopaminerge eller pre-dopaminerge neuroner. *

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for å produsere ikke-tumorigene, genetisk modifiserte multipotente nervestamceller fra sentralnervesystemet (CNS), karakterisert ved følgende trinn: (a) isolering av multipotente CNS-nervestamceller fra nervevev, unntatt humant embryonalt vev/humane embryonale celler, der nervestamcellene ikke er immortalisert med en onkogen, og der CNS-nervestamcellene er i stand til å produsere avkom som kan differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter; (b) proliferering av nevnte multipotente CNS-nervestamceller i et serumfritt kulturmedium inneholdende en vekstfaktor som induserer multipotent CNS-nervestamcelleproliferering, (c) ytterligere formering av de prolifererende celler, og (d) genetisk modifisering av de formerte celler ved å introdusere et eksogent polynukleotid til de prolifererte celler, der de prolifererende celler er genetisk modifisert til å produsere et vekstfaktorprodukt, en vekstfaktor reseptor eller til å uttykke en neurotransmitter.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at vekstfaktoren som induserer multipotent CNS-nervestamcelleproliferering i kulturmediet ifølge trinn (b) er valgt fra gruppen sur fibroblastvekstfaktor, basisk fibroblastvekstfaktor, epidermalvekstfaktor, amfiregulin, transformerende vekstfaktor alfa, plateavledet vekstfaktor, insulinliknende vekstfaktorer og kombinasjoner av disse.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nervevevet oppnås fra et voksent menneske.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at vekstfaktorproduktet er valgt fra gruppen bestående av nervevekstfaktor, hjerneavledet neurotrofisk faktor, neurotrofiner, ciliær neurotrofisk faktor, amfiregulin, basisk fibroblastvekstfaktor, sur fibroblastvekstfaktor, epidermalvekstfaktor, transformerende vekstfaktor-alfa, transformerende vekstfaktor-beta, blodplateavledet vekstfaktor, insulinliknende vekstfaktorer og interleukiner.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at vekstfaktorreseptoren er valgt fra gruppen bestående av p75 lavaffinitetsnervevekstfaktorreseptor, ciliær neurotrofisk faktor reseptor, neurofrofinreseptorer, epidermal vekstfaktorreseptor, fibroblastvekstfaktorreseptor og amfiregulinreseptor.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at neurotransmitteren velges fra gruppen bestående av serotonin, L-dopa, dopamin, noradrenalin, adrenalin, tachykinin, endorfin, histamin, N-metyl-D-aspartat, glycin, glutamat, y-aminosmørsyre og acetylcholin.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at de prolifererende celler er genetisk modifisert til å inneholde et neurotransmittersyntetiserende gen.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det neurotransmittersyntetiserende genet velges fra gruppen bestående av tyrosinhydroksylase, dopadekarboksylase, dopa-beta-hydroksylase, fenyletanolamin-N-metyltransferase, glutaminsyre dekarboksylase, tryptofanhydroksylase, cholinacetyltransferase og histidindekarboksylase.

9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at de prolifererende celler genetisk modifiseres til å produsere et neuropeptid.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at neuropeptidet velges fra gruppen bestående av substans-P, neuropeptid-Y, enkefalin, vasopressin, vasoaktivt tarmpeptid, cholecystokinin, glukagon, bombesin, somatostatin og kalsitoningenrelatert peptid.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at de prolifererende celler genetisk modifiseres til å utrykke kromaffingranulatamintransporter.

12. Kultur omfattende genetisk modifiserte multipotente nervestamceller fra sentralnervesystemet (CNS) som ikke er immortalisert med et onkogen, og som: (a) farger positivt for nestin; (b) er i stand til å produsere avkom som har evne til å differensiere til oligodendrocytter, astrocytter og neuroner; og (c) er ikke-tumorigene, der cellekulturen oppnås ved trinnene: (a) isolering av multipotente CNS-nervestamceller fra nervevev unntatt humant embryonalt vev/humane embryonale celler, der nervestamcellene ikke er immortalisert med et onkogen, og der CNS-nervestamcellene er i stand til å produsere avkom som har evnen til å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter; (b) proliferering av nevnte multipotente CNS-nervestamceller i et serumfritt dyrkningsmedium inneholdende en vekstfaktor som induserer multipotent CNS-nervestamcelleproliferering, (c) ytterligere formering av de prolifererende celler, og (d) genetisk modifisering av de formerte celler ved å introdusere et eksogent polynukleotid til de prolifererende celler, der de prolifererende celler er genetisk modifisert til å produsere et vekstfaktorprodukt, en vekstfaktor reseptor eller til å uttykke en neurotransmitter.

13. Kultur ifølge krav 12, karakterisert ved at cellen er en human celle.

14. Kultur ifølge krav 12 eller 13, karakterisert ved at cellen er genetisk modifisert til å uttrykke en biologisk aktiv substans valgt fra gruppen bestående av vekstfaktorprodukter, vekstfaktorreseptorer, neurotransmittere, neurotransmitterreseptorer og neuropeptider.