JPH08505396A - Oligonucleotides modified to increase stability at acidic pH - Google Patents

Oligonucleotides modified to increase stability at acidic pH

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JPH08505396A
JPH08505396A JP6516188A JP51618894A JPH08505396A JP H08505396 A JPH08505396 A JP H08505396A JP 6516188 A JP6516188 A JP 6516188A JP 51618894 A JP51618894 A JP 51618894A JP H08505396 A JPH08505396 A JP H08505396A
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Abstract

(57)【要約】 ２’−Ｏ−位でアルキル化により修飾された酸耐性オリゴヌクレオチドは経口投与に適している。有効成分として、開示された修飾オリゴヌクレオチドを含み調製された経口的に許容される処方もまた提供される。 (57) Summary: Acid-resistant oligonucleotides modified by alkylation at the 2'-O-position are suitable for oral administration. Orally acceptable formulations prepared containing the disclosed modified oligonucleotides as the active ingredient are also provided.

Description

【発明の詳細な説明】 酸性ｐＨにおいて安定性を増加するよう修飾されたオリゴヌクレオチド関連出願の相互参照 本出願は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）１９８６年１０月２８日 付出願の米国特許出願第０６／９２４，２３４号の一部係属出願である１９９０ 年７月２７日付出願の米国特許出願第０７／５５８，３３８号の一部係属出願で ある。発明の背景および概要 本発明は酸性ｐＨにおいて増加した安定性を供給するオリゴマーを供給する方 法、このようなオリゴマーをその作用部位に送達する方法、ならびに経口投与ま たは酸に対する耐性が有利である他の投与形態のための処方における使用に関す る。 酸性条件下でのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の脱プリン（塩基と糖の間のグリ コシド結合の開裂を通じるヌクレオシジル単位からのプリン塩基の損失）が報告 されてきた（ヘベシ・エル（Hevesi，L））ら、ジャーナル・オブ・アメリカン ・ケミカル・ソサイエティ（J．Amer．Chem．Soc．）、９４、４７１５−４７２ ０（１９７））。治療用のオリゴデオキシリボヌクレオチドの経口送達は、薬剤 送達の通常条件で約４時間までの、および徐放性薬剤送達の条件で約１２時間ま での胃の酸性条件（ｐＨ１）への暴露を要求するであろう（例えば、米国特許第 ４，８３９，１７７号を参照）。酸性条件でのその安定性の欠如のために、経口 投与されたオリゴデオキシヌクレオチドの充分量が無傷で有効なままであること はありそうにない。伝えられるところによれば、リボ核酸（ＲＮＡ）はそのＤＮ Ａの相対物よりも酸性条件での脱プリンに対し、より安定であると報告されてい るが、これは糖と塩基の間のグリコシド結合の２’−ヒドロキシルの明白な安定 化効果によるものである（ヘベシ・エル（Hevesi．L．）ら、上記）。 ＲＮＡは酸性条件下で脱プリンに耐性であるかもしれないが、生物物質中に存 在する普偏的ヌクレアーゼに対するその感受性はその治療用の有用性を限定する 。さらに、該分子の、中性から少々塩基性の状態に対する本質的な不安定性のた めに、 薬剤としての修飾されない形態でのオリゴリボヌクレオチドの利用は実行できそ うにない。 不運にも、リン酸結合をメチルホスホネートで置換することによる、ヌクレア ーゼに対するＲＮＡの保護は、不可能である。なぜなら糖の２’−ヒドロキシル が急速にメチルホスホネート骨格を切断するからである。発明の概要 本発明は酸に耐性な形態の予め選択された塩基配列を有するヌクレオシジル単 位からなるオリゴマーを供給する方法に関する。本発明の一の態様において、オ リゴマーが供給され、ここに、ヌクレオシジル単位は２’−Ｏ−アルキルリボシ ル基である糖部分を有する。好ましくは、オリゴマーは本質的に中性である。好 ましいのはメチルホスホネートのヌクレオシジル間結合を有するもので、より好 ましいのは約５０ないし約１００％のヌクレオシジル間結合がメチルホスホネー ト結合であるものである。好ましい２’−Ｏ−アルキルリボシル基は２’−Ｏ− メチルリボシル基を含む。 他の態様により、酸耐性形態で供給されるオリゴマーは、メチルホスホネート ヌクレオシド間結合からなり、好ましくは約５０％ないし約１００％のメチルホ スホネート結合からなる。 付加的な態様として、本発明は、該オリゴマーが経口投与に適し、酸による分 解に対して耐性を示すような予め選択された塩基配列を有するヌクレオシジル単 位からなるオリゴマー調製方法に関する。一の態様において、該方法は２’−Ｏ −アルキルリボシル基、より好ましくは２’−Ｏ−メチルリボシル基である糖部 分を有するヌクレオシジル単位を用いてオリゴマーを合成することからなる。好 ましくは、オリゴマーは実質的に中性である。より好ましくは、オリゴマーはメ チルホスホネートヌクレオシジル間単位を有するよう合成される。 他の方法として、該方法はメチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有する オリゴマーを合成することからなる。特に好ましいのは約５０パーセントないし 約１００パーセントのヌクレオシジル間単位を有するオリゴマーである。 さらなる態様において、本発明はオリゴマーを哺乳動物に治療の目的のために 経口送達する方法に関し、ここに該オリゴマーはプリン塩基を有するヌクレオシ ジル単位からなり、該方法は酸耐性オリゴマーを投与することからなる。本態様 の一の具体例において、該酸耐性オリゴマーは、２’−Ｏ−アルキルリボシル基 、より好ましくは２’−Ｏ−メチルリボシル基からなる糖部分を有するヌクレオ シジル単位からなる。好ましくは、該オリゴマーは実質的に中性である。好まし い酸耐性オリゴマーはメチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有するオリゴ マーを含み、より好ましくはヌクレオシド結合の約５０ないし約１００パーセン トがメチルホスホネート結合である。とりわけ好ましい態様において、該酸耐性 オリゴマーは制御された速度で放出される形態で投与される。 数ある因子の中で、本発明は、２’−Ｏ−アルキルリボシル基である糖部分あ るいはメチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有するヌクレオシド単位を含 むように合成されたオリゴマーが酸触媒の脱プリンおよびこれに続く加水分解に 有利な耐性を示すという、驚くべき我々の発見に基づいている。 ２’−Ｏ−アルキルリボシル基およびメチルホスホネートヌクレオシジル間結 合を有するヌクレオシジル単位からなるオリゴマーは、対応する２’−デオキシ リボヌクレオシドメチルホスホネートよりも、ＲＮＡ標的分子とより安定なデュ ープレックスを形成するように思われるということも信じられている。 さらなる態様において、本発明は制御された速度で放出される形態の本発明の 酸耐性オリゴマーからなる医薬組成物に関する。代わりに、酸耐性オリゴマーか らなる医薬組成物が供給され、その組成物はそれ自体酸性であるか、あるいは製 造または貯蔵の間酸性条件に暴露されてもよい。定義 本明細書中で用いるごとく、以下の語句は、特に断りのない限り、以下の意味 を有する。 「プリン」もしくは「プリン塩基」なる語は、天然のアデニンおよびグアニン 塩基のみならず、８-位で塩基置換されている塩基のごときこれら塩基の修飾物 、または、６-位で修飾されているグアニンアナログ、もしくはアデニンのアナ ログ、２-アミノプリン、ならびに９-デアザプリン誘導体のごとき９-位に炭素 置換窒 素を有するプリンのアナログおよび他のプリンアナログをも包含する。 「ヌクレオシド」なる語は、ヌクレオシジル単位であって、それらと互換的に 用いられ、５-炭素の糖および含窒塩基よりなる核酸のサブユニットをいう。該 語には、その塩基としてＡ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵを有するそれらのヌクレオシジ ル単位のみならず、偽イソシトシンおよび偽ウラシルおよび（８-置換プリンの ごとき）他の修飾塩基のごときピリミジンアナログを含む天然の塩基のアナログ および修飾形態も含まれる。ＲＮＡにおいては、該５-炭素の糖はリボースであ り；ＤＮＡにおいては、２’-デオキシリボースである。ヌクレオシドなる語句 には、２’-Ｏ-アルキルリボースのごとき修飾された糖を有するものを含むかか るサブユニットの他のアナログも含まれる。 ［式中、Ｒは水素またはアルキルもしくはアリール基である］をいう。適当なア ルキルもしくはアリール基には、ホスホネート結合を立体的に隠さないか、また は互いに相互作用しないものが包含される。該ホスホネート基は、「Ｒ」もしく は「Ｓ」の立体構造のいずれかで存在してもよい。ホスホネート基は、ヌクレオ シジル単位を結合させるヌクレオシジル間リン基架橋（もしくは結合）として用 いられる。］ ［式中、ホスホジエステル基は、ヌクレオシジル単位を結合させるヌクレオシジ ル間リン基架橋（もしくは結合）として用いられる。］をいう。 「非-ヌクレオシド・モノマー単位」とは、その中の塩基、糖および/またはリ ン骨格が他の化学基により置き換えられているモノマー単位をいう。 「ヌクレオシド/非-ヌクレオシド・ポリマー」とは、ヌクレオシドおよび非- ヌクレオシド・モノマー単位よりなるポリマーをいう。 「オリゴヌクレオシド」もしくは「オリゴマー」なる語は、約１００個のヌク レオシド長を超えることもあるが、一般に約４ないし約１００個のヌクレオシド 長であるヌクレオチシド間連結により結合されているヌクレオシドの鎖をいう。 それらは、酵素的な方法によっても得ることができるが、通常はヌクレオシド・ モノマーから合成する。従って、「オリゴマー」なる語は、該ヌクレオシド・モ ノマーを結合させるヌクレオシジル間結合を有するオリゴヌクレオシドの鎖を意 味し、かくして、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル -およびアリール-ホスホネート・アナログ、オリゴヌクレオチドのアルキル-お よびアリール-ホスホノチオエート、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチ オエート・アナログ、オリゴヌクレオチドのホスホルアミデート・アナログ、ホ スホトリエステルおよび他のオリゴヌクレオシド・アナログおよび修飾オリゴヌ クレオシドのごとき、中性ホスフェートエステル・オリゴヌクレオシド・アナロ グが含まれ、また、ヌクレオシド/非-ヌクレオシド・ポリマーも含まれる。また 、該語句には、モノマー単位間の１もしくはそれを超えるリン基結合が、ホルム アセタール結合、チオホルムアセタール結合、スルファメート結合もしくはカル バメート結合のごとき非-リン結合により置き換わったヌクレオシド/ヌクレオチ ドポリマーも包含される。また、それには、該糖およびリン基の双方が、モルホ リノ塩基アナログ、もしくはポリアミド塩基アナログのごときで置き換えられま たは修飾されたヌクレオシド/非-ヌクレオシド・ポリマーも包含される。また、 それには、該非-ヌクレオシドの塩基、糖、およびホスフェート骨格が、非-ヌク レオシド基で置き換わっているか、または非-ヌクレオシド基が当該ヌクレオシ ド/非-ヌクレオシド・ポリマーに挿入されているかのいずれかのヌクレオシド/ 非-ヌクレオシド・ポリマーも包含される。所望により、該非-ヌクレオシド基は 、標的配列と相互作用できるか、または標的細胞中への取り込みを変化させるこ とができる他の小分子に結合するよう供することもできる。 「アルキル-もしくはアリール-ホスホネート・オリゴマー」なる語は、少なく とも１個のアルキル-もしくはアリール-ホスホネート・ヌクレオシジル間結合を 有するオリゴマーをいう。適当なアルキル-もしくはアリール・ホスホネート基 には、該ホスホネート結合を立体的に隠さないか、または互いに相互作用しない アルキル-もしくはアリール-基が包含される。好ましいアルキル基には、約１な いし約６個の炭素原子を有する低級アルキル基が包含される。適当なアリール基 は、共役π電子系を有する少なくとも１個の環を有し、所望により置換されてい てもよく、かつ好ましくは約１０個までの炭素原子を有する炭素環式アリール基 および複素環アリール基が包含される。 「メチルホスホネート・オリゴマー」（または「ＭＰ-オリゴマー」）なる語 は、少なくとも１個のメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリ ゴマーをいう。 「中性オリゴマー」なる語は、ヌクレオシド・モノマー間の非イオン性ヌクレ オシジル間結合（すなわち、正または負のイオン電荷を有しない結合）を有する オリゴマーをいい、例えば、アルキル-もしくはアリール-ホスホネート結合、ア ルキル-もしくはアリール-ホスホノチオエート、およびホスホトリエステル結合 、特に中性エチルトリエステル結合のごとき中性ホスフェートエステル結合のご とき、ヌクレオシジル間結合；ならびに、スルファメート、モルホリノ、ホルム アセタール、チオホルムアセタールおよびカルバメート結合のごとき非-ホスホ ラス含有ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーが包含される。所望により、 中性オリゴマーは、オリゴヌクレオシドまたはヌクレオシド/非-ヌクレオシド・ ポリマーと、結合相手よりなる第二分子との間の結合体よりなっていてもよい。 かかる結合相手は、インターカレーション剤、アルキル化剤、細胞表面レセプタ ーに対する結合基質、親油性剤、およびソラレン（psoralen）のごとき光-架橋 剤を含む核酸修飾基ならびに核酸の標的部位を切断できる基等からなってよい。 かかる結合相手は、さらに、該オリゴマーの取り込みをさらに向上させることが でき、該オリゴマーと該標的配列との相互作用を修飾することができ、あるいは 、該オリゴマーの薬物動態的な分布を変化させることができる。本質的に必要な のは、該オリゴマー結合体を構成する該オリゴヌクレオシドまたはヌクレオシド /非-ヌレノオシド・ポリマーが実質的に中性であることである。 「実質的に中性」なる語は、該ヌクレオシド・モノマー間のヌクレオシジル間 結合の少なくとも約８０％が非イオン性結合であるオリゴマーをいう。 「中性アルキル-またはアリール-ホスホネート・オリゴマー」なる語は、少な くとも１つのアルキル-もしくはアリール-ホスホネート結合よりなる中性ヌクレ オシジル間結合を有する中性オリゴマーをいう。 「中性メチルホスホネート・オリゴマー」なる語は、少なくとも１つのメチル ホスホネート結合よりなるヌクレオシジル間結合を有する中性オリゴマーをいう 。 「酸耐性」なる語は、デオキシリボオリゴヌクレオチドと比較して、Ｎ−グリ コシル結合の加水分解による酸触媒脱プリンに対し耐性であるオリゴマーをいう 。 「トリプレット」または「トリアド」なる語は、標的配列の１個の塩基（もし 一本鎖ならば）または複数の塩基（もし二本鎖ならば）、第二の鎖の塩基および 第三の鎖の塩基（もし標的配列が一本鎖ならば）もしくは第三の鎖の塩基（もし 標的が二重鎖ならば）間の３つのヌクレオシド塩基の水素結合した複合体をいう 。図の簡単な説明 図１は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルリボシラントを有するメチルホス ホネート・オリゴマーおよびメチルホスホネート・オリゴマーからなるオリゴマ ー類に対する無傷のアデニンのパーセント対時間のプロットの図である。 図２は、図１でプロットされたのと同一のオリゴマー類に対する無傷のアデニ ンのパーセントの対数対時間のプロットの図である。 図３は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルリボシル単位を有するオリゴマー およびメチルホスホネート・オリゴマーからなるオリゴマー類に対する３７℃に おける脱プリンのパーセント対時間のプロットの図である。 図４は、図３でプロットされたのと同一のオリゴマー類に対する３７℃におけ る脱プリンのパーセントの対数対時間のプロットの図である。 図５は、３７℃、ｐＨ１における、２’−Ｏ−メチルリボシル単位を有するメ チルホスホネート・オリゴマーに対する無傷の骨格対時間のプロットの図である 。 図６は、オリゴデオキシリボヌクレオチド（１）、２’−Ｏ−メチルリボシル 単位を有するメチルホスホネート・オリゴマー（２）およびデオキシリボシル単 位を有するメチルホスホネート・オリゴマー（３）からなるオリゴマー類とＤＮ Ａ 標的とのハイブリダイゼーションについての融解曲線の図である。 図７は、図６と同一のオリゴマー類とＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーション の融解曲線の図である。 図８は、（ａ）オリゴ−２’−Ｏ−メチルーリボヌクレオシドメチルホスホネ ート、（ｂ）オリゴテオキシリボヌクレオシドメチルホスホネート、および（ｃ ）オリゴデオキシリボヌクレオシドからなるダイマーの例の図である。発明の詳細な説明 好ましいオリゴマー類 本発明のオリゴマー類は独立して２’−Ｏ−アルキルリボシル基から選択され る糖部分を有するヌクレオシジル単位からなる。適当なのは１ないし５個の炭素 原子のアルキル基である。特に好ましいヌクレオシドは２’−Ｏ−メチルリボシ ル基を有する。 選択されたヌクレオシド間結合を有するオリゴマー鎖は当業者に公知の合成技 術によって都合よく調製することができる。例えば、ホスホジエステルおよび他 のあるリン含有ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの合成には、市販の機 器、試薬およびプロトコール類を利用できる（（ゲイト，エム・ジェイ（Gait， M．J．）「オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ（Oligonucleotide Synt hesis：A Practical Approach）」、アイアールエル・プレス社（IRL Press）、 １９８４年；コーエン，ジャック・エス（Cohen，JackS．）「遺伝子発現のオリ ゴデオキシリボヌクレオチド・アンチセンス・インヒビター（Antisense Inhibi tors ofGene Expression）」、シーアールシー・プレス社（CRC Press）、フロ リダ州、ボカ・レートン（BocaRaton，FL）１９８９年；および「オリゴヌクレ オチドおよびアナログ:実践的アプローチ（Oligonucleotides and Analogues；A Practical Approach）」、エフ・エックスタイン（F．Eckstein）編、１９９１ 年）も参照）。ある種の非−リン含有ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマー の調製は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）米国特許第５，１４２，０ ４７号に記載されている。 好ましいのは実質的に中性であるオリゴマーである。 特に好ましい態様において、これらのオリゴマーはメチルホスホネートヌクレ オシジル間結合を有する。より好ましくは、全てのヌクレオシド間結合がメチル ホスホネート結合である。メチルホスホネートヌクレオシジル間結合と他のヌク レオシジル間結合との混合物を有するオリゴマーが、ある治療的適応症に好まし く、本発明の範囲内にあるよう意図される。 好ましくは、該オリゴマーは約４ないし約４０ヌクレオシドからなり、より好 ましくは、約６ないし３０ヌクレオシドからなる。特に好ましいのは約８ないし 約２０ヌクレオシドのオリゴマーである。有用性および投与 本明細書中で提供されるオリゴマーは、高い選択性を有する核酸のごとき標的 配列または蛋白質と高アフィニティー複合体を形成することができる。例えば、 誘導されたオリゴマーは架橋により（ソラレン（psoralen）類）、あるいは１本 または両方の鎖の開裂により（ＥＤＴＡ）核酸中の標的部位と結合し、次いで不 可逆的に修飾するために用いることができる。切断のための標的部位の注意深い 選択により、鎖のうち１本を、分子バサミとして、選択された核酸配列を特異的 に切断するために用いることができる。 本明細書中で提供されるオリゴマーは、不可逆的に核酸を修飾、分解、破壊し 、次いでその機能を不可逆的に阻害する核酸断片またはその標的配列と反応を起 こすことができる基と、反応するかまたはそれを修飾する核酸を包含するように 誘導化することができる。 これらのオリゴマーは、生きている細胞中のものと同一である特定の遺伝子ま たは標的配列の発現を不活性化するか阻害するか変化させ、発現の選択的な不活 性化、阻害もしくは変化を可能とする。標的配列は、ＤＮＡまたはあるｍＲＮＡ の前駆体ｍＲＮＡのごときＲＮＡであってよい。ｍＲＮＡ標的配列は開始コドン 領域、ポリアデニル化領域、ｍＲＮＡキャップ部位あるいはスプライス結合部を 含有する。これらのオリゴマーは不完全なまたは望ましくない生産物を生産する か、または活性化されると望ましくない影響を引き起こす遺伝子を永久的に不活 性化するか、発現をオフにするか、または破壊するためにも使用することができ る。 本明細書中で提供されるオリゴマーは、核酸の転写された領域と共にデュープ レックスまたはトリプルヘリックス複合体あるいは他の形の安定な会合形態を形 成するので、これらの複合体は「アンチセンス」あるいは三本鎖療法において有 用である。本明細書中で用いる「アンチセンス」治療とは、イン・ビトロ（in v itro）あるいはイン・ビボ（in vivo）で望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡ配列 を不活性化する、特異的結合オリゴマーの使用を包含する包括的用語である。 多くの病気および他の疾患は望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡの存在によって 特徴付けられるが、これはある例では一本鎖であって、他の例では二本鎖である 。これらの病気および疾患は当該分野で一般的に理解されているアンチセンス治 療の原理を用いて治療することができる。アンチセンス治療は、相補性または他 の特異的結合手段を用いて（本発明の場合にはデュープレックスあるいはトリプ ルヘリックス複合体の形成により）、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列を標 的とすることを包含する。 本発明で用いるオリゴマーは、単独で投与するか、あるいは、隣接するまたは 離れた標的または前記の一般的機構を有する組み合わさった効果のアンチセンス 機構のために、オリゴマーの組み合わせを投与することができる。 治療的な適用には、経口、局所または局部投与を包含する種々の投与様式に該 オリゴマーを処方できる。製造の間に、またはこのような処方自体を、適用の部 位にて優勢な状態（例えば皮膚のアシッド・マントル（acid mantle））により 適合するようにある程度まで酸性条件にするかもしれない場合に、酸条件に接触 し得る酸耐性オリゴマーを含有する医薬処方があると有利であろう。技術および 処方は一般的に、「レミントンの医薬科学（Remington's Pharmaceutical Scien ces）」、マック・パブリッシング社（Mack PublishingCo．）、ペンシルベニア 州、イーストン（Easton，P．A．）の最新版に見い出すことができる。該オリゴ マーの有効成分は、投与様式および投与形態の性質に応じて、一般的に、充填剤 、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、分解性ポリマー、または滑沢 剤を含有できる希釈剤または賦形剤のごとき担体と組み合わせる。典型的な投与 形態には、錠剤、散剤、懸濁液、乳剤および液剤を含めた液状調製物、顆粒剤、 ならびにカプ セル剤が含まれる。 本発明のオリゴマーは、具体的には、胃の中の状態では通常の薬剤の送達下で ４時間まで、徐放の形態で送達される場合は１２時間までの薬剤の酸性状態への 暴露を必要とする。ある疾患の治療には、これらのオリゴマーを徐放性形態で処 方した方が有利である。出典明示して本明細書の一部とみなすコロンボ（Colomb o）らの米国特許出願第４，８３９，１７７号には、ある好ましい制御された速 度の放出の形態が記載されている。経口投与用には、該オリゴマーは、カプセル 剤、錠剤および液体のごとき遅延放出だけでなく通常放出の経口投与形態に製剤 化される。 これらのオリゴマーは特に局所投与のための調製物の処方に適している、なぜ なら皮膚にはアシッド・マントル（acid mantle）があるため、これらの酸耐性 オリゴマーを含む処方は有利であると分かるであろう。出典明示して本明細書の 一部とみなす米国特許出願第０７／７０７，８７９号に記載されているように、 これらのオリゴマーは皮膚と粘膜を横切るという知見を考慮すれば、これもまた 有利であろう。酸性媒体を含む処方を供給することも望ましいであろう。 局所投与のために、本発明で用いるオリゴマーは、当該分野で一般的に公知の 軟膏、膏剤、点眼剤、ゲルまたはクリームに処方される。 全身投与は、粘膜内または経皮の手段によっても可能であり、または該化合物 は経口投与できる。粘膜内または経皮投与には、浸透されるべき障壁に適当な浸 透剤が該処方に用いられる。このような浸透剤は、一般的に当該分野で知られて おり、例えば、粘膜内投与のための肝汁酸塩およびフシジン酸の誘導体が含まれ る。加えて、活性剤を加えて浸透を容易にすることもできる。粘膜内投与は、例 えば、吸入、または坐薬による投与に適した処方と同様、経鼻用スプレーの使用 により行うことができる。 本発明の理解の補助のために、以下の実施例が含まれ、これらは一連の実験の 結果を記載する。本発明に関連する以下の実施例は、もちろん、本発明を特に限 定ずると解釈されてはならず、本発明のこのような変形は、今公知なものもまた は後で開発されるものも、当業者の権限の中にあって、本明細書で後に請求され る本発明の範囲内にあると考えられる。実施例 実施例１ ２’−Ｏ−メチルアデノシン合成試薬の合成 Ａ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ− ジイソプロピルアミノ−Ｏ−β−シアノエチルホスフィン）−Ｎ−ベンゾイ ルアデノシンの調製 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル-２’−Ｏ−メチル−Ｎ−ベンゾアデノシン （０．７５ｇ；１．０９ミリモル）（バリー・アソシエーツ，インコーポレイテ ッド（Barry Associates，Inc．））を無水の１／１ アセトニトリル／ジイソ プロピルエチルアミンと３回共沸させた。ヌクレオシドを次いで３０ｍｌの無水 アセトニトリルに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（０．５７０ｍ１；３ ．２７ミリモル；３容量）（アルドリッチ（AIdrich））を室温で添加し、次い でクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン（０ ．３８６ｍｌ；１．６４ミリモル；１．５容量）（ＡＢＮ）を添加した。１時間 後５０／４５／５の酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミンを溶出液として用 いたシリカゲルプレート上のＴＬＣにより反応が完結したことが決定された。溶 媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。粗混合物を、予めトリ エチルアミンで処理してシリカの酸性を中和したシリカゲルカラム上で精製した 。生成物を５０／４９／１の酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミンで溶出し た。純粋な画分を溜め、乾燥して４４０ｍｇ（０．４５ミリモル；４１．４％） の生成物を得た。 Ｂ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ− ジイソプロピルアミノーメチルホスフィン）−Ｎ−ベンゾイルアデノシン の調製 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル-２’−Ｏ−メチル−Ｎ−ベンゾイルアデノ シン（１．０ｇ；１．４５ミリモル）（バリー・アソシエーツ，インコーポレイ テッド（Barry Associates，Inc．））を無水の１／１ アセトニトリル／ジイ ソプロピルエチルアミンと３回共沸させた。ヌクレオシドを次いで２０ｍｌの無 水アセト ニトリルに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１．１１ｍｌ；６．４ミリ モル；４．４等量）（アルドリッチ（Aldrich））を室温で添加し、次いでクロ ロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メチルホスフィン（０．５８２ｍ１；３． ２ミリモル；２．２等量）（ＪＢＬサイエンティフィック（JBL Scientific）） を添加した。１時間後、５０／４５／５の酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルア ミンを溶出液として用いたシリカゲルプレート上のＴＬＣにより反応が完結した ことが決定された。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。 粗混合物を、予めトリエチルアミンで処理してシリカの酸性を中和したシリカゲ ルカラム上で精製した。生成物を５０／４９／１の酢酸エチル／ヘキサン／トリ エチルアミンで溶出した。純粋な分画を溜め、乾燥して３４０ｍｇ（０．４１ミ リモル；２８％）の生成物を得た。実施例２ ホスホジエステルヌクレオシジル間結合を有するデオキシアデノシンテトラ マー（化合物１）の調製 標準的ホスホルアミダイト手法を用いてミリゲン（Milligen）８７５０ＤＮＡ シンセサイザーによってテトラマーを合成し脱保護した（例えば、ゲイト，エム ・ジェイ（Gait，M．J．）「オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ（0lig onucleotide Synthesis:A Practical Approach）」、アイアールエル・プレス社 （IRL Press）、１９８４年を参照）。化合物を、ワットマン（Whatmann）ＲＡ ＣII分析カラム上の逆相ＨＰＬＣおよび０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中 のアセトニトリル（「ＡＣＮ」）の勾配（１ｍｌ／分の流速において４０分にわ たる０−３０％ＡＣＮ）を用いて精製した。実施例３ デオキシアデノシンメチルホスホネートテトラマー（化合物２）および２’− Ｏ−メチルアデノシンメチルホスホネートテトラマー（化合物４）の調製 化合物２を、５’−（ジメトキシトリチル）アデノシン−３’−［（Ｎ，Ｎ− ジイソプロピルアミノ）メチル］ホスホノアミトのモノマーを用いて合成した。 固相合成を、以下の修飾をする以外は製造者の忠告に従い、バイオサーチ・モデ ル（Biosearch Model）８７５０ＤＮＡシンセサイザーによってメタクリレート ポリマーの支持台上で行った：モノマーを１００ｍＭの濃度においてアセトニト リル中に溶解した。ＤＥＢＬＯＣＫ試薬（DEBLOCK reagent）とはジクロロメタ ン中の２．５％ジクロロ酢酸をいう。ＯＸＩＤＩＺＥＲ試薬（OXIDIZER reagent ）は、０．２５％水、２５％２，６−ルチジン，７２．５％テトラヒドロフラン 中の２５ｇ／Ｌのヨウ素をいう。ＣＡＰ Ａは、アセトニトリル中１０％無水酢 酸をいう。ＣＡＰ Ｂは、ピリジン中０.６２５％のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピ リジンをいう。カップリング時間は４分まで延長させた。 ジメトキシトリチル基を合成の最後にオリゴヌクレオチドから除去した。 オリゴヌクレオチドを次いで支持体から切断し、脱保護した。支持体が結合し たオリゴヌクレオチドを合成カートリッジから取り出し、スクリュー・トップ（ screw top）のついたガラス製の１ドラムのバイアルの中に入れた。支持体を、 １ｍｌのアセトニトリル／エタノール/ＮＨ4ＯＨ（９／９／１）の溶液により室 温で３０分間処理した。次いで、１ｍｌのエチレンジアミンを反応容器に添加し 、反応を６時間行わせ、完結させた。オリゴヌクレオチドを含む上清を次いで支 持体から除去し、支持体を２ｍｌの１／１ アセトニトリル／水で２回すすぎ、 次いで上清と合した。合した溶液を水で全体の容積が３０ｍｌになるまで希釈し 、約４ｍｌの６Ｎ塩酸で中和した。中和した溶液を、予め１０ｍｌのアセトニト リル、１０ｍｌの５０％アセトニトリル／１００ｍＭ 炭酸水素トリエチルアン モニウム、１０ｍｌの２５ｍＭ 炭酸水素トリエチルアンモニウムで順次平衡化 したウォーターズ（Waters）のＣ−１８セプーパック（Sep-Pak）カートリッジ を用いて脱塩した。反応溶液がカラムを通過した後で、それを３０ｍｌの水で洗 浄した。生成物を次いで５ｍｌの１／１ アセトニトリル／水で溶出した。 オリゴヌクレオチドを逆相カラム（ワットマン（Whatmann）ＲＡＣII）上のＨ ＰＬＣによって、５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム中のアセトニトリルの 勾配によって精製した。 カップリング時間を３分間に延ばして、立体障害２’−Ｏ−メチルモノマー試 薬の適当なカップリングを起こさせる以外は実施例１（Ｂ）の２’−Ｏ−メチル アデノシンのモノマーを用い、化合物２について記載されたように、化合物４を 合成し、脱保護し、精製した。化合物４を、支持体に結合したデオキシアデノシ ン上で合成した。実施例４ アデノシンオリゴリボヌクレオチドテトラマーの調製（化合物３） オリゴリボヌクレオチドテトラマー（化合物３）を、５’−Ｏ−ジメトキシト リチル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジ イソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイトアデノシン（ミリポア（Mi llipore））を用いて合成した。合成は、カップリングの時間を１２分間にまで 延ばし、より立体障害の２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルＲＮＡモノ マーが反応するようにする以外は標準的なミリゲン（Milligen）ホスホルアミダ イド法により、ミリゲン（Milligen）８７５０自動ＤＮＡシンセサイザーを用い て、１μｍｏｌｅのスケールで行われた。合成は、孔を制御したガラスに結合し た２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン（ペニスラ・ラボラト ーリーズ（Pennisul aLaboratories））上で行われた。全ての他のオリゴヌクレ オチド合成試薬はミリゲン（Milligen）の標準的プロトコールによって記載され た通りである。合成後、オリゴリボヌクレオチドは、滅菌された、ＲＮａｓｅの 無い状態で扱われた。水を０．５％ジエチルピロカーボネートによる一晩の処理 の後オートクレーブすることによって滅菌した。全てのガラス製品は３００℃で 少なくとも４時間加熱処理した。該オリゴヌクレオチドを、最初に、支持体に結 合したオリゴマーを３／１ 水酸化アンモニウム／エタノールで１５時間５５℃ において処理することにより脱保護し、支持体から切断した。オリゴヌクレオチ ドを含む上清を、次いでデカントし、乾燥乾固した。得られた残渣を次いで室温 において２４時間テトラヒドロフラン（５％またはそれ以下の水を含有する）（ アルドリッチ（Aldrich））中の０．６ｍｌの１Ｍ フッ化テトラブチルアンモ ニウムによって処理した。該反応を０．６ｍｌの２Ｍ酢酸トリエチルアンモニウ ム水溶液、ｐＨ７の添加によって冷却した。反応混合物の脱塩は、滅菌水を用い て該溶 液を１０ＤＧカラム（バイオラッド（Bio-Rad））に通すことにより行なった。 脱塩したオリゴヌクレオチドを、次いで乾燥した。該化合物を化合物１について 記載されるのと同様にＨＰＬＣにより精製した（実施例２参照）。実施例５ ホスホジエステルヌクレオシジル間結合を有する２’−Ｏ−メチルアデノシンオ リゴチドテトラマーの調製 該オリゴヌクレオチドは、カップリング時間を４分まで延長し、より立体障害 の２’−Ｏ−メチル試薬の適当なカップリングを起こさせること以外は、化合物 １について記載されたように合成し、脱保護し、精製した。該化合物を、支持体 に結合したデオキシアデノシン上で合成した。実施例Ａ オリゴマーの酸安定性の決定 胃のｐＨを刺激する酸性条件下で、化合物１ないし５の相対的安定性を測定し た。該化合物を塩化水素の水溶液、ｐＨ１で処理し、時間に対するグリコシド結 合の切断の速度は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラム上の消化生成物アデニンの出現 によって決定された。 逆相ＨＰＬＣ分析はベックマン・システム・ゴールド（Beckman SystemGold） ＨＰＬＣモデル１２６ポンプ、モデル１６８フォトジオドアレイ検出器、および モデル５０７のオートインジェクターで行われた。ワットマン（Whatman）ＲＡ ＣIIＯＤ３（１００×４．６ｍｍ）分析カラムを分析のために用いた。用いられ た溶媒系は、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液、ｐＨ７中のアセトニ トリルの勾配であった。勾配は１０分間にわたり０ないし２％のアセトニトリル であって、次の１０分間では２ないし６０％のアセトニトリルであった。勾配が 次いで０％アセトニトリルに戻りカラムを次の注入のために平衡化した。液速は １ｍｌ／分であった。この勾配はアデニンを出発物質および種々の副産物からき れいに分けた。 ０．１Ｍ塩酸、ｐＨ１．０５の１００ｍｌのストックを滅菌水中に調製し（滅 菌方法は上記参照）、アデニンの溶出液が、ベースラインの干渉を受けていない 領 域を確かめるためにＨＰＬＣ分析した。該ベースラインは所望の領域で干渉を受 けていなかった。 テトラマーの脱プリンの速度を、次いで、１０．Ｄ．単位260を注入される体 積である１１０μｌで溶解して、０時間の点を得ることにより決定した。その後 １０μｌの試料を各々０．５時間おきに（化合物１および２）、または１時間お きに（化合物３ないし５）自動的に採取した。結果を以下の表Ｉに掲げる。 図１はテトラマーに対する無傷のアデノシンの％対時間のプロットを示す。図 ２は無傷のアデノシンの％の対数対時間のプロットを示す。該対数プロットから 、テトラマーの脱プリンの速度のｋA’及び半減期が計算される。表１はホスホ ジエステル対照と比較した場合のこれらの数値ならびに脱プリンの相対速度を含 む（化合物１）。 この結果は、２’−Ｏ−メチルアデノシニルメチルホスホネートがホスホジエ ステルデオキシアデノシンまたはメチルホスホネートデオキシアデノシンのアナ ログのいずれよりも大いに安定（１７５×）であることを明白に示している。２ ’ −Ｏ−メチルアデノシニルメチルホスホネートについて明白な小さい脱プリン値 は、２’−ＯＭｅ−アデノシニルの代わりのデオキシアデノシニル残基である３ ’−末端のヌクレオシドに起因しているということが最もありそうなことである が、これは支持にはならない。脱プリンの速度の違いを示すために、ｐＨ１にお ける処理の４時間後、約３３％のホスホジエステルデオキシアデノシン、メチル ホスホネートデオキシアデノシンのうち７％のみ、および２’−Ｏ−メチルアデ ノシンメチルホスホネートのちょうど０．２８％が脱プリンされた。 大変驚くべき観察は、メチルホスホネートデオキシアデノシニルテトラマーの 安定性であった。グリコシド結合に対するホスホネート骨格の安定化効果は予期 せぬことであった。実施例Ｂ ３７℃におけるオリゴマーの酸安定性の決定 化合物１ないし４の相対する安定性が、３７℃に維持された熱ブロックを用い て実施例Ａに述べられたごとく決定された。 結果を以下の表IIに示す。 図３は、ｐＨ１．０、３７℃におけるアデノシニルテトラマーの、時間に対す る％脱プリンとしてプロットした脱プリン速度を示す。図４は、時間に対する％ 脱プリンの対数としてプロットしたｐＨ１．０、３７℃におけるアデノシニルテ トラマーの脱プリン速度を示す。図５は、（２’−Ｏ−メチルＡ）3（ｄＡ）− メチルホスホネートオリゴマーについてのｐＨ１．０、３７℃の酸性条件に対す るメチルホスホネートの骨格の安定性を示す。条件は、０．１Ｍ ＨＣｌ中０． ３ｍＭのオリゴマー、３７℃、ｐＨ１．０であった。検出の限界は０．２％；誤 差≦２％。アデニニルを有する種類の全体と比較した遊離アデニンの増加と、こ れに続くＨＰＬＣにより速度が決定された。データは脱プリン、および２’−Ｏ −メチルアデノシニルメチルホスホネートオリゴマーに対する３’−末端のデオ キシアデノシンの切断に対し補正された。実施例Ｃ オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチシドメチルホスホネートの酸安定性 オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドメチルホスホネート（Ａ）が、適 当な保護された２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドメチルホスホンアミダイトの シントンを用いて調製された。以下の注釈において、Ｎmは２’−Ｏ−メチルリ ボヌクレオシドを示し、下線はメチルホスホネート結合の位置を示す。該オリゴ マーの５’−ヌクレオチド間結合はホスホジエステル結合である。該オリゴマー は酢酸で緩衝化されたピリジン中のヒドラジン水和物で連続して処理して脱保護 し、次いで９５％エタノール中のエチレンジアミン溶液（１：１ 体積／体積） で処理した。該オリゴマーをＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーで精製し、 次いでＣ−１８逆相カラム上で調製用ＨＰＬＣによって精製した。 オリゴマーＡはポリヌクレオチドキナーゼおよびガンマー［32Ｐ］−ＡＴＰを 用いてリン酸化された。リン酸化されたオリゴマーを次いで０．１Ｎ ＨＣｌと インキュベートするか、または３７℃において一晩（〜１４時間）０．１Ｎ Ｈ Ｃｌとインキュベートした。該オリゴマーを次いで変性条件下でポリアクリルア ミドゲル電気泳動により分析した。これらの状態ではオリゴマーの分解は検出さ れなかった。本発明者らの経験によれば、３７℃において一晩０．１Ｎ ＨＣｌ と、または３７℃において数時間１．０Ｎ ＨＣｌとデオキシリボヌクレオシド メチルホスホネート（Ｂ）をインキュベートすることによってＧまたはＡヌクレ オンドにおいてかなりの脱プリンを引き起こす。この脱プリンに続いてメチルホ スホネート結合の自発的加水分解が起こり、これはより短鎖長オリゴマーの生産 を引き起こす。過去の経験によって、（Ｃ）のごときオリゴデオキシリボヌクレ オチドのプリン残基は酸触媒脱プリンに対しよりいっそう感受性が強いことが示 されていた。 これらの実験の結果は、それゆえ、オリゴー２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシ ドメチルホスホネート中のプリンヌクレオシドは、オリゴデオキシリボヌクレオ シドメチルホスホネートまたはオリゴデオキシリボヌクレオシド中の対応するプ リンヌクレオシドよりもはるかに酸触媒脱プリンに対し耐性があるということを 示唆する。オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドメチルホスホネートの酸 触媒脱プリンに対する顕著な耐性は、特に、もしこれらのオリゴマーが経口投与 されるならば、重要な治療的結果をもたらす可能性がある。実施例Ｄ オリゴー２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドメチルホスホネートの相補的ＤＮＡ およびＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーション オリゴマー２のハイブリダイゼーション特性が決定され、オリゴマー１および３ のそれらと比較された。相補的な一本鎖ＤＮＡ標的ＤまたはＲＮＡ標的Ｅに対 するハイブリダイゼーションが１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２ｍＭＥ ＤＴＡを含有する緩衝液中で行われた。得られた融解曲線および融点は図６およ び図７に示されている（注意：これらの図において、Ｎmは２’−Ｏ−メチルリ ボヌクレオシドを表す）。オリゴデオキシリボヌクレオチド１は、ＤＮＡおよび ＲＮＡ標的の両方と安定なハイブリッドを形成した。オリゴー２’−Ｏ−メチ ルリボヌクレオシドメチルホスホネート２はＤＮＡ標的とはハイブリダイズしな かったが、ＲＮＡ標的とは非常に安定なデュープレックスを形成した。この挙動 は、、オリゴデオキシリボヌクレオシドメチルホスホネート３がＤＮＡ標的と安 定なデュープレックスを形成するがＲＮＡ標的とは非常に弱いデュープレックス しか形成しないことと対照的である。これらの結果はオリゴー２’−Ｏ−メチル リボヌクレオシドメチルホスホネートが、オリゴデオキシリボヌクレオシドメチ ルホスホネートよりも、ＲＮＡとより安定なハイブリッドを形成することができ ることと、それゆえ標的が細胞またはウイルスのＲＮＡである場合にそれらがよ り有効なアンチセンス試薬であることを示唆する。 Detailed Description of the Invention     Oligonucleotides modified to increase stability at acidic pHCross-reference of related applications   This application is filed on October 28, 1986 (cited as a part of this specification) U.S. Patent Application No. 06 / 924,234, which is a co-pending application, is a part-pending application 1990 Partially pending application of US Patent Application No. 07 / 558,338 filed on July 27, 2013 is there.BACKGROUND AND SUMMARY OF THE INVENTION   The present invention is directed to providing oligomers that provide increased stability at acidic pH. Methods, methods of delivering such oligomers to their site of action, and oral administration. Or in use in formulations for other dosage forms in which resistance to acid is advantageous It   Depurination of deoxyribonucleic acid (DNA) under acidic conditions (glycine between base and sugar Loss of purine bases from nucleosidyl units through cleavage of coside bonds) (Hevesi, L) et al., Journal of American ・ Chemical Society (J. Amer. Chem. Soc.), 94, 4715-472 0 (197)). Oral delivery of therapeutic oligodeoxyribonucleotides Up to about 4 hours under normal conditions of delivery and up to about 12 hours under sustained release drug delivery. Would require exposure of the stomach to acidic conditions (pH 1) (see, for example, US Pat. 4,839,177). Oral due to its lack of stability in acidic conditions A sufficient amount of the administered oligodeoxynucleotide remains intact and effective Is unlikely. Ribonucleic acid (RNA) is reportedly the DN It is reported to be more stable to depurination under acidic conditions than the A counterpart. This is due to the apparent stability of the 2'-hydroxyl of the glycosidic bond between the sugar and the base. This is due to the activating effect (Hevesi. L. et al., Supra).   RNA may be resistant to depurination under acidic conditions but is present in biological material Its sensitivity to existing universal nucleases limits its therapeutic utility . In addition, the intrinsic instability of the molecule from neutral to slightly basic states In order to The use of oligoribonucleotides in unmodified form as a drug is not feasible. There is no sea urchin.   Unfortunately, by replacing the phosphate bond with a methylphosphonate, nuclea The protection of RNA against the enzyme is not possible. Because 2'-hydroxyl of sugar Because it rapidly cleaves the methylphosphonate skeleton.Summary of the invention   The present invention is directed to nucleosides with acid-resistant forms of preselected base sequences. A method of supplying oligomers of In one aspect of the invention, A ligomer is provided, where the nucleosidyl unit is a 2'-O-alkyl ribosyl unit. It has a sugar moiety that is a diol group. Preferably the oligomer is essentially neutral. Good Preferable is one having an internucleoside bond of methylphosphonate, which is more preferable. More preferably, about 50 to about 100% of the internucleoside bonds are methylphosphonese. That is a bond. A preferred 2'-O-alkylribosyl group is 2'-O- Contains a methylribosyl group.   According to another aspect, the oligomer supplied in acid resistant form is methylphosphonate. Consisting of internucleoside linkages, preferably about 50% to about 100% methylphore. It consists of suphonate bonds.   In an additional aspect, the invention provides that the oligomer is suitable for oral administration and is A nucleocidyl unit having a preselected base sequence that is resistant to solution The present invention relates to a method for preparing an oligomer having a position. In one aspect, the method comprises 2'-O. A sugar moiety which is an -alkylribosyl group, more preferably a 2'-O-methylribosyl group It consists of synthesizing an oligomer using nucleosidyl units having minutes. Good Advantageously, the oligomer is substantially neutral. More preferably, the oligomer is It is synthesized to have intertilde phosphonate nucleoside units.   Alternatively, the method has a methylphosphonate internucleoside linkage. Consists of synthesizing an oligomer. Especially preferred is about 50 percent to It is an oligomer having about 100 percent internucleoside units.   In a further embodiment, the present invention provides oligomers for therapeutic purposes in mammals. A method for oral delivery, wherein the oligomer is a nucleoside having a purine base. The method comprises the administration of acid-resistant oligomers, which consist of zircon units. This aspect In one embodiment, the acid resistant oligomer is a 2'-O-alkyl ribosyl group. , More preferably a nucleoside having a sugar moiety consisting of a 2'-O-methylribosyl group. It consists of sigil units. Preferably the oligomer is substantially neutral. Preferred Acid-resistant oligomers are oligos with methylphosphonate internucleoside linkages. And more preferably about 50 to about 100 percent of the nucleoside linkages. Is a methylphosphonate bond. In a particularly preferred embodiment, the acid resistance The oligomer is administered in a controlled release form.   Among other factors, the present invention relates to sugar moieties that are 2'-O-alkylribosyl groups. Includes a nucleoside unit containing a methylphosphonate internucleoside bond. The resulting oligomers are capable of acid-catalyzed depurination and subsequent hydrolysis. It is based on our surprising discovery of advantageous resistance.   2'-O-alkyl ribosyl group and methylphosphonate nucleosidyl bond Oligomer consisting of a nucleoside-containing unit with a corresponding 2'-deoxy RNA target molecules and more stable dunes than ribonucleoside methylphosphonates. It is also believed that it seems to form a plex.   In a further aspect, the invention provides a controlled release rate of the invention. A pharmaceutical composition comprising an acid resistant oligomer. Instead of acid resistant oligomers A pharmaceutical composition consisting of: It may be exposed to acidic conditions during manufacture or storage.Definition   As used herein, the following terms have the following meanings, unless otherwise indicated: Have.   The term "purine" or "purine base" refers to naturally occurring adenine and guanine. Not only bases, but also modified bases such as bases substituted at the 8-position , Or a guanine analog modified at the 6-position or an adenine analog Carbon at the 9-position, such as logs, 2-aminopurine, and 9-deazapurine derivatives Substitution Also included are purine analogs having primes and other purine analogs.   The term "nucleoside" is a nucleosidyl unit and is interchangeably Used to refer to a nucleic acid subunit consisting of a 5-carbon sugar and a nitrogen-containing base. The The term includes those nucleosides having A, G, C, T and U as their bases. Not only the pseudo-isolation unit but also the pseudo-isocytosine and pseudo-uracil and (8-substituted purine Analogs of natural bases, including pyrimidine analogs such as other modified bases And modified forms are also included. In RNA, the 5-carbon sugar is ribose. In DNA, it is 2'-deoxyribose. The term nucleoside Include those with modified sugars such as 2'-O-alkylribose? Other analogs of subunits are also included. [Wherein R is hydrogen or an alkyl or aryl group]. Appropriate Do not sterically hide the phosphonate bond on the alkyl or aryl group, or Include those that do not interact with each other. The phosphonate group may be "R" or May exist in any of the "S" conformations. The phosphonate group is a nucleo For use as a phosphorus group bridge (or bond) between nucleosides that binds sidyl units Can be ] [In the formula, the phosphodiester group is a nucleoside that binds a nucleosidyl unit. It is used as a phosphorus group bridge (or bond) between the two. ].   "Non-nucleoside monomer unit" means a base, sugar and / or liquor in the unit. A monomer unit in which the skeleton is replaced by another chemical group.   "Nucleoside / non-nucleoside polymer" means nucleoside and non-nucleoside A polymer composed of nucleoside monomer units.   The term "oligonucleoside" or "oligomer" refers to about 100 nucleosides. Generally, about 4 to about 100 nucleosides, which may exceed the length of the reoside A long chain of nucleosides linked by internucleoside linkages that are long. They can also be obtained by enzymatic methods, but usually nucleosides Synthesized from monomers. Therefore, the term "oligomer" refers to the nucleoside model It refers to a chain of oligonucleosides having internucleoside linkages that attach the nomers. Tasted and thus oligonucleotide, nonionic oligonucleoside alkyl -And aryl-phosphonate analogs, oligonucleotide alkyl- And aryl-phosphonothioates, phosphorothioates or phosphoroditi Oate analogs, oligonucleotide phosphoramidate analogs, Suphotriester and other oligonucleoside analogs and modified oligonuclides Neutral phosphate esters, oligonucleosides, analogs such as cleosides Nucleoside / non-nucleoside polymers are also included. Also , The phrase includes one or more phosphorus group bonds between monomer units Acetal bond, thioform acetal bond, sulfamate bond or cal bond Nucleosides / nucleoties replaced by non-phosphorus bonds such as bamate bonds Dopolymers are also included. In addition, both the sugar and phosphorus groups are Replaced with a Reno base analog or a polyamide base analog. Also included are modified nucleoside / non-nucleoside polymers. Also, It includes non-nucleoside bases, sugars, and phosphate backbones. A nucleoside group has been replaced or a non-nucleoside group is present in the nucleoside. Nucleoside / either inserted into the non / nucleoside polymer Non-nucleoside polymers are also included. Optionally, the non-nucleoside group is , Can interact with the target sequence or alter uptake into target cells. It can also serve to bind to other small molecules capable of   The term "alkyl- or aryl-phosphonate oligomer" is less With one alkyl- or aryl-phosphonate-nucleoside bond It means an oligomer having. Suitable alkyl- or aryl phosphonate groups Do not sterically hide the phosphonate bond or interact with each other Alkyl- or aryl-groups are included. Preferred alkyl groups have about 1 Lower alkyl groups having about 6 carbon atoms are included. Suitable aryl group Has at least one ring with a conjugated π-electron system and is optionally substituted And preferably a carbocyclic aryl group having up to about 10 carbon atoms And heterocyclic aryl groups are included.   The term "methylphosphonate oligomer" (or "MP-oligomer") Is an ori- nate having at least one methylphosphonate-nucleoside bond. Gomer.   The term "neutral oligomer" refers to a nonionic nuclei between nucleoside monomers. Have interosidyl bonds (ie, bonds that do not have a positive or negative ionic charge) An oligomer, for example, an alkyl- or aryl-phosphonate bond, Rualkyl- or aryl-phosphonothioate, and phosphotriester bonds , Especially of neutral phosphate ester bonds such as neutral ethyl triester bonds. Sometimes internucleoside linkages; as well as sulfamate, morpholino, form Non-phospho, such as acetal, thioform acetal and carbamate linkages Oligomers having lath-containing internucleoside linkages are included. If desired Neutral oligomers are oligonucleosides or nucleoside / non-nucleoside It may consist of a conjugate between a polymer and a second molecule which is a binding partner. Such binding partners include intercalating agents, alkylating agents, cell surface receptors. Photo-crosslinking such as binding substrates for lipophilic agents, lipophilic agents, and psoralen It may consist of a nucleic acid modifying group containing an agent, a group capable of cleaving a target site of nucleic acid, and the like. Such a binding partner may further improve the uptake of the oligomer. And can modify the interaction of the oligomer with the target sequence, or , The pharmacokinetic distribution of the oligomer can be changed. Essentially required Is the oligonucleoside or nucleoside that constitutes the oligomer conjugate. / The non-nurenooside polymer is substantially neutral.   The term "substantially neutral" refers to the nucleosides between the nucleoside monomers. An oligomer in which at least about 80% of the bonds are nonionic.   The term "neutral alkyl- or aryl-phosphonate oligomer" refers to Neutral nucleotide consisting of at least one alkyl- or aryl-phosphonate bond A neutral oligomer having an osidyl bond.   The term "neutral methylphosphonate oligomer" refers to at least one methyl A neutral oligomer having a nucleoside bond composed of phosphonate bonds .   The term "acid-resistant" refers to N-glycol as compared to deoxyribooligonucleotides. An oligomer that is resistant to acid-catalyzed depurination by hydrolysis of cosyl bonds .   The term "triplet" or "triad" refers to one base (if Single-stranded) or multiple bases (if double-stranded), second-stranded bases and Third-strand base (if target sequence is single-stranded) or third-strand base (if A hydrogen-bonded complex of three nucleoside bases between (if the target is a duplex) .Brief description of the figure   FIG. 1 shows methylphosphine having RNA, DNA and 2'-O-methylribosilane Oligomers consisting of phonate oligomers and methylphosphonate oligomers FIG. 6 is a plot of percent intact adenine versus time of day;   FIG. 2 shows intact adenylation for the same oligomers plotted in FIG. FIG. 3 is a plot of the log of the percent of logarithm versus time.   FIG. 3 is an oligomer having RNA, DNA and 2'-O-methylribosyl units. And oligomers consisting of methylphosphonate oligomers at 37 ° C FIG. 5 is a plot of percent depurination versus time in a mouse.   FIG. 4 shows the same oligomers plotted in FIG. 3 at 37 ° C. FIG. 6 is a plot of the log of depurination versus log versus time.   FIG. 5 shows a polymer having 2'-O-methylribosyl units at 37 ° C. and pH 1. FIG. 6 is a plot of intact scaffold versus time for tylphosphonate oligomers. .   FIG. 6 shows oligodeoxyribonucleotides (1) 2'-O-methylribosyl Methylphosphonate oligomer having units (Two) And deoxyribosyl monohydrate Methylphosphonate oligomer (Three) Oligomers and DN A FIG. 6 is a melting curve diagram for hybridization with a target.   FIG. 7 shows hybridization of RNA targets with the same oligomers as in FIG. It is a figure of the melting curve of.   FIG. 8 shows (a) oligo-2'-O-methyl-ribonucleoside methylphosphone. , (B) oligoteoxyribonucleoside methylphosphonate, and (c ) Is a diagram of an example of a dimer consisting of oligodeoxyribonucleosides.Detailed Description of the Invention Preferred oligomers   The oligomers of the invention are independently selected from 2'-O-alkylribosyl groups. A nucleosidyl unit having a sugar moiety. Suitable is 1 to 5 carbons It is an alkyl group of an atom. A particularly preferred nucleoside is 2'-O-methylribosi It has a group.   Oligomeric chains with selected internucleoside linkages can be prepared by synthetic techniques known to those skilled in the art. It can be conveniently prepared by surgery. For example, phosphodiester and others For the synthesis of an oligomer having a phosphorus-containing internucleoside linkage having a certain Vessels, reagents and protocols are available ((Gait, MJ, Gait, M. J. ) "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" hesis: A Practical Approach) ", IRL Press, 1984; Cohen, Jack S. "Origin of gene expression" Godeoxyribonucleotide Antisense Inhibitor tors of Gene Expression) ”, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL, Lida, 1989; and “Oligonucle Oligonucleotides and Analogues; A  Practical Approach ”, edited by F. Eckstein, 1991. See also). Oligomer with certain non-phosphorus containing internucleoside bonds Of US Pat. No. 5,142,0 (which is hereby incorporated by reference). No. 47.   Preferred are oligomers that are substantially neutral.   In a particularly preferred embodiment, these oligomers are methylphosphonate nuclei. It has an inter-osidyl bond. More preferably, all internucleoside linkages are methyl. It is a phosphonate bond. Methylphosphonate internucleoside linkages and other nucleosides Oligomers with a mixture of inter-leosidyl bonds are preferred for certain therapeutic indications However, it is intended to be within the scope of the present invention.   Preferably, the oligomer consists of about 4 to about 40 nucleosides, more preferably Preferably it consists of about 6 to 30 nucleosides. Particularly preferred is about 8 to It is an oligomer of about 20 nucleosides.Utility and administration   The oligomers provided herein target a target such as a nucleic acid with high selectivity. A high affinity complex can be formed with the sequence or protein. For example, Derived oligomers can be crosslinked (psoralens) or one Or by cleavage of both strands (EDTA) binds to the target site in the nucleic acid and then It can be used to reversibly modify. Careful targeting site for cleavage Depending on the selection, one of the strands is used as a molecular scissor to specifically select the selected nucleic acid sequence. It can be used to cut into.   The oligomers provided herein irreversibly modify, degrade, and destroy nucleic acids. Then reacts with the nucleic acid fragment or its target sequence that irreversibly inhibits its function. To include nucleic acids that react with or modify groups that can be scraped Can be derivatized.   These oligomers are specific genes that are identical to those in living cells. Alternatively, it selectively inactivates, inhibits, or alters the expression of the target sequence to selectively inactivate expression. Allows sexualization, inhibition or alteration. The target sequence is DNA or some mRNA RNA such as the precursor mRNA thereof. mRNA target sequence is the start codon Region, polyadenylation region, mRNA cap site or splice junction contains. These oligomers produce incomplete or unwanted products Permanently inactivate genes that cause unwanted effects when activated or Can also be used to sexualize, turn off expression, or disrupt It   The oligomers provided herein are duplicates with transcribed regions of nucleic acid. Form a stable association form of a Rex or triple helix complex or other form As such, these complexes have potential in “antisense” or triple-strand therapy. It is for. As used herein, “antisense” therapy refers to in vitro (in v undesired DNA or RNA sequences in vitro or in vivo Is a generic term that includes the use of specific binding oligomers to inactivate.   Many diseases and other diseases are caused by the presence of unwanted DNA or RNA Characterized, in some cases it is single-stranded, in other it is double-stranded . These diseases and disorders are commonly known in the art as antisense cures. It can be treated using the principle of medical treatment. Antisense therapy is complementary or otherwise Specific binding means (in the case of the present invention, the duplex or triplex (By formation of a helix complex) to target specific DNA or RNA target sequences. Including targeting.   The oligomers used in the present invention can be administered alone or in adjacent or Antisense with distant targets or combined effects with the general mechanism described above Depending on the mechanism, a combination of oligomers can be administered.   Therapeutic applications include administration in a variety of modes including oral, topical or topical administration. The oligomer can be formulated. During manufacture, or such prescription itself, the By the predominant condition (eg, acid mantle on the skin) Contact with acidic conditions, where it may be to some extent to be compatible It would be advantageous to have a pharmaceutical formulation containing a possible acid resistant oligomer. Technology and Prescriptions are commonly referred to as "Remington's Pharmaceutical Sciences. ces) ", Mack Publishing Co., Pennsylvania It can be found in the latest edition of Easton, PA. The oligo The active ingredient of the mer, depending on the mode of administration and the nature of the dosage form, is generally a bulking agent. , Extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, degradable polymers, or lubricants Combined with a carrier such as a diluent or excipient that can contain an agent. Typical administration Forms include liquid preparations, including tablets, powders, suspensions, emulsions and solutions, granules, And cap Includes cell agents.   The oligomers of the invention are specifically under the delivery of drugs that are normal in the stomach. Up to 4 hours, up to 12 hours if delivered in sustained release form Requires exposure. These oligomers are treated in sustained release form to treat certain disorders. It is more advantageous. Colombo (Colomb) o) et al., in U.S. Pat. No. 4,839,177, discloses a preferred controlled speed. Modes of release are described. For oral administration, the oligomer is a capsule Formulated in oral as well as delayed-release oral dosage forms such as drugs, tablets and liquids Be converted.   Why are these oligomers especially suitable for formulating preparations for topical administration? The skin has an acid mantle, so these acids are resistant Formulations containing oligomers will prove advantageous. Specified source of this specification As described in commonly assigned U.S. patent application Ser. No. 07 / 707,879, Considering the finding that these oligomers cross the skin and mucous membranes, this too Would be advantageous. It may also be desirable to provide a formulation that includes an acidic medium.   For topical administration, the oligomers used in the invention are generally known in the art. Formulated in ointments, salves, eye drops, gels or creams.   Systemic administration can also be by intramucosal or transdermal means, or the compound Can be administered orally. For intramucosal or transdermal administration, an appropriate immersion in the barrier to be penetrated A penetrant is used in the formulation. Such penetrants are generally known in the art. And include, for example, hepatic hydrate and fusidic acid derivatives for intramucosal administration. It In addition, active agents can be added to facilitate penetration. Intramucosal administration is an example Use of nasal sprays as well as formulations suitable for inhalation or suppository administration, for example Can be done by.   To assist in understanding the invention, the following examples are included, which are included in a series of experiments. Describe the results. The following examples, which are relevant to the present invention, are of course not particularly limited to the invention. It should not be construed as definite, and such variations of the invention may also be presently known. What is later developed is within the purview of one of ordinary skill in the art and is claimed later in this specification. It is considered to be within the scope of the invention.Example Example 1 Synthesis of 2'-O-methyladenosine synthetic reagent A.5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-3'-O- (N, N-     Diisopropylamino-O-β-cyanoethylphosphine) -N-benzoi     Preparation of luadenosine     5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-N-benzoadenosine (0.75 g; 1.09 mmol) (Barry Associates, Inc. (Barry Associates, Inc.) anhydrous 1/1 acetonitrile / diiso It was azeotroped 3 times with propylethylamine. The nucleoside is then added to 30 ml of anhydrous It was dissolved in acetonitrile. Diisopropylethylamine (0.570m1; 3 ． 27 mmol; 3 vol) (AIdrich) was added at room temperature, then And chloro-N, N-diisopropylamino-β-cyanoethoxyphosphine (0 ． 386 ml; 1.64 mmol; 1.5 vol) (ABN) was added. 1 hour After that use 50/45/5 ethyl acetate / hexane / triethylamine as eluent The reaction was determined to be complete by TLC on a silica gel plate. Melting The medium is evaporated, the residue is dissolved in dichloromethane and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution is added. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The crude mixture was previously Purified on silica gel column treated with ethylamine to neutralize silica acidity . Elute the product with 50/49/1 ethyl acetate / hexane / triethylamine It was Pure fractions were pooled and dried to 440 mg (0.45 mmol; 41.4%). The product was obtained. B.5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-3'-O- (N, N-     Diisopropylamino-methylphosphine) -N-benzoyladenosine     Preparation of     5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-N-benzoyl adeno Shin (1.0 g; 1.45 mmol) (Barry Associates, Inc. Ted (Barry Associates, Inc.) with anhydrous 1/1 acetonitrile / diy Azeotroped with Sopropylethylamine three times. The nucleoside is then added to 20 ml of neat Water aceto Dissolved in nitrile. Diisopropylethylamine (1.11 ml; 6.4 mm Mole; 4.4 eq) (Aldrich) was added at room temperature and then black. R-N, N-diisopropylamino-methylphosphine (0.582m1; 3. 2 mmol; 2.2 equivalents) (JBL Scientific) Was added. After 1 hour, 50/45/5 ethyl acetate / hexane / triethyl ether. Reaction complete by TLC on silica gel plate with min as eluent It was decided. The solvent was evaporated, the residue dissolved in dichloromethane and saturated carbonate It was washed with an aqueous solution of sodium hydrogen and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The crude mixture was previously treated with triethylamine to neutralize the acidity of the silica. Purified on a column. The product was converted to 50/49/1 ethyl acetate / hexane / tri Elute with ethylamine. The pure fractions were pooled, dried and 340 mg (0.41 Limol; 28%) was obtained.Example 2   Deoxyadenosine tetra with a phosphodiester internucleoside bond   Preparation of mer (compound 1)   Milligen 8750 DNA using standard phosphoramidite techniques Tetramers were synthesized and deprotected by a synthesizer (eg, Gate, M ・ Jay (Gait, MJ) “Oligonucleotide synthesis: Practical approach (0lig nucleotide Synthesis: A Practical Approach) ", IRL Press (IRL Press), 1984). Whatman RA Reversed phase HPLC on a CII analytical column and in 0.1 M triethylammonium acetate. Acetonitrile (“ACN”) gradient (40 min at a flow rate of 1 ml / min). Purification was carried out using 0-30% ACN).Example 3   Deoxyadenosine methylphosphonate tetramer (Compound 2) and 2'-   Preparation of O-methyladenosine methylphosphonate tetramer (Compound 4)   Compound 2 was converted to 5 '-(dimethoxytrityl) adenosine-3'-[(N, N- It was synthesized using a monomer of diisopropylamino) methyl] phosphonoamito. Solid-phase synthesis was performed according to the manufacturer's advice, except for the following modifications. (Biosearch Model) Methacrylate by 8750 DNA synthesizer Performed on polymer support: monomer at 100 mM concentration of acetonite Dissolved in Lil. What is DEBLOCK reagent? 2.5% dichloroacetic acid in water. OXIDIZER reagent ) Is 0.25% water, 25% 2,6-lutidine, 72.5% tetrahydrofuran 25 g / L of iodine in the medium. CAP A is 10% anhydrous vinegar in acetonitrile Refers to acid. CAP B is 0.625% N, N-dimethylaminopyrrole in pyridine. Refers to lysine. Coupling time was extended to 4 minutes.   The dimethoxytrityl group was removed from the oligonucleotide at the end of the synthesis.   The oligonucleotide was then cleaved from the support and deprotected. The support is bound Removed the oligonucleotide from the synthesis cartridge, screw top ( It was placed in a glass one-drum vial with a screw top). The support 1 ml of acetonitrile / ethanol/NHFourChamber with a solution of OH (9/9/1) Heated for 30 minutes. Then add 1 ml ethylenediamine to the reaction vessel The reaction was allowed to complete for 6 hours. The supernatant containing the oligonucleotide is then Remove from support and rinse support twice with 2 ml 1/1 acetonitrile / water, It was then combined with the supernatant. Dilute the combined solution with water to a total volume of 30 ml. , Neutralized with about 4 ml of 6N hydrochloric acid. 10 ml of acetonite was added to the neutralized solution in advance. Ril, 10 ml of 50% acetonitrile / 100 mM triethylamine bicarbonate Sequentially equilibrate with monium and 10 ml of 25 mM triethylammonium hydrogen carbonate. Waters C-18 Sep-Pak Cartridge Was used to desalt. After the reaction solution has passed through the column, wash it with 30 ml of water. Clean The product was then eluted with 5 ml of 1/1 acetonitrile / water.   The oligonucleotide was loaded onto the reverse phase column (Whatmann RACII) with H The amount of acetonitrile in 50 mM triethylammonium acetate was measured by PLC. Purified by gradient.   By extending the coupling time to 3 minutes, the sterically hindered 2'-O-methyl monomer test was performed. 2'-O-Methyl of Example 1 (B), except for proper coupling of the drug. Compound 4 was used as described for Compound 2 with the monomer of adenosine. Synthesized, deprotected and purified. Compound 4 is a support-bound deoxyadenosine derivative. It was synthesized on.Example 4 Preparation of adenosine oligoribonucleotide tetramer (compound 3)   The oligoribonucleotide tetramer (compound 3) was treated with 5'-O-dimethoxide. Lityl-2'-O-tert-butyl-dimethylsilyl-3'-ON, N-di Isopropyl-β-cyanoethyl phosphoramidite adenosine (Millipore (Mi llipore)). Syntheses up to 12 minutes coupling time Extended and more sterically hindered 2'-O-tert-butyldimethylsilyl RNA mono Standard Milligen phosphoramida, except to allow the mer to react Using the Milligen 8750 automated DNA synthesizer by the Id method , On a 1 μmole scale. Synthetic bonded to glass with controlled pores 2'-O-tert-butyldimethylsilyladenosine (Penisula Laborato It was performed on the Lees (Pennisul a Laboratories). All other oligonuclides Otide synthesis reagents are described by Milligen's standard protocol. That's right. After synthesis, oligoribonucleotides are sterilized and I was treated without it. Treatment of water with 0.5% diethylpyrocarbonate overnight After that, it was sterilized by autoclaving. All glass products at 300 ° C Heat treated for at least 4 hours. The oligonucleotide is first bound to a support. Combined oligomers in 3/1 ammonium hydroxide / ethanol for 15 hours at 55 ° C It was deprotected by treatment in C. and cleaved from the support. Oligonucleoti The supernatant containing the enzyme was then decanted and dried to dryness. The residue obtained is then brought to room temperature For 24 hours in tetrahydrofuran (containing 5% or less water) ( 0.6 ml of 1 M tetrabutylammonium fluoride in Aldrich Treated with Ni. The reaction was mixed with 0.6 ml of 2M triethylammonium acetate. The aqueous solution, pH 7, was added to cool. Use sterile water to desalt the reaction mixture. The melt The solution was passed through a 10DG column (Bio-Rad). The desalted oligonucleotide was then dried. For the compound 1 Purified by HPLC as described (see Example 2).Example 5 2'-O-methyladenosine having a phosphodiester nucleosidyl bond Preparation of Rigotide Tetramer   The oligonucleotide extends the coupling time up to 4 minutes, resulting in more steric hindrance. Compounds except for the appropriate coupling of the 2'-O-methyl reagent of Synthesized, deprotected and purified as described for 1. The compound as a support Synthesized on deoxyadenosine linked to.Example A Determination of acid stability of oligomers   Determine the relative stability of compounds 1-5 under acidic conditions that stimulate gastric pH It was The compound was treated with an aqueous solution of hydrogen chloride, pH 1, and the glycosidic linkage was set against time. The rate of cleavage depends on the appearance of the digestion product adenine on the reverse-phase HPLC chromatogram. Determined by   Reversed-phase HPLC analysis is Beckman SystemGold HPLC model 126 pump, model 168 photodiode array detector, and It was done with a model 507 auto-injector. Whatman RA A CIIOD3 (100 x 4.6 mm) analytical column was used for analysis. Used The solvent system used was acetonitrile in 0.1M aqueous triethylammonium acetate, pH 7. It was a trill gradient. Gradient from 0 to 2% acetonitrile over 10 minutes 2 to 60% acetonitrile in the next 10 minutes. The slope is Then return to 0% acetonitrile and equilibrate the column for the next injection. Liquid speed It was 1 ml / min. This gradient draws adenine from the starting material and various byproducts. Divided into rei.   Prepare a 100 ml stock of 0.1 M hydrochloric acid, pH 1.05 in sterile water. Refer to the above for the bacterial method), and the adenine eluate is not subject to baseline interference. Territory HPLC analysis was performed to confirm the area. The baseline receives interference in the desired area. I didn't lose it.   The rate of depurination of the tetramer was then determined by 10. D. unit260Body to be injected It was determined by lysing with the product, 110 μl, and obtaining the 0 hour point. afterwards Samples of 10 μl were taken every 0.5 hours (compounds 1 and 2) or 1 hour. Automatically (compounds 3-5). The results are listed in Table I below.   FIG. 1 shows a plot of intact adenosine vs. tetramer versus time. Figure 2 shows a plot of% intact adenosine versus log versus time. From the log plot , K of tetramer depurination rateA'And the half-life are calculated. Table 1 is phospho These numbers as well as the relative rate of depurination compared to the diester control are included. (Compound 1).   This result indicates that 2'-O-methyladenosinylmethylphosphonate is phosphodiester. Stedeoxyadenosine or Methylphosphonate Deoxyadenosine Ana It is clearly shown to be much more stable (175x) than any of the logs. Two ’ Small depurination value apparent for -O-methyladenosinylmethylphosphonate Is a deoxyadenosinyl residue instead of 2'-OMe-adenosinyl 3 Most likely due to the'-terminal nucleoside But this is not supportive. In order to show the difference in depurination rate, pH 1 was used. After 4 hours of treatment, about 33% phosphodiester deoxyadenosine, methyl Only 7% of phosphonate deoxyadenosine, and 2'-O-methyl adenosine Just 0.28% of the nonosine methylphosphonate was depurinated.   A very surprising observation is that of the methylphosphonate deoxyadenocinyl tetramer It was stable. Expected stabilizing effect of phosphonate skeleton on glycosidic bonds It was not done.Example B Determination of acid stability of oligomers at 37 ° C   The relative stability of compounds 1 to 4 was measured using a heat block maintained at 37 ° C. Was determined as described in Example A.   The results are shown in Table II below.   FIG. 3 shows the time course of adenocinyl tetramer at pH 1.0 and 37 ° C. Depurination rates plotted as% depurination. Figure 4 is% against time Adenosine test at 37 ° C, pH 1.0 plotted as log of depurination The depurination rate of the tramer is shown. FIG. 5 shows (2'-O-methyl A)3(DA)- Methylphosphonate oligomers at pH 1.0 and acidic conditions at 37 ° C 2 shows the stability of the backbone of methylphosphonate. Conditions are 0.1M in 0.1M HCl. 3 mM oligomer, 37 ° C, pH 1.0. Detection limit is 0.2%; false Difference ≦ 2%. The increase in free adenine compared to the whole species with adenynyl, The rate was determined by subsequent HPLC. Data are depurinated and 2'-O -3'-terminal deo to methyl adenosinyl methyl phosphonate oligomer Corrected for xyadenosine cleavage.Example C Acid stability of oligo-2'-O-methylribonucleoside methylphosphonate   Oligo-2'-O-methylribonucleoside methylphosphonate (A) Is suitable Of the appropriate protected 2'-O-methylribonucleoside methylphosphonamidites Prepared using Synth. In the notes below, NmIs 2'-O-methyl The nucleosides are shown and the underline indicates the position of the methylphosphonate bond. The oligo The 5'-internucleotide linkage of the mer is a phosphodiester bond. The oligomer Deprotects by successive treatments with hydrazine hydrate in pyridine buffered with acetic acid Solution, then a solution of ethylenediamine in 95% ethanol (1: 1 v / v) Processed in. The oligomer was purified by DEAE cellulose chromatography, It was then purified by preparative HPLC on a C-18 reverse phase column.   OligomerAIs a polynucleotide kinase and gamma [32P] -ATP Was used to phosphorylate. The phosphorylated oligomer is then treated with 0.1N HCl. Incubate or at 37 ° C overnight (~ 14 hours) 0.1 NH Incubated with Cl. The oligomer is then subjected to polyacrylic acid under denaturing conditions. It was analyzed by mid gel electrophoresis. Degradation of oligomers is not detected in these conditions. I couldn't. Our experience shows that at 37 ° C. overnight, 0.1N HCl was added. Or at 37 ° C. for several hours with 1.0 N HCl and deoxyribonucleosides Methylphosphonate (B) By incubating Causes considerable depurination in the ondo. Following this depurination, methylpho Spontaneous hydrolysis of the sulfonate bond occurs, which results in the production of shorter chain length oligomers. cause. By past experience, (C) Such as oligodeoxyribonucleotide Otide purine residues are shown to be more sensitive to acid-catalyzed depurination It had been.   The results of these experiments therefore show that oligo-2'-O-methylribonucleosides Purine nucleosides in demethylphosphonate are oligodeoxyribonucleosides. Sidmethylphosphonate or the corresponding predecessor in the oligodeoxyribonucleoside That it is much more resistant to acid-catalyzed depurination than phosphorus nucleosides. Suggest. Acid of oligo-2'-O-methylribonucleoside methylphosphonate Significant resistance to catalytic depurination, especially if these oligomers were administered orally If done, it can have important therapeutic consequences.Example D Complementary DNA of oligo-2'-O-methylribonucleoside methylphosphonate And hybridization to RNA targets   OligomerTwoThe hybridization characteristics of the1andThree Was compared to those of. Complementary single-stranded DNA targetDOr RNA targetEAgainst Hybridization is 10 mM HEPES (pH 7.0), 2 mM It was performed in a buffer containing DTA. The melting curve and melting point obtained are shown in FIG. And Figure 7 (Note: in these figures, NmIs 2'-O-methyl Represents a nucleoside). Oligodeoxyribonucleotide1Is DNA and It formed stable hybrids with both RNA targets. Oligo-2'-O-meth Luribonucleoside methylphosphonateTwoDoes not hybridize to the DNA target However, it formed a very stable duplex with the RNA target. This behavior Is an oligodeoxyribonucleoside methylphosphonateThreeDNA target and cheap Duplexes that form a constant duplex but are very weak with RNA targets In contrast to forming only. These results show that oligo-2'-O-methyl The ribonucleoside methylphosphonate is an oligodeoxyribonucleoside methyl ester. Can form more stable hybrids with RNA than do luphosphonates And therefore if the target is cellular or viral RNA. Suggest that it is a more effective antisense reagent.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ツ’オ，ポール・オン−ポング アメリカ合衆国メリーランド州21043、エ リコット・シティ、ファロウ・アベニュー 9039番 (72)発明者 サイモン，ライオネル・ノートン アメリカ合衆国カリフォルニア州92075、 ソラナ・ビーチ、ハイランド・コート 15834番─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Tsuo, Paul On-Pong             21043, Maryland, United States             Ricot City, Farrow Avenue             No. 9039 (72) Inventor Simon, Lionel Norton             United States California 92075,             Solana Beach, Highland Court             No. 15834

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． オリゴマーのヌクレオシジル単位が２’−Ｏ−アルキルリボシル基で ある糖部分を有する酸耐性形態の予め選択された塩基配列を有するヌクレオシジ ル単位からなるオリゴマー。 ２． 該オリゴマーが実質的に中性であるように合成される請求項１記載の オリゴマー。 ３． 該オリゴマーがメチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有するよ うに合成される請求項２記載のオリゴマー。 ４． 該アルキルがメチルである請求項３記載のオリゴマー。 ５． 約５０パーセントないし約１００パーセントのメチルホスホネートヌ クレオシジル間結合からなる請求項４記載のオリゴマー。 ６． 該オリゴマーを２’−Ｏ−アルキルリボシル基である糖部分を有する ヌクレオシジル単位を用いて合成することを特徴とする、経口投与に適し、かつ 酸分解に耐性を示す予め選択された塩基配列を有するヌクレオシジル単位からな るオリゴマーの調製方法。 ７． 実質的に中性であるように合成された請求項６記載のオリゴマー。 ８． 該オリゴマーがメチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有するよ うに合成される請求項７記載のオリゴマー。 ９． 該アルキルがメチルである請求項８記載のオリゴマー。 １０． 約５０％ないし約１００％のメチルホスホネートヌクレオシジル間結 合単位からなる請求項９記載のオリゴマー。 １１． 該オリゴマーがメチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有するよ うに合成される、酸耐性形態の予め選択された塩基配列を有するヌクレオシジル 単位からなるオリゴマーを供給する方法。 １２． 約５０％ないし約１００％のメチルホスホネートヌクレオシジル間結 合からなる請求項１１記載のオリゴマー。 １３． メチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有するヌクレオシジル単 位を用いオリゴマーを合成することを特徴とする、経口投与に適しかつ酸分解に 対する耐性を示す予め選択された塩基配列を有するヌクレオシジル単位からなる オリゴマーを調製する方法。 １４． 約５０％ないし約１００％のメチルホスホネートヌクレオシジル間単 位からなる請求項１３記載のオリゴマー。 １５． 酸耐性オリゴマーを投与することを特徴とする、プリン塩基を有する ヌクレオシジル単位からなる該オリゴマーを治療の目的のために哺乳動物に経口 送達する方法。 １６． 該オリゴマーが２’−Ｏ−アルキルリボシル基からなる糖部分を有す るヌクレオシジル単位からなる請求項１５記載の方法。 １７． 該オリゴマーが実質的に中性である請求項１６記載の方法。 １８． 該アルキルがメチルである請求項１７記載の方法。 １９． 該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求項１８記載 の方法。 ２０． 該オリゴマーが実質的に中性である請求項１５記載の方法。 ２１． 該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求項２０記載 の方法。 ２２． 該オリゴマーが制御された速度の放出形態で投与される請求項１５、 １６、１９または２１いずれか一項に記載の方法。 ２３． 制御された速度の放出形態であって、２’−Ｏ−アルキル−リボシル 基からなる糖部分を有するヌクレオシジル単位よりなる酸耐性オリゴマーからな る医薬組成物。 ２４． 少なくとも８個のヌクレオシジル単位からなる請求項２３記載のオリ ゴマー。 ２５． 該オリゴマーが２’−Ｏ−メチル−リボシル基からなる糖部分を有す るヌクレオシジル単位からなる請求項２３記載の方法。 ２６． 該オリゴマーが実質的に中性である請求項２５記載の方法。 ２７． 該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求項２６記載 の方法。 ２８． 制御された速度の放出形態であって、メチルホスホネートヌクレオシ ジル間単位を有する酸耐性オリゴマーからなる経口投与のための医薬組成物。 ２９． 該オリゴマーが、２’−Ｏ−メチルリボシル基である糖部分を有する ヌクレオシジル単位からなる請求項２８記載の組成物。 ３０． 適合する処方の、酸耐性オリゴマーの治療学的有効量からなる、酸性 条件下でその治療学的活性を保持する医薬組成物。[Claims] 1. The nucleosidyl unit of the oligomer is a 2'-O-alkylribosyl group A nucleoside having an acid-resistant form of a preselected base sequence with a sugar moiety An oligomer composed of units. 2. The method of claim 1, wherein the oligomer is synthesized to be substantially neutral. Oligomer. 3. The oligomer has a methylphosphonate internucleoside bond. The oligomer according to claim 2, which is synthesized as described above. 4. The oligomer according to claim 3, wherein the alkyl is methyl. 5. About 50 percent to about 100 percent methylphosphonate The oligomer according to claim 4, comprising an inter-cleosidyl bond. 6. The oligomer has a sugar moiety which is a 2'-O-alkylribosyl group Suitable for oral administration, characterized by being synthesized using nucleocidyl units, and It consists of a nucleosidyl unit with a preselected base sequence that is resistant to acid degradation. A method for preparing an oligomer. 7. The oligomer according to claim 6, which is synthesized so as to be substantially neutral. 8. The oligomer has a methylphosphonate internucleoside bond. The oligomer according to claim 7, which is synthesized as described above. 9. The oligomer according to claim 8, wherein the alkyl is methyl. 10. About 50% to about 100% methylphosphonate nucleoside binding The oligomer according to claim 9, which comprises a compound unit. 11. The oligomer has a methylphosphonate internucleoside bond. Acid-resistant forms of nucleosides with preselected base sequences A method of supplying an oligomer composed of units. 12. About 50% to about 100% methylphosphonate nucleoside binding The oligomer according to claim 11, which comprises 13. Methylphosphonate single nucleosides with internucleoside linkages Suitable for oral administration and acid decomposition, characterized by synthesizing oligomers using Consisting of a nucleosidyl unit with a preselected base sequence that is resistant to A method for preparing an oligomer. 14. Between about 50% to about 100% methylphosphonate nucleosides The oligomer according to claim 13, which comprises a position. 15. Having a purine base characterized by administering an acid-resistant oligomer Oral administration of said oligomer consisting of nucleocidyl units to mammals for therapeutic purposes How to deliver. 16. The oligomer has a sugar moiety consisting of a 2'-O-alkylribosyl group 16. The method according to claim 15, which comprises nucleocidyl units. 17. 17. The method of claim 16, wherein the oligomer is substantially neutral. 18. 18. The method of claim 17, wherein the alkyl is methyl. 19. 19. The oligomer is a methylphosphonate oligomer. the method of. 20. 16. The method of claim 15, wherein the oligomer is substantially neutral. 21. 21. The oligomer is a methylphosphonate oligomer. the method of. 22. 16. The oligomer is administered in a controlled rate release form, 22. The method according to any one of 16, 19 or 21. 23. A controlled rate release form of 2'-O-alkyl-ribosyl Consists of acid-resistant oligomers consisting of nucleosidyl units with sugar moieties consisting of groups A pharmaceutical composition. 24. The ori of claim 23, comprising at least 8 nucleosidyl units. Gomer. 25. The oligomer has a sugar moiety consisting of a 2'-O-methyl-ribosyl group 24. The method of claim 23, which comprises a nucleocidyl unit of 26. 26. The method of claim 25, wherein the oligomer is substantially neutral. 27. 27. The oligomer is a methylphosphonate oligomer. the method of. 28. A controlled-release form of methylphosphonate nucleoside A pharmaceutical composition for oral administration comprising an acid resistant oligomer having inter-gill units. 29. The oligomer has a sugar moiety that is a 2'-O-methylribosyl group 29. The composition of claim 28, which comprises nucleocidyl units. 30. Acidic, consisting of a therapeutically effective amount of an acid-resistant oligomer in a compatible formulation A pharmaceutical composition which retains its therapeutic activity under conditions.
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