JPH08505528A - 神経芽細胞の産生方法 - Google Patents

神経芽細胞の産生方法

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JPH08505528A JP6516204A JP51620494A JPH08505528A JP H08505528 A JPH08505528 A JP H08505528A JP 6516204 A JP6516204 A JP 6516204A JP 51620494 A JP51620494 A JP 51620494A JP H08505528 A JPH08505528 A JP H08505528A
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Abstract

(57)【要約】 神経芽細胞を産生する方法、ならびに神経芽細胞の豊富化された集団よりなる細胞組成物を提供する。また、神経芽細胞に影響する組成物を同定し、かつニューロン疾患を持つ対象を治療するための方法、ならびに神経芽細胞を産生し維持するための培養系も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 神経芽細胞の産生方法 本出願は、１９９３年１月６日出願の出願番号０８/００１,５４３号の一部継 続出願である。 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、一般的に示された神経芽細胞であるニューロン由来の細胞集団、こ れら細胞集団の産生方法および長期イン・ビトロ培養方法、および種々のニュー ロン疾患の治療における神経芽細胞の使用ならびに神経芽細胞に影響する組成物 の同定に関する。 ２．関連分野の説明 わずかに数種のニューロン細胞型が成人脳において分裂すると報告されている にすぎず、成人ニューロンはイン・ビトロでは良好に生存しない。神経生物学、 遺伝学、免疫学および分子生物学における全ての最近の進歩にも拘わらず、今日 まで、不滅性を欠いた中枢神経系（ＣＮＳ）およびニューロン組織から細胞系を 確立する信頼できる方法がない。脳の異なった領域からのクローン化細胞系の世 代は重要であり、新規な神経栄養因子やその受容体の発見を顕著に容易ならしめ 、それらの機能の理解を向上させるであろう。 中枢神経系には、ニューロンおよび神経膠細胞として知られる２種の主要なク ラスの細胞が含まれる。神経膠細胞には、神経星状膠細胞、乏突起膠細胞および 小膠細胞が含まれる。数百種の異なった型のニューロン、ならびにその増殖性お よび分化に影響する多くの異なった神経栄養因子が存在する。ニューロンの型お よび該ニューロンが存在する脳の領域に依存して、異なった神経栄養因子または 因子の特定の組合せが、該ニューロンの生存、増殖および分化に影響している。 各型のニューロンは、異なった組合せの神経伝達物質、神経栄養因子およびその 環境における他の分子に反応する。 今日まで、潜在的に有用な神経活性化合物を研究するのに必要な細胞系の不足 により、ＣＮＳにおける神経薬理学的研究は遅延してきた。生きた動物において は、脳の複雑さが、これらの化合物によりいずれの細胞性受容体が標的化される かを効果的に測定するのを困難なものとしている。加えて、生きた動物の研究に かかる出費および動物擁権運動に起因する最近の論争が、初期研究におけるイン ・ビボ（in vivo）の動物実験をより受け入れ難いものとしてきた。ニューロン 組織からの初代細胞がしばしばＣＮＳ研究に用いられるが、初代ニューロンの長 期培養は達成されていない。また、長期培養のみならず、ニューロン細胞の実際 の増殖を達成しようとする試みは数件しか報告されていない。実際、ニューロン 細胞の増殖は、非常につかまえどころのないものと証明されてきたため、ニュー ロン細胞はイン・ビトロでは増殖しないということが科学学会において深く根付 いてきている。その結果、必要なニューロン細胞型を得るための各実験につき新 鮮体の切開を行わなければならず、その結果として、実験結果に大きな変動を伴 った費用のかかる研究となる。 幾つかのニューロン腫瘍原細胞が存在する一方で、それらは数がほとんどなく 、しかも特徴付けされていない。一般的に、これらの腫瘍細胞系は、それらが元 来それから確立された初代ニューロンの生物性を模倣せず、その結果、薬剤発見 のスクリーニング・プログラムには適していない。初代細胞をよりよく表現型的 に表し、かつ増殖能を有する特定のニューロン細胞系の連続培養を可能とするで あろうイン・ビトロの初代培養物は、神経生物学の研究およびＣＮＳ薬剤発見の 試行ならびに治療には非常に価値あるものであろう。 神経系のイン・ビトロ実験からの情報収率を向上させるであろうニューロン細 胞系を産生するためには、培養方法学におけるはっきりとした条件および改善が さらに必要であることがますます明らかになってきている。培養中のニューロン 細胞を維持するための細胞型および発生段階に特異的な要求性、ならびにより広 い培養条件範囲の開発の認識が必要である。しかしながら、これらの目的に達す るためには、通常の培養技術で用いる生物流体を欠いたイン・ビボ（in vivo） 条件を模倣した最適な培養法を開発することが非常に重要である。 最近、幾人かの研究者達が、脳の種々の領域および異なった発生段階から前駆 細胞を単離し不滅化させている。ニューロンおよび神経膠細胞の表現型を有する 細胞系を開発するために、嗅細胞系および小脳細胞系がウイルスmyc（v-myc）オ ンコジーンを用いて不滅化されている（ライダー（Ryder）ら、ジャーナル・オ ブ・ニューロバイオロジー（J.Neurobiology）第２１巻：３５６頁、１９９０年 ）。スニダー（Snyder）らによる同様な実験（セル（Cell）第６８巻：３３頁、 １９９２年）では、ラット小脳に移植するとニューロンおよび神経膠細胞を形成 する多能性のニューロン細胞系が得られた。その他の研究において、ｃ-ｍｙｃ を含むレトロウイルス・ベクターを用いてネズミの神経上皮細胞が不滅化され、 それを成長因子と共に培養して星状膠細胞およびニューロンに類似する分化細胞 型が得られている（バートレット（Bartlett）ら、プロシーディングス・オブ・ ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ（Proc.N atl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第８５巻：３２５５頁、１９８８年）。 上皮成長因子（ＥＧＦ）は、成体マウス脳の線条から単離した少数の細胞のイ ン・ビトロ増殖を誘導するために用いられている（レイノルズ（Reynolds）およ びワイス（Weiss）、サイエンス（Science）第２５５巻：１７０７頁、１９９２ 年））。これらの細胞クラスターは、神経上皮幹細胞の免疫原性を有し、適当な 条件下でこれらの細胞は、イン・ビボにおける成体線条の表現型特性を有する神 経星状膠細胞およびニューロンへの分化を誘導できた。しかしながら、これらの 分化ニューロンは長期間は培養されておらず、これらの細胞を冷凍し、次いで解 凍して再培養できたという証拠がないことは特記すべきである。 カッタネオ（Cattaneo）およびマッケイ（Mckay）は、神経成長因子（ＮＧＦ ）のニューロン前駆細胞の増殖に対する影響を測定するためにラット線条を用い て実験を行った（ネイチャー（Nature）第３４７巻：７６２頁、１９９０年）。 ラット胎児線条から該細胞を摘出し、ＮＧＦおよび塩基性繊維芽細胞成長因子（ ＦＧＦ２としても知られているｂＦＧＦ）の双方に露した。９日間だけこれらの 細胞をイン・ビトロで培養し、その時点で、ニューロン特異的マーカーでのアッ セイにより測定するとこれらの細胞がニューロンへと分化していた。 １３日齢のラット胚の大脳半球からのニューロン前駆細胞を、５ｎｇ/ｍｌの ｂＦＧＦの存在下にて８日目まで培養した（ゲンスバーガー（Gensberger）ら、 エフイィビィエス・レターズ（ＦＥＢＳ Lett.）第２１７巻：１頁、１９８７年 ）。この濃度では、ｂＦＧＦは短期間の増殖を刺激したにすぎなかった。ＮＧＦ およびｂＦＧＦの組合せまたはＥＧＦのみに反応しての、胎児および成体の線条 からの初代ニューロンの増殖および分化も報告されている（カッタネオ（Cattan eo）ら、前掲；レイノルズ（Reynolds）およびワイス（Weiss）、前掲）。 前記の観点より、増殖させ、長期にわたって継代し、継代培養植することがで きるニューロン細胞集合集団を大規模で産生し維持できるであろう長期イン・ビ トロ培養系に対する要望がある。かかるイン・ビトロにおける同質のニューロン 培養物が、細胞集団、これらの細胞間の相互作用および種々の神経活性組成物の これら細胞に対する影響を研究するのに貴重であることが証明されるであろう。 発明の概要 イン・ビトロにおいてニューロン細胞を産生し維持するための系の重要性を認 識して、本発明者らは、胎児および成体のニューロン細胞系を連続産生するため の方法および培養系を開発した。オンコジーンの不滅化を欠いた中で神経栄養因 子を用いる、神経芽細胞として知られる細胞系として維持された初代ニューロン 培養法の開発は、今や、これらの細胞の生化学的および細胞的特性に関する基本 的な問題、ならびにそれらの細胞環境と化学環境との間の相互作用の動態の研究 を可能とする。 本発明の神経芽細胞は、例えば、ニューロン疾患を患った対象の治療における 使用および種々の受容体、リガンドおよび神経伝達物質と相互作用する組成物を 同定するためためのこれらの分子をコードする遺伝子配列を安定に取り込ませる のに有利に用いることができる。 図面の簡単な説明 図１は、培養物中の初代ニューロンのＢｒｄＵ染色およびニューロタグTM（Ne uroTagTM）結合を示す図である。Ａ．初代ニューロンをＢｒｄＵで１日間；Ｂ． ４日間標識した図。Ｃ．初代細胞のニューロン性をテタヌス毒（ニューロタ グTM）との結合により測定した図。培養物中の全細胞の細胞体および突起を染色 した。較正バー＝２０μｍ。 図２は、初代ニューロンの培養および継代の間に起こる形態学的変化を示した 顕微鏡写真を示す図である。Ａ．Ｎ２＋ｂＦＧＦ中に平板培養して４日後の初代 細胞培養物。Ｂ．継代（継代３）後培養４日目の初代細胞。細胞はさらに大きく なっており、やはり大きさが増大した突起により相互連結している。小さな増殖 中の細胞が培養物中に確認できた。Ｃ．ｂＦＧＦの存在下にて〜１４日継代（継 代３）し、培養保持した細胞。ネガティブにて倍率 ３３×。 図３は、培養物中の初代ニューロンの透過型電子顕微鏡写真を示す図である。 Ａ．主頂端突起（矢印）および細径突起（矢印根元）を含む細胞体および突起の 両方を示す錐体型の初代海馬ニューロン。バー＝１０μｍ。Ｂ．パネルＡに示し たニューロン細胞体の拡大図。バー＝１μｍ。Ｃ．パネルＡに示したニューロン の主頂端突起の一部分である。バー＝１μｍ。Ｄ．２つの神経細胞突起の接触点 。バー＝０.１μｍ。 図４は、培養中の初代ニューロンの走査型電子顕微鏡写真を示す図である。Ａ ．複数レベルの分岐を含む大きな突起を有する良好に分化した錐体型細胞体（矢 印）と、大きく、伸長した突起を有する丸い分化の低いニューロン（矢印根元） を含む培養中の初代海馬ニューロンの全体図である。バー＝５０μｍ。Ｂ．（恐 らく細径突起から出現した軸索である）幾つかの小突起を有し、第一（主）分岐 に隣接した滑らかかつ規則的な径の突起を示す良好に分化した錐体型ニューロン から出現した主頂端樹状突起。容器表面を被覆するＰＯＲＮ/ラミニンが、幾つ かの斑点を欠く多孔性の絨毬状物として観察できた。Ｃ．（図３Ａに比して）大 きな錐体細胞体を有するよく分化したニューロン（図面中央）および他のニュー ロンからの多数の突起により接触した大頂端樹状突起（矢印の根元）。細胞分裂 過程の間に固定された他の分化の低いニューロンも存在する（矢印）。バー＝２ ０μｍ。Ｄ．パネルＣの図の上部視野における細胞分裂しているニューロンの拡 大図。バー＝１０μｍ。 発明の詳細な説明 本発明は、単離したニューロン細胞集団を産生するためのイン・ビトロ法を提 供する。神経繊維芽と称されるこれらの細胞は、該細胞が付着できる容器を用い て、少なくとも１種の栄養因子を補給した無血清培地中でニューロン細胞を培養 することよりなる方学を利用することにより産生できる。この方法により、増殖 能を有する胎児および成体の両組織からの、脳の異なった領域からのニューロン 細胞培養物を連続して得ることが可能となる。 また、本発明は、神経芽細胞の増殖を阻害または剌激することによるごとき、 神経芽細胞に影響する組成物を同定する方法も提供する。少なくとも１種の栄養 因子を含有する無血清基礎培地および神経芽細胞が付着できる容器よりなる、神 経芽細胞の産生および維持に有用な培養系も提供される。また、本発明の方法に より産生した神経芽細胞の豊富化された集団も提供され、さらに、神経細胞疾患 を持つ対象の治療または、別法として該神経芽細胞に影響する組成物をスクリー ニングするのに利用することもできる。 本明細書中で用いる「神経芽細胞」なる語は、不滅化されたニューロン系の非 神経膠細胞をいう。ニューロンの「不滅化」とは、それにより、無期限にイン・ ビトロで維持、成長および増殖できるよう成長因子でニューロン系の非-神経膠 細胞を処理する方法をいう。典型的には、動物から摘出した組織を適当な流体培 地を入れた培養容器に置いた、有限の寿命を有する初代培養物である。それに対 して、連続細胞系は増殖し、従って継代培養できる（すなわち新たな培養容器に 繰り返して継代できる）。また、連続細胞系は、低温保存剤、例えば１０％ジメ チルスルホキシドまたはグリセリンが存在する場合、液体窒素の気相中にて冷凍 状態で長期間保存することもできる。本発明の神経芽細胞は、オンコジーン不滅 化をたよることがないのを除いて、初代培養物に酷似した細胞系として、長期培 養にて維持できる。むしろ、「不滅化」は、特定の成長因子または成長因子の組 合せを利用することにより初代ニューロン細胞から連続培養を確立する。この不 滅化技術は、遺伝子移入または遺伝子操作を要せず、その結果、該細胞は初代培 養物にさらに酷似する点で新規である。 それぞれ区別される特性を有する数百の異なった型のニューロンがある。各型 のニューロンは、異なった組合せの神経伝達物質および神経栄養因子を産生し、 それに反応する。ニューロンは成体の脳では分裂せず、またそれらは一般的にイ ン・ビトロでは長期間生存しない。本発明の方法は、脳および脊髄の実質的にい ずれもの領域からの不滅化ニューロンまたは神経芽細胞のイン・ビトロにおける 単離および増殖を提供する。神経芽細胞系を開発するためには、胎児または成体 のニューロンのいずれかが利用できる。神経芽細胞の産生に利用する本発明のニ ューロン細胞は、海馬、小脳、脊髄、皮質（例えば、運動皮質または体性感覚皮 質）、線条、前脳基底野（コリン作動性ニューロン）、腹側中脳（黒質の細胞） 、および青斑核（中枢神経系の神経性アドレナリン細胞）からの組織を包含する 、いずれの胎児または成体のニューロン組織由来のものであってもよい。 本発明の神経芽細胞を産生するための液体培地は、神経芽細胞の成長および増 殖を支持するための少なくとも１種の栄養因子が補給されている。栄養因子は、 ニューロンの発生および生存に関与する分子である。それらは、しばしば脳で合 成され、特異的な受容体を有し、ニューロンのサブセットの生存および機能に影 響する。かかる因子の例としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因 子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロピン-３,-４および-５（ＮＴＦ-３,-４,-５）、 毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸 性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細 胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子-Ｉおよび-II（ＩＧＦ-Ｉ、-II） 、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）およびリンパ球侵潤因子/コリン作 動性分化促進因子（ＬＩＦ/ＣＤＦ）が含まれる。栄養因子の特異性および選択 性は、その受容体により測定する。本発明で利用する該栄養因子は神経栄養因子 が好ましい。本発明の神経芽細胞の産生のための基礎培地に添加する神経栄養因 子はｂＦＧＦが好ましい。イン・ビトロにおいて該神経芽細胞を成長させ増殖で きる神経栄養因子は、該神経芽細胞の組織起源に依存するであろう。しかしなが ら、ほとんどのニューロン細胞には、ｂＦＧＦが好ましい神経栄養因子であろう 。 神経芽細胞の産生に利用する容器は、該ニューロン細胞が粘着できる表面を提 供しなければならない。また、かかる容器は、一度単離した神経芽細胞培養物を 産生させたことがあるものが好ましい。該ニューロン細胞の付着性を高めるため に用いる表面は、容器の実際の内部層あるいは、より間接的には、容器内に存在 する補給挿入物または膜である。うちゃくは、該細胞が容器上で単層にて増殖で きるいずれの方法でもなし得る。付着性を高める表面は、該容器に適するプラス チックポリマーを有利に選択することによるごとく直接的に作製するか、または 、第二の化学処理により容器内の表面を処理するごとく間接的に作製できる。し たがって、「付着」とは、細胞が組織培養容器の表面に付着できる能力をいい、 ここに該付着促進性表面は、懸濁液中では三次元の細胞集合体にて増殖するであ ろうニューロン細胞と直接接触する。ニューロン細胞の容器表面への粘着または 接着により、該細胞を不滅化させることができる。 可溶性因子との相互作用に加えて、ニューロン細胞を含むほとんどのイン・ビ ボの細胞は、細胞間の間隙で局部的に分泌され複雑なネットワークに集合する相 互活性蛋白質および多糖分子の複合配列である細胞外マトリックスと接触する。 従って、細胞外マトリックス蛋白質を該培養容器の表面に添加して、イン・ビボ 細胞外マトリックスにそっくり対応する様式にて培養物中のニューロン細胞が付 着できるような不溶性マトリックスを形成させる。好ましくは、本発明の神経芽 細胞は、初期粘着が可能な多塩基性アミノ酸組成物で組織培養皿またはフラスコ のごとき容器の表面を被覆することにより産生させることができる。かかる組成 物は当該分野でよく知られており、ポリオルニチンおよびポリリジンが含まれる 。本発明の該塩基性ポリアミノ酸はポリオルニチンが最も好ましい。加えて、該 容器の表面は、該神経芽細胞の増殖能を向上させ、基質上に突起を形成させる公 知の細胞外マトリックス蛋白質組成物で被覆することもできる。かかる組成物に は、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンが含まれる。多塩基性アミノ 酸と組み合わせて用いることができる他の細胞外マトリックス蛋白質は、当業者 に明らかであろう。加えて、成体神経芽細胞の産生には、最初に、血清存在下に て該細胞を培養するのが好ましい。 本発明の神経芽細胞は、神経芽細胞の生物学的機能に影響する神経薬理学的化 合物のスクリーニング手段として有用である。かくして、もう一つの具体例にお いて、本発明は、成分を相互作用させるに十分な条件下にて、試験すべき組成物 および神経芽細胞を含む成分をインキュベートし、次いで、該組成物の該神経芽 細胞に対する影響を測定することよりなる、神経芽細胞に影響する組成物を同定 する方法を提供する。該神経芽細胞に対して観察される影響は、阻害性または剌 激性のいずれかとなり得る。例えば、神経伝達物質に似ているか、または受容体 に結合してアンタゴニストもしくはアゴニスト作用を示し、それにより神経芽細 胞における生物学的反応を阻害または剌激する神経剌激性化合物が、本発明の方 法を用いて同定できる。生物学的反応の発生は、当業者に知られている標準的な 技術を用いてモニターできる。例えば、生物学的反応の阻害または刺激は、神経 芽細胞におけるある遺伝子の発現レベルにより同定できる。かかる遺伝子には、 ｆｏｓ、ｍｙｃまたはｊｕｎのごとき初期反応性遺伝子を含めることができる（ グリーンバーグ,エム（Greenberg,M.）およびツィフ，イィ（Ziff,E.）、ネイチ ャー（Nature）第３１１巻：４３３頁、１９８４年；ブルック（Bruck）ら編、 オンコジーンズ（Oncogenes）、１９８８年、スシュププリンゲルーファーラグ （Spriner-Verlag）、ニュー・ヨーク（New York））。細胞表面マーカーをコー ドするものを含む他の遺伝子を、本発明の神経芽細胞に対する神経薬理学的化合 物の影響の指標として用いることもできる。かかる影響を測定する方法には、Ｒ ＮＡのノザンブロッティング分析（転写）、蛋白質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析（翻 訳）、［3Ｈ］-チミジン取り込み（ＤＮＡ合成）および（細胞内および細胞外の ）抗体反応性が含まれる。他の通常用いる方法は、当業者に明らかであろう。 かくして、ニューロン細胞に影響することがすでに知られているものと同様に 作用する神経刺激性薬剤を同定することができる。例えば、重要な阻害性伝達物 質であるガンマ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の作用を増大または刺激するバリウム （Valium）に類似する、不安を緩和する新しい薬剤が同定できる。プロザック（ Prozac）のごとき抗鬱薬は、広範な種々の機能を有するインドールアミンである セロトニンの作用を向上させる。本発明の方法による神経芽細胞を用いれば、他 の薬剤も容易に同定することができる。他の例としては、精神刺刺激化合物が含 まれる。例えば、コカインがドーパミンの作用を助長する一方、ある種の抗精 神薬はこのカテコールアミンに拮抗するかまたは阻害する。もう一つの例は、大 脳皮質全体にわたって分布しているアセチルコリン受容体を活性化するニコチン である。従って、脳の適当な領域からのニューロン細胞由来の神経芽細胞を用い ることにより、種々の受容体に結合してニューロン細胞に同様の影響を及ぼす薬 剤および栄養因子が、本発明の方法を用いて同定できる。 前記のごとく、ニューロン細胞の不滅化は、オンコジーン用いることなく達成 することができる。しかしながら、所望により、本発明の神経芽細胞を不滅化し て、所定の発生段階で該細胞を維持することができる。典型的に、不滅化のため の本技術には、オンコジーンの該細胞へのトランスフェクションが含まれ、従っ て、少なくとも１種のオンコジーンを神経芽細胞に導入することにより該神経芽 細胞の不滅化が達成できる。該オンコジーンのトランスフェクションは、組換え レトロウイルス、化学的方法または物理的方法を用いることを包含する当業者に よく知られた幾つかの常法により達成できる。組換えレトロウイルス移入が、神 経芽細胞を不滅化させるための本発明の好ましい方法である。 リン酸カルシウム共沈法のようなトランスフェクション法、マイクロインジェ クションのごとき通常の機械的方法、リポソーム中に封入したプラスミドの挿入 によって、またはウイルスベクターの使用によって、特定のオンコジーンで該宿 主神経芽細胞を不滅化できる。例えば、１つの方法は、シミアンウイルス４０（ ＳＶ４０）またはウシ乳頭腫ウイルスのごとき真核生物ウイルスベクターを用い て該神経芽細胞を一過的に感染するかまたは形質転換することである（「真核生 物ウイルスベクターズ（Eukaryotic Viral Vectors）」、コールド・スプリング ・ハーバー研究所（Cold Spring Habor Laboratory）、グルツマン（Gluzman） 編、１９８２年）。 本明細書中にて教示した不滅化のために利用できる種々のウイルスベクターに は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、好ましくはレト ロウイルスのごときＲＮＡウイルスが含まれる。該レトロウイルスベクターは、 マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体が好ましい。その中に一個の外来遺 伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、限定するものではないが： モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス （ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳ガンウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイ ルス（ＲＳＶ）が含まれる。さらに多数のレトロウイルスベクターが、複数の遺 伝子を取り込むことができる。これら全てのベクターは、形質導入した細胞を同 定しそれを得ることができる発生できるように、選択マーカー用の遺伝子を移入 しまたは取り込むことができる。 組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるため、感染性のベクター粒子を生 成するためにはそれらは補助手段を要する。例えば、長鎖末端繰返し配列（ＬＴ Ｒ）内の調節配列の制御下にある該レトロウイルスの全構造遺伝子（ｇａｇ、ｅ ｎｖおよびpｏｌ遺伝子）をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用い ることにより、この補助手段を提供できる。これらのプラスミドは、包膜のため のＲＮＡ転写物を認識するパッケージング機構を可能にするヌクレオチド配列を 欠損している。該パッケージング・シグナルを欠損しているヘルパー細胞系には 、限定するものではないが、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７、ＰＡ１２、ＣＲＩＰお よびＣＲＥが含まれる。ゲノムがパッケージないため、これらの細胞系は空のビ リオンを生成する。その中の該パッケージ・シグナルは無傷であるが構造遺伝子 が他の目的遺伝子により置換されているかかる細胞にレトロウイルスベクターを 導入しすると、該ベクターはパッケージングされ、ベクタービリオンを生成でき る。次いで、この方法により生成したベクタービリオンを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３ 細胞のごとき組織細胞系に感染させて大量のキメラウイルスビリオンを産生させ ることができる。 別法として、通常のリン酸カルシウム共沈法またはリポフェクション・トラン スフェクションにより、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ をコードするプラスミドでＮＩＨ３Ｔ３または他の組織培養細胞を直接トラスフ ェクションすることもできる。次いで、これらの細胞を目的の遺伝子を含むベク タープラスミドでトランスフェクションする。得られた細胞は該レトロウイルス ベクターを培養培地中に放出する。 また、ヘルペスウイルスに基づくベクターを用いて遺伝子を神経芽細胞に移入 することもできる。ヘルペスウイルスは潜伏感染を確立でき、かつ幾つかのニュ ーロン細胞と明らかな非病原性関係を確立できるため、例えば、ＨＳＶ-１に基 づくかかるベクターを用いることができる。同様にして、狂犬病ウイルス、麻疹 ウイルスおよび他のパラミクソウイルスのごときＣＮＳの細胞に効率的に感染す る他のヒトおよび動物ウイルス、ならびにヒト免疫不全症候群レトロウイルス（ ＨＩＶ）さえもが、有用なデリバリーベクターおよび発現ベクターを開発するの に利用する有利できよう。 組換えレトロウイルスを不滅化オンコジーンを含むよう設計する場合、該オン コジーンは不滅化することが知られているいずれのものであってもよい。例えば 、かかる通常用いられる不滅化遺伝子には、ｍｙｃファミリーの遺伝子（ｃ-ｍ ｙｃおよびｖ-ｍｙｃの両方）が含まれる（バートレット（Bartlett）プロシー ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユ ーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第８５巻：３２５５頁、１９８８年 ）、アデノウイルス遺伝子（Ｅ１ａ１２ｓおよびＥ１ａ１３ｓ）（ラリー（Rule y）ら、ネイチャー（Nature）第３０４巻：６０２頁、１９８３年）、ポリオー マウイルスの大Ｔ抗原およびＳＶ４０の大Ｔ抗原（フレデリクセン（Frederikse n）ら、ニューロン（Neuron）第１巻：４３９頁、１９８８年）。本発明の神経 芽細胞を不滅化するのに用いる該オンコジーンはｖ-ｍｙｃが好ましい。例えば 、細胞を不滅化するが、完全な形質転換には第二の遺伝子を必要とする他の核オ ンコジーンのような他の遺伝子も当業者に知られているであろう。 神経芽細胞の不滅化のための前記と同一のトランスフェクション方法を利用し て他の外来遺伝子を本発明の神経芽細胞に移入することができる。「外来遺伝子 」とは、神経芽細胞に導入される該神経芽細胞の外に由来する遺伝物質をいう。 神経薬理学的化合物を同定する方法に有用であろう望ましい外来遺伝子の例は、 受容体分子の遺伝子である。例えば、かかるニューロン受容体には、ドーパミン 、ＧＡＢＡ、アドレナリン、ノルアドレナリン、セロトニン、グルタメート、ア セチルコリンおよび種々の他の神経ペプチドに結合する受容体が含まれる。特定 の神経起源の神経芽細胞における特定の受容体の移入および発現によって、その 神 経芽細胞型およびその受容体が関与する疾患の治療に有用となり得る神経刺活性 性薬剤および栄養因子を同定することが可能となろう。例えば、神経伝達物質に 似ており、かつ受容体に結合してしてアンタゴニストまたはアゴニスト作用を示 し、それにより神経芽細胞における反応を阻害または刺激する神経活性化合物が 、本発明の方法を用いて同定できる。 もう一つの具体例において、本発明は、少なくとも１種の栄養因子を含有する 無血清基礎培地と神経芽細胞が粘着できる表面を有する容器とからなる、神経芽 細胞を産生し維持するのに有用な培養系を提供する。該培養系を利用して前記し た神経起源のいずれの組織からも神経芽細胞を産生することができる。本発明の 「無血清基礎培地」とは、神経芽細胞を産生し維持できる溶液をいう。該基礎培 地は、好ましくは、通常用いる液体組織培養培地であるが、無血清であって神経 芽細胞が増殖できる種々の明確な成分が補給されている。本発明の培養系に有用 な基礎培地は、特定なアミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝剤およびエネルギー源 を含むダルベッコの最小必須培地のごとき当該分野でよく知られたいずれかの組 織培養培地である。ホルモン、成長因子、輸送蛋白質、微量元素、ビタミンおよ び下層修飾因子を包含する精製分子を基礎培地に添加して生物流体を置き換える 。典型的には、例えば、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、プトレッシン 、インスリンおよびトランスフェリンを、該基礎培地に添加して神経芽細胞の成 長および増殖を向上させる。本発明の培養系では、ニューロン単独の増殖を支持 するのに２種の明確な補給物（トランスフェリンおよびインスリン）のみが必要 であるが、前記の５種の補給物を組み合わせても高い相乗性の増殖刺激効果を有 する。いずれか１種の補給物を欠くと、神経芽細胞の増殖は顕著に低下する。こ れらの要素を含む好ましいプロトタイプ培地の例はＮ２培地である（ボッテンシ ュタイン（Bottenstein）およびサト（Sato）ら、プロシーディングズ・オブ・ ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ（Proc.N atl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第７６巻：５１４頁、１９７９年）。該補給物の最適濃 度は以下の通りである：５μｇ/ｍｌのインスリン、１００μｇ/ｍｌのトランス フェリン、２０ｎＭのプロゲステロン、１００μＭのプトレッシンおよび３０ｎ Ｍの （Ｎａ2ＳｅＯ3）セレン。 該培養系の基礎培地は、神経芽細胞の産生および維持のための少なくとも１種 の栄養因子をさらに含有する。最も好ましくは、神経栄養因子を、特にｂＦＧＦ を利用する。ｂＦＧＦは、約１ｎｇ/ｍｌないし約１００ｎｇ/ｍｌ、より特別に はさらに特には約５ｎｇ/ｍりないし約７０ｎｇ/ｍｌ、最も好ましくは約１５ｎ ｇ/ｍｌないし約６０ｎｇ/ｍｌの濃度にて該基礎培地で利用する。神経培養物は 、一般的にｐＨ７.２-７.６にて維持する。非神経細胞とは反対に、神経細胞に は高グルコースという要件も要求される。従って、本発明の基礎培地は、約０. ０１％ないし約１.０％の濃度のグルコース、好ましくは約０.１％ないし約０. ６％の濃度のグルコースを含有する。 また本発明は、神経芽細胞の豊富な集団よりなる細胞組成物も提供する。該組 成物は、好ましくは、大部分は神経芽細胞を含むか、あるいは少なくとも約９０ ％の神経芽細胞を含有する。該神経芽細胞は、前記したごとく、脳のいずれかの 領域のごとくいずれかのＣＮＳ神経組織由来であるか、または脊髄由来である。 該神経芽細胞は、オンコジーンでさらに不滅化でき、あるいは受容体または受容 体に対するリガンドをコードする外来遺伝子を含有することができる。 また本発明は、治療有効量の本発明の神経芽細胞を対象に投与することからな るニューロン細胞疾患を患った対象を治療する方法も提供する。本明細書中で用 いる「治療有効」とは、ニューロン疾患の原因を緩和させるのに十分な量の神経 芽細胞量をいう。「緩和する」とは、該治療を受けている患者においてニューロ ン疾患の有害な効果を低減することをいう。本発明の対象は、好ましくはヒトで あるが、しかしながら、本発明の神経芽細胞で治療できるニューロン疾患を持っ たいずれの動物を想定することもできる。好ましくは、該神経芽細胞は、治療を 受ける対象の種と同一種のニューロン組織由来である。 ニューロン疾患を持つ対象を治療する方法は、当該疾患を有するＣＮＳ領域へ の神経芽細胞の大脳内移植を必然的に伴う。要すれば、神経芽細胞を遺伝子操作 して外来遺伝子を含有させることができる。該疾患は、疾病または外傷（障害） のいずれでもよい。神経芽細胞移植または「移植術」には、中枢神経系または心 室 腔あるいは宿主脳の表面上の硬膜への細胞の移植が含まれる。移植術のかかる方 法は、当業者に知られており、（出典明示して本明細書の一部とみなす）「哺乳 動物ＣＮＳにおける神経移植（Neural Grafting in the Mammalian ＣＮＳ）」 ビヨルクルンド（Bjorklund）およびステネビ（Stenevi）編（１９８５年）に記 載されている。当該方法は、移植時に脳実質に命中するように宿主脳内に組織を 注射するかまたは沈載することにより達成される実質内移植（すなわち、宿主脳 内）が含まれる。 受容対象の脳の選択された領域への本発明の神経芽細胞の投与は、ドリルで硬 膜に孔を空け、挿入すべきマイクロシリンジの針を通すことにより行うことがで きる。別法として、該神経芽細胞を脊髄領域にクモ膜下注射することもできる。 本発明の神経芽細胞調製物により、神経芽細胞を脳または脊髄中のいずれかの予 め決定した部位に移植することができ、かつ同細胞の懸濁液を用いて幾つかの異 なったサイトに同時に複数移植でき、異なった解剖学的領域からの細胞混合物で も可能となる。本発明は、以前は利用できなかった増殖性神経芽細胞、ならびに イン・ビトロ遺伝子移入に続くイン・ビボ移植用の十分な数の細胞を増殖させる ためにこれらの神経芽細胞を産生するための培養系を提供することにより、種々 の神経組織を移植する方法を提供する。 ニューロン疾患の治療に用いる該神経芽細胞は、所望により、例えば、オンコ ジーン、受容体をコードする遺伝子またはリガンドをコードする遺伝子のような 外来遺伝子を含有させることもできる。かかる受容体には、前記したごとき、ド ーパミン、ＧＡＢＡ、アドルナリン、ノルアドレナリン、セレトニン、グルタメ ート、アセチルコリンおよび他の神経ペプチドに反応する受容体が含まれる。ニ ューロン疾患において治療効果を提供できるリガンドの例としては、ドーパミン 、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、ガンマーアミノ酪酸およ びセロトニンが含まれる。供与神経芽細胞により分泌された後に必要なリガンド の拡散および取り込みは、かかる遺伝子産物の産生において対象の神経細胞が欠 損している疾患において有利であろう。神経成長因子（ＮＧＦ）のごとき神経栄 養因子を分泌するよう遺伝子的に修飾した神経芽細胞は、処理なしでは死滅し得 るコリン作動性ニューロンの変性を防ぐのに用いることができよう。別法として 、パーキンソン病のごとき基底星状膠細胞の疾患を持つ対象へ移植すべき神経芽 細胞を修飾して、ドーパミンの前駆体であるＬ−ＤＯＰＡをコードする外来遺伝 子を含有させることもできる。パーキンソン病は、その主な標的組器官としての 基底星状膠細胞を有する、中脳の黒質におけるドーパミン・ニューロンの喪失に より特徴付けられる。別法として、ドーパミンを産生する黒質ニューロン細胞由 来の神経芽細胞をパーキンソン患者の脳に導入して「天然に」ドーパミンを産生 する細胞を提供することもできる。 本発明の方法により同様に治療できる他のニューロン疾患には、アルツハイマ ー病、ハンチントン舞踏病、発作によるニューロン障害および脊髄における損傷 が含まれる。アルツハイマー病は、前脳基底野のコリン作動性ニューロンの変性 により特徴付けられる。これらのニューロンの神経伝達物質は、それらの生存に 必要であるアセチルコリンである。コリン作動性神経芽細胞、またはこれらのニ ューロンの生存を促進するであろう因子についての外来遺伝子を含有する神経芽 細胞の移植は、前記のごとき本発明の方法により達成することができる。発作の 後には、海馬のＣＡ１における細胞の選択的な喪失、ならびにこれらの患者にお ける認識機能および記憶喪失に関与し得る皮質細胞の喪失がある。一旦同定した ら、ＣＡ１細胞死滅の原因である分子は本発明の方法により阻害できる。例えば 、アンチセンス配列、またはアンタゴニストをコードする遺伝子を神経芽細胞に 移入し、脳の海馬領域に移植することができる。 また、ニューロン疾患を患った対象を治療する方法は、ＣＮＳの疾患を治療す るのに有用な他の治療方法と組み合わせた神経芽細胞の移植も考えられる。例え ば、成長因子、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素 、神経突起促進分子および代謝阻害剤ならびにドーパミンの前駆体であるＬ-Ｄ ＯＰＡのごときこれらの分子の前駆体と共に該神経芽細胞を投与することができ る。 以下の実施例は、本発明を詳細に説明するものであって、限定するものではな い。これらは用いることができる典型的なものであって、当業者に公知の他の方 法も用いることができる。 実施例 以下の実施例では、ｂＦＧＦで５ヶ月にわたり培養した胎児ラットからの海馬 、脊髄、黒質、前脳基底野および他のニューロン組織細胞のニューロン増殖性を 示す。さらに、成体海馬を合成培地中にてｂＦＧＦで７ヶ月を超えて培養した。 これらの実施例は、胎児および成体のニューロン組織からの膨大な数の細胞型の 発生、分化および長期培養の方法も提供し、成体ｂＦＧＦ処理培養物における増 殖性の非ニューロン細胞型およびニューロン細胞型の形態学的、免疫細胞化学的 、超微細構造学的および分子的な特性を記載する。 ブロモデオキシウリジンを取り込む増殖性細胞は、ニューロン特異的エノラー ゼに対して免疫陽性であった。良好に分化したニューロンに典型的な偏光形態を 有する細胞は、成熟ニューロンに特徴的な高分子量のニューロフィラメント蛋白 質（ＮＦｈ）のサブユニット、ニューロフィラメント蛋白質の中および低サブユ ニットならびに微小管結合蛋白質２（ＭＡＰ−２）に対して免疫陽性であった。 成体哺乳動物の海馬からの細胞は、増殖能ならびにイン・ビトロにおける長期神 経発生能および神経分化能を有する。これらの細胞は、ニューロン移植における 置換細胞の源とすることができる。さらに、これらの細胞のイン・ビボにおける 増殖および分化の誘導は、ニューロンの喪失または変性の置換または増強に有用 であろう。 実施例１ 材料および方法 材料：ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、Ｎ２補給物およびラミリンはギブコ/ＢＲＬ社 （Gibco/ＢＲＬ）（メリーランド州、ベセスダ（Ｂethesda,MD））から得た；ポ リオルニチン（ＰＯＲＮ）はシグマ社（Sigma）（ミズーリ州、セントルイス（S t.Louis,ＭＯ））から入手した。組換えｂＦＧＦはシンテックス/シナージェン ・コンソルティウム社（Syntex/Synergen Consortium）（コロラド州、ボウルダ ー（Boulder,CO））から得た。ウシｂＦＧＦは、アール・アンド・ディ社（Ｒ＆ Ｄ）、ミネソタ州、ミネアポオリス（Minneapolis,MN）から購入した。ニューロ タグTM（NeuroTagTM）グリーンは、ベーリンガー・マンハイム社 （Boehringer Mannheim）インデイアナ州、インデイアナポリス（Indianapolis, IN）から得た。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、抗-ＢｒｄＵ抗体および ストレプトアビジン/テキサス・レッド（Texas Red）を含有する細胞増殖キット はアマーシャム社（Amersham）、インディアナ州、アーリントン・ハイツ（Arli ngtonHeights,IN）から購入した。培養物中の細胞の表現型を同定するのに用い る抗体は、以下の供給源から得、示した希釈率にて用いた：ウサギ抗-ニューロ フィラメント２００（ＮＦ）ポリクローナル抗体（１：５００；ケミコン・イン ターナショナル社（Chemicon International）、カリフォルニア州、テメキュラ （Temecula,ＣＡ））、抗-ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）モノクローナ ル抗体（１:５０；ダコ社（ＤＡＫＯ）、(カリフォルニア州、カーオペンテリア （Carpenteria,ＣＡ）））、抗-膠細胞繊維質酸性蛋白質モノクローナル抗体（ １：５００-１：１０,０００；アマーシャム社（Amersham）（インディアナ州、 アーリントン・ハイツ（Arlington,Heights,ＩＮ））、抗-ビメンチン・モノク ローナル抗体（１：８００；ベーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannhei m）、インディアナ州、インディアナポリス（Indianapolis,ＩＮ））、抗-ＯＸ- ４２モノクローナル抗体（１：５０００；セロテック社（Serotec）、インディ アナ州、インディアナポリス（Indianapolis,ＩＮ））、抗-ガラクトセレブロシ ド（ＧａｌＣ）ポリクローナル抗体（１：５０００；アドバンスド・イムノケミ カル・サービシーズ社（Advanced Immunochemical Services）、カリフォルニア 州、ロングビーチ（Long Beach,ＣＡ））、抗-微小管結合蛋白質（ＭＡＰ２）モ ノクローナル抗体（１：５００；シグマ・イムノケミカルズ社（Sigma Immunoch emicals）、ミズーリ州、セントルイス（St.Louis,ＭＯ））、抗-フィブロネク チンポリクローナル抗体（１：２０００；レリオス社（Relios）、カリフォルニ ア州、ラ・ジョーラ（La Jolla,ＣＡ））。ネスティンポリクローナル抗体（１ ：１５,０００）は、マサチューセッツ州、ケンブリッジのＭＩＴのアール、マ ッケイ博士（Ｄｒ.Ｒ.ＭｃＫａｙ）から寄贈され、高アフィニティーのｂＦＧＦ 受容体のモノクローナル抗体（１：２０）はカリフォルニア州、ラ・ジョーラの ウィッティエル研究所（Whittier Institute）のエイ、バード博士から寄贈され た。抗-ＧＦＡＰポリクローナル抗体（１：２０００）は、カリフォ ルニア州、パロ・アルトのスタンフォード大学のエル・エフ、エング博士（Ｄｒ .Ｌ.Ｆ.Ｅｎｇ）から寄贈された。 細胞培養 フィッシャー（Fisher）３４４ラット（Ｅ１６）の脳を切開し、髄 膜を摘出し、海馬を単離した。海馬を１５ｍｌの組織培養管に移し、その容量を ０.６％のグルコースを補給したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ-Ｇ）（ｐＨ７. ４）で１-２ｍｌに調整した。パスツール・ピペット（〜２０×）でトリチュレ ートし、続いて、焼成してピペット孔をかなり細くしたパスツールピペット（〜 ２０×）でトリチュレートすることにより、海馬を機械的に解離させた。該細胞 懸濁液を、１０００ｒｐｍで室温にて５分間遠心することによりペレット化した 。細胞を〜２０ｍｌのＮ２培地（２０ｍＭのプロジゲステロン、３０ｍＭの亜セ レン酸ナトリウム、１００μＭのプテレッシン、３.９ｍＭのグルタミン、５μ Ｍ/ｍｌのインスリン、１００μｇ/ｍｌトランスフェリンを含有するＤＭＥＭ： Ｆ１２の１：１混合物）に取り、ヘモサイトメーターで細胞数を定量した。組織 培養プレートを、ポリオルニチン（ＰＯＲＮ；１０μｇ/ｍｌ）続いてラミニン （１０μｇ/ｍｌ）で被覆した。約０.５−１.０×１０6細胞/ウェルを、２０ｎ ｇ/ｍｌのｂＦＧＦ（Ｎ２＋ｂＦＧＦ）を含有するＮ２培地を入れたＰＯＲＮ/ラ ミニン-被覆６ウェルプレートで平板培養し、５％ＣＯ2中３７℃にて培養した。 培地は３-４日毎に新鮮なＮ２＋ｂＦＧＦで置き換えた。継代のために、細胞を トリプシン処理（ＡＴＶトリプシン、カリフォルニア州、サンタ・アナ（Santa Ana,ＣＡ）、アーバイン・サイエンティフィック社（Irvine Scientific））し 、次いでＮ２＋ｂＦＧＦに取った。細胞を遠心によりペレット化し、トリプシン を含む上清を除去した。細胞を１０ｍlのＮ２＋ｂＦＧＦに再懸濁し、平板培養 した。細胞は、Ｎ２＋ｂＦＧＦ＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に て液体窒素中で冷凍することができた。培養のために、細胞を３７℃にて素早く 解凍し、１０ｍlのＮ２＋ｂＦＧＦに添加し、遠心してＤＭＳＯを除去し、新鮮 なＮ２＋ｂＦＧＦ中に再懸濁し、前記のごとく平板培養した。 ＢｒｄＵ取込み実験 初代ニューロン（継代５）を３日間増殖させ、その際に該 培地を交換した。翌臼に細胞をＢｒｄＵと共に１日または４日間インキュベート し た。細胞を固定し、洗浄し、次いで、ＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体で１ 時間処理した。洗浄した後に、細胞をビオチン化抗-マウス抗体（ベクター・ラ ボラトリーズ社（Vector Laboratories）、カリフォルニア州、バーリンゲーム （Burlingame,ＣＡ））、続いてストレプトアビジン/テキサス・レッド（Texas Red）複合体と反応させた。染色された培養物は、ＹＨＳフィルターセット（５ ６８ＥＸ、５８５ＬＰ）を用いたクリプトンーアルゴンレーザーを装備したバイ オラドＭＲＣ６００（BioRad ＭＲＣ６００）共焦点走査型レーザー顕微鏡で検 鏡した。共焦点蛍光顕微鏡およびノマルスキー透過型顕微鏡で画像を収集し、ア ップル社（Apple）製マッキントッシュ・クアドラ（Maintosh Quadra）７００に 移し、アドーブ・フォトショップ（Adobe Photoshop）２.０１を用いて合成し、 ＧＣＣフィルムレコーダー上に印刷した。 ニューロタグTM（NeurotagTM）結合性 培養中にて６日間増殖させた初代ニュ ーロン（継代５）を、Ｎ２＋ｂＦＧＦおよびウシ血清アルブミン（０.１ｍｇ/ｍ ｌ）中のフルオレセイン・イソチオシアネート（ニューロタグTM）に結合させた 組換えテタヌス毒Ｃ断片１０μｇ/ｍlと共に２時間インキュベートした。該細胞 を洗浄した後に、ＢＨＳフィルター（４８８ＥＸ、５１５ＬＰ）を用いる以外は ＢｒｄＵ染色細胞で記載したごとくバイオラド共焦点顕微鏡で検鏡した。免疫組 織化学 細胞を継代（継代３；平板培養後の培養４日目）し、２４ウェルプレー トで増殖させ、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、トリス 緩衝化生理食塩水中の０.２５％のトリトン（Triton）Ｘ-１００を浸透させた。 １％正常ウマ血清（モノクローナル抗体用）または１０％正常ヤギ血清（ポリク ローナル抗体用）の存在下、細胞をポリクローナル抗体またはモノクローナル抗 体と共に４℃にて一晩インキュベートした。洗浄した後に、細胞をビオチン結合 ヤギ抗-ウサギIｇＧまたはウマ抗-マウスＩｇＧ抗体（ベクター・ラボラトリー ズ社（Vector Laboratories）カリフォルニア州、バーリンゲーム（Burlingame, ＣＡ））と共に室温にて１時間インキュベートし、続いてアビジン-ビオチン化 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ベクタスタイン・エリート・エイビイシイ ・キット（Vectastain Elite ＡＢＣ kit））の予め形成させた混合物 と共に室温にて１時間インキュベートした。該反応生成物をジアミノベンジジン （ＤＡＢ）組織化学で視覚化した。 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）ラブテック（LabTek）TMパーマノックス・スライ ド（テッド・ペラ社（Ted Pella,Inc.）、カリフォルニア州、レディング（Redd ing,ＣＡ））上で増殖させた培養物（継代３；平板培養４日目）を、１００ｍＭ のＰＯ4中の２％グルタルアルデヒド中、３７℃にて２時間固定し、次いで、濯 いで、ＯＳＯ4の１％水溶液中で１時間室温にて後固定した。次いで、培養物を 一連のエタノール濃度勾配中にて脱水し、アラルダイト樹脂で包埋し、イン・サ イチューにて重合させた。それから培養細胞塊を切断し、樹脂空間に接着した重 合樹脂からガラススライドを分離した。７０ｎｍの厚みで、該培養基材に対して 平行に切片を切断した。３００メッシュ銅グリッド上に採取した切片を酢酸ウラ ニルおよびクエン酸鉛で染色し、８０ｋＶにてフィリップス（Phillips）ＣＭ１ ０透過型電子顕微鏡で検鏡した。 走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）ラブテック・ガラススライド上で増殖させた培養 物（継代２；平板培養後４日）をエタノール脱水を通してＴＥＭ用に調製した。 次いで、シールガスケットを所定位置に残しつつプラスティックチャンバーを取 り出して、該スライドをペルコ臨界点乾燥機（Pelco critical point dryer）中 に置いた。乾燥させ後に、該スライドを金-パラジウムで被覆してテクニクス・ スパッター・コーター（Technics sputter coater）中にて３００Åの厚みとし た。１０ｋＶのケンブリッジ・ステレオスキャン（Cambridge Stereoscan）３６ ０走査型電子顕微鏡で該細胞を検鏡した。 ニューロンへの遺伝子移入 約１×１０6個の産生細胞を６ウェルプレート中 のＰＯＲＮ/ラミニン被覆ウェル上に平板培養し、５％ＣＯ2中、３７℃にて一晩 増殖させた。５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または５％新生コウシ胎児血清（ＢＣ Ｓ）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコの最小必須培地）中で一晩インキュベート させた後に、産生細胞からのウイルスを採取した。ウイルスを含む培地を０．４ ５μｍのフィルターを通して濾過し、次いで、ポリブレン（８μｇ/ｍｌ）およ びｂＦＧＦ（２０ｎｇ/ｍｌ）と混合した。ニューロン培養物から培地を除去し 、ウイルスを含 む培地をニューロン培養物に添加し、５％ＣＯ2中、３７℃にて一晩インキュベ ートした。この感染期間の後に該培地を除去し、２０ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦを含 有するＮ２培地で置き換えた。発現ベクターがネオマイシン抵抗性遺伝子を含む 場合には、Ｇ４１８（４００μｇ/ｍｌ）の存在下にて感染細胞を選抜した。前 記のごとく細胞を継代し、維持した。 用いた発現ベクターおよび産生細胞は以下の通りである： １．トリｖ-ｍｙｃ遺伝子はＭＬＶ-ＬＴＲプロモーターから発現させ、細菌ネオ マイシン抵抗性遺伝子はチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターから発現させた （ライダー（Ryder）ら、ジャーナル・オブ・ニューロバイオロジー（J.Neurobi ol.）第２１巻：３５６-３７５頁、１９８９年；カプラン（Kaplan）ら、ジャー ナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第６１巻：１７３１-１７３４頁、１９ ８７年；およびランド（Land）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ ジー（Mol.Cell.Biol.）第６巻：１９１７-１９２５頁、１９８６年）。産生細 胞系はΨ２細胞から得た。１０％ＦＣＳおよび４００μｇ/ｍｌのＧ４１８を含 有するＤＭＥＭ中にてこれらの細胞を増殖させた。感染させる前日に、５％ＦＣ Ｓを含有する新鮮なＤＭＥＭで培地を置き換えた。 ２．細菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子はＭＬＶ-ＬＴＲプロモーターから発現さ せた。この発現ベクターは、ｇａｇ遺伝子の一部分を含み、非常に高い力価のウ イルスを産生する。このベクター中にはネオマイシン抵抗性遺伝子がない。この ベクターは、マサチューセッツ州、ケンブリッジのＭＩＴのリチャード、マリガ ン博士（Dr.Richard Mulligan）から寄贈された。 プロモーター系はＣＲＩＰ細胞から得た。これらの細胞を、１０％ＢＣＳを含 有するＤＭＥＭ中にて増殖させた。感染の前日に、５％ＢＣＳを含有するＤＭＥ Ｍで培地を置き換えた。 実施例２ イン・ビトロにおけるニューロンの増殖 化学的に成分の明確な培地であるＮ２（ボッテンシュタイン（Bottenstein） およびサト（Sato）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ ブ・ サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７６巻：５ １４-５１７頁、１９８０年；ボッテンシュタイン，ジェイ・イィ（Bottenstein ,Ｊ.Ｅ）：「神経科学における細胞培養（Cell culture in the neurosciences ）」中：ジェイ・イィ、ボッテンシュタイン（J.E.Bottenstein）およびジィ・ エイチ、サト（Ｇ.Ｈ.Sato）編、プレナム・プレス社（Plenum Press）、ニュー ・ヨーク州、ニュー・ヨーク（New York,Ｎ.Ｙ.）３-４３頁、１９８５）；ジ・ ポリゾ（di Porizo）ら、ネイチャー（Nature）第２８８巻：３７０-３７３頁、 １９８０年）は、実質的に純粋なニューロン培養物を短期間で再現性よく得るた めに用いられてきたものである（ボッテンシュタイン（Bottenstein）ら、エク スペリメンタル・アンド・セル・リサーチ（Exp.Cell Res.）第１２５巻：１８ ３-１９０頁、１９８０年；バーンズ（Barnes）およびサト（Sato）、アナリテ ィカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１０２巻：２５５-３０２頁、 １９８０年）。この培地は、非ニューロン細胞の生存または増殖を支持せず、＞ ９５％純度のニューロン培養物を得ることができる。成分の明確な培地中では、 海馬ニューロンの初代培養物は７日以内に死滅するが、星状細胞条件培地中の海 馬外植体である星状細胞のフィーダー層の存在下（バンカー，ジイ・エイ（Bank er,Ｇ.Ａ.）、サイエンス（Science）第２０９巻：８０９-８１０頁、１９８０ 年）、またはｂＦＧＦの存在下（ワリック（Walicke）およびベイアード（Baird ）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー ズ・イン・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第８３巻：３０１２-３ ０１６頁、１９８６年；ワリック，ピィ・エイ（Walicke,Ｐ.Ａ.）ジャーナル・ オブ・ニューロサイエンス（J.Neurosci）第８巻：２６１８-２６２７頁、１９ ８８年；ワリック（Walicke）ら、プログ・ブレイン・レス（Prog.Brain Res.） 第７８巻中、ディイ・エム、ガッシュ（Ｄ.m.Gash）およびジェイ・アール、ス ラデク（Ｊ.Ｒ.Sladek）編（エルセビアー・サイエンス・パブリッシャーズ・ビ イ・ブイ（Elsevier Science PublishersＢ.Ｖ.）３３３-３３８頁、１９８８年 ））では２-４週間維持できる。しかしながら、細胞は徐々に死滅し続け、１カ 月後にはほとんど細胞が残存していない（ワリック，ピィ（Walicke,Ｐ.）ら、 プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ イエンシーズ・イン・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第８３巻： ３０１２-３０１６頁、１９８６年）。 軸索の生存性および伸長性を実験（ワルック，ピィ（Walicke,Ｐ.）ら、プロ シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第８３巻：３０１２-３０１６頁 、１９８６年；ワリック，ピィ・エイ（Walicke,Ｐ.Ａ.）、ジャーナル・オブ・ ニューロサイエンス（J.Neurosci.）第８巻：２６１８-２６２７頁、１９８８年 ）するために以前に用いられたたよりも約１００倍高い濃度である２０ｎｇ/ｍ ｌのｂＦＧＦは、海馬細胞に対して顕著な増殖効果を示した。ｂＦＧＦのこの増 殖特性を用いて、初代海馬細胞の連続した増殖を促進させて長期培養を形成させ た。２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦで培養した細胞は、２日までに増殖し始め、倍加時 間は４日である。集塊中では増殖し続けるにも拘わらず、初代細胞は成長が接触 阻止され、７日後にプラトーに達した（図２Ｃ）。 分裂はすべての細胞で起こるかあるいは部分集団のみで起こるかあるかを試験 するため、培養物をＢｒｄＵと共に１または４日間インキュベートし、抗-Ｂｒ ｄＵ抗体を用いた間接免疫蛍光法によって、標識した核を視覚化した（図１Ａ、 Ｂ）。 図１は、培養物中の初代ニューロンのＢｒｄＵ染色性およびニューロ・タグTM 結合性を示す。初代ニューロンをＢｒｄＵで１日（Ａ）および４日間（Ｂ）の間 標識した。１日目はわずかな細胞のみが染色されたが、４日目までに全細胞が染 色され、これは培養物中の全細胞が増殖していることを示した。初代細胞のニュ ーロンの性質は、テタヌス毒（ニューロタグTM）との結合性により測定した（Ｃ ）。培養物中の全細胞の細胞体および突起が染色された。補正バー＝２０μｍ。 １日後に、小画分の細胞のみが免疫染色された（図１Ａ）が、ほぼ全ての細胞集 団がＢｒｄＵとのインキュベート４日後に免疫染色された（図１Ｂ）。 長期培養を確立するため、細胞をトリプシン処理し、継代した。（試験した６ 継代までの）継代細胞は、元の培養物と同程度に増殖した。細胞を液体窒素中で 冷凍し、解凍して再度培養した。異なった継代数の細胞を解凍して再培養した場 合、該継代数に関係無く等しく良好に増殖した。冷凍-解凍した細胞は、連続し て培 養し続けた細胞と同一の形態を示した。 ニューロン組織由来の他の細胞についてもそれらの増殖能につき実験し、ｂＦ ＧＦの存在下のＮ２培地中で維持した。表１は、種々の細胞系の培養のためのｂ ＦＧＦの最適濃度を示す。 実施例３ 細胞の特徴付け 幾つか独立した基準を用いて、培養物中の細胞が実際にニューロンであること を示した。これらには、増殖中のそれらの形態特性、ニューロンマーカーの発現 性および透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡による超微細構造分析が含ま れる。 培養物中の細胞形態は、ニューロンの短期培養に記載されたものと同様であっ た（バンカー（Banker）およびコーワン（Cowan）、ブレイン・リサーチ（Brain Res.）第１２６巻：３９７-４２５頁、１９７７年；バンカー（Banker）および コーワン（Cowan）、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー（J.C omp.Neurol.）第１８７巻：４６９-４９４頁、１９７９年）（図２Ａ、Ｂ、Ｃ） 。図２は、 初代ニューロンの培養および継代の間に起こる形態変化を示す光学顕微鏡写真を 図示する。Ａは、多数の増殖細胞および突起を出した細胞を含有するＮ２＋ｂＦ ＧＦ中の平板培養４日後の初代細胞培養物を示す。Ｂは、継代（継代３）４日後 の培養物中の初代細胞を示す。細胞はより大きく、やはり大きさが増大した突起 によって相互連結していた。小さな増殖細胞が培養物中に観察された。Ｃは、継 代（継代３）し、ｂＦＧＦの存在下で〜１４日間培養を維持した細胞が集塊を形 成し、かつ格子型模様を形成する突起の伸長したネットワークにより相互連絡し たのを示す（ネガティブにて倍率 ３３×）。 幾つかの異なった抗原マーカーにつき細胞を免疫染色した。細胞を抗-ＮＦ（ ２００ＫＤ）抗体（Ｄ）；抗-ＮＳＥ抗体（Ｅ）または抗-ＧＦＡＰ抗体（Ｆ）で 染色した。全細胞が抗-ＮＦまたは抗-ＮＳＥ抗体で染色されたにも拘わらず、抗 -ＧＦＡＰ抗体で染色された細胞はなかった（ネガティブにて倍率 ３３×（Ｄ 、Ｅ）；６６×（Ｆ））。 細胞は２日目までには増殖し始め、新たに発生した細胞は小さく、形状は二極 性であった。細胞体に大まか等しい長さの短い突起が親細胞から出現し始めた。 次ぎの２-３日にわたって、１もしくは２個の突起が急速に接触し始め、近隣の 細胞と連結し始めた（図２Ａ）。７日目までには細胞体および突起が共にサイズ が増大し、突起の伸長した相互連結ネットワークが形成された。この形態的進行 は、イン・ビトロにおいて以前に記載されている海馬錐体ニューロンの形態（バ ンカー（Banker）およびコーワン（Cowan）ウレイン・リサーチ（Brain Res.） 第１２６巻：３９７-４２５頁、１９７７年；バンカー（Banker）およびコーワ ン（Cowan）ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー（J．Comp.Neu rol.）第１８７巻：４６９-４９４頁、１９７９年）に似ていた。１-２週間の培 養物中で増殖する細胞を継代した場合、これら細胞の多くが、脳から新たに培養 した細胞より突起を多く有していた（図２Ｂ）。たとえ部分的には脱落するとし ても、これら突起の多くを継代で生存させることが可能である。ｂＦＧＦの存在 下にて継代し、１４日間培養を維持した細胞は集塊を形成し、格子型模様を形成 する突起の伸長したネットワークによって相互連結していた（図２Ｃ）。 異なった抗原マーカーについての免疫染色により該培養物を特徴付けした（図 ２Ｄ）Ｅ、Ｆ；表１）。すべての細胞体およびそれらの突起が、ニューロンによ り特異的に発現されるＮＦ蛋白質に対する抗体で強く免疫染色された（図２Ｄ） 。同様に、抗-ＮＳＥ抗体も本発明者らの培養物においてすべての細胞を染色し た（図２Ｅ；表１）。ｂＦＧＦに反応して増殖する細胞のニューロン特性を、ニ ューロンについての特異的マーカーであるテタヌス毒の結合性によりさらに証明 した（ニール（Neale）ら、ソック・ニューロサイ・アブスト（Soc.Neurosci.Ab st.）第１４巻：５４７頁、１９８８年）。培養物中のすべての細胞の細胞体お よび突起がニューロタグTM-グリーンで染色されたこと（図１Ｃ）は、当該細胞 がニューロンであって、培養物中には全くもしくはほとんど非-ニューロン細胞 が存在しないことを示した。用いた対象物の視野の大きな光学深度（１０×）に より、膜結合物としてのニューロタグTMシグナルの局在性は証明できなかった。 培養物を、非ニューロン細胞の存在につき免疫染色により試験した（表２）。 ＧＦＡＰに対する抗体で免疫染色されないことは、星状膠細胞が存在しないこと を示していた（図２Ｆ）。対照実験において、同一濃度（１：１０,０００）の 抗-ＧＦＡＰ抗体（アマーシャム社（Amersham））でラットＣ６および９Ｌなら びにヒトＵ３７３神経膠腫細胞を免疫染色した。本発明者らの培養物には乏突起 膠細胞および繊維芽細胞が存在しないことが、ＧａｌＣ、ビメンチンまたはフィ ブロネクチンにつき染色されないことによって証明された（表２）。対照として ラットＣ６、９ＬおよびヒトＵ３７３神経膠腫細胞を、ニューロン培養で用いた のと同一濃度のビメニン（１：８００）で染色した。他の抗原マーカーについて の免疫染色性の結果を表２に示す；これらのデータは、培養物が非ニューロン細 胞により汚染されていないニューロンよりなるという結論を支持する。 実施例４ イン・ビトロにおける不滅化ニューロンの分析 培養物中の初代ニューロンの超微細構造レベルでの分析によって、これらの細 胞の組織型ニューロン形態が、以前の超微細構造実験のもの（バートレット （Bartlett）およびバンカー（Banker）、ジャーナル・オブ・ニューロサイエン ス（J.Neurosci.）第４巻：１９４４０-１９４５３頁、１９８４年；ロスマン（ Rothman）およびコーワン（Cowan）、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニュ ーロロジー（J.Comp.Neurol.）第１９５巻：１４１−１５５頁、１９８１年；ピ ーコック（Peacock）ら、ブレイン・リサーチ（Brain Res.）第１６９巻：２３ １-２４６頁、１９７９年）と同一であることが証明された。図３は、培養物中 の初代ニューロンの透過型電子顕微鏡写真を示す。Ａは、細胞体ならびに主頂端 突起（矢印）および細径突起（矢印根元）を含む突起の双方を示している錐体型 第一海馬ニューロンを示す。バー＝１０μｍ。Ｂは、パネルＡで示したニューロ ン細胞体の拡大図を示す。バー＝１μｍ。Ｃは、パネルＡで示したニューロンの 主頂端突起の一部分を示す。この突起は、それを初代樹状突起として同定する微 小管およびポリソーム・リボソームにより特徴付けられる。バー＝１μｍ。Ｄは 、２個のニューロン突起間の接触を示す。バー＝０.１μｍ。 良好に分化したニューロンは、複数の樹枝を有する初代の先端樹状突起、細径 軸索および特徴的な核形態を含む組織型錐体形態を示す（図３および４）。錐体 形状の初代海馬ニューロンのＴＥＭ顕微鏡写真を図３Ａに示す。この切片レベル は、体細胞ならびに主頂端突起（矢印）および該体細胞の基底層から出現した細 径突起（矢印根元）を含む突起の双方を包含している。隣接ニューロンからの他 の突起も認められる。 該ニューロンの体細胞は、ヘテロクロマチンの辺縁および幾分網状の核小体を 有するユークロマチン核を有する（図３Ｂ）。ミトコンドリアおよび微小管は、 ロゼット型のポリソーム・リボソームが多い核周部細胞質に存在する。ニューロ ンの主頂端突起の一部分は、それを初代樹状突起として同定する微小管およびポ リソーム・リボソームが多い（図３Ｃ）。２個のニューロン突起間の接触を図３ Ｄに示す。ミトコンドリア、微小管および液胞を含有する大きな突起は、細径突 起から発生する膨張したボタン様の構造物によって接触している。かかる突起の 間の結合点は、典型的に、この齢の培養物でははっきりせずかつ未熟である。接 触サイトにおける膜は均一に平行のようであるが、シナプス構造のさらなる集合 体の 示唆はほとんどない。ボタン様突起末端の内容物は、不明瞭であり、液胞の蓄積 物のようであるが、接触サイトの付くには恐らく被覆された液胞がある。 図４は、培養物中の初代ニューロンの走査型電子顕微鏡写真を示す。Ａは、複 数レベルの分岐を含む大きな突起を有する良好に分化した錐体型細胞体（矢印） および大きな伸長した突起を有する分化の低い丸いニューロン（矢印根元）を含 む培養物中の初代海馬ニューロンの全体図を示す。バー＝５０μｍ。Ｂは、恐ら くは第一分岐から出現した軸索である幾つかの小さな突起を有する第一（主な） 分岐の側近に滑らかで規則正しい径の突起を示す良好に分化した錐体型ニューロ ンから出現した主頂端樹状突起を示す。ＰＯＲＮ/ラミニン被覆容器の表面は、 幾分斑点が欠けている多孔性カーペットのように見える。バー＝２μｍ。Ｃは、 （図３Ａに比して）大きな錐体型細胞体、および他のニューロンからの多数の突 起により接触した大きな頂端樹状突起（矢印根元）を保有する（視野中央の）良 好に分化したニューロンを示す。分裂の過程で固定された他の未分の低いニュー ロンも存在した（矢印）。バー＝２０μｍ。Ｄは、パネルＣの図の上方視野にお ける分裂中のニューロンの拡大図を示す。細胞分裂が明らかに起こっているにも 拘わらず、２個の娘細胞成分を連結する膜が明らかに連続している。この分化の 低いニューロンからの突起の伸長が、有糸分裂の間のある程度の分化を示してい ることを注記する。バー＝１０μｍ。 培養物中の初代海馬ニューロンの走査型ＥＭは、複数レベルの分岐を示す大突 起を伸長する幾つかの良好に分化した錐体体細胞および幾つかの分化の低い丸い ニューロンがあり、形態の多様性の存在を示した。これらの丸いニューロンでさ え大きな伸長した突起を有する（図４Ａ；矢印根元）。良好に分化したニューロ ンから発生した主要樹状突起のさらに詳細な検鏡は、鋭利な分岐を有する大径突 起を示す（図４Ｂ）。数多くの小径で軸索様の突起が、これらの主頂端樹状突起 から発生しているところが認められる（図４Ｂ）。良好に分化したニューロンは 、典型的には、大きな錐体体細胞を有する（図３Ａに比しての図４Ｃ）。分化の 低いニューロンを検鏡した場合には、これらの多くが分裂の過程で固定されたの が認められる（図４Ｃ；矢印）。分裂中のニューロンのさらに詳細な図は、細胞 分裂が明ら かに起きているにも拘わらず、２個の娘細胞成分を連結する膜が明らかに連続し ていることを示している。右側の娘細胞成分は細直径のおそらく軸索である突起 を前方に伸長している。この成分から視野の右上に伸長しているのは、もう一つ の太い、幾つかのレベルで分岐している樹状様突起である。 以前の超微細構造の報告（バンカー（Banker）およびコーエン（Cowen）、ブ レイン・リサーチ（Brain Res.）第１２６巻：３９７-４２５頁、１９７７年； バンカー（Banker）およびコーエン（Cowen）、ジャーナル・オブ・コンパラテ ィブ・ニューロロジー（J.Comp.Neurol.）第１８７巻：４６９-４９４頁、１９ ７９年；２９ ロスマン（Rothman）ら、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ ニューロロジー（Ｊ.Comp.Neurol.）第１９５巻：１４１−１５５頁、１９８１ 年））とは対照的に、不滅化ニューロンは、樹状起源に加えて組織型様式で体細 胞から出現する細径軸索突起を有していた（図３Ａおよび４Ｄ）。これらの体細 胞軸索の伸長は、高レベルの栄養因子の支持の結果であろう。分化の低いニュー ロンは、典型的に、わずかのほとんど同化していない突起を有する丸い体細胞を 有していた。丸いニューロンでさえ突起を伸長するのに十分に分化しており、増 殖できるようであった（図４Ｄ）。超微細構造の表面形態およびオルガネラ内容 物の両方に基づいてニューロンの突起および体細胞が同定されたことは、良好に 分化した細胞および増殖し分化の低い細胞の両方がニューロンであることを明ら かに証明している。 実施例５ 細胞培養に対する異なった成長因子の影響 中枢神経系（ＣＮＳ）の特定領域から摘出した組織を、実施例１に記載したご とく解離させた。遠心した後に、細胞をＮ２培地に再懸濁し、細胞を計数した。 約０.５−１.０×１０6細胞を、該ＣＮＳの特定領域に応じて、異なる濃度の異 なる成長因子を含有するＮ２培地を入れたＰＯＲＮ/ラミリン被覆２４ウェルプ レート上に平板培養した。細胞は、５％ＣＯ2下、３７℃にてインキュベートし た。細胞を調べ、要すれば、１、４および７日目にウェル中の５ヶ所の別々の領 域で計数して、種々の成長因子の存在下における増殖率を測定した（表３）。 幾つかの実験において、ある種の成長因子の存在下では細胞の増殖が認められ なかった。幾つかの場合において、小細胞集団は４日目まで生存したにも拘わら ず、かなりの細胞死滅があった。これらの生存細胞は健全に見えなかったが、（ 組織の起源に依存して）２０-１００ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦをＮ２培地中に添加す ると、この増殖により明らかなごとくこれらの生存細胞を救出した（表３参照） 。 実施例６ 成体ニューロン培養物の調製 正常な成体フィッシャー（Fisher）ラットの海馬を摘出し、実施例１に記載し たごとくｂＦＧＦを含有する無血清培地中にて増殖させた。簡単に述べると、海 馬を正常な成体（＞３ヶ月）ラット脳から摘出した。脈絡集網、上衣ライニング および亜上衣領域のうちのほとんどを取り出した。パパイン-プロテアーゼ-ＤＮ アーゼエ（ＰＰＤ）溶液（４ｍＭのＭｇＳＯ4および０.０１％のパパイン、０. １％の中性プロテアーゼおよび０.０１％のＤＮアーゼエを補充したハンクスバ ランス塩溶液）中で酵素的に解離した後に、細胞を１０００ｇで３分間遠心し、 ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１；１）の高グルコース培地（アーバイン・サイエンティフ ィック社（Irvine Scientific））＋１０％ウシ胎児血清（１０％ＦＢＳ）（シ グマ社（Sigma））１ｍｌ中に再懸濁し、トリチュレートするという就職を施し 、以前に記載されている方法を用いて細胞を機械的および酵素的に解離した。１ ０％ＦＢＳ培地を入れたフラスコ当たり１×１０6生細胞にて、細胞を非被覆プ ラスチックＴ-７５培養フラスコ（コスター社（Costar））上に一晩平板培養し た。小さな培養フラスコまたはラブーテック・スライド・チャンバー（ナンク社 （Nunc））には低細胞密度を用いた。場合によっては、実施例１に記載したごと くポリオルニチン/ラミニンで予め被覆したカルチャーウェア（cultureware）上 に細胞を平板培養した。翌朝、該培地を取り出し、１ｍｌ/１００ｍｌ培地（Ｎ ２）のＤＭＥＭ：Ｆ１２＋Ｎ２（ギフコ社（GIBCO））＋２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧ Ｆ（組換えヒトｂＦＧＦ（シンテックス／シナージェン・コンソルティウム社（ Syntex/Synergen Consortium）；（レイ（Ray）ら、前掲）））である無血清培 地で置き換えた。フラスコを１-３週間インキュベートし、その時点で培地の半 分を除去し、同容量の新鮮なＮ２＋ｂＦＧＦで置き換えた。部分的な培地の交換 は、１-２週間毎または必要に応じて行った。位相差顕微鏡（ニコン-ダイアホッ ト社（Nikon Diaphot））を用いて培養物を検査し、写真撮影した。 多数の実験において、細胞を採取し、それらがそこで直ちに付着し増殖し始め る新たなフラスコまたはラブ-テック・スライド・チャンバーに直接移すか、ま たは、場合によっては、ＡＴＶトリプシン（アーバイン・サイエンティフィック 社（Irvine Scientific））でのトリプシン処理を用いて継代し、次いで水洗し 、遠心してＮ２＋ｂＦＧＦで再度平板培養した。 成体ラット海馬からのニューロンの初代培養物は１５回を超えて複製させた。 １０％ＰＢＳまたはＮ２培地のいずれ観察された効果を説明するかを決定するた めに、幾つかの培養物を１０％ＦＢＳまたはＮ２中で増殖させた。ｂＦＧＦを用 いた培養物のみが多数のニューロンを生じた。ＣＡ１、ＣＡ３および歯状回領域 の幾つかの切片を作製した。全３領域からニューロンが発生した。培養物は、３ つの重複する時間段階：初期、中期および後期で表す。 初期培養物（１-２１日）は、基体に対する細胞付着性、成体ニューロンの特 徴である細胞増殖および発現により特徴付けられた。該培地中の細胞夾雑物を除 去した後に、細胞分裂を示す、相の明白な丸い単一の細胞および二重の細胞が、 イン・ビトロ２日目（d.i.v.）に認められた。相の明白な多数の細胞体が、成長 円錘を有する先端に突起を示した。ニューロン形態の細胞、すなわち、細い分岐 突起を有する相の明白な多極性細胞体が５d.i.v.に認められた。複雑な分岐パタ ーンを表す突起ならびに不完全な細胞分裂または推定される姉妹ニューロン間の 潜在的なシナプス形成の証拠が、８d.i.v.に認められた（ニコン位相差−２顕微 鏡／ネガティブにて倍率３３×-６６×）。 ＳＥＭについては、０.１ＭのＰＢＳ中の２％グルタルアルデヒドで培養物を 固定し、１％四酸化オスミニウム水溶液中でオスミニウム処理し、一連のエタノ ール勾配中で脱水処理し、液体二酸化炭素で臨界点乾燥し、銀ペーストを載せた スタブに付着させ、金/パラジウムで３００Åにスパッタリング被覆して、ケン ブリッジ型（Cambridge）走査型電子顕微鏡（ステレオスキャン（Stereoscan） ３６０）で検鏡し写真撮影した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いた初期/中 期段階の培養物の三次元形態の検鏡により、ニューロン細胞および上皮様細胞の 両表現型の多くの細胞が明らかとなった。位相差顕微鏡を用いると、レース状の 神経ネットワークが認められた。分裂しているらしい細胞も認められた。さらに 高拡大すると、光学顕微鏡レベルでは１個の突起であると解釈されていた細胞間 の突起お よび細胞集塊が、しばしば２またはそれを超える束生突起（fasciculated proce ss）であることが明らかとなった。 中期培養物（約１４−６０日）は、細胞数の増加、神経芽細胞ネットワークの 存在、成体ニューロンの進展および初期細胞集塊物の形成によって特徴付けられ た。小さな細胞クラスターを連結する細突起の未発達ネットワークが、１４d.i. v.もと早期に認められた。ニューロン形態を示す細胞のネットワークはさらに広 範かつ複雑となった。神経ネットワークのここの斑は均一な形態表現型を示すが 、培養物中の細胞は不均一であった。クラスターまたはネットワークから離れた 個々の細胞も、大きな相の明白な多極性細胞体および繰り返し分岐する長く細い 突起を有する成体ニューロンに特徴的な良好に分化した形態特徴を呈した。これ らの細胞の突起は、しばしば１０００μｍ近くのものが測定され、異なった焦平 面において大きなくぼんだ（indented）核および突起した（prominent）核小体 が認められた。幾つかのニューロンは、突起上の樹状突起棘とは区別できない小 さな棘様突出物を示していた。 後期培養物（約２ないし７ヶ月）は、密集する細胞数の増加、突起によって連 結する細胞集塊および個々の細胞のバックグラウンドの増加によって特徴付けら れた。基体空間が利用できる場合には、初期段階に特徴的な複数の細突起を有す る細胞が連続的に観察認された。細胞集塊はケーブル様の神経突起によって連結 していた。多数の細胞集塊が発達し、基体全体が細胞集塊および該細胞集合から 移動したと考えられる個々の細胞で覆われるようになった。多くのバックグラウ ンド細胞がニューロンに典型的な特徴を示す一方、幾つかの細胞は星状膠細胞に 典型的な特徴を示した。 実施例７ 培養ニューロン細胞における遺伝子発現 ＮＦｈおよびＧＦＡＰの存在は、異なった培養期間後に採取した細胞から得た ＲＮＡでの逆転写酵素-ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりさらに確認 した。 ＲＮＡはグアニジニウム-塩化セシウム（ＣｓＣｌ）法を用いて抽出した（「 分子生物学における最近のプロトコール（Current Protocols in Molecular Bio lo- gy）」第１巻、ウイリー・インターサイエンス（Wiley Interscience）ニュー・ ヨーク（ＮＹ）、エフ・エム、アウスベル（Ｆ.Ｍ.Ausubel）ら編、１９８８年 ）。解凍した後に、該ペレットを１ｍｌの溶液Ｄ（４.０Ｍのグアニジンイソシ アネート、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０.５％のサルコシルおよびＤＥＰ Ｃ処理Ｈ2Ｏ）に可溶化し、穏やかにトリチュレートし、細胞溶解物を予め遠心 管に注入したＣｓＣｌに移した。ＣｓＣｌのレベルに印を付け、該管の重量を測 定し、平衡化した。ベックマン（Beckman）超高速遠心機で該管を、４０,０００ rpm、２０℃にて一晩遠心した。翌朝に、溶液Ｄを除去し、溶液Ｄで界面を洗浄 した。ＣｓＣｌ溶液を注意深く取り出し、該ＲＮＡペレットを（ＤＥＰＣ水で作 製した）７０％ＥｔＯＨで濯いだ。該ペレットが乾燥した後に、それをＤＥＰＣ -Ｈ2Ｏ中に可溶化し、残りを-７０℃のＥｔＯＨ中にて保存した。 ＲＴ-ＰＣＲ法を用いてｃＤＮＡを得た（アウスベル（Ausubel）ら、１９８８ 年、前掲）。該反応管には、４μｌのＲＮＡ（１０-１００ｎｇ）、８μｌ（バ ランス量のＤＥＰＣ-Ｈ2Ｏで容量を２０μｌとする）、２μｌの１０×ＰＣＲ緩 衝液、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ類、１μｌのランダムヘキサマー、３μｌの ２４ｍＭ ＭｇＣｌ、０.１２５μｌのＡＭＶ-ＲＴおよび０.５μｌのＲＮエーシ ンが含まれていた。各管に１滴のヌジョール鉱油を添加し、パーキンエルマー・ サーマル・サイクラー（Parkin Elmer Thermal Cycler）：４２℃-７５分；９５ ℃-１０分；次いで４℃に固定して反応を進行させた。 ＰＣＲ法を用いて、特別に望むｃＤＮＡを前期のごとく得たｃＤＮＡからさら に増幅させた。各反応管には、５μｌのｃＤＮＡ、９.５μｌのＰＣＲ緩衝液、 ７.２５μｌのＭｇＣｌ2、０.２もしくは０.３μｌの32Ｐ-ｄＣＴＰ、１.５μｌ の１０ｍＭ ｄＮＴＰ類、０.５のタック・ポリメラーゼ、６μｌのプライマー（ ２μｌ ３’）各ＲＰＬ２７、ＮＦｈ、ＧＦＡＰ、ＮＧＦもしくはｂＦＧＦ）が含まれ、 バランス量のＨ2Ｏで容量を１００μｌとした。該反応は、パーキンエルマー・ サーマル・サイクラー：９４℃-1０分、次いで４℃に固定して進行させた。 アンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポイメラーゼはパーキンエルマー社から、 ＡＭＶ-逆転写酵素、ランダム・オリゴヌクレオチド・ヘキサマー・プライマー および組換えＲＮエーシン・リボヌクレアーゼ阻害剤はプロメガ社（Promega） から、特異的なプライマーは注文して入手した。ｄＮＴＰはニュー・イングラン ド・ニューキュラー社（New England Nuclear）から入手した。該プライマーは 以下の通りである：ＮＦｈ フォワード（Ｆ）プライマー：5'-GAGGAGATAACTGAGTACCG-3'（配列番号１） リバース（Ｒ）プライマー ：5'-CCAAAGCCAATCCGACACTC-3'（配列番号２）ＧＦＡＰ Ｆプライマー： 5'-ACCTCGGCACCCTGAGGCAG-3' （配列番号３） Ｒプライマー： 5'-CCAGCGACTCAACCTTCCTC-3' （配列番号４） ＰＣＲ増幅から得たｃＤＮＡ試料のゲル電気泳動は、６％非変性ポリアクリル アミドゲル上で行った。幾つかの試料およびそれらの対応する分解物は、エチジ ウムブロマイドを用いたアガロースゲル上で泳動させて、ＤＮＡを結合させ、Ｕ Ｖ光を照射した。該試料の側のレーンにおいて、１２３ｂｐの分子量マーカーを 泳動した。種々の時間で電気泳動を行い、得られたゲルをゲルドライヤー上で１ 時間乾燥した。乾燥したアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ・フィルムは 、数時間から１０日間までの範囲の時間感光させた。 ３６日から１１７日増殖させた培養物のノザンブロットからＮＦｈ、ＧＦＡＰ 、ＮＧＦ、ｂＦＧＦとして同定したｃＤＮＡバンドにわたり、デンシトメトリー を用いて定量的にｍＲＮＡの相対レベルを分析した。ｍＲＮＡ発現の多様なパタ ーンは明らかであった。ＮＦｈについてのメッセージ発現は比較的低かった。約 ２ヶ月後、相対レベルが転換してＧＦＡＰに対するｍＲＮＡの発現が経時的に上 昇し、次いで培養約４ヶ月後に劇的に低下した。一方、ＮＦｈの発現は経時的に 低下し、次いで培養４ヶ月後にわずかに上昇した。 ＮＦｈの消化は、４０μｌの試料、５μｌの反応（React）＃６緩衝液（５０ ｍＭ のトリス緩衝液、ｐＨ７.４、６ｍｍのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭ のＮａＣｌ）および５μｌのPvuII制限酵素よりなるカクテルを用いて、初期反 応の残りの試料に対して行い、３７℃にて１時間反応させた。該生成物を１２３ ｂｐ分子量マーカーに沿って６％アクリルアミドゲル上で泳動させた。ゲルを乾 燥させ、異なった時間フイルム上に暴露し、予想分子量レベルのバンドにつき、 得られたオートラジオグラフを検査した。ＮＦｈおよびＧＦＡＰの両方に対する ｍＲＮＡが、検査した時間の全培養物に存在した。 実施例８ 免疫細胞化学 神経組織に典型的な抗原を細胞が発現するか否かを確認するために、培養物を 免疫細胞化学用に加工した。細胞を、室温もしくは３７℃にて４％パラホルムア ルデヒド中で３０分間固定し、ＴＢＳ中の０.６％Ｈ2Ｏ2と共にインキュベート し、続いてブロッキング溶液中でインキュベートした。該培養物を、適当な希釈 率の一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を希釈液で濯 ぎ、二次抗体と共に室温にて１時間インキュベートし、ＴＢＳで濯ぎ、ＡＢＣ溶 液（等量のアビジンおよびビオチン）中で室温にて１時間インキュベートした。 それらをＴＢＳで濯ぎ、ＤＡＢ-ＮｉＣｌと共に種々の反応時間インキュベート し、ＴＢＳで濯ぎ、一晩乾燥し、一連のアルコール勾配を通して脱水処理し、ヒ ストクリアー（histoclear）中に設置した。抗体は以下に示した起源のものであ り、以下に示した希釈率にて用いた。モノクローナル抗体：ニューロフィラメン ト蛋白質の高分子量サブユニット（ＮＦ-Ｈ ２００ｋＤ；１：２４）；ニューロ フィラメント蛋白質の中分子量サブユニット（ＮＦ-Ｍ １６０；１：１０）；膠 フィラメント酸性蛋白質（ＧＦＡＰ；１：１００）およびシナプトフシン（１： １０）(ベーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim））；カルビンジン （Ｃａｌ-ｂ；１：２００）および微小管結合蛋白質２（ＭＡＰ２；１：５００ ）（シグマ社（Sigma））；ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；１：２００ ）（ダコ社（ＤＡＫＯ））。ポリクローナル抗体：ＮＦ-Ｈ ２００（１：２５０ ）；ＮＦ-Ｍ １５０（１：５００），ＮＦ-Ｌ ６８（１：１２５）；ＧＦＡＰ（ １：１０００）およびガンマ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ；１：２００） （ケミコン社（Chemicon））；ＮＳＥ（１：８００）（ポリサイエンシーズ社（ Ｐolysciences））；ガラクトロセレブロシド（Ｇａｌ-Ｃ；１：５０００）（ア ドバンスド・イムノ・ケム社（Advanced Immuno Chem.））；ｂＦＧＦ（１：１ ０００）；（ウィター・インスティチュート社（Whittier Institute）、カルフ ォルニア州、ラ・ジョーラ（La Jolla,ＣＡ））。正常ウマおよびヤギ血清、ビ オチン化ヤギ抗-ウサギＩｇＧ、ウマ抗-マウスＩｇＧおよびＡＢＣベクタステイ ン・エリートキット（Vectastain Elite kit）は、ベクター・ラボラトリーズ社 （Vector Laboratories（カリフォルニア州、バーリンガム（Bur1ingame,ＣＡ） ））から入手した。一次抗体を省略したり、非免疫血清で置き換えた場合には、 染色は検出されなかった。初期培養物においてニューロン-特異的エノラーゼ（ ＮＳＥ）-陽性細胞が認められた。１７０d.i.v.までに、成体ニューロンに特徴 的である高分子量ニューロフィラメント蛋白質（ＮＦｈ、２００ｋＤ）、ならび 中分子量および低分子量のＮＦに対して、ほとんどの細胞が免疫反応性であった 。ほとんどのＮＦ-陽性細胞も、ニューロンの形態特性を有していた。小亜集団 の細胞（１０％未満）が、顆粒細胞に特異的なカルビンジンに対して免疫陽性で あった。ニューロン表現型を有する細胞も、細胞体および頂端突起の細胞質に局 在する反応生成物を有するＭＡＰ２に対して免疫陽性であった。星状膠細胞の形 態を有する細胞は、ＧＦＡＰに対して染色された。１％未満の細胞がＧＡＢＡに 対して染色された。多くの細胞がｂＦＧＦに対して免疫陽性であり、わずかな小 さく丸い細胞がガラクトセレブロシドに対して免疫陽性であった。 実施例９ イン・ビトロにおけるニューロン細胞増殖性の特徴付け 細胞が増殖するか否かを確認するため、もしそうである場合にはかかる細胞型 の性質を評価するために、培養物をブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）中にて ３６時間インキュベートし、次いで、ＢｒｄＵおよびニューロン特異的エノラー ゼ（ＮＳＥ）もしくは膠フィラメント酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）での免疫蛍光のた めに二重標識した。 ＢｒｄＵ取込みには、細胞をガラス製のラブ-テック・スライド・チャンバー 中 にて１１日間培養した。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識試薬（１μｌ /ｍｌ培地；アマーシャム社（Amersham））を含む新鮮なＮ２＋ｂＦＧＦで該培 地を置き換え、該培養物をさらに１もしくは４日間（合計１２もしくは１５日間 ）インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パ ラホルムアルデヒド中にて３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１０％ の正常ロバ血清（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボズ社（Jackson ImmunoRese arch Labs））でブロッキングし、ＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体（Ｂｒ ｄＵ；未希釈液；アマーシャム社（Amersham））、続いてＣｙ-５にカップリン グさせたロバ抗-マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボズ社（J ackson ImmunoResearch Labs））と反応させた。幾つかの培養物は、ニューロン 特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；１：８００）に対するポリクローナル抗体もしくは 膠フィラメント酸性蛋白質（ＧＦＡＰ；１：１０００）に対する抗体で二重標識 された。該ポリクローナル抗体に対する二次抗体は、フルオレセイン・イソチオ シアネート（ＦＩＴＣ；ジャクソン・イムノリサーチ・ラボズ社（Jackson Immu noResearch Labs））に結合させたロバ抗-ウサギＩｇＧ抗体であった。スライド をスロー-フェード・マウンティング（Slow-Fade mounting）試薬（モレキュラ ー・プローブス社（Mole-cular Probes））に設置した。バイオラド・ＭＲＣ６ ００・共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いて細胞を視覚化した。画像を採取し、 アップル社（Apple）マッキントッシュ・クアドラ７００（Macintosh Quadra 70 0）に移して、アドーブ・フォトショップ（Adobe Photoshop）２.０１を用いて 合成し、ＧＣＣフィルム・レコーダー上に印刷した。 共焦点走査型顕微鏡により、ＮＳＥおよびＢｒｄＵに対して免疫反応性である 細胞、ならびにこれらの培養物中で分裂しているニューロン・マーカーおよび神 経膠細胞マーカーを細胞が発現していることを示すＢｒｄＵおよびＧＦＡＰ陽性 細胞が明らかとなった。 培養物中の細胞数が増加しているのか否かを確認するために、１０ヶ所のラン ダムなIVやにおいて２週間にわたり細胞を計数した。元来付着していた細胞の３ ７％が、培養２日目まで生存していた。５日以内に細胞数がその元来のレベル より僅かに増加し、７日目の最後までにほぼ２倍の細胞数となった。２週間の最 後までに、培養初日に比してほぼ５倍の細胞数となった。 この実験の最も重要な結果は、ｂＦＧＦで培養した場合に正常な成体海馬から のニューロンが増殖することが証明された点にある。２００d.i.v.を超える長期 にわたり、ニューロンが生存し、かなり増殖した；これは最初のかかる証明であ る。 培養物中の単離した成体脳の（線条）細胞の細胞分裂の開始には上皮細胞成長 因子（ＥＧＦ）を要するが、２０ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦおよび非粘着基体を要し ないことが報告されている（レイノルズ（Reynolds）およびワイス（Weiss）、 サイエンス（Science）第７５５巻：１７０７頁、１９９２年）。対照的に、今 回のデータは：１）２０ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦが、成体ならびに胎児の海馬培養 物において、強力な細胞分裂促進剤および生存因子として作用すること；２）基 体結合細胞および集塊、すなわち懸濁していない細胞において増殖が起こること 、ならびに３）ほとんどではないにせよ多くの付着する細胞がｂＦＧＦ反応性で あること、を支持する。 限定されたニューロン分裂が、成体脳の他の培養系において短期にわたり報告 されている（レイノルズ（Reynolds）、前掲；リチャーズ（Richards）ら、プロ シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第８９巻：８５９１頁、１９９ ２年）。今回の実験において、ＢｒｄＵの取込みおよび２週間にわたりほぼ５０ ０％も細胞数が増加するという知見により増殖性が確認された。最初に平板培養 した１％未満の成体線条細胞が増殖するということが報告されている（レイノル ズ（Reynolds）ら、前掲）が、本明細書に記載した培養においては、最初に付着 した細胞の４０％近くが培養２日目まで生存していることは、多くの細胞が増殖 能を有する成体海馬中に存在することを示している。 幾つかの独立した実験の証拠は、これらの培養物中のほとんどの細胞がニュー ロンであることのみならず、成体ニューロンに特徴的な形態学的、生化学的およ び分子的な特徴を発現する成体ニューロンでもあるという考えを支持している。 神経膠細胞も発生するが、神経膠細胞は、ほとんどの培養物において少数の表現 型であった。同様な知見が、ｂＦＧＦと共に培養した胎児ラット海馬ニューロン に関しても報告されている（レイ（Ray）ら、１９９３年、前掲）。 成体脳についての増殖性ニューロンの入手源は、決定すべき点として残ってい る。該細胞は、高濃度のｂＦＧＦによって救出され、増殖が誘導される成体機能 性のニューロンとすることができる；該細胞は予想される増殖ゾーンの幹細胞と することができる；あるいは、該細胞は、胚性脳にのみ存在する高濃度のｂＦＧ Ｆの低下および/または接触阻止のために静止状態となる部分的に関与するニュ ーロン（神経芽細胞）とすることができる。観察し発生した全てのニューロンが 平板培養後に救出された成体ニューロンを説明できそうではないが、成体分化し たニューロンが脱分化を通してイン・ビトロで生存し増殖できるか否かを決定す る実験が進行している。哺乳動物の前脳のサブベントリキュラー・ゾーン（subv entricular zone）（ＳＶＺ）が成体マウスのニューロンおよび神経膠細胞に分 化する細胞の起源であることが明らかにされているため、該ＳＶＺをこれらの細 胞の起源とすることができる（クロイス（Clois）ら、プロシーディングス・オ ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ（Pr oc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ）第７９巻：２０７４頁、１９９３年）。しかしなが ら、上衣細胞ライニング/ＳＶＺは脈絡集網と共に剥がれ落ちるため、本発明の 培養中の増殖細胞の主起源としてＳＶＺを供することができそうにはない。これ らのニューロンは、成体マウスの線条に存在することが示されている（レイノル ズ（Reynolds）ら、前掲）休眠状態で非増殖性状態の成体脳に生存する小集団の 胚性幹細胞由来とできる。別法として、これらのニューロンは、成体マウス脳で 予想されたごとき（リチャーズ（Richards）ら、前掲）、それらの増殖性および 分化性について区別される後生的なシグナルを要する成体哺乳動物脳に存在する ニューロン前駆細胞とすることもできる。 ＳＶＺの幹細胞に加えて、適当なイン・ビトロ条件下で長期にわたり多数のニ ューロンの発生を誘導できる正常な成体哺乳動物の海馬中には大集団の神経芽細 胞がある。基礎および臨床の神経科学についての深い含蓄を有する概念を、イ ン・ビボにおいて真実とできることも可能である。このことは、正常な海馬およ び、拡大するなら、正常なＣＮＳが、適当な条件下において活性化され多数のニ ューロンを複製できる細胞の貯蔵所を有することを意味し得る。かくして、神経 芽細胞は胎児ＣＮＳの培養物のみならず、成体ＣＮＳの培養物およびイン・サイ チュー（in situ）における成体ＣＮＳにも存在し得る。 実施例１０ 成体海馬からのニューロンの長期培養 成体フィッシャーラット（＞３ヶ月齢）の脳を切開し、髄膜を取り除いて海馬 を摘出した。該組織を１５ｍｌの組織培養管に移し、５ｍｌのダルベッコのリン 酸緩衝液生理食塩水（Ｄ-ＰＢＳ）で３回洗浄した。最後の洗浄の後に、１００ ０ｇで３分間遠心することにより該組織をペレット化し、該洗液を除去した。該 組織を５ｍｌのパパイン-中性プロテアーゼ-ＤＮアーゼ（ＰＰＤ）溶液に懸濁し 、時々振盪しつつ３７℃にて２０-３０分間インキュベートした。該溶液は、０. ０１％のパパイン、０.１％の中性プロテアーゼおよび０.０１％のＤＮアーゼＩ を含む１２.４ｍＭのＭｇＳＯ4を補給したハンスクのバランス塩溶液で作製した （ロンドン，アール・エム（London,Ｒ.Ｍ.）およびロビンス,アール・ジェイ（ Robbins,Ｒ.Ｊ.）メソッズ・イン・エンザイモロジー（Method.Enzymol.）第１ ２４巻：４１２-４２４頁、１９８６年）。 中程度の孔をあけたパスツールピペットでトリチュレートすることにより（約 ２０回）、海馬を機械的に解離させた。１０００ｇで３分間遠心することにより 細胞をペレット化した。該細胞を、１０％のウシ胎児血清、３.９ｍＭのグルタ ミンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（１：１）（完全培地）１ｍｌに再懸濁した。 培地で細孔パスツールピペットにトリチュレートすることにより（各々約２０回 ）、細胞凝集物を機械的に解離させた。細胞は、遠心によって５-１０ｍｌの完 全培地で２回洗浄した。細胞を１ｍｌの完全培地に採り、トリチュレートするこ とによって解離させ、ヘモサイトメーターで計数した。１×１０6細胞/Ｔ７５フ ラスコ（コースター社（Coaster）製）の密度で細胞を平板培養し、５％ＣＯ2/ ９５％空気インキュベーター中、３７℃にてインキュベートした。１８-２４時 間インキュ ベートした後に、２０ｎｇ/ｍｌのＦＧＦ-２（ｂＦＧＦ）を含有するＮ２培地［ ２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、１００μＭのプ トレッシン、３.９ｍＭのグルタミン、インスリン（５μｇ/ｍｌ）およびトラン スフェリン（１００μｇ/ｍｌ）を含有するＤＭＥＮ/Ｆ-１２の１：１混合物］ で該培地を置き換えた。現在までのところ、細胞を少なくとも７ヶ月培養してお り、１５種の異なった独立した切片から培養している。 光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡レベルで形態を検鏡することにより細胞の ニューロン特性を分析した。免疫細胞化学的分析によって、これらの細胞がニュ ーロン特異的エノラーゼ、ニューロフィラメント媒質および高分子量蛋白質、Ｍ ＡＰ-２ならびに（小集団のみの）カルビンジンを発現することが示された。こ れらの培養物中の幾つかの細胞もＧＦＡＰに対して染色されることは、これらの 培養物中に神経星状膠細胞が存在することを示している。培養物中における成体 ニューロン細胞の増殖性は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みによ って測定した。ニューロン特異的エノラーゼを発現する細胞の核がＢｒｄＵに対 する抗体で免疫染色されることは、培養物中での細胞増殖を示している。 実施例１１ 成体脳における移植後の不滅化海馬ニューロンのイン・ビボ生存性 胚性海馬ニューロンを、２０ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦを含有するＮ２培地にて培 養した。細胞を継代し、７０-８０％密集性となるまで増殖させた。該培地を3Ｈ -チミジン（１μＣｉ/ｍｌ；特異活性：２５Ｃｉ/mmol）を含む新鮮な培地（Ｎ ２＋ｂＦＧＦ）で置き換え、３.５日間増殖させた。トイプシン処理によりフラ スコから細胞を採取し、Ｄ-ＰＢＳで遠心によって３回洗浄した。細胞を２０ｎ ｇ/ｍｌのｂＦＧＦを含有する２ｍｌのＤ-ＰＢＳに再懸濁し、トリチュレートす ることにより解離させ、ヘモサイトメーターで計数した。遠心して該上清を除去 した後に、６０,０００細胞/μｌの濃度にて細胞を再懸濁した。１μｌの細胞懸 濁液を、成体フィッシャーラット（＞３ヶ月齢）の海馬に注射した。４％パラホ ルムアルデヒドを動物に灌流させ、該脳を取り出した。脳切片を、カルビンジン 、ＧＦＡＰおよびＮＦ-Ｈ蛋白質と共に抗体で処理した。該切片を乳化液に浸漬 し、６週間後に 展開した。細胞上に少なくとも１２個の粒状物を有する当該細胞の数は、各動物 （全３動物）につき毎１２切片と計数された。３週間後に、該脳に移植した細胞 の平均１７％が生存していた（表４）。 本発明は、現在において好ましい具体例に参照して記載したものであって、本 発明の精神から離れることなしに種々の修飾を作ることができることは理解され るであろう。 配列番号表 配列番号１および２は、ＲＮＡで逆転写酵素-ポリメラーゼ鎖反応させてＮＦ ｈを同定するための、各々、フォワード・プライマーおよびリバース・プライマ ーのヌクレオチド配列である。 配列番号３および４は、ＲＮＡで逆転写酵素-ポリメラーゼ鎖反応させてＧＦ ＡＰを同定するための、各々、フォワード・プライマーおよびリバース・プライ マーのヌクレオチド配列である。 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ゲージ,フレッド・エイチ（Gage,FredH.） レイ,ジャソダーラ（Ray,Jasodhara） （ii）発明の名称：神経芽細胞の産生方法 （iii）配列数：４ （iv）通信住所： （Ａ）受信人：スペンスリー・ホーン・ジュバス・アンド・ルビッツ （Ｂ）通り：スイート５００、センチュリー・パーク・イースト１８８０番 （Ｃ）都市：ロサンゼルス （Ｄ）州：カリフォルニア州 （Ｅ）国籍：合衆国 （Ｆ）郵便番号：９００６７ （ｖ）コンピュータ判読形態： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣ・コンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ-ＤＯＳ/ＭＳ-ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース（PatentIn Release）＃１. ０、バージョン＃１.２５ （vi）最新出願データ： （Ａ）出願番号：ＰＣＴ （Ｂ）出願日：１９９４年１月５日 （Ｃ）分類： （viii）代理人/代理事務所の情報 （Ａ）氏名：ウェサレル,ジュニア,ピーエイチディ,ジョンソン,アール （Ｂ登録番号：３１,６７８ （Ｃ）参照/ファイル番号：ＦＤ-３１０７ ＰＣＴ （ix）電信電話通信の情報： （Ａ）電話番号：（６１９）４５５-５１００ （Ｃ）ファックス番号：（６１９）４５５-５１１０ （２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：（ゲノミック）ＤＮＡ （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：ＮＦｈ・フォワード・プライマー （ix）配列の特徴： （Ａ）配列の名称/キー：ＣＤＳ （Ｂ）配列位置：１...２０ （xi）配列：配列番号１： GAGGAGATAA CTGAGTACCG （２）配列番号２：に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：（ゲノミック）ＤＮＡ （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：ＮＦｈ・リバース・プライマー （ix）配列の特徴： （Ａ）配列の名称/キー：ＣＤＳ （Ｂ）配列位置：１...２０ （xi）配列：配列番号２： CCAAAGCCAA TCCGACACTC （２）配列番号：３に関する情報： （i）配列特性 （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：（ゲノミック）ＤＮＡ （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：ＧＦＡＰ・フォワード・プライマー （ix）配列の特徴： （Ａ）配列の名称/キー：ＣＤＳ （Ｂ）配列位置：１...２０ （xi）配列：配列番号３： ACCTCGGCAC CCTGAGGCAG （２）配列番号：４に関する情報： （i）配列特性 （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：（ゲノミック）ＤＮＡ （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン：ＧＦＡＰ・リバース・プライマー （ix）配列の特徴： （Ａ）配列の名称/キー：ＣＤＳ （Ｂ）配列位置：１...２０ （xi）配列：配列番号４： ＣＣＡＧＣＧＡＣＴＣ ＡＡＣＣＴＴＣＣＴＣ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/09 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種の栄養因子を補給した無血清基基礎培地を入れた容器中にて ニューロン細胞を培養することからなり、ここに該容器の表面は該ニューロン細 胞が付着できることを特徴とするイン・ビトロにおいて神経芽細胞を産生する方 法。 ２．該ニューロン細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、線条、基底前脳、腹側中脳 および青斑よりなる群から選択される神経芽細胞組織由来である請求項１記載の 方法。 ３．該栄養因子が、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロピン、繊 維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、インスリン成長因子お よびトランスフォーミング成長因子よりなる群から選択される請求項１記載の方 法。 ４．該繊維芽細胞成長因子が、塩基性繊維芽細胞成長因子である請求項３記載の 方法。 ５．該ニューロトロピンが、ニューロトロピン-３である請求項３記載の方法。 ６．該容器の表面が、該ニューロン細胞が付着できるように多塩基性アミノ酸で 処理されている請求項１記載の方法。 ７．該多塩基性アミノ酸がポリオルニチンである請求項６記載の方法。 ８．該容器の表面が、該ニューロン細胞が付着できるように細胞外マトリックス 分子で処理されている請求項１記載の方法。 ９．該細胞外マトリックス分子が、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチ ンよりなる群から選択される請求項８記載の方法。 １０．該ニューロン細胞を、無血清培地中に培養する前に含血清培地中で培養す ることを特徴とする請求項１記載の方法。 １１．（ａ）組成物および神経芽細胞よりなる成分をインキュベートし、ここに 該インキュベートは該成分が十分に相互反応できる条件下で行い；次いで （ｂ）該組成物により引き起こされた該神経芽細胞に対する効果を測定するこ と を特徴とする神経芽細胞に影響する組成物を同定するための方法。 １２．該効果が神経芽細胞の阻害である請求項１１記載の方法。 １３．該効果が神経芽細胞の刺激である請求項１１記載の方法。 １４．該神経芽細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、前脳基底野、腹側中脳および 青斑よりなる群から選択される神経組織である請求項１１記載の方法。 １５．該神経芽細胞が不滅化されている請求項１１記載の方法。 １６．該神経芽細胞が、少なくとも１種のオンコジーンの神経芽細胞への導入に より不滅化されている請求項１５記載の方法。 １７．該オンコジーンが、ｖ-ｍｙｃ、ＳＶ４０の大Ｔ抗原およびアデノウイル スのＥ１Ａよりなる群から選択される請求項１５記載の方法。 １８．該神経芽細胞が、さらに少なくとも１種の外来遺伝子よりなる請求項１１ 記載の方法。 １９．該外来遺伝子が受容体をコードしている請求項１８記載の方法。 ２０．該受容体が、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、セロトニ ン、ドーパミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンに結合する受容体よりなる群か ら選択される請求項１９記載の方法。 ２１．（ａ）少なくとも１種の栄養因子を含有する無血清基本培地；および （ｂ）容器よりなり、ここに該容器の表面は神経芽細胞が付着できることを特 徴とする神経芽細胞を産生し維持するのに有用な培養系。 ２２．該神経芽細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、前脳基底野、腹側中脳および 青斑よりなる群から選択される神経組織由来である請求項２１記載の培養系。 ２３．該栄養因子が塩基性繊維芽細胞成長因子である請求項２1記載の培養系。 ２４．該栄養因子が約１ｎｇ/ｍｌ〜約１００ｎｇ/ｍｌの濃度で存在する請求項 ２１記載の培養系。 ２５．該栄養因子が約５ｎｇ/ｍｌ〜約７０ｎｇ/ｍｌの濃度で存在する請求項２ １記載の培養系。 ２６．該栄養因子が約１５ｎｇ/ｍｌ〜約６０ｎｇ/ｍｌの濃度で存在する請求項 ２１記載の培養系。 ２７．グルコースが約０.０１％〜約１.５％の濃度で存在する請求項２１記載の 培養系。 ２８．グルコースが約０.１％〜約０.６％の濃度で存在する請求項２１記載の培 養系。 ２９．該容器中の表面が、多塩基性アミノ酸で処理されている請求項２１記載の 培養系。 ３０．該多塩基性アミノ酸がポリオルニチンである請求項２９記載の培養系。３ １．該容器中の表面が、細胞外マトリックス分子で処理されている請求項２１記 載の培養系。 ３２．該細胞外マトリックス分子が、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネク チンよりなる群から選択される請求項３１記載の培養系。 ３３．治療的に有効な量の神経芽細胞を対象に投与することを特徴とするニュー ロン細胞疾患を持つ対象を治療する方法。 ３４．該神経芽細胞が外来遺伝子を含有する請求項３３記載の方法。 ３５．該外来遺伝子がオンコジーンをコードしている請求項３４記載の方法。 ３６．該オンコジーンが、ｖ-ｍｙｃ、ＳＶ４０の大Ｔ抗原およびアデノウイル スのＥ１Ａよりなる群から選択される請求項３５記載の方法。 ３７．該外来遺伝子が受容体をコードしている請求項３４記載の方法。 ３８．該受容体が、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、セロトニ ン、ドーパミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンに結合する受容体よりなる群か ら選択される請求項３７記載の方法。 ３９．該外来遺伝子がリガンドをコードしている請求項３４記載の方法。 ４０．該リガンドが、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、ドーパ ミン、アセチルコリン、ガンマ-アミノ酪酸およびセロトニンよりなる群から選 択される請求項３９記載の方法。 ４１．該ニューロン疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン 舞踏病、発作および脊髄外傷よりなる群から選択される請求項３３記載の方法。 ４２．神経芽細胞の豊富化された集団よりなる細胞組成物。 ４３．該神経芽細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、前脳基底野、腹側中脳および 青斑よりなる群から選択される神経組織由来である請求項４２記載の組成物。 ４４．該神経芽細胞が不滅化されている請求項４２記載の組成物。 ４５．該不滅化が、少なくとも１種のオンコジーンの細胞への導入によって達成 される請求項４４記載の組成物。 ４６．該オンコジーンが、ｖ-ｍｙｃ、ＳＶ４０の大Ｔ抗原およびアデノウイル スＥ１Ａよりなる群から選択される請求項４５記載の組成物。 ４７．該神経芽細胞が、さらに少なくとも1種の外来遺伝子よりなる請求項４２ 記載の組成物。 ４８．該外来遺伝子が受容体をコードしている請求項４７記載の組成物。 ４９．該受容体が、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、セロトニ ン、ドーパミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンに結合する受容体よりなる群か ら選択される請求項４８記載の組成物。 ５０．該外来遺伝子がリガンドをコードしている請求項４７記載の組成物。 ５１．該リガンドが、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、ドーパ ミン、アセチルコリン、ガンマーアミノ酪酸およびセロオトニンよりなる群から 選択される請求項５０記載の組成物。
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