JPH10510433A - Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkages - Google Patents

Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkages

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JPH10510433A
JPH10510433A JP9501254A JP50125497A JPH10510433A JP H10510433 A JPH10510433 A JP H10510433A JP 9501254 A JP9501254 A JP 9501254A JP 50125497 A JP50125497 A JP 50125497A JP H10510433 A JPH10510433 A JP H10510433A
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phosphorothioate
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Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

(57)【要約】 実質的にすべてSpのまたは実質的にすべてRpのホスホロチオエート糖間結合のいずれかにより一緒に結合したヌクレオシドユニットを含む配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供される。そのような実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、酵素的または化学合成により製造される。   (57) [Summary] Provided are sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides comprising nucleoside units joined together by either substantially all Sp or substantially all Rp phosphorothioate intersugar linkages. Such sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides having substantially chirally pure intersugar linkages are produced by enzymatic or chemical synthesis.

Description

【発明の詳細な説明】 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド関連出願のクロスリファレンス 本出願は、1994年8月29日に出願された、米国特許出願08/297, 703の一部継続出願であり、これは、1991年10月16日に出願され、取 り下げられた米国特許出願07/777,007の継続出願である。本出願はま た、1993年5月5日に出願された米国特許出願08/058,023の一部 継続出願であり、これは、1991年10月15日に出願された米国特許出願0 7/777,670(米国特許5,212,295として1993年5月18日 に発行)の分割出願であり、これは、米国特許出願07/777,007の一部 継続出願である。上述の各特許出願は、本発明の譲受人にともに譲渡されており 、各出願の全開示を本明細書の一部としてここに引用する。発明の分野 本発明は、糖間結合により結合したヌクレオシドを含む配列特異的ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチド、およびそれらの合成および使用に関する。より詳 細には、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシドをつなぐ糖間結合は、実質 的に純粋なすべてSpのまたはすべてRpのキラルホスホロチオエート結合であ る。そのようなオリゴヌクレオチドは、化学的または酵素的合成により製造され る。これらは、診断、治療および研究試薬として特によく適している。発明の背景 オリゴヌクレオチドは一本鎖RNAまたは一本鎖DNAにハイブリダイズする ことが知られている。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの塩基の 標的RNAまたはDNAの塩基への配列特異的塩基対水素結合である。そのよう な塩基対は互いに相補的であるといわれる。 オリゴヌクレオチドの相補的核酸へのハイブリダイゼーションの程度の決定に おいては、オリゴヌクレオチドが相補的核酸と結合する相対的能力を、特定のハ イブリダイゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することが できる。融解温度(Tm)は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせ ん形(ハイブリダイズしている)対コイル形(ハイブリダイズしていない)が5 0%の比率で存在する温度(℃)を表す。Tmは、UVスペクトルを用いてハイ ブリダイゼーション複合体の形成および崩壊(融解)を判定することにより測定 される。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基のスタッキングは、UV吸収 の減少(淡色化)を伴う。したがって、UV吸収の減少はより高いTmを示す。 Tmがより高くなればなるほど、鎖の間の結合強度はより大きくなる。 オリゴヌクレオチドを用いて、細胞内酵素RNase Hを用いる標的RNA の酵素的切断を行うことができる。そのようなRNase H切断のメカニズム は、2’−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドが標的RNAにハイブリ ダイズすることを必要とする。得られるDNA−RNAデュープレックスはRN ase H酵素を活性化し、活性化された酵素はRNA鎖を切断する。RNA鎖 の切断は、標的RNAの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドはこのタイプのメカニズムにより作用する。しかし、DNAオリゴヌク レオチドがRNase Hの細胞性活性化に有用であるためには、オリゴヌクレ オチドは、RNase H活性化に十分な時間細胞内で生き残るため、ヌクレア ーゼに対して適度に安定でなければならない。非細胞的な用途、例えばオリゴヌ クレオチドの研究試薬としての使用においては、そのようなヌクレアーゼ安定性 は必要ではないだろう。 Walderらのいくつかの刊行物は、RNase Hとオリゴヌクレオチド との相互作用を記載する。特に興味深いものは以下のものである:(1)Dag le et al.,Nucleic Acids Research 199 0,18,4751;(2)Dagle et al.,Antisense Research And Development 1991,1,11;( 3)Eder et al.,J.Biol.Chem.1991,266,6 472;および(4)Dagle et al.,Nucleic Acids Research 1991,19,1805。これらの刊行物によれば、未 修飾ホスホジエステルヌクレオシド間結合と修飾ホスホロチオエートヌクレオシ ド間結合との両方を有するDNAオリゴヌクレオチドは、細胞性RNase H の基質である。これらは基質であるため、RNase Hによる標的RNAの 切断を活性化する。しかし、著者はさらに、アフリカツメガエル(Xenopu s)胚において、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方が エキソヌクレアーゼ分解をも受けることに注目している。そのようなヌクレアー ゼ分解は、RNase H活性化に利用可能なオリゴヌクレオチドを急速に枯渇 させるため、有害である。 文献(1)、(2)および(4)に記載されるように、なおRNase H活 性化を与えたままオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解に対して安定化させる ために、ホスホルアミデート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル 結合の区域の間に配置されたホスホジエステル結合ヌクレオチドの短い区域を有 する2’−デオキシオリゴヌクレオチドが構築された。ホスホルアミデート含有 オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対して安定化されていたため、文 献(4)においては、著者はそれぞれのホスホルアミデート結合が、ホスホルア ミデート含有オリゴヌクレオチドの測定Tm値において1.6℃の低下をもたら したことに注目している。このようなTm値の低下は、オリゴヌクレオチドとそ の標的核酸鎖との間のハイブリダイゼーションの減少を示している。 診断、研究試薬、および治療剤としてのオリゴヌクレオチドの適用には、オリ ゴヌクレオチドが細胞膜を越えて移送されることまたは細胞により取り込まれる こと、標的RNAまたはDNAに適切にハイブリダイズすること、および続いて 核酸機能を停止または破壊することが必要である。これらの必須の機能は、部分 的には、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期の安定性に依存す る。さらに、これらの機能は、標的RNAまたはDNA分子に対するオリゴヌク レオチドの特異性に依存する。 オリゴヌクレオチドのこれらの目的に関する深刻な欠陥は、細胞内および細胞 外に存在しうる偏在する種々のヌクレアーゼによる酵素的分解に対して感受性で あることである。未修飾の、”野生型”オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに より急速に分解されるため、治療剤としては有用ではない。したがって、ヌクレ アーゼ耐性を付与するためのオリゴヌクレオチドの修飾は、オリゴヌクレオチド 治療および診断の開発をめざす研究の主要な焦点であった。 オリゴヌクレオチドを修飾してヌクレアーゼ耐性を増強させることは、一般に 糖−リン酸主鎖において、特にリン原子上で行われてきた。ホスホロチオエート は、ヌクレアーゼに耐性を示すことが報告されている。さらに、ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドは一般に、天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチド より化学的により安定である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、 水性媒体中での溶解性を示す。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド −RNAヘテロデュープレックスは、外来RNase Hのための基質として働 くことができる。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、高い熱力 学的安定性を示す。しかし、オリゴヌクレオチドが標的RNAまたはDNAに確 実性をもって結合する能力は、標的RNAまたはDNAへのハイブリダイゼーシ ョンにとって重要であるが、オリゴヌクレオチドのリン原子における修飾は、種 々の程度のヌクレアーゼ耐性を示すものの、一般に劣ったハイブリダイゼーショ ン特性という欠点を有する[Cohen,J.S.,Ed.,Oligonuc leotides:Antisense Inhibitors of Gen e Expression(CRC Press,Inc.,Boca Rat on,FL,1989]。 この劣ったハイブリダイゼーションの理由は、リン原子のプロキラルな性質で あろう。修飾されたリンのオリゴヌクレオチドの内部リン原子における修飾は、 RpおよびSp立体異性体を生ずる。 現在までに得られた、得られる分子が非対称の置換基を有する修飾リンオリゴ ヌクレオチドは、2n個(nはオリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート糖間 結合の数と等しい)の異性体を有するラセミ混合物であった。したがって、14 個の非対称中心を含む15−merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、 214すなわち16,384個のジアステレオマーを含む。この観点から、ラセミ 混合物においては、少ないパーセントのオリゴヌクレオチドのみが、十分な親和 性をもって標的mRNAまたはDNAに特異的にハイブリダイズするようである 。 キラル的に純粋な糖間結合を有する化学的に合成されたホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドは、これまでのところ、1つまたは2つのジアステレオマー性 糖間結合のみを有する分子に限定されている。キラル的に純粋な糖間結合を有す るオリゴヌクレオチドの合成は、自動化合成によってはまだ達成されていないた め、配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの化学的に合成されたラ セミ混合物に導入されたキラル性の効果は最近まで評価されなかった。これは、 自動化合成の間にイオウが非立体特異的に取り込まれるためである。例えば、S tec et al.,J.Chromatography,326:263( 1985)は、ラセミ糖間結合を有するある種のオリゴヌクレオチドホスホロチ オエートを合成したが、1つまたは最大でも2つのジアステレオマー性リン糖間 結合を有するある種の小さいオリゴマーのジアステレオマーを解明することがで きたのみである。 しかし、Stec et al.[Nucleic Acids Res., 19:5883(1991)]は続いてオリゴヌクレオチドの自動化立体制御合 成を報告した。上述の文献に記載される方法は、5価のホスホロチオイル中心に おける、塩基により触媒される求核置換を利用する。 酵素的方法を用いる、すべてRpの糖間結合を有するホスホロチオエートの合 成は、何人かの著者により研究されてきた[Burgers and Ecks tein,J.Biological Chemistry,254:6889 (1979);Gupta et al.,J.Biol.Chem.,256 :7689(1982);Brody and Frey,Biochemist ry,20:1245(1981);およびEckstein and Jovi n,Biochemistry,2:4546(1983)]。Brodyら( Biochemistry,21:2570(1982)]、およびRoman iukおよびEckstein[J.Biol.Chem.,257:7684 (1982)]は、ポリTpAおよびポリApTホスホロチオエートを酵素的に 合成した。BurgersおよびEckstein[Proc.Natl.Ac ad.Sci.U.S.A.,75:4798(1978)]は、ポリUpAホ スホロチオエートを酵素的に合成した。Cruseら[J.Mol.Biol. ,192:891(1986)]は、3つのジアステレオマー性RpのGpCホ スホロチオエートダイマーを天然のホスホジエステル結合により結合させてヘキ サマーとした。 オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合する相対的能力は、特定のハイブリダ イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。 融解温度(Tm)は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせん形対コ イル形(ハイブリダイズしていない)が50%で存在する温度(℃)を表す。T mは、UVスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成および崩壊(融解 )を判定することにより測定される。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基 のスタッキングは、UV吸収の減少(淡色化)を伴う。したがって、UV吸収の 減少はより高いTmを示す。Tmがより高くなればなるほど、鎖の間の結合強度 はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩基対は、Tmに対して強い不安定化 効果を有する。 予備的報告[Stec,J.W.,Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expres sion:Therapeutic Implications,Meetin g abstracts,June 18−21,1989]においては、天然 のホスホジエステル結合により結合した2つのチミジンメチルホスホネート4量 体ジアステレオマーから、糖間結合に1つを除いてすべて修飾リン酸結合を有す るチミジンホモポリマー8量体(”1つ以外”)のRp立体コンフィギュレーシ ョンまたは”1つ以外”Sp立体コンフィギュレーションが形成された。1つを 除きすべてRpの糖間結合を有するRp”1つ以外”メチルホスホネート配列非 特異的チミジンホモ8量体、すなわち(dT)8は、15量体デオキシアデノシ ンホモポリマー、すなわち(dA)15と、”1つを除く”Spコンフィギュレー ションメチルホスホネート結合を有する同様のチミジンホモポリマー、すなわち 1つを除きすべてSpの糖間結合を有するd(T)15とd(A)15により形成さ れたハイブリッド(Tm<O℃)よりも、熱力学的により安定なハイブリッド( Tm 38℃)を形成したことに注目されたい。天然のホスホジエステル結合を 有する(dT)8、すなわちオクタチミジル酸とd(A)15との間のハイブリッ ドは、14℃のTmを有することが報告されている。 より最近では、Uedaら[Nucleic Acids Research ,19:547(1991)]は、翻訳系において用いるための、Rpジアステ レ オマー性ホスホロチオエート結合を断続的に取り込んだmRNAを酵素的に合成 した。Uedaらは、T7RNAポリメラーゼのための17のプロモーターおよ び1つの停止部位を有するT7コリファンDNAを用いた。T7RNAポリメラ ーゼによるインビトロ合成は、数百から数万個のヌクレオチドを有するmRNA を生成した。 主鎖キラル性はまた、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド−RNAヘテロ デュープレックスのRNase H活性に対する感受性に影響を与えるであろう 。RNase HがRNA−DNAオリゴヌクレオチドヘテロデュープレックス 中のRNA成分の切断を引き起こすことが示唆されているため、RNase H のためのテンプレートとして働く能力は著しい治療的意味を有する。Rpおよび Sp糖間結合のラセミ混合物を含むオリゴヌクレオチドについては、すべてのホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドがRNase Hの基質として同等に機能 しうるか否かはわかっていない。種々の触媒反応について、核酸のホスホジエス テル主鎖の加水分解は、立体特異的メカニズム(インラインメカニズム)および コンフィギュレーションの反転により進行する。したがって、ラセミ混合物には 、最大のハイブリダイゼーション効率および翻訳の停止のための正しいキラル性 を含むオリゴヌクレオチドは少ないパーセンテージでのみ存在するであろう。す なわち、ヘテロデュープレックス中でRNase Hのための基質として働くこ とができるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのパーセンテージを増加させ ることは、アンチセンス療法のためのより有効な化合物につながるであろう。 ハイブリダイゼーションの確実性を増強させるために、実質的にキラル的に純 粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが非常に望まれて いる。さらに、そのような実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロ チオエートオリゴヌクレオチドは、より有効な治療化合物につながるであろう。 しかし、これまでのところ、そのような分子の合成にはほとんど成功していない 。したがって、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを合成する簡単な方法が非常に望まれている。 オリゴヌクレオチド治療の開発においてオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐 性およびハイブリダイゼーションの確実性が非常に重要であることが認識されて きた。ヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドはまた、研究試薬および診 断薬としても望まれている。発明の概要 本発明にしたがえば、すべてのヌクレオシドユニットが実質的にすべてSpの ホスホロチオエート糖間結合または実質的にすべてRpのホスホロチオエート糖 間結合のいずれかにより一緒に連結されているホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドが提供される。好ましくは、本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドは、標的RNAまたはDNAの配列の少なくとも一部に相補的である。 さらに、本発明にしたがえば、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配 列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成する化学的および酵素的 方法が提供される。ここで、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実 質的にすべてRpのまたは実質的にすべてSpの糖間結合のいずれかにより一緒 に連結された、少なくとも10ヌクレオシドユニットからなる。好ましくは、ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋な糖間結合に より連結された約10から約50ヌクレオシドユニットからなる。より好ましく は、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋な 糖間結合により連結された約15から約30ヌクレオシドユニットからなる。最 も好ましくは、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル 的に純粋な糖間結合により連結された約17から21ヌクレオシドユニットから なる。前記方法は、配列プライマー、テンプレート、および過剰量の4つすべて のキラル的に純粋なヌクレオシド5’−O−(1−チオトリホスフェート)を組 み合わせることを含む。前記方法はさらに、ポリメラーゼの付加およびそれに続 く相補的オリゴヌクレオチドからのプライマーの切断により、相補的オリゴヌク レオチドを合成することを含む。さらに、前記方法は、前記相補的オリゴヌクレ オチドを前記テンプレートから解離させることを含む。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドを合成する本発明の方法の別の態様においては、配列プライマ ー、テンプレートおよびヌクレオシド5’−O−(1−チオトリホスフェート) のラセミ混合物を組み合わせる。実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有し、テ ンプレートに相補的であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ポリメラ ーゼおよび選択された金属イオンを添加することにより合成する。このようにし て合成されたオリゴヌクレオチドを、テンプレートおよびプライマーから解離さ せる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドは、標的RNAおよびDNAとともに形成されたヘテロデュープレックス の熱力学的安定性を増加させ、RNase H活性を引き出すのに有用である。 さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、RNAの活性を調節するのに有用であ る。発明の詳細な記載 オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合中のリン原子は、”プロキラル” であるということができる。ホスホジエステル結合の非結合酸素原子が置換また は修飾されると、キラルな糖−リン酸結合が生成する。得られる糖間結合は、S p糖間結合またはRp糖間結合のいずれかである。天然のホスホジエステル結合 の非結合酸素原子をイオウで置換してホスホロチオエート結合を得ると、キラル 中心が生成し、SpおよびRpジアステレオマーが生ずる。糖主鎖中のリン原子 の実質的にすべてがSpまたはRpである分子は、本明細書においてキラル的に 純粋であると称される。 リボヌクレオシド−5’−O−(1−チオトリホスフェート)(NTPαS) および2’−デオキシリボヌクレオシド−5’−O−(1−チオトリホスフェー ト)(dNTPαS)は、LudwigおよびEckstein[J.Org. Chem.,631(1989)]の方法論を用いて、SpおよびRpのラセミ 混合物として合成された。この例示的合成スキームにおいては、非保護ヌクレオ シドを、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスホリン−4−オン と反応させ、これは5’−ヒドロキシル基をホスフィチル化する。続くピロホス フェートとの反応により、イオウに対して反応性である環状トリホスフェート誘 導体が生成し、RpおよびSpヌクレオシド5’−O−(1−チオトリホスフェ ート)、すなわち、α−チオトリホスフェートの混合物が得られる。生成物を、 例えば、DEAE−セファデックスクロマトグラフィーにより精製し、NMR分 光分析法を用いて(特徴的なRpまたはSp化学シフトにより)同定することが できる。 以下の実施例で示されるように、純粋なRpおよびSpヌクレオシド−5’− O−(1−チオトリホスフェート)ジアステレオマーは、例えば、逆相HPLC クロマトグラフィーを用いて製造規模で容易に単離することができる。このよう なHPLCで単離されたヌクレオチドジアステレオマーは、そのようなRpおよ びSpヌクレオシド5’−O−(1−チオトリホスフェート)ジアステレオマー の市販試料との分析HPLC比較により、さらに特性決定することができる。 配列特異的な天然のオリゴヌクレオチド、すなわち天然のホスホジエステルオ リゴヌクレオチドの酵素的合成は、テンプレートおよびプライマーの存在下で適 当なヌクレアーゼを用いることにより行うことができる。同様に、キラル的に混 合された糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのラセミ混合 物を合成することができる。本発明にしたがえば、そのような酵素的合成は、配 列特異的テンプレートおよびプライマーの存在下に、鏡像異性体に関して純粋な すべてSpのまたはすべてRpのヌクレオシド5’−O−(1−チオトリホスフ ェート)を適当なヌクレアーゼの基質として用いることにより、実質的にキラル 的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド の合成を含むようにさらに発展させることができる。例えば、市販のDNAポリ メラーゼであるシークエナーゼTM(U.S.Biochemical,Inc. ,Cleveland,OH)を用いることにより、ホスホジエステルオリゴヌ クレオチドテンプレートおよびラセミ体のホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドプライマーを用いてホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成することが できる。このポリメラーゼを用いることにより、ホスホジエステルおよびホスホ ロチオエートプライマーの両方を伸長することができる。 酵素的に合成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの収量は、テンプ レートおよびプライマーを繰り返し添加することにより、ポリメラーゼを繰り返 し添加することにより、ヌクレオシド三リン酸を繰り返し添加することにより、 またはこれらのいくつかまたはすべてを組み合わせることにより最適化すること ができる。例えば、テンプレートおよびプライマーの繰り返し添加により、酵素 的カスケードによる収量は最大化する。さらなる最適化は、テンプレートとプラ イマーとを系の緩衝液中で一緒にプレハイブリダイゼーションし、つづいて冷却 し、ヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼを加えることにより行うことがで きる。 適当なポリメラーゼを選択して、DNAまたはRNAホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドを生成することができる。このようなポリメラーゼとしては、T 7DNAポリメラーゼ、修飾T7DNAポリメラーゼ、例えば上記に論及したシ ークエナーゼTM、E.coli DNAポリメラーゼ、DNAポリクレノーフラ グメントポリメラーゼ、M.ルテウス(luteus)ポリメラーゼ、T4バク テリオファージポリメラーゼ、修飾T4DNAポリメラーゼ、T7RNAポリメ ラーゼおよびE.coli RNAポリメラーゼが挙げられるが、必ずしもこれ らに制限されない。 酵素的合成は、リン原子のキラル中心のまわりでのコンフィギュレーションの 反転を伴って進行する。すなわち、すべてSpのα−チオトリホスフェートの使 用により、実質的にすべてRpのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが生じ 、すべてRpのα−チオトリホスフェートの使用により、実質的にすべてSpの ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが生じる。本発明の別の態様においては 、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、金属イオンを反応溶液中で用いて 一方または他方のキラルα−チオトリホスフェートを優先的に取り込むことを促 進することにより、ヌクレオシド−5’−O−(1−チオトリホスフェート)の ラセミ混合物から合成することができる。上述したように、ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ合成は、前駆体ヌクレオシド−α−チオトリ ホスフェートのキラル中心のまわりでのコンフィギュレーションの反転を伴って 達成される。理論に拘束されることを望むものではないが、すべてRpのコンフ ィギュレーションの最適化は、例えば、E.coliポリメラーゼを用いる反応 緩衝液中に高濃度のマグネシウムイオンを加えることにより達成することができ ると考えられる。同様に、再度理論に拘束されることを望むものではないが、す べてSpのコンフィギュレーションは、反応緩衝液中において高いマンガンイオ ン濃度を用いることによって得られると考えられる。 本発明にしたがえば、”実質的にすべての”とは、少なくとも75%の糖間結 合がキラル的に純粋であるすべてのオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。 より好ましくは、約85%から約100%のキラル的に純粋な糖間結合を有する オリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋である。最も好ましくは、約9 5%から約100%のキラル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオチドは 、実質的にキラル的に純粋である。 本発明の分脈において、用語”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”は、 天然に生ずる塩基、糖およびホスホロチオエート結合から形成されるホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドを含む。天然に生ずる塩基には、アデニン、グアニ ン、シトシン、チミンおよびウラシルが含まれる。天然の糖には、β−D−リボ フラノシルおよびβ−D−2’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルが含ま れる。”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”はまた、ヌクレオシド−5’ −O−(1−チオトリホスフェート)類似体が適当なポリメラーゼのための基質 である程度まで、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートヌクレオチドユニッ ト中に取り込まれた修飾された塩基または修飾された糖を含む。本発明のオリゴ ヌクレオチドの修飾された塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル 、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、6−メチル、2 −プロピルおよび他のアルキル−アデニン、5−ハロウラシル、5−ハロシトシ ン、6−アザウラシル、6−アザシトシンおよび6−アザチミン、シュードウラ シル、4−チオウラシル、8−ハロアデニン、8−アミノアデニン、8−チオー ルアデニン、8−チオールアルキルアデニン、8−ヒドロキシルアデニンおよび 他の8−置換アデニン、8−ハログアニン、8−アミノグアニン、8−チオール グアニン、8−チオールアルキルグアニン、8−ヒドロキシルグアニンおよび他 の8−置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、他のアザおよびデアザチ ミジン、他のアザおよびデアザシトシン、他のアザおよびデアザアデニン、他の アザおよびデアザグアニン、5−トリフルオロメチルウラシルおよび5−トリフ ルオロシトシンが含まれる。糖成分は、デオキシリボースであってもリボースで あってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、修飾された核塩基または本 発明の精神に合致する他の修飾、特に、治療、診断または研究試薬としての使用 を容易に するため、そのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾を有する核塩基を含んでいて もよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療および研究試薬として使用 することができる。これらは、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを適当な薬 学的に許容しうる希釈剤または担体に加えることにより、医薬組成物中で使用す ることができる。これらはさらに、蛋白質の望ましくない生成により特徴づけら れる疾患を有する生物を治療するために用いることができる。生物を、望ましく ない蛋白質をコードする標的核酸の鎖と特異的にハイブリダイズしうる配列を有 する本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることができる。 治療組成物の処方およびその続いての投与は、当業者の技術の範囲内であると 考えられる。一般に、治療のためには、そのような治療を必要とする患者に本発 明にしたがうオリゴヌクレオチドを、通常は薬学的に許容しうる担体中で、処置 される患者の年齢および疾患状態の重篤度に依存して、体重1kgあたり0.0 1μgから100gの範囲の用量で投与する。さらに、治療計画は、特定の疾患 の特性、その重篤度、および患者の全体的状態に依存して変わるであろう期間継 続し、1日に1回から数年に1回まで拡張することができる。処置後、患者をそ の状態の変化についておよび疾患状態の症状の緩和について監視する。患者が現 在の用量レベルに有意に応答しない場合には、オリゴヌクレオチドの用量を増加 することができ、または疾患状態の症状の緩和が観察された場合、または疾患状 態が除去された場合には、用量を低下させることができる。 場合により、他の伝統的な治療モダリティーと組み合わせて、本発明のオリゴ ヌクレオチドで患者を処置することがより有効であろう。 用量は、治癒が行われるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、数日 から数ヶ月の処置過程で、治療すべき病状の重篤度および応答性に依存する。最 適用量スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積の測定から計算することがで きる。当業者は、最適用量、投与法および反復率を容易に決定することができる 。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化し、一般 に、インビトロおよび動物モデルのインビボで有効であることが見いだされたE C50に基づいて見積もることができる。一般に、用量は体重1kgあたり0.0 1μgから100gであり、1日に1回またはそれ以上、1週間に1回、1ヶ月 に 一回または1年に1回、または数年に1回、与えられる。 治療の成功に続き、疾患状態の再発を防ぐため、オリゴヌクレオチドを体重1 kgあたり0.01μgから100g、1日に1回またはそれ以上から数年に1 回の範囲の維持用量で患者に投与する維持療法を行うことが望ましいであろう。 本発明の医薬組成物は、局所または全身の処置が望まれているか、および処置 されるべき領域に依存して、多くの方法により投与することができる。投与は、 局所的に(点眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む)、経口で、または非経口で行う ことができる。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、 または髄腔内(intrathecal)または脳室内(intraventr icular)投与が含まれる。 局所投与のための処方には、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、 ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の 医薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などが必要かまたは望ましいで あろう。被覆されたコンドーム、手袋等もまた有用であろう。 経口投与のための組成物には散剤、顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤 または液剤、カプセル剤、サッシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化剤、芳香 剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれるであろう。 髄腔内または脳室内投与のための組成物には、緩衝液、希釈剤およびその他の 適切な添加剤を含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。 非経口投与のための処方には、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤を 含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション 、ヌクレアーゼ耐性およびRNase H活性に及ぼすそれらの影響に関して、 天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびラセミ体ホスホロチオエート ヌクレオチドの両方と比較することができる。同様に、実質的にキラル的に純粋 な糖間結合を有する純粋なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、インビボ 試験系において治療の有効性を増加させる能力について評価することができる。 そのような治療の有効性の増加には、薬物動態学または代謝、毒性学、配剤(す なわち吸収および分布)、および種比較等の特性が含まれる。 すべてRpのまたはすべてSpの糖間結合を有するホモポリマーは、安定性お よび他の特性の最初の研究には有用であった。しかし、これらのオリゴヌクレオ チドは、標的分子に特異的ではないため、治療的にはほとんど用途はない。標的 核酸に特異的にハイブリダイズするためには、特異的配列を有するホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドが必要である。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドは、標的RNAおよびDNAとのヘテロデュープレックスの熱 力学的安定性を増加させ、RNase H活性を付与するのに有用である。 放射性標識を用いて、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドの同定を助けることができる。自動化合成機で合成 されたラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、合成機から 得られた水素ホスホネートオリゴマーの酸化反応のために[35S](放射性標識 された元素イオウ)を用いることができる。酵素的に合成されたホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの標識は、[α−32P]ATPおよびリガーゼにより、 またはポリメラーゼ反応において[α−35S]ATPを用いて行うことができる 。また、放射性標識ヌクレオシドトリホスフェートを、プローブおよび配列決定 分析において用いることができる。オートラジオグラムは標準的な方法で作成さ れる。 本発明のテンプレートは、疾患増強性蛋白質の合成を指令する核酸配列の領域 であることが最も好ましい。前記テンプレートオリゴヌクレオチドの領域に対し て塩基対を形成する短いオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによるオリゴヌク レオチド合成の出発点を形成するプライマーとして作用する。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドは、ヌクレアーゼ切断、例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断に感受性で ある部位をその上に有するように選択されたプライマーを用いて合成することが できる。前記切断部位は、前記プライマーの3’末端に位置していてもよい。適 当な制限エンドヌクレアーゼによる前記部位における切断により、最初の5’末 端ヌクレオシドを前記プライマーから得るオリゴヌクレオチドが得られる。本発 明の前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドは、酵素的 手段により付加されたヌクレオシドキラルチオトリホスフェートである。 選択されたプライマーとともに適当な制限ヌクレアーゼを選択することにより 、所望のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの種々の5’−末端ヌクレオシ ドをホスホロチオエートヌクレオチドの5’末端に適切に配置させることができ る。すなわち、互い違いの切断によりプライマーからの1つのヌクレオシドが新 たに合成された本発明の配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの最 初の5’ヌクレオシドとなる限り、任意のエンドヌクレアーゼ認識部位を設計す ることができる。このことにより、本発明の酵素的に合成されたホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの5’末端において各種のヌクレオシドが生成する。 所望の配列の適当なテンプレート上での前記プライマーの酵素的伸長を完了し たら、適当なヌクレアーゼを用いることにより、本発明のホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドを前記プライマーから脱離させることができる。例えば、所望 のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの5’末端にグアノシンヌクレオシド を取り込ませるために、3’末端に配列CTGCAGを有するプライマーを用い ることができる。次に、Pst1制限ヌクレアーゼを用いることにより、A−G 結合を切断することができる。したがって、このA−G結合のグアノシンヌクレ オシド成分は、所望のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレ オシドとして取り込まれることができる。他の制限エンドヌクレアーゼとしては 、制限されないが、BamH1、SmalおよびHinD III制限エンドヌ クレアーゼがある。 前記テンプレートとなお会合したオリゴヌクレオチドは、前記テンプレートか ら解離させ、次に、例えば、ゲル電気泳動および/またはクロマトグラフィーに よって精製することができる。例えば、適当な精製は、SepPac(Mill ipore,Milford,MA)クロマトグラフィーと組み合わせた標準的 なポリアクリルアミド/尿素ゲル電気泳動を用いて行うことができる。使用しう る他の有用なクロマトグラフィー技術は、HPLCクロマトグラフィーである。 本発明のキラルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、Stec e t al.[Nucleic Acids Res.,19:5883(199 1)]およびStec and Lesnikowski(Methods i n Molecular Biology,S.Agrawal,Ed.,Vo lume 20,p.285,1993]に記載されるように、1,3,2−オ キサチアホスホラン中間体を介して化学的に合成することができる。 本発明の方法にしたがって合成される実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有 するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、多くの方法によって分析するこ とができる。例えば、得られる実質的にキラル的に純粋なすべてSpのまたはす べてRpの糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド のコンフィギュレーション分析は、[31P]NMR化学シフトを用いて判定する ことができる。このような化学シフトは、ホスホロチオエートジヌクレオチドの Rpエピマーを同定するのに使用されている(Ludwig and Ecks tein,J.Org.Chem.,631−635(1989)]。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの配列の正確さは、S1ヌク レアーゼに対するヘテロデュープレックスの感受性を使用して判定することがで きる。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの配列は、ホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドの3’−ヒドロキシル基を〔α−32P〕コルジセピントリホスフェ ート(すなわち、3’−デオキシアデノシン−5’−トリホスフェート)で標識 することによって、さらに確証を高めることができる。得られたオリゴヌクレオ チドを酵素的分解に供することもできる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドが相補的鎖に結合する相対的能力は、実質的にキラル的に純粋な糖間結合 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとその相補的鎖とのハイブリダ イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。 融解温度(Tm)は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせん形対コ イル形(ハイブリダイズしていない)が50%の比率で存在する摂氏温度を意味 している。Tmは、UVスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成およ び崩壊(融解)を測定することによって測定される。ハイブリダイゼーションの 間に生ずる塩基のスタッキングは、UV吸収の減少(淡色化)を伴う。結果的に 、UV吸収の減少はより高いTmを示す。Tmが高くなればなるほど、鎖の結合 強 度はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩基対は、Tmに対して強い不安定 化効果を有する。したがって、オリゴヌクレオチドのその標的RNAへの最適の 結合を得るためには、塩基対ができるだけ最適に近い正確さであることが望まし い。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはさらに、種々のエキソヌク レアーゼおよびエンドヌクレアーゼの分解能力に対する抵抗性に関して評価する ことができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼで処理し 、次に、例えばポリアクリルアミドゲルによる電気泳動(PAGE)を行い、そ して適切な染色剤〔例えばStains AllTM(Sigma Chem.C o.,St.Lois,MO)〕を使用して染色することによって分析すること ができる。分解生成物は、レーザー・デンシトメトリーを使用して定量化するこ とができる。 ウシ胎児血清およびヒト血清を使用して、実質的にキラル的に純粋な糖間結合 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対する核酸分解(nucle olytic)活性を評価することができる。例えば、実質的にすべてRpの糖 間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをこのような仕方で評価 することができる。3’または5’末端がキャップされた分子(1キャップ当た り1つまたはいくつかのホスホロチオエート結合を有する)の組み合わせに関す る試験を使用して、最も大きなヌクレアーゼ安定性を生じる組み合わせを求める ことができる。キャッピングは、精製されたRpモノマーを使用して配列のキャ ップ部分を化学的に合成し、次いで前記キャップをDNA合成機上のオリゴヌク レオチド中に取り込ませることによって行うことができる。キャッピングに関す る分析により、核酸分解安定性に及ぼすキラル性の重要性および、最大の安定性 を得るのに必要とされる結合の数を決定することができる。 RNase Hの触媒活性に対するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド− RNAヘテロデュープレックスの感受性も評価することができる。ホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドを、種々のハイブリダイゼーション温度で、放射性標 識した標的mRNA(例えばT7RNAポリメラーゼを介して合成)と共にイン キュベートすることができる。次に、Minshull and Hunt[N uc.Acid Res.,6433(1986))に記載の方法にしたがって 、ヘテロデュープレックスをE.coliからのRNase Hとともに37℃ でインキュベートすることができる。次に、生成物をノザンブロット分析法によ りRNase H活性に関して評価することができる。この方法においては、生 成物を1.2%アガロース/ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ニトロセルロ ースに移す。次に、標的mRNAに相補的なランダムプライマー〔32P〕−標識 cDNAを用いてフィルターを探索し、オートラジオグラフィーによって定量化 する。各種のホスホロチオエート類似体を比較することにより、RNAと複合体 を形成したときにRNase Hに対する基質として作用しうる能力に及ぼすキ ラル性の影響を調べることができる。 E.coli RNase Hおよび哺乳動物RNAse Hの触媒作用に対 するヘテロデュープレックスの感受性の比較を行うことができる。ヘテロデュー プレックスを、翻訳の条件下にてラビットの網状赤血球溶解物中でインキュベー トし、内在RNase HによるmRNAの触媒切断に関して、ノザンブロット 分析によりアッセイすることができる。このことにより、哺乳動物RNAse H活性に及ぼすキラル性の影響を調べることができる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドはまた、細胞培養のモデルシステムにおける遺伝子発現の阻害に関して評 価することができる。実質的に純粋なキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドが遺伝子発現のより強力なまたはより特異的な 阻害剤であるか否かを調べるために、レポーター遺伝子を標的とするよう設計さ れた、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドを合成し、遺伝子発現の細胞培養モデルにおいて試験することができ る。ベクターpSV2CATを用いて遺伝子発現に及ぼすアンチセンスの影響を 調べることが前に記載されている[Henthorn et al.,Proc .Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:6342(1988)] 。このベクターは、SV40プロモーターの調節制御下の細菌クロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。CAT mRNAの翻訳開 始に相補的な配列の、すべてRpの糖間結合を有する15−merホスホロチオ エ ートオリゴヌクレオチドを用いて、pSV2CATをHeLa細胞にトランスフ ェクトし、次にすべてRpの糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドで細胞を48時間処理して、細胞内のCAT活性をアッセイすることがで きる。次に、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートの 遺伝子発現の阻害における活性を、ジアステレオマー性糖間結合を有する化学的 に合成したランダムホスホロチオエート、および同じ配列の天然ホスホジエステ ルオリゴヌクレオチドと直接比較することができる。 ベクターpSV2APAP[Marcus−Sekura et al.,N ucleic Acids Research,15:5749(1987)] は、哺乳動物胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子(PAP)を含む。これはまた 、遺伝子発現に及ぼすアンチセンスの影響を測定するためのレポーターとして使 用することもできる。PAPは、イントロンおよび他のRNAプロセシング信号 を含む細菌遺伝子ではなく哺乳動物遺伝子であるという点において、レポーター 遺伝子としてはCATを凌ぐ利点を有する。現時点では、PAPの発現は、天然 の哺乳動物遺伝子の発現における事象をより近似して模倣すると考えられている 。CAT mRNAに関して前述したような、実質的にキラル的に純粋な糖間結 合を有する15−merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、類似の配列 を有する化学合成したラセミ体ホスホロチオエートおよび天然のホスホジエステ ルオリゴヌクレオチドと平行して調べることができる。PAPおよびCATレポ ーター構築物を、遺伝子発現に及ぼす非特異的影響を調べるための繰り返し実験 における対照として用いる。 さらに、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドは、インビボでRNA翻訳の阻害剤として作用するその能力につ いて評価することができる。種々の治療分野が本発明のオリゴヌクレオチドによ るそのような操作の標的とすることができる。1つの治療分野はC型肝炎ウイル ス(HCV)により引き起こされる肝炎である。以下のホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドは、HCV肝炎の治療に適用を有する:オリゴ#259、CCTTTC GCGACCCAACACTA(配列番号1)、オリゴ#260、GCCTTTCGCGACCCAACACT(配列 番号2)、オリゴ270、GTACCACAAGGCCTTTCGCG(配列番号3)、オリゴ #330、GTGCTCATGGTGCACGGTCT(配列番号4)およびオリゴ#340、TTTAGG ATTCGTGCTCATGG(配列番号5)。別の治療分野は、細胞間接着分子(ICAM− 1)により媒介される炎症性疾患である。炎症性疾患の治療に適用を有するオリ ゴヌクレオチドには、ISIS−2302、GCCCAAGCTGGCATCCGTCA(配列番号6 )が含まれる。別の治療分野には、サイトメガロウイルス(CMV)により引き 起こされる感染が含まれる。ISIS−2922は、CMV網膜炎の治療に適用 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列GCGTTTGCTCTTCTTC TTGCG(配列番号7)を有する。別の治療分野には、蛋白質キナーゼC−α(P KC−α)により媒介される癌が含まれる。ISIS−3521は、そのような 癌の治療に適用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列GT TCTCGCTGGTGAGTTTCA(配列番号8)を有する。さらに別の治療分野には、C−r afキナーゼ媒介性癌が含まれる。ISIS−5132は、そのような癌の治療 に適用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列TCCCGCCTGT GACATGCATT(配列番号9)を有する。さらに別の治療分野は、Ha−rasまた はKi−rasにより媒介される癌を含む。以下のホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドは、そのような癌の治療に適用を有する:ISIS−2503、TCCG TCATCGCTCCTCAGGG(配列番号10)、ISIS−2570、CCACACCGACGGCGCCC (配列番号11)、およびISIS−6957、CAGTGCCTGCGCCGCGCTCG(配列番 号12)。別の治療分野にはHIVにより媒介されるAIDSおよび他の関連す る感染が含まれる。ISIS−5320は、AIDSの治療に適用を有するホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列TTGGGGTT(配列番号17)を有 する。上述の配列において、オリゴヌクレオチドの個々のヌクレオチドユニット は左から右へ5’から3’方向に表記される。 本発明の分脈において、”ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオチ ドユニット間の水素結合を意味し、これはワトソン−クリック、フーグスティー ンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。例えば、アデニンとチミ ンとは、水素結合の形成によって対合する相補的核塩基である。本明細書におい て用いる場合、”相補的”とは、2つのヌクレオチドユニット間の配列相補性を も表す。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置にあるヌクレオチドユニットが DNAまたはRNA分子の同一の位置のヌクレオチドユニットと水素結合するこ とができる場合、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNAとはその位置におい て互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドとそのDNAまたはR NAとは、それぞれの分子中の十分な数の対応する位置が互いに水素結合しうる ヌクレオチドユニットにより占められる場合、互いに相補的である。すなわち、 ”特異的にハイブリダイズしうる”および”相補的”とは、オリゴヌクレオチド と標的RNAまたはDNAとの間に安定かつ特異的な結合が生ずるような十分な 程度の相補性を示すために用いられる用語である。オリゴヌクレオチドが特異的 にハイブリダイズしうるためには、その標的DNA配列に100%相補的である 必要はないことが理解されるであろう。オリゴヌクレオチドの標的RNAまたは DNA分子への結合が標的RNAまたはDNAの正常な機能を妨害し、かつ特異 的結合が望まれる条件、例えば、インビボアッセイまたは治療処置の場合には生 理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイを行う条件下で 、オリゴヌクレオチドの非標的配列に対する非特異的結合を回避するのに十分な 程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズするこ とができる。 特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の米国特許出願(本発明の譲受人 に譲渡されている)中に明記されているように、治療において、診断として、お よび研究のために用いることができる。これらの出願は次の表題を有する:Co mpositions and Methods for Modulatin g RNA Activity、1990年1月11日出願の第463,358 号;Antisense Oligonucleotides Inhibit ors of Papilloma Virus、1989年12月4日出願の 第445,196号;Oligonucleotide Therapies for Modulating the Effects of Herpes virus、1990年2月26日出願の第485,297号;Reagent s and Methods for Modulating Gene Ex pression Through RNA Mimicry、1990年3月 21日出願の第497,090号;Oligonucleotide Modu lation of Lipid Metabolism、,1990年4月3 0日出願の第516,969号;Oligonucleotides for Modulating the Effects of Cytomegalo virus Infections,1990年8月16日出願の第568,3 66号;Antisense Inhibitors of the Huma n Immunodeficiency Virus、1990年5月11日出 願の第521,907号;Nuclease Resistant Pyrim idine Modified Oligonucleotides for Modulation of Gene Expression、1990年7 月27日出願の第558,806号;Novel Polyamine Con jugated Oligonucleotides、1990年7月27日出 願の第558,663号;Modulation of Gene Expre ssion Through Interference with RNA Secondary Structure、1990年5月4日出願の第518 ,929号;Oligonucleotide Modulation of Cell Adhesion、1990年8月14日出願の第567,286号 ;Inhibition of Influenza Viruses、199 0年8月14日出願の第567,287号;Inhibition of Ca ndida、1990年8月16日出願の第568,672号;およびAnti sense Oligonucleotides Inhibitors o Papillomavirus、1990年12月3日出願のPCT/US90 /07067号。これらの特許出願は、オリゴヌクレオチドの相互作用によりR NAおよびDNAの活性の改良された調節を行うことのできる多くの手段を開示 している。上記特許出願中に開示される特定の配列を本発明とともに使用しうる 点において、上記米国特許出願の開示内容を本明細書の一部としてここに引用す る。 以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。実施例1 すべてSpのまたはすべてRpの5’−O−(1−チオトリホスフェート)ヌク レオシドの単離 5’−O−(1−チオトリホスフェート)デオキシヌクレオシドおよびリボヌ クレオシドは、ODS Hypersil(Shandon Southern ,Runcon,UK)を充填したカラムを用い、溶媒A(5mMのテトラブチ ルアンモニウムイオンを含む30mMリン酸カリウム、pH7.0)および溶媒 B(5mM水酸化テトラブチルアンモニウムのメタノール溶液)のアイソクラチ ック混合物で溶出するC−18逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に より単離される。あるいは、20分間で0%から15%のアセトニトリルの直線 濃度勾配変化を含む100mM炭酸水素トリエチルアンモニウム、pH7.5、 を用いると効果的な分離が達成される。 そのようなHPLCで分離したエナンチオマーの純度を確認するため、HPL Cで分離されたSpおよびRpデオキシヌクレオチドエナンチオマーを、E.I .Dupont,Wilmington,DEから市販品として入手可能なデオ キシヌクレオシド5’−O−(1−チオトリホスフェート)類と比較する。実施例2 ラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの実質的にすべてRpの糖間結 合を有するホスホロチオエート伸長物の合成 ラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライマーのすべてRpのホ スホロチオエート伸長物の酵素的合成は、修飾T7DNAポリメラーゼI,シー クエナーゼ(SequenaseTM)(U.S.Biochemicals C orp.Cleveland,OH)を用いて行う。このT7DNAポリメラー ゼを用いて、21merの天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドにハイブ リダイズした18merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライマーを伸 長させる。30ピコモル(pmol)のプライマーおよびテンプレートを含む1 XシークエナーゼTM反応緩衝液(U.S.Biochemicals Corp .,Cleveland,OH)(最終用量10μl)を95℃で5分間加熱し 、室温までゆっくり冷却する。180pmolのデオキシ5’−[α−35S]シ チジントリホスフェートおよびシークエナーゼTM酵素(U.S.Biochem icals Corp.,Cleveland,OH)を加え、37℃で20分 間インキュベートする。生成物を、20%ポリアクリルアミド/7M尿 素変性ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分析す る。生成物のオートラジオグラフをプライマー/テンプレートなしの対照反応と 比較する。最終生成物を、例えば、酵素的分解によりさらに特性決定する。その ような分解の1つは、ヘビ毒ホスファターゼ分解である。E.coli DNA ポリメラーゼIを用いて合成したジヌクレオシドモノホスホロチオエートのヘビ 毒ホスファターゼ分解は、ジヌクレオシドがRpコンフィギュレーションである ことを示す。実施例3 実質的に純粋なRp糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド CGACTATGCAAGTAC(配列番号13)の合成 配列特異的なすべてRpのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模な 酵素的合成は、55merの天然ホスホジエステルテンプレートおよび41me rの天然ホスホジエステルプライマーを用いて行った。テンプレート配列は: GTACTTGCATAGTCGATCGGAAAATAGGGTTCTCATCTCCCGGGATTTGGTTTGAG (配列番号14)であった。プライマー配列は、 CTCAACCAAATCCCGGGAGATGAGAACCCTATTTTCCGATC (配列番号15)であった。テンプレートは所望の特異的配列 CGACTATGCAAGTAC(配列番号13)に相補的な配列を有するように選択された。 5×から1×に希釈されたシークエナーゼTM緩衝液(U.S.Biochemi cals Corp.,Cleveland,OH)を使用した。テンプレート およびプライマーを両方とも20nMの濃度で40μLのこの緩衝液に加えた。 テンプレートおよびプライマーを95℃で5分間ハイブリダイズさせ、室温まで 冷却した。緩衝液を冷却後、緩衝液を7mMDTTに調整した。次に、20μL の1:8希釈シークエナーゼTM酵素および各々320μMのSpのGTPαS, CTPαS,ATPαSおよびTTPαSを加えた。反応溶液はH2Oにより1 40μLに調整した。反応液を37℃で18時間インキュベートした。反応溶液 を常法通り等量のフェノールで2回抽出し、常法通り−20℃で2.5容量の1 00%エタノールで処理することにより沈殿させ、ペレット化し、500μLの 70%エタノールで洗浄し、再びペレット化して乾燥した。沈殿を30分間20 μLのH2Oに懸濁し、次に40μLのH2O中1mM CaCl2,25mMト リスHCl,pH8.0に調整した。この溶液を95℃に5分間維持し、急冷し た(すなわち、氷で非常に急速に冷却した)。4.6μM DNase Iを加 え、37℃で10分間インキュベートすることにより、合成されたオリゴヌクレ オチドからテンプレートおよびプライマーを除去した。反応混合物をフェノール で2回抽出し、上記のごとくエタノールで沈殿させた。沈殿をH2Oに再懸濁し 、SepPakTMクロマトグラフィー(Millipore,Milford, MA)と組み合わせた20%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル電気泳動を用い て精製した。 別の合成法においては、PstI制限ヌクレアーゼ(Life Techno logies,Inc.,Gaithersburg,MD)を用いて、プライ マー結合ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを制限部位で切断した。所望の ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドCGACTATGCAAGTAC(配列番号13)は、 SepPakTMクロマトグラフィー(Millipore,Milford,M A)と組み合わせたポリアクリルアミド/7M尿素ゲル電気泳動を用いて精製し た。反応を通しての反復テンプレート−プライマー付加により影響される酵素的 カスケードを用いて、収率を最適化した。カスケード増加合成により20mlの 反応液から75 A260単位のすべてRpのコンフィギュレーションホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドCGACTATGCAAGTAC(配列番号13)を得た。実施例4 自動化DNA合成を用いての、糖間結合のラセミ体混合物を有するホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、常法により水素ホスホネート化学を用いる自動化DN A合成機(Applied Biosystems モデル380B)で合成し た[Agrawaletal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U. S.A.,85:7079(1988)]。最終カップリング工程後、結合オリ ゴマーを二硫化炭素/トリエチルアミン/ピリジン中イオウで酸化することによ りホスホロチオエート結合を発生させた。イオウ酸化後、水酸化アンモニウムに よる標準脱保護法を使用して支持体からオリゴヌクレオチドを解離させ、塩基保 護基を除去した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ ド精製カラム(OPC;ABI,FosterCity,CA)クロマトグラフ ィーおよびHPLC(Beckman System Gold HPLCを用 いて)により精製した。HPLC精製オリゴヌクレオチドは、続いてエタノール で沈殿させ、20%アクリルアミド/7M尿素上のゲル電気泳動または分析用H PLCにより最終純度を評価した。オリゴヌクレオチド配列の確実性は、ピリジ ン/水中でのヨウ素酸化および標準配列決定法により評価した。これらのオリゴ ヌクレオチドは、各々のリン結合において全ての可能なRpおよびSp異性体の 組合せの混合物を含む。実施例5 熱力学的および速度論的ハイブリダイゼーション分析のためのT7RNAポリメ ラーゼを用いる相補的DNAまたはRNA配列の合成 天然ホスホジエステル結合の短い相補的DNAオリゴヌクレオチドの合成は、 ABIモデル380BDNA合成機による標準自動化合成を利用して実施した。 正しい長さのオリゴヌクレオチドをHPLCにより精製し、標準技術により配列 決定した。 T7 RNAポリメラーゼを用いて、ハイブリダイゼーション分析のための短 い相補的RNAオリゴヌクレオチドを合成した。短いRNAを合成するのに必要 とされる多くのサイクルの開始のために高濃度で多量のT7 RNAポリメラー ゼが必要であった。この必要性のため、T7 RNAポリメラーゼは、T7 R NAポリメラーゼ発現ベクター、BL21/pAR1219を含む大腸菌株(B rookhaven National Laboratory,Upton, NYから入手された)から得た。2Lの細胞からの単離により約300,000 から500,000単位のT7RNAポリメラーゼが得られた。吸光度値=1. 2A600。これを短い(10−30ヌクレオチド)RNA種の合成のため十分に 濃縮した。合成のため、ABI合成機(ABI,Foster City,CA )を用いてT7プロモーター、および相補的標的配列およびT7プロモーターハ イブリダイゼーション配列を含むテンプレートを合成した。テンプレートおよび プロモーターをHPLCにより精製し、酵素的合成のために正しい化学種が存 在することを確実にした。合成された生成物を20%ポリアクリルアミド/8M 尿素ゲル上で精製し、常法により配列決定した。実施例6 熱変性 オリゴヌクレオチド(本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは その他のもの)は、相補的DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドとともに、各 々のオリゴヌクレオチドに対し4μMの標準濃度で100mMのイオン強度緩衝 液(89.8mM NaCl,10mMリン酸ナトリウム,pH7.0,0.2 mM EDTA)中でインキュベートした。試料を90℃に加熱し、Guilf ord Response II分光光度計(Corning)を用いて最初の 吸光度を測定した。次に試料を徐々に15℃まで冷却し、熱変性過程の間260 nmで吸光度の変化をモニターした。温度を1度ずつ上げて吸光度を読み、融解 曲線の一次導関数をとって変性プロフィールを分析した。データはまたTmおよ びデルタGを決定するため2相線形回帰分析を用いて分析した。これらの試験の 結果は表1に示されている。 実施例7 放射性標識オリゴヌクレオチドの合成 種々のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの結合ストリンジェンシーを定 量するため、フィルター結合アッセイを利用した。すなわち、これらがDNAま たはRNAとハイブリダイズして、ヘテロデュープレックスを形成する傾向を定 量した。これらのアッセイは放射性標識オリゴヌクレオチドを必要とする。 すべてRpの糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、S pモノマーから精製された[35S]−モノマーから酵素的方法により合成した。 キラル混合糖間結合を含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの自動合成の ために、水素ホスホネートを含むオリゴヌクレオチドを合成し、次にピリジン/ 二硫化炭素混合物中で元素状[35S]存在下で硫化した。得られた放射性標識ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドはOPCクロマトグラフィーおよびHP LCにより精製することができる。標的mRNAをニトロセルロースフィルター に適用し、80℃で2時間焼き、ブロッキングし、続いて放射性標識ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。結合ストリンジェンシー は、温度を高くした後または溶出緩衝液(例えばトリスNaCl緩衝液)のイオ ン強度を増加させた後にフィルターから溶出された放射性標識オリゴヌクレオチ ドを定量することにより評価した。溶出されたオリゴヌクレオチドはまた、アイ ソクラチックリン酸緩衝液を利用したアニオン交換HPLCプロトコールにおけ るそれらの移動度によっても評価した。結果を、糖間結合のラセミ体混合物を有 するように製造された標準オリゴヌクレオチドの移動度と比較した。実施例8 ヌクレアーゼ消化 10%ウシ胎児血清(FCS)を含む培地中でのホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドのヌクレアーゼ分解速度の決定は、10%熱不活性化FCSを含むダ ルベッコ改良必須培地(DMEM)中で実施した。培地に添加する前に55℃で 1時間FCSの熱不活性化を実施した。ラセミ体およびキラル的に純粋な糖間結 合を有するオリゴヌクレオチドについて、別々にヌクレアーゼ消化に対する耐性 を試験した。各々66μg/mlのオリゴヌクレオチドを別々に培地に添加し、 表2に示した時間間隔で37℃でインキュベートした。15μlのアリコートを とり、15μlの9M尿素を含む0.1Mトリス−HCl(pH8.3),0. 1Mホウ酸および2mMEDTAに加えた。アリコートをボルテックスにより混 合し、−20℃で保存した。20%ポリアクリルアミド/7M尿素スラブゲル上 でポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)分析を行った。電気泳動後“S tains All”(Sigma.Chem.Co.,St.Louis,M O)を用いてゲルを染色した。脱染色後、ゲルをUltraScan XL装置 (Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala ,Swedeu)を用いたレーザーデンシトメトリーにより分析した。積分を実 施し、データはインキュベーション前の完全長(n)からn−1へのパーセント 減少値として表した。Rpのキラル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオ チド配列CGACTATGCAAGTAC(配列番号6)についての結果を表2に示す。 表2から明らかなように、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドは、ラセミ体糖間結合を有するホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドよりもより高いヌクレアーゼ消化耐性を示した。実施例9 RNase H分析 ラセミ体の、および実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオ エートのRNase Hに対する感受性を分析した。オリゴヌクレオチド(RN Aに対し2倍モル過剰)および5μg(3.1kb)のインビトロで合成された mRNA(T7RNAポリメラーゼプロモーターを用いて)を5μlのRNas e Hハイブリダイゼーション緩衝液中60℃にて30分間インキュベートした 。試料を徐々に室温まで冷却し、次に3.7mg/ml BSA,20ユニット のE.coli RNase H(Promega),142mM DTT,1 50mM KClおよび3mM MgCl2に調節した。試料は37℃で30分 間 インキュベートした。次に試料をフェノール抽出、エタノール沈殿させ、1.2 %アガロースゲルでの電気泳動、続いてのエチジウムブロミド染色により分析し た。RNA試料のおおよその長さを決定するため、試料と同時にマーカーをゲル に流した。実施例10 HCVにより引き起こされる肝炎に罹患した患者を、それぞれ実施例3または 実施例19の方法にしたがって合成した、オリゴ#259(配列番号1)、オリ ゴ#260(配列番号2)、オリゴ270(配列番号3)、オリゴ#330(配 列番号4)またはオリゴ340(配列番号5)で処置する。1−1000μg/ kg体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈 内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復する ことができる。実施例11 ICAM−1により媒介される炎症性疾患に罹患した患者をISIS−230 2、すなわち実施例3または実施例19にしたがって合成され、配列GCCCAAGCTG GCATCCGTCA(配列番号6)を有するオリゴヌクレオチドで処置する。1−100 0μg/kg体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ま せ、静脈内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて 反復することができる。実施例12 サイトメガロウイルスにより引き起こされる網膜炎に罹患した患者を、ISI S−2922、すなわち実施例3または実施例19にしたがって合成され、配列 GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG(配列番号7)を有するオリゴヌクレオチドで処置する 、1−1000μg/kg体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体 中に取り込ませ、硝子内(intravitreally)投与する。処置は、 感染が除去されるまで必要に応じて反復することができる。実施例13 PKC−α−媒介性癌に罹患した患者を、ISIS−3521、すなわち実施 例3または実施例19にしたがって合成され、配列GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA(配 列番号8)を有するオリゴヌクレオチドで処置する。1−1000μg/kg体 重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内また は筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復することが できる。実施例14 C−rafキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、ISIS−5132、すな わち実施例3または実施例19にしたがって合成され、配列TCCCGCCTGTGACATGCA TT(配列番号9)を有するオリゴヌクレオチドで処置する。1−1000μg/ kg体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈 内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復する ことができる。実施例15 C−rafキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、それぞれ実施例3または実 施例19にしたがって合成したISIS−2503(配列番号10)、ISIS −2570(配列番号11)またはISIS−6957(配列番号12)を有す るオリゴヌクレオチドで処置する。1−1000μg/kg体重のオリゴヌクレ オチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内または筋肉内投与する 。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復することができる。 それぞれ実施例16、17および18の化合物1、2および3は、Stec et al.[Nucleic Acids Res.,19:5883(19 91)]およびStec and Lesnikowski[Methods in Molecular Biology,S.Agrawal,Ed.,V olume20、p.285,1993)の方法にしたがって合成した。実施例16 2−クロロ−1,3,2−オキサチアホスホラン(1)の合成 ピリジン(1mol)、ベンゼン(400mL)、2−メルカプトエタノール (0.5mol)および三塩化リン(0.5mol)の混合物を室温で30分間 撹拌する。塩化ピリジニウムを濾別し、溶媒を減圧下に蒸発させ、粗生成物を減 圧下の蒸留により精製する。70−72℃/20mmHgで沸騰する画分を回収 し、31P NMRにより特性決定する。実施例17 N,N−ジイソプロピルアミノ−1,3,2−オキサチアホスホラン(2)の合 成 化合物1(0.2mol)をn−ペンタン(300mL)に溶解し、ジイソプ ロピルアミン(0.4mol)を滴加する。反応混合物を室温で30分間撹拌し 、その後ジイソプロピルアミン塩酸塩を濾別し、溶媒を減圧下に蒸発させて、粗 生成物を真空蒸留により精製する。生成物2は、70℃/0.1mmHgで沸騰 する画分として得られ、これを31P NMRおよび質量分析により特性決定する 。実施例18 5’−O−ジメトキシトリチルチミジン−3’−O−[2−チオノ−1,3,2 −オキサチアホスホラン](3)の合成 5’−O−ジメトキシトリチルチミジン(10mmol)および1H−テトラ ゾール(11mmol)を真空乾燥し、ジクロロメタン(25mL)に溶解する 。化合物2(11mmol)を溶液に加え、反応混合物を室温で2時間撹拌する 。乾燥元素イオウ(15mmol)を加え、反応混合物を室温で16時間撹拌し 、放置する。次に未反応イオウを濾別し、濾液を減圧下に濃縮する。残渣をクロ ロホルム(3mL)に溶解し、シリカゲル(230−400メッシュ)カラムク ロマトグラフィーにより精製し、最初にクロロホルム、次にクロロホルム:メタ ノール(97:3)で溶出する。シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによ り化合物3の別々のジアステレオマー種を得る。化合物3を酢酸エチルに溶解し 、シリカゲル60Hカラムに負荷する。酢酸エチルを溶出溶媒として用い、溶出 はHPTLC(シリカゲル60、展開溶媒として酢酸エチル)によりモニターす る。化合物3の分離されたジアステレオマーを含む画分を減圧下に濃縮し、残渣 を31P NMRおよびHPLC(Lichrospher Si100、5μM 、溶出剤として酢酸エチル、流速3mL/分)により特性決定する。早い溶出画 分はSpジアステレオマーに対応し、遅い溶出画分はRpジアステレオマーであ る。実施例19 固相自動化合成における5’−OHヌクレオシドとジアステレオマー的に純粋な 化合物3との反応の立体特異的制御 Applied Biosystems(Foster City,CA)モ デル380B自動化DNA合成機を用いて、Stecらの方法にしたがった。5 ’−OHヌクレオシドとジアステレオマー的に純粋なヌクレオシドオキサチアホ スホラン、例えば化合物3との間の反応は、触媒として1,8−ジアザビシクロ (5.4.0)ウンデセ−7−エン(DBU)の使用を必要とする。自動化DN A合成においてオリゴヌクレオチドを支持体マトリックスに結合するために用い られる市販のリンカーはDBUに対して不安定であるため、リンカーにおける修 飾が必要である。オキサチアホスホラン法によるオリゴヌクレオチド合成のため の適当なリンカーは、DBUに耐性であり、濃水酸化アンモニウムにより室温で 1時間以内に加水分解することができる”コハク酸−サルコシニル”リンカーで ある。 (A)”コハク酸−サルコシニル”リンカーを用いる、固体マトリックスに結合 した5’−O−ジメトキシトリチルヌクレオシドの合成 (1)N−Fmoc−サルコシン(Bachem Bioscience,I nc.,Philadelphia,PA)(1.6mmol)を長鎖アルキル アミン−CPG(LCA−CPG,Sigma,St.Louis,MO)(2 g)に加え、真空下に乾燥した。無水DMF(5mL)、ピリジン(0.5mL )およびDCC(2.4mmol)を加え、反応混合物を室温で12時間振盪し た。次に溶媒を濾別し、支持体をメタノール:アセトニトリル:ピリジン(1: 1:1、3x20mL)で洗浄した。支持体をピリジン中のピペリジンの10% 溶液10mLで処理することにより、N−Fmoc保護基を除去した。N−サル コシニル化LCA−CPGをメタノール:アセトニトリル:ピリジン(1:1: 1、3x20mL)で洗浄し、真空下に乾燥した。 (2)5’−O−ジメトキシトリチルヌクレオシドを、DMF(2mL)、ピ リジン(0.2mL)およびDCC(50mg)の存在下に、(1)に記載のよ うにして得たサルコシニル化LCA−CPGに加えた。反応混合物を室温で12 時間振盪し、次にメタノール:アセトニトリル:ピリジン(1:1:1、3x2 0mL)で洗浄した。乾燥後、支持体をN−メチルイミダゾール:THF(1m L)および無水酢酸/ルチジン(1mL)で15分間処理した。次に、支持体を メタノール:アセトニトリル:ピリジン(1:1:1、3x10mL)、続いて アセトニトリル(3x10mL)で洗浄し、次に真空下に乾燥した。 (B)次に、ジアステレオマー的に純粋な活性化ヌクレオシドを、300倍モル 過剰のDBUの存在下に、サルコシニルLCA−CPG支持体に結合したオリゴ ヌクレオチドの上に加えた。活性化ヌクレオシドのジアステレオマーは、カップ リング反応において用いる前に、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル60H 、溶出溶媒として酢酸エチルを用いる、溶出はHPTLC(シリカゲル60、展 開溶媒として酢酸エチル)によりモニターした]で精製した。合成プロトコルは 表3に示される。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのジアステレオマー純度は、31P N MRにより、HPLC(Lichrospher Si100、5AM、溶出剤 として酢酸エチル、流速3mL/分)により、酵素的に、または電気泳動法によ り判定することができる。実施例20 ヒト患者における疾患状態の治療 本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の疾患状態の治療に用いることができる 。特定の疾患状態であると診断された患者の治療は、薬学的に許容される処方中 の有効用量のオリゴヌクレオチドを適当な経路で患者に投与することを含む。有 効なオリゴヌクレオチド用量は、治療すべき疾患状態、疾患状態の重篤度および 治療される患者の年齢に依存する。オリゴヌクレオチドの有効用量はそのIC50 に基づいて決定することができ、これは当業者には日常的な方法である。あるい は、オリゴマーの有効用量は、薬物動態学ソフトウエアプログラムTopFit を用いることにより決定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの用量 は、疾患状態の進行に依存して、体重1kgあたり0.01μg(子供用)から 100g(成人用)まで様々である。同様に、投与の頻度は、疾患状態の進行に 依存し、1日1回またはそれ以上から、20年に1度まで様々であろう。 オリゴヌクレオチド投与の経路は、治療すべき疾患状態による。例えば、炎症 性疾患について処置される患者へのオリゴヌクレオチドの投与は、経口または直 腸経路で行うことができる。AIDSに苦しむ患者の処置の場合には、オリゴヌ クレオチド投与の最も有効な方法は、経口経路または皮下注射によるものであろ う。癌、例えば乳癌は、皮下注射により処置することができ、一方、結腸癌はオ リゴヌクレオチドの経口または直腸投与により処置することができる。中枢神経 系の疾患または疾病は、オリゴヌクレオチドを患者の脊柱または脳に送達するた めに、髄腔内または脳室内投与により最もよく処置されるであろう。 オリゴヌクレオチド投与に続き、患者を疾患状態に伴う症状の緩和についてモ ニターすることができる。次に、疾患状態の重篤度および処置に対する反応性に より、用量を調節(増加または減少)することができる。 本発明のオリゴヌクレオチドを他の伝統的治療と組み合わせて投与することが 好ましいであろう。オリゴヌクレオチドは、AIDSに苦しむ患者の治療のため のAZT、炎症性疾患、例えば潰瘍性大腸炎の治療のためのスルファサラジン( sulfasalazine)、および結腸癌の治療のための5−フルオロウラ シル等の薬剤と組み合わせて投与することができるが、これらに限定されない。 また、疾患状態について治療が成功した患者に維持療法を投与することが望ま しいであろう。維持投与計画の一部としてのオリゴヌクレオチド投与の用量およ び頻度は、体重1kgあたり0.01μgから100gで、1日1回またはそれ 以上から数年に1回まで様々である。実施例21 オリゴヌクレオチドの脳室内投与 薬剤を患者の脳に直接送達するための脳室内薬剤投与は、脳を苦しめる疾患を 有する患者の治療に望ましいであろう。このオリゴヌクレオチド投与のモードを 行うために、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者の脳の脳室内に導入し、 これを腹部に外科手術で移植した皮下注入ポンプ(Medtronic Inc .,Minneapolis,MN)に接続する[Cancer Resear ch,44:1698(1984)]。ポンプを用いてオリゴヌクレオチドを注 入し、外部プログラミング装置の補助によって正確な用量調節および用量スケジ ュールの変更を行う。ポンプの貯蔵器容量は18−20mLであり、注入速度は 0.1mL/hから1mL/hの範囲であろう。毎日から毎月の投与の頻度およ び投与すべき薬剤の体重1kgあたり0.01μgから100gの範囲の用量に 依存して、ポンプ貯蔵器は、3−10週間間隔で補充することができる。ポンプ の補充は、ポンプの自己密封性隔膜を経皮的に穿剌することにより行われる。実施例22 オリゴヌクレオチドの髄腔内投与 患者の脊柱に薬剤を導入するための髄腔内薬剤投与は、中枢神経系の疾患を有 する患者の治療に望ましいであろう。このオリゴヌクレオチド投与の経路を行う ためには、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者のL3−4腰椎脊柱空間中 に移植し、これを上部腹部に外科手術で移植した皮下注入ポンプに接続する[T he Annals of Pharmacotherapy,27:912 (1993)およびCancer,41:1270(1993)]。ポンプを用 いてオリゴヌクレオチドを注入し、外部プログラミング装置の補助によって正確 な用量調節および用量スケジュールの変更を行う。ポンプの貯蔵器容量は18− 20mLであり、注入速度は0.1mL/hから1mL/hの範囲であろう。毎 日から毎月の投与の頻度および投与すべき薬剤の体重1kgあたり0.01μg から100gの範囲の用量に依存して、ポンプ貯蔵器は、3−10週間間隔で補 充することができる。ポンプの補充は、ポンプの自己密封性隔膜を経皮的に1回 穿剌することにより行われる。実施例23 AIDSに罹患した患者を、ISIS−5320、すなわち実施例3または実 施例19にしたがって合成し、配列TTGGGGTT(配列番号17)を有するオリゴヌ クレオチドで処置する。体重1kgあたり1−1000μgのオリゴヌクレオチ ドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、硝子内投与する。処置は、感染が 除去されるまで必要に応じて反復することができる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION     Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkagesCross Reference of Related Applications   This application is based on U.S. patent application Ser. No. 08/297, filed Aug. 29, 1994. 703 is a continuation-in-part application, filed October 16, 1991, This is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 07 / 777,007. This application US Patent Application No. 08 / 058,023 filed May 5, 1993 A continuation-in-part application, which is a US patent application Ser. 7 / 777,670 (May 18, 1993 as US Pat. No. 5,212,295) ), Which is part of US patent application Ser. No. 07 / 777,007. It is a continuation application. Each of the above patent applications is assigned to the assignee of the present invention. The entire disclosure of each application is incorporated herein by reference.Field of the invention   The present invention provides a sequence-specific phosphorothioate containing nucleosides linked by intersugar linkages. Oate oligonucleotides and their synthesis and use. More details In particular, the intersugar linkage connecting the nucleosides of the oligonucleotide of the present invention is substantially A purely all-Sp or all-Rp chiral phosphorothioate linkage. You. Such oligonucleotides are produced by chemical or enzymatic synthesis. You. They are particularly well suited as diagnostic, therapeutic and research reagents.Background of the Invention   Oligonucleotide hybridizes to single-stranded RNA or single-stranded DNA It is known. Hybridization is based on the bases of the oligonucleotide. A sequence-specific base pair hydrogen bond to a base of the target RNA or DNA. Like that Base pairs are said to be complementary to each other.   For determining the degree of hybridization of oligonucleotides to complementary nucleic acids In some cases, the relative ability of an oligonucleotide to bind a complementary nucleic acid The comparison can be made by measuring the melting temperature of the hybridization complex. it can. Melting temperature (Tm) is a physical property characteristic of a double helix. 5 (Hybridized) vs. Coiled (unhybridized) It represents the temperature (° C.) present at a ratio of 0%. Tm is high using the UV spectrum. Determined by determining the formation and collapse (melting) of hybridization complexes Is done. The base stacking that occurs during hybridization is due to UV absorption (Lightening). Thus, a decrease in UV absorption indicates a higher Tm. The higher the Tm, the greater the bond strength between the chains.   Target RNA using intracellular enzyme RNase H using oligonucleotide Can be performed enzymatically. Mechanism of such RNase H cleavage Indicates that the 2'-deoxyribofuranosyl oligonucleotide hybridizes to the target RNA. You need to soy. The resulting DNA-RNA duplex is RN Activates the ase H enzyme, and the activated enzyme cleaves the RNA strand. RNA strand Cleavage disrupts the normal function of the target RNA. Phosphorothioate oligonuc Leotide works by this type of mechanism. However, DNA oligonucleotides In order for leotide to be useful for cellular activation of RNase H, oligonucleotide Otides survive in cells for a time sufficient for RNase H activation, and It must be reasonably stable against lyse. Non-cellular uses, such as Oligonu In the use of nucleotides as research reagents, such nuclease stability Would not be necessary.   Some publications by Walder et al. Describe RNase H and oligonucleotides. The interaction with is described. Of particular interest are: (1) Dag le et al. , Nucleic Acids Research 199 0, 18, 4751; (2) Dagle et al. , Antisense Research And Development 1991, 1, 11; 3) Eder et al. , J. et al. Biol. Chem. 1991, 266, 6 472; and (4) Dagle et al. , Nucleic Acids   Research 1991, 19, 1805. According to these publications, Modified phosphodiester internucleoside linkages and modified phosphorothioate nucleosides DNA oligonucleotides that have both internucleotide linkages are cellular RNase H Substrate. Since these are substrates, the target RNA is Activate cleavage. However, the author further states that Xenopus s) In the embryo, both phosphodiester and phosphorothioate linkages Note that it also undergoes exonuclease degradation. Such a nucleus Degradation rapidly depletes oligonucleotides available for RNase H activation It is harmful.   As described in references (1), (2) and (4), the RNase H activity Stabilizes oligonucleotides against nuclease degradation with conjugation For phosphoramidates, alkyl phosphonates or phosphotriesters With a short section of phosphodiester-linked nucleotides located between the sections of A 2'-deoxyoligonucleotide was constructed. Contains phosphoramidate Since the oligonucleotide was stabilized against exonuclease, the In tribute (4), the authors argue that each phosphoramidate linkage is Causes a 1.6 ° C drop in the measured Tm value of the midate-containing oligonucleotide It is noted that it did. Such a decrease in Tm value is caused by the oligonucleotide and its Shows a decrease in hybridization between the target nucleic acid strand and the target nucleic acid strand.   Oligonucleotide applications as diagnostics, research reagents, and therapeutics include Gonucleotides are transported across cell membranes or taken up by cells Properly hybridizing to the target RNA or DNA, and subsequently It is necessary to stop or destroy nucleic acid function. These essential features are part Depends on the initial stability of the oligonucleotide to nuclease degradation You. In addition, these functions can be used to target oligonucleotides to target RNA or DNA molecules. Depends on the specificity of the leotide.   Serious deficiencies for these purposes of oligonucleotides are intracellular and cellular. Susceptible to enzymatic degradation by various ubiquitous nucleases That is. Unmodified, "wild-type" oligonucleotides are converted to nucleases It is not useful as a therapeutic because it is more rapidly degraded. Therefore, Modification of oligonucleotides to confer ase resistance It was a major focus of research aimed at developing treatment and diagnostics.   Modification of oligonucleotides to enhance nuclease resistance generally involves It has been performed in the sugar-phosphate backbone, especially on the phosphorus atom. Phosphorothioate Are reported to be resistant to nucleases. Furthermore, phosphorothioe The oligonucleotides generally are naturally occurring phosphodiester oligonucleotides More chemically more stable. Phosphorothioate oligonucleotides can also be Shows solubility in aqueous medium. In addition, phosphorothioate oligonucleotides -RNA heteroduplex acts as a substrate for foreign RNase H Can be In addition, phosphorothioate oligonucleotides have high thermal power Shows chemical stability. However, if the oligonucleotide is not The ability to bind with certainty depends on hybridization to target RNA or DNA. Although important to the oligonucleotide, modifications at the phosphorus atom of the oligonucleotide Demonstrates varying degrees of nuclease resistance, but generally poor hybridization Have the drawback of a non-linear characteristic [Cohen, J. et al. S. , Ed. , Oligonuc leoteides: Antisense Inhibitors of Gen e Expression (CRC Press, Inc., Boca Rat) on, FL, 1989].   The reason for this poor hybridization is due to the prochiral nature of the phosphorus atom. There will be. Modification at the internal phosphorus atom of the modified phosphorus oligonucleotide is Generates Rp and Sp stereoisomers.   Modified phosphorus oligos obtained to date where the resulting molecule has an asymmetric substituent The nucleotide is 2nPieces (n is between phosphorothioate sugars in the oligonucleotide) (Equal to the number of bonds). Therefore, 14 A 15-mer phosphorothioate oligonucleotide containing two asymmetric centers is 214That is, it contains 16,384 diastereomers. From this perspective, racemic In the mixture, only a small percentage of oligonucleotides have sufficient affinity Seems to specifically hybridize to target mRNA or DNA .   Chemically synthesized phosphorothioates with chirally pure intersugar linkages. Ligonucleotides have so far been characterized by one or two diastereomers Limited to molecules with only intersugar linkages. Has chirally pure intersugar linkages Oligonucleotide synthesis has not yet been achieved by automated synthesis. For example, a chemically synthesized library of sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides The effect of chirality introduced in the semi-mixture was not evaluated until recently. this is, This is because sulfur is incorporated non-stereospecifically during automated synthesis. For example, S tec et al. , J. et al. Chromatography, 326: 263 ( 1985) discloses certain oligonucleotide phosphorothiomers having racemic intersugar linkages. Oate was synthesized, but with one or at most two diastereomeric phosphorus Clarify diastereomers of certain small oligomers with bonds Only came.   However, Stec et al. [Nucleic Acids Res. , 19: 5883 (1991)], followed by automated stereocontrolled synthesis of oligonucleotides. Reported. The method described in the above-mentioned literature is based on a pentavalent phosphorothioyl center. Nucleophilic substitution catalyzed by bases in   Synthesis of phosphorothioates containing all Rp intersugar linkages using enzymatic methods Has been studied by several authors [Burgers and Ecks tein, J .; Biological Chemistry, 254: 6889 (1979); Gupta et al. , J. et al. Biol. Chem. , 256 : 7689 (1982); Brody and Frey, Biochemist. ry, 20: 1245 (1981); and Eckstein and Jobi. n, Biochemistry, 2: 4546 (1983)]. Brody et al. ( Biochemistry, 21: 2570 (1982)], and Roman iuk and Eckstein [J. Biol. Chem. , 257: 7684 (1982)] enzymatically convert poly TpA and poly ApT phosphorothioate Synthesized. Burgers and Eckstein [Proc. Natl. Ac ad. Sci. U. S. A. , 75: 4798 (1978)]. Suphorothioate was synthesized enzymatically. Cruse et al. [J. Mol. Biol. , 192: 891 (1986)] disclose three diastereomeric Rp GpC proteins. Hexathiothioate dimer linked by a natural phosphodiester bond Summer.   The relative ability of an oligonucleotide to bind to a complementary nucleic acid depends on the specific hybrid The comparison can be made by measuring the melting temperature of the isomerization complex. Melting temperature (Tm) is a physical property characteristic of a double helix, Represents the temperature (° C.) at which the il form (unhybridized) is present at 50%. T m is the hybridization formation and collapse (melting) using the UV spectrum. ) Is determined. Bases generated during hybridization Is accompanied by a reduction in UV absorption (lightening). Therefore, UV absorption A decrease indicates a higher Tm. The higher the Tm, the stronger the bond strength between the chains Will be larger. Non-Watson-Crick base pairs are strongly destabilizing to Tm Has an effect.   Preliminary report [Stec, J. et al. W. , Oligonucleotides as   Antisense Inhibitors of Gene Express session: Therapeutic Implications, Meetin g abstracts, June 18-21, 1989] Of two thymidine methyl phosphonates linked by a phosphodiester bond of All but one of the intersugar linkages have modified phosphate linkages Steric configuration of thymidine homopolymer octamer ("other than one") An "except one" Sp solid configuration has been formed. One Except for all Rp “other than one” methylphosphonate sequences which have an intersugar bond of Rp Specific thymidine homooctamer, ie (dT)8Is a 15-mer deoxyadenosine Homopolymer, ie (dA)FifteenAnd "except one" Sp configuration A similar thymidine homopolymer with a thiomethylphosphonate linkage, i.e. D (T) having all but one sp-sugar linkageFifteenAnd d (A)FifteenFormed by Thermodynamically more stable hybrid (Tm <O ° C.) (Tm 38 ° C.). The natural phosphodiester bond Have (dT)8Ie, octatimidylic acid and d (A)FifteenHybrid between Is reported to have a Tm of 14 ° C.   More recently, Ueda et al. [Nucleic Acids Research , 19: 547 (1991)] describes Rp diasters for use in translation systems. Les Enzymatic synthesis of mRNA intermittently incorporating omeric phosphorothioate linkages did. Ueda et al. Reported 17 promoters for T7 RNA polymerase and T7 coliphan DNA with one stop site was used. T7 RNA polymer In vitro synthesis by ribonuclease has been used for mRNAs with hundreds to tens of thousands of nucleotides. Generated.   Backbone chirality can also be attributed to phosphorothioate oligonucleotide-RNA heterogeneity. Will affect duplex susceptibility to RNase H activity . RNase H is an RNA-DNA oligonucleotide heteroduplex RNase H has been suggested to cause cleavage of RNA components in The ability to serve as a template for has significant therapeutic implications. Rp and For oligonucleotides containing a racemic mixture of Sp intersugar linkages, all oligonucleotides Suphorothioate oligonucleotides function equally as substrates for RNase H It is not known whether it can be done. Phosphodies of nucleic acids for various catalytic reactions The hydrolysis of the ter backbone is based on a stereospecific mechanism (in-line mechanism) and It proceeds by reversing the configuration. Therefore, for racemic mixtures , Correct chirality for maximum hybridization efficiency and translation termination Will only be present in a small percentage. You That is, it can serve as a substrate for RNase H in a heteroduplex. Increase the percentage of phosphorothioate oligonucleotides That would lead to more effective compounds for antisense therapy.   Substantially chirally pure to increase the certainty of hybridization High demand for phosphorothioate oligonucleotides with smart intersugar linkages I have. In addition, phosphoryls having such substantially chirally pure intersugar linkages Thioate oligonucleotides will lead to more effective therapeutic compounds. However, so far, there has been little success in synthesizing such molecules. . Accordingly, phosphorothioates having substantially chirally pure intersugar linkages A simple method for synthesizing oligonucleotides is highly desirable.   Nuclease resistance of oligonucleotides in the development of oligonucleotide therapy It is recognized that sex and hybridization certainty are very important Came. Oligonucleotides with nuclease resistance are also used as research reagents and diagnostics. It is also desired as a drug withdrawal.Summary of the Invention   In accordance with the present invention, all nucleoside units are substantially all Sp Phosphorothioate intersugar linkage or substantially all Rp phosphorothioate sugars Phosphorothioate oligonucleotides linked together by any of the interlinks Otide is provided. Preferably, the phosphorothioate oligonucleotide of the invention The tide is complementary to at least a portion of the sequence of the target RNA or DNA.   Further, in accordance with the present invention, a system having substantially chirally pure intersugar linkages. Chemical and enzymatic synthesis of column-specific phosphorothioate oligonucleotides A method is provided. Here, the phosphorothioate oligonucleotide is actually Together either qualitatively all of the Rp or substantially all of the Sp Consisting of at least 10 nucleoside units linked to Preferably, Suphorothioate oligonucleotides are capable of providing substantially chirally pure intersugar linkages. Consisting of about 10 to about 50 more linked nucleoside units. More preferred The phosphorothioate oligonucleotide is substantially chirally pure Consisting of about 15 to about 30 nucleoside units linked by an intersugar linkage. Most Also preferably, said phosphorothioate oligonucleotide is substantially chiral. From about 17 to 21 nucleoside units linked by an essentially pure sugar linkage Become. The method uses all four of the sequence primer, template, and excess Of a chirally pure nucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) Including combining. The method further comprises the addition and subsequent addition of a polymerase. Cleavage of the primer from the complementary oligonucleotide will result in a complementary oligonucleotide. And synthesizing leotide. Further, the method comprises the complementary oligonucleotide. Dissociating the oxide from the template.   Sequence-specific phosphorothioates with substantially chirally pure intersugar linkages. In another embodiment of the method of the present invention for synthesizing a oligonucleotide, the sequence primer , Template and nucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) Combine the racemic mixture of It has a substantially chirally pure intersugar linkage and A phosphorothioate oligonucleotide that is complementary to the template is It is synthesized by adding the enzyme and selected metal ions. Like this The synthesized oligonucleotide is dissociated from the template and primer. Let   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages Otide is a heteroduplex formed with target RNA and DNA It is useful for increasing the thermodynamic stability of E.g. Furthermore, the oligonucleotides of the present invention are useful for modulating the activity of RNA. You.Detailed description of the invention   The phosphorus atom in the phosphodiester bond of the oligonucleotide is a "prochiral" It can be said that. When the non-bonded oxygen atom of the phosphodiester bond is substituted or Is modified to produce a chiral sugar-phosphate linkage. The resulting sugar linkage is S It is either a p-to-sugar linkage or an Rp-to-sugar linkage. Natural phosphodiester linkage Displacing the unbound oxygen atom of with sulfur to give a phosphorothioate linkage gives the chiral A center is formed, giving Sp and Rp diastereomers. Phosphorus atom in sugar backbone Are substantially all Sp or Rp. Called pure.   Ribonucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) (NTPαS) And 2'-deoxyribonucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate G) (dNTPαS) is described in Ludwig and Eckstein [J. Org. Chem. , 631 (1989)], and racemic Sp and Rp. Synthesized as a mixture. In this exemplary synthetic scheme, the unprotected nucleo Is converted to 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Which phosphitylates the 5'-hydroxyl group. Following Pyrophos Reaction with phosphate induces cyclic triphosphates that are reactive towards sulfur. A conductor is formed and the Rp and Sp nucleosides 5'-O- (1-thiotriphospho ), Ie a mixture of α-thiotriphosphates. The product For example, purification by DEAE-Sephadex chromatography, NMR Identification using optical analysis (by characteristic Rp or Sp chemical shift) it can.   As shown in the examples below, pure Rp and Sp nucleoside-5'- The O- (1-thiotriphosphate) diastereomer can be produced, for example, by reversed-phase HPLC. It can be easily isolated on a production scale using chromatography. like this Nucleotide diastereomers isolated by simple HPLC can And Sp nucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) diastereomer Can be further characterized by analytical HPLC comparison with commercial samples of   Sequence-specific natural oligonucleotides, i.e. natural phosphodiester Enzymatic synthesis of oligonucleotides is suitable in the presence of templates and primers. It can be performed by using an appropriate nuclease. Similarly, chirally mixed Racemic mixing of phosphorothioate oligonucleotides with combined intersugar linkages Can be synthesized. According to the invention, such an enzymatic synthesis is Enantiomerically pure in the presence of column-specific templates and primers All Sp or all Rp nucleosides 5'-O- (1-thiotriphosphine Is used as a substrate for a suitable nuclease, thereby providing substantially chiral Sequence-Specific Phosphorothioate Oligonucleotides with Pure Intersugar Bonds Can be further developed to include the synthesis of For example, commercially available DNA poly Sequenase, a meraseTM(U.S. Biochemical, Inc. , Cleveland, OH). Nucleotide Templates and Racemic Phosphorothioate Oligonucleotides Can be used to synthesize phosphorothioate oligonucleotides it can. By using this polymerase, phosphodiester and phosphodiester Both rothioate primers can be extended.   The yield of enzymatically synthesized phosphorothioate oligonucleotides is Repeat polymerase by repeatedly adding rates and primers By repeatedly adding the nucleoside triphosphate, Or to optimize by combining some or all of these Can be. For example, repeated addition of template and primer The maximum cascade yield is maximized. Further optimization is done with templates and Pre-hybridization with the immersion buffer in the system buffer, followed by cooling And by adding a nucleoside triphosphate and a polymerase. Wear.   Select the appropriate polymerase to allow DNA or RNA phosphorothioate Gonucleotides can be produced. Such polymerases include T 7 DNA polymerase, a modified T7 DNA polymerase, such as those discussed above. QuenaseTM, E .; coli DNA polymerase, DNA polyklenowra Fragment polymerase, M.P. Luteus polymerase, T4 tap Teriophage polymerase, modified T4 DNA polymerase, T7 RNA polymer Lase and E. coli RNA polymerase, but not necessarily Are not restricted.   Enzymatic synthesis involves the configuration of a phosphorus atom around a chiral center. Proceed with reversal. That is, use of all α-thiotriphosphates of Sp. Use yields phosphorothioate oligonucleotides of substantially all Rp , The use of all Rp α-thiotriphosphates results in substantially all of the Sp A phosphorothioate oligonucleotide results. In another aspect of the invention, Phosphorothioate oligonucleotides use metal ions in the reaction solution Promotes preferential uptake of one or the other chiral α-thiotriphosphate To form a nucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) It can be synthesized from a racemic mixture. As mentioned above, phosphorothioate Oligonucleotide polymerase synthesis involves the precursor nucleoside-α-thiotri With a reversal of configuration around the chiral center of the phosphate Achieved. While not wishing to be bound by theory, all of Rp's The optimization of the configuration is described, for example, in E. Reaction using E. coli polymerase This can be achieved by adding high concentrations of magnesium ions in the buffer. It is thought that. Similarly, while not wishing to be bound by theory again, All Sp configurations have high manganese ion in reaction buffer. It is thought that it can be obtained by using the ion concentration.   According to the invention, "substantially all" means at least 75% of the sugar linkages Is meant to include all oligonucleotides that are chirally pure. More preferably, it has about 85% to about 100% chirally pure intersugar linkages. Oligonucleotides are substantially chirally pure. Most preferably, about 9 Oligonucleotides with 5% to about 100% chirally pure intersugar linkages are Is substantially chirally pure.   In the context of the present invention, the term "phosphorothioate oligonucleotide" refers to Phosphorothio formed from naturally occurring bases, sugars and phosphorothioate linkages Oate oligonucleotides. Naturally occurring bases include adenine and guani , Cytosine, thymine and uracil. Natural sugars include β-D-ribo Includes furanosyl and β-D-2'-deoxy-erythro-pentofuranosyl. It is. "Phosphorothioate oligonucleotides" also include nucleoside-5 ' -O- (1-thiotriphosphate) analogs are suitable substrates for polymerases To some extent, the phosphorothioate nucleotide unit of the oligonucleotide. Modified sugars or modified bases incorporated into the sugars. Oligo of the invention Modified bases of nucleotides include adenine, guanine, cytosine, uracil Thymine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl, 2 -Propyl and other alkyl-adenines, 5-halouracil, 5-halocytosine 6-azauracil, 6-azacytosine and 6-azathymine, pseudoura Syl, 4-thiouracil, 8-haloadenine, 8-aminoadenine, 8-thio- Luadenine, 8-thiolalkyladenine, 8-hydroxyl adenine and Other 8-substituted adenine, 8-haloguanine, 8-aminoguanine, 8-thiol Guanine, 8-thiolalkylguanine, 8-hydroxylguanine and others 8-Substituted guanines, other aza and deazauracils, other aza and deazachi Midines, other aza and deazacytosine, other aza and deazaadenine, other Aza and deazaguanine, 5-trifluoromethyluracil and 5-trif Luorocytosine is included. The sugar component can be either deoxyribose or ribose. There may be. The oligonucleotides of the present invention can also be modified nucleobases or Other modifications consistent with the spirit of the invention, especially as therapeutic, diagnostic or research reagents Easily To include a nucleobase having a modification that increases its nuclease resistance Is also good. Oligonucleotides of the invention are used as diagnostic, therapeutic and research reagents can do. These can be used to treat an effective amount of the oligonucleotide of the invention with a suitable drug. For use in pharmaceutical compositions by adding to a biologically acceptable diluent or carrier. Can be These are further characterized by the undesired production of proteins. Can be used to treat an organism having a disease of interest. Organisms, desirably Has a sequence that can specifically hybridize with the target nucleic acid The oligonucleotide of the present invention.   Formulation of the therapeutic composition and its subsequent administration is well within the skill of the artisan. Conceivable. Generally, for treatment, it is primarily intended for patients in need of such treatment. The oligonucleotide according to the invention is treated, usually in a pharmaceutically acceptable carrier. Depending on the age of the patient being treated and the severity of the disease state, 0.0 Administer doses ranging from 1 μg to 100 g. In addition, treatment plans may Duration, which will vary depending on the characteristics of the patient, its severity, and the patient's overall condition. It can be extended from once a day to once every few years. After the procedure, the patient is For changes in the status of the disease and for relief of symptoms of the disease condition. Patient is present Increase the oligonucleotide dose if it does not respond significantly to the current dose level Or if relief of symptoms of the disease state is observed, or If the condition is eliminated, the dose can be reduced.   The oligos of the present invention, optionally in combination with other traditional therapeutic modalities, It may be more effective to treat the patient with the nucleotide.   Dosage may be adjusted for several days until healing occurs or reduction in disease state is achieved. The course of treatment for up to several months depends on the severity and responsiveness of the condition to be treated. Most Dosage schedules can be calculated from measurements of drug accumulation in the patient's body. Wear. Persons of ordinary skill can easily determine optimum dosages, dosing methodologies and repetition rates. . Optimal doses will vary depending on the relative potency of the individual oligonucleotides, Has been found to be effective in vitro and in vivo in animal models. C50Can be estimated based on Generally, the dose is 0.0 1 μg to 100 g, once a day or more, once a week, once a month To Given once or once a year, or once every few years.   Following a successful treatment, the oligonucleotide should be given a weight of 1 to prevent recurrence of the disease state. 0.01 μg to 100 g per kg, once a day or more, once every several years It may be desirable to provide maintenance therapy to the patient at a maintenance dose in a range of times.   Pharmaceutical compositions of the invention may be used to determine whether local or systemic treatment is desired and It can be administered in a number of ways depending on the area to be treated. Administration is Topical (including ophthalmic, vaginal, rectal, nasal), oral or parenteral be able to. For parenteral administration, intravenous infusion, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, Or intrathecal or intraventricular icular) administration.   Formulations for topical administration include transdermal patches, ointments, lotions, creams, Gels, drops, suppositories, sprays, solutions and powders may be included. Normal Pharmaceutical carriers, aqueous, powder or oily bases, thickeners, etc. are necessary or desirable There will be. Coated condoms, gloves, etc. may also be useful.   Compositions for oral administration include powders, granules, suspending agents in water or non-aqueous media Or a solution, capsule, sachet, or tablet. Thickening agent, aroma Agents, diluents, emulsifiers, dispersing aids or binders may be desired.   Compositions for intrathecal or intraventricular administration include buffers, diluents and other Sterile aqueous solutions that may contain suitable additives are included.   Formulations for parenteral administration include buffers, diluents and other suitable additives. Sterile aqueous solutions that may be included are included.   The phosphorothioate oligonucleotide of the present invention can be used for hybridization. , For their effects on nuclease resistance and RNase H activity, Natural phosphodiester oligonucleotides and racemic phosphorothioates Can be compared to both nucleotides. Similarly, substantially chirally pure Pure phosphorothioate oligonucleotides with a unique intersugar linkage The ability to increase the effectiveness of the treatment in a test system can be assessed. Increasing the efficacy of such treatments may include pharmacokinetics or metabolism, toxicology, (I.e. absorption and distribution) and species comparisons.   Homopolymers with all Rp or all Sp intersugar linkages have stability and And was useful for the first study of other characteristics. However, these oligonucleotides Tides have little therapeutic use because they are not specific to target molecules. target In order to specifically hybridize to a nucleic acid, a phosphorothio having a specific sequence is required. Eate oligonucleotides are required.   Sequence-specific phosphorothioates with substantially chirally pure intersugar linkages. Ligonucleotides heat the heteroduplex with target RNA and DNA. Useful for increasing mechanical stability and conferring RNase H activity.   Using radiolabels, phosphorothiones with substantially chirally pure intersugar linkages It can aid in the identification of oate oligonucleotides. Synthesize with an automated synthesizer Racemic phosphorothioate oligonucleotides For the oxidation reaction of the obtained hydrogen phosphonate oligomer,35S] (radioactive label Elemental sulfur). Enzymatically synthesized phosphorothioe Labeling of the oligonucleotide is [α-32P] ATP and ligase Or [α-35S] can be performed using ATP . In addition, radiolabeled nucleoside triphosphates can be probed and sequenced. Can be used in analysis. Autoradiograms are created in a standard way. It is.   The template of the present invention comprises a region of a nucleic acid sequence that directs the synthesis of a disease enhancing protein. Is most preferred. For the region of the template oligonucleotide Short oligonucleotides that form base pairs with each other Acts as a primer forming the starting point for leotide synthesis.   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages Otides are susceptible to nuclease cleavage, e.g., restriction endonuclease cleavage. Can be synthesized using primers selected to have a site on it it can. The cleavage site may be located at the 3 'end of the primer. Suitable Cleavage at the site by the appropriate restriction endonuclease results in the first 5 ' An oligonucleotide is obtained from which the terminal nucleoside is obtained from the primer. Departure Another nucleoside of said phosphorothioate oligonucleotide is enzymatically Nucleoside chiral thiotriphosphate added by means.   By selecting an appropriate restriction nuclease with the selected primers The various 5'-terminal nucleosides of the desired phosphorothioate oligonucleotide Can be appropriately placed at the 5 'end of the phosphorothioate nucleotide. You. That is, one nucleoside from the primer is newly A newly synthesized sequence-specific phosphorothioate oligonucleotide of the present invention Design any endonuclease recognition site as long as it is the first 5 'nucleoside Can be This results in the enzymatically synthesized phosphorothioe of the present invention. Various nucleosides are generated at the 5 'end of the salt oligonucleotide.   Complete the enzymatic extension of the primer on the appropriate template of the desired sequence Then, by using an appropriate nuclease, the phosphorothioate of the present invention can be used. Ligonucleotides can be eliminated from the primer. For example, desired A guanosine nucleoside at the 5 'end of the phosphorothioate oligonucleotide Using a primer having the sequence CTGCAG at the 3 'end Can be Next, by using Pst1 restriction nuclease, A-G The bond can be broken. Therefore, the guanosine nucleotide of this AG bond The osidic component is the 5 'terminal nucleic acid of the desired phosphorothioate oligonucleotide. It can be incorporated as an osid. Other restriction endonucleases include But not limited, BamH1, Smal and HinD III restriction endonucleases There is creatase.   The oligonucleotide still associated with the template, And then, for example, by gel electrophoresis and / or chromatography. Therefore, it can be purified. For example, a suitable purification is SepPac (Mill standard in combination with ipore, Milford, MA) chromatography Polyacrylamide / urea gel electrophoresis. Use Another useful chromatography technique is HPLC chromatography.   The chiral phosphorothioate oligonucleotides of the present invention also include t al. [Nucleic Acids Res. , 19: 5883 (199 1)] and Stec and Lesnikowski (Methods i n Molecular Biology, S.M. Agrawal, Ed. , Vo lume 20, p. 285, 1993]. It can be chemically synthesized via a xathiaphosphorane intermediate.   Having substantially chirally pure intersugar linkages synthesized according to the methods of the present invention. Phosphorothioate oligonucleotides can be analyzed by a number of methods. Can be. For example, the resulting substantially chirally pure all Sp or sulfur Sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides having all Rp intersugar linkages The configuration analysis for31P] Judgment using NMR chemical shift be able to. Such a chemical shift is associated with the phosphorothioate dinucleotide. Used to identify Rp epimers (Ludwig and Ecks tein, J .; Org. Chem. , 631-635 (1989)].   The sequence accuracy of the phosphorothioate oligonucleotides of the present invention is Can be determined using the sensitivity of the heteroduplex to lease Wear.   The phosphorothioate oligonucleotide sequence is When the 3'-hydroxyl group of the nucleotide is [α-32P] Cordycepin triphosphate Labeled (i.e., 3'-deoxyadenosine-5'-triphosphate) By doing so, confirmation can be further enhanced. Oligonucleotide obtained The tide can also be subjected to enzymatic degradation.   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages The relative ability of otide to bind to the complementary strand is substantially chirally pure intersugar linkage Of a phosphorothioate oligonucleotide having a nucleoside with its complementary strand The comparison can be made by measuring the melting temperature of the isomerization complex. Melting temperature (Tm) is a physical property characteristic of a double helix, Mean celsius temperature at which il form (unhybridized) is present at 50% doing. Tm is determined by hybridization formation using the UV spectrum. And decay (melting). Hybridization Intermediate base stacking is accompanied by a reduction in UV absorption (lightening). as a result , A decrease in UV absorption indicates a higher Tm. The higher the Tm, the more chain binding strength The degree is greater. Non-Watson-Crick base pair is strongly unstable to Tm Has a chemical effect. Therefore, the optimal choice of oligonucleotide for its target RNA In order to obtain binding, it is desirable that base pairs be as close to optimal accuracy as possible. No.   The phosphorothioate oligonucleotides of the present invention further include various exonucleic acids. Evaluate resistance to degradability of reases and endonucleases be able to. Treating the phosphorothioate oligonucleotide with nuclease Next, for example, electrophoresis (PAGE) using a polyacrylamide gel is performed, and the To a suitable dye [eg, Stains AllTM(Sigma Chem. C o. , St. [Lois, MO)]. Can be. Degradation products can be quantified using laser densitometry. Can be.   Substantially chirally pure intersugar linkages using fetal calf serum and human serum Nucleolysis to phosphorothioate oligonucleotides having (olitic) activity can be assessed. For example, substantially all Rp sugars Evaluation of phosphorothioate oligonucleotides with intermolecular bonds in this way can do. 3'- or 5'-end-capped molecule (1 cap Having one or several phosphorothioate linkages) Test to find the combination that produces the greatest nuclease stability be able to. Capping uses sequenced Rp monomers to cap the sequence. The cap portion is chemically synthesized, and the cap is then placed on an oligonucleotide on a DNA synthesizer. It can be carried out by incorporating it into leotide. Regarding capping Analysis shows the importance of chirality on nucleolytic stability and the maximum stability Can be determined to determine the number of bonds required to obtain   Phosphorothioate oligonucleotides for the catalytic activity of RNase H- The sensitivity of the RNA heteroduplex can also be assessed. Phosphorothio Eat oligonucleotides can be used at various hybridization temperatures with radioactive labels. Together with the identified target mRNA (eg, synthesized via T7 RNA polymerase). Can be cubated. Next, Minshul and Hunt [N uc. Acid Res. , 6433 (1986)). E., heteroduplex. 37 ° C with RNase H from E. coli Can be incubated. Next, the product was analyzed by Northern blot analysis. RNase H activity. In this method, the raw The product was electrophoresed on a 1.2% agarose / formaldehyde gel and nitrocellulose Transfer to the source. Next, a random primer complementary to the target mRNA [32P] -label Search for filters using cDNA and quantify by autoradiography I do. By comparing various phosphorothioate analogs, RNA and complex Effect on the ability to act as a substrate for RNase H when formed You can examine the effect of sexuality.   E. FIG. E. coli RNase H and mammalian RNAse H A comparison of the sensitivity of heteroduplexes can be made. Heterodue The plex was incubated in rabbit reticulocyte lysate under translational conditions. Northern blot for catalytic cleavage of mRNA by endogenous RNase H It can be assayed by analysis. This allows mammalian RNAse The effect of chirality on H activity can be examined.   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages Otide has also been reviewed for inhibition of gene expression in cell culture model systems. Can be valued. Substantially Pure Chirally Pure Phospho with Intersugar Bonds Rothioate oligonucleotides are more potent or more specific for gene expression Designed to target a reporter gene to determine if it is an inhibitor Phosphorothioate oligonucleotides having substantially chirally pure intersugar linkages Can synthesize and test nucleotides in cell culture models of gene expression You. Effect of antisense on gene expression using vector pSV2CAT Examining has been described previously [Henthorn et al. , Proc . Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 85: 6342 (1988)]. . This vector contains the bacterial chloramphenicol under the control of the SV40 promoter. Acetyltransferase gene. Translation of CAT mRNA 15-mer phosphorothio having all Rp intersugar linkages of the initially complementary sequence D PSV2CAT was transferred to HeLa cells using a target oligonucleotide. And then all phosphorothioate oligonucleotides having an Rp intersugar linkage. Cells can be treated with otide for 48 hours to assay intracellular CAT activity. Wear. Next, a phosphorothioate having a substantially chirally pure intersugar linkage is prepared. The activity in inhibiting gene expression is determined by the use of chemicals with diastereomeric intersugar linkages. Random phosphorothioate and natural phosphodiester of the same sequence Can be directly compared to oligonucleotides.   The vector pSV2APAP [Marcus-Sekura et al. , N ucleic Acids Research, 15: 5749 (1987)] Contains the mammalian placental alkaline phosphatase gene (PAP). This is also Used as a reporter to measure the effect of antisense on gene expression Can also be used. PAP is an intron and other RNA processing signal Reporter in that it is a mammalian gene, not a bacterial gene containing As a gene, it has advantages over CAT. At present, the expression of PAP is Is thought to more closely mimic events in mammalian gene expression in . A substantially chirally pure sugar linkage, as described above for CAT mRNA 15-mer phosphorothioate oligonucleotides with similarity Racemic phosphorothioate and natural phosphodiester containing Can be examined in parallel with the oligonucleotide. PAP and CAT repo Experiments to determine non-specific effects of protein constructs on gene expression Used as a control in   In addition, phosphorothioate oligomers having substantially chirally pure intersugar linkages Gornucleotides demonstrate their ability to act as inhibitors of RNA translation in vivo. Can be evaluated. Various therapeutic fields are based on the oligonucleotide of the present invention. Can be the target of such operations. One therapeutic area is hepatitis C virus Hepatitis caused by HCV. The following phosphorothioate olives Gonucleotides have applications in the treatment of HCV hepatitis: oligo # 259, CCTTTC GCGACCCAACACTA (SEQ ID NO: 1), oligo # 260, GCCTTTCGCGACCCAACACT (sequence No. 2), oligo 270, GTACCACAAGGCCTTTCGCG (SEQ ID NO: 3), oligo # 330, GTGCTCATGGTGCACGGTCT (SEQ ID NO: 4) and oligo # 340, TTTGG ATTCGTGCTCATGG (SEQ ID NO: 5). Another therapeutic area is cell-cell adhesion molecules (ICAM- It is an inflammatory disease mediated by 1). Ori with application in the treatment of inflammatory diseases The oligonucleotides include ISIS-2302, GCCCAAGCTGGCATCCGTCA (SEQ ID NO: 6). ) Is included. Another therapeutic area is the induction by cytomegalovirus (CMV). Includes infections caused. ISIS-2922 applied for the treatment of CMV retinitis A phosphorothioate oligonucleotide having the sequence GCGTTTGCTCTTCTTC It has TTGCG (SEQ ID NO: 7). Another therapeutic area includes protein kinase C-α (P KC-α) -mediated cancers. ISIS-3521 provides such A phosphorothioate oligonucleotide having application in the treatment of cancer, having the sequence GT It has TCTCGCTGGTGAGTTTCA (SEQ ID NO: 8). Yet another therapeutic area includes Cr af kinase-mediated cancers are included. ISIS-5132 is a treatment for such cancers. A phosphorothioate oligonucleotide having application to the sequence TCCCGCCTGT GACATGCATT (SEQ ID NO: 9). Yet another therapeutic area is Ha-ras or Include cancers mediated by Ki-ras. The following phosphorothioate oligonucleotides Nucleotides have applications in the treatment of such cancers: ISIS-2503, TCCG TCATCGCTCCTCAGGG (SEQ ID NO: 10), ISIS-2570, CCACACCGACGGCGCCC (SEQ ID NO: 11), and ISIS-6957, CAGTGCCTGCGCCGCGCTCG (SEQ ID NO: No. 12). Another therapeutic area is HIV-mediated AIDS and other related Infections. ISIS-5320 is a host that has application in the treatment of AIDS. Holothioate oligonucleotide having the sequence TTGGGGTT (SEQ ID NO: 17) I do. In the above sequence, the individual nucleotide units of the oligonucleotide Are written from left to right in the 5 'to 3' direction.   In the context of the present invention, "hybridization" refers to complementary nucleotides. Means hydrogen bonds between the two units, which are Watson-Crick, Hoogstee Or an inverse Hoogsteen hydrogen bond. For example, adenine and thimi Are complementary nucleobases that pair by hydrogen bond formation. In this specification As used herein, "complementary" refers to the sequence complementarity between two nucleotide units. Also represent. For example, a nucleotide unit at a certain position on an oligonucleotide Hydrogen bond to a nucleotide unit at the same position on a DNA or RNA molecule If possible, the oligonucleotide and DNA or RNA are Are considered to be complementary to each other. Oligonucleotides and their DNA or R NA means that a sufficient number of corresponding positions in each molecule can hydrogen bond with each other When occupied by nucleotide units, they are complementary to each other. That is, "Specifically hybridizable" and "complementary" refer to oligonucleotides Sufficient for stable and specific binding to occur with the target RNA or DNA A term used to indicate a degree of complementarity. Oligonucleotide specific Must be 100% complementary to its target DNA sequence to be able to hybridize to It will be appreciated that there is no need. The target RNA of the oligonucleotide or Binding to a DNA molecule interferes with the normal function of the target RNA or DNA and is specific Conditions for which specific binding is desired, for example, in the case of in vivo assays or therapeutic treatments. Under physical conditions or, in the case of in vitro assays, the conditions under which the assay is performed Sufficient to avoid non-specific binding of oligonucleotides to non-target sequences If there is a degree of complementarity, the oligonucleotide will hybridize specifically. Can be.   In particular, the oligonucleotides of the present invention are disclosed in the following U.S. patent applications (assignee of the present invention): As a diagnostic, in the treatment, as specified in And can be used for research. These applications have the following title: Co compositions and Methods for Modultin gRNA Activity, 463,358, filed Jan. 11, 1990. No .: Antisense Oligonucleotides Inhibit ors of Papilloma Virus, filed December 4, 1989 No. 445,196; Oligonucleotide Therapies for Modulating the Effects of Herpes virus, No. 485,297, filed Feb. 26, 1990; Reagent s and Methods for Modulating Gene Ex presentation Through RNA Mimicry, March 1990. No. 497,090 filed on the 21st; Oligonucleotide Modu ration of Lipid Metabolism, April 3, 1990. No. 516,969 filed on Nov. 0; Oligonucleotides for Modulating the Effects of Cytomegalo virus Infections, filed on August 16, 1990, filed on 568,3. No. 66; Antisense Inhibitors of the Huma n Immunodeficiency Virus, published May 11, 1990 No. 521,907; Nuclease Resistant Pyrim Idine Modified Oligonucleotides for Modulation of Gene Expression, July 1990 No. 558,806 filed on Nov. 27; Novel Polyamine Con Justified Oligonucleotides, July 27, 1990 No. 558,663; Modulation of Gene Express session Through Interference with RNA Secondary Structure, No. 518, filed May 4, 1990. , No. 929; Oligonucleotide Modulation of Cell Adhesion, filed August 14, 1990, No. 567,286. Inhibition of Influenza Viruses, 199; No. 567,287 filed on Aug. 14, 0; Inhibition of Ca ndida, No. 568,672, filed August 16, 1990; and Anti. sense Oligonucleotides Inhibitors o PCT / US90, filed December 3, 1990, by Papillomavirus / 07067. These patent applications disclose the use of R Discloses many means by which improved regulation of NA and DNA activity can be achieved doing. Certain sequences disclosed in the above patent applications may be used with the present invention. In this regard, the disclosure of the above-mentioned U.S. patent application is incorporated herein by reference. You.   The following examples are illustrative and do not limit the invention.Example 1 5'-O- (1-thiotriphosphate) nucleotide of all Sp or all Rp Isolation of leoside   5'-O- (1-thiotriphosphate) deoxynucleoside and ribonucleic acid Cleosides are available from ODS Hypersil (Shandon Southern). , Runcon, UK) using solvent A (5 mM tetrabutyrate). 30 mM potassium phosphate containing luammonium ion, pH 7.0) and solvent Isocratation of B (methanol solution of 5 mM tetrabutylammonium hydroxide) C-18 reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC) eluting with More isolated. Alternatively, a straight line from 0% to 15% acetonitrile in 20 minutes 100 mM triethylammonium bicarbonate with change in concentration gradient, pH 7.5, Effective separation is achieved with.   To confirm the purity of the separated enantiomers by such HPLC, HPL The Sp and Rp deoxynucleotide enantiomers separated by C. I . Deo available commercially from Dupont, Wilmington, DE Compare with xynucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) s.Example 2 Substantially all Rp sugar linkages of racemic phosphorothioate oligonucleotides Of Phosphorothioate Extensions Having Moiety   Racemic phosphorothioate oligonucleotide primers have all Rp Enzymatic synthesis of a suorothioate extension was performed using modified T7 DNA polymerase I, C Quenase (SequenaseTM) (US Biochemicals C) orp. Cleveland, OH). This T7 DNA Polymerer Hybridase to 21-mer natural phosphodiester oligonucleotide using Extend the 18mer phosphorothioate oligonucleotide primer Lengthen. 1 containing 30 pmol of primer and template X SequenaseTMReaction buffer (US Biochemicals Corp.) . , Cleveland, OH) (final volume 10 μl) was heated at 95 ° C. for 5 minutes. Cool slowly to room temperature. 180 pmol of deoxy 5 '-[α-35S] Thidine triphosphate and sequenaseTMEnzyme (U.S. Biochem) icals Corp. , Cleveland, OH) at 37 ° C for 20 minutes Incubate for The product is treated with 20% polyacrylamide / 7 M urine Analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using a denaturing gel You. The product autoradiograph was compared to a control reaction without primer / template. Compare. The final product is further characterized, for example, by enzymatic degradation. That One such degradation is snake venom phosphatase degradation. E. FIG. coli DNA Dinucleoside monophosphorothioate snake synthesized using polymerase I Toxin phosphatase degradation shows that dinucleosides are in the Rp configuration Indicates thatExample 3 Phosphorothioate oligonucleotides having substantially pure Rp intersugar linkages Synthesis of CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13)   Large-scale of sequence-specific all-Rp phosphorothioate oligonucleotides Enzymatic synthesis involves the 55-mer natural phosphodiester template and 41me r using a natural phosphodiester primer of r. The template array is: GTACTTGCATAGTCGATCGGAAAATAGGGTTCTCATCTCCCGGGATTTGGTTTGAG (SEQ ID NO: 14). The primer sequence is CTCAACCAAATCCCGGGAGATGAGAACCCTATTTTCCGATC (SEQ ID NO: 15). Template is the desired specific sequence It was selected to have a sequence complementary to CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13). Sequenase diluted from 5 × to 1 ×TMBuffer solution (US Biochemi) cals Corp. , Cleveland, OH) was used. template And both primers were added to 40 μL of this buffer at a concentration of 20 nM. Hybridize template and primers at 95 ° C for 5 minutes and bring to room temperature Cool. After cooling the buffer, the buffer was adjusted to 7 mM DTT. Next, 20 μL 1: 8 diluted sequenaseTMGTPαS with enzyme and 320 μM Sp each, CTPαS, ATPαS and TTPαS were added. The reaction solution is HTwo1 by O Adjusted to 40 μL. The reaction was incubated at 37 ° C. for 18 hours. Reaction solution Is extracted twice with an equal amount of phenol as usual, and 2.5 volumes of 1 Precipitate by treatment with 00% ethanol, pellet, 500 μL Washed with 70% ethanol, pelleted again and dried. Settle for 20 minutes for 30 minutes μL of HTwoO, then 40 μL of HTwo1 mM CaCl in OTwo, 25 mM Squirt HCl, adjusted to pH 8.0. The solution is maintained at 95 ° C for 5 minutes, quenched (Ie, cooled very quickly with ice). 4.6 μM DNase I After incubation at 37 ° C for 10 minutes, the synthesized oligonucleotides were The template and primer were removed from the otide. Phenol the reaction mixture , And precipitated with ethanol as described above. HTwoResuspend in O , SepPakTMChromatography (Millipore, Milford, MA) with 20% polyacrylamide / 7M urea gel electrophoresis And purified.   In another synthesis, PstI restriction nuclease (Life Techno) logs, Inc. , Gaithersburg, MD). The mer-linked phosphorothioate oligonucleotide was cleaved at the restriction site. Desired The phosphorothioate oligonucleotide CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13) is SepPakTMChromatography (Millipore, Milford, M Purified using polyacrylamide / 7M urea gel electrophoresis in combination with A) Was. Enzymatic as affected by repeated template-primer addition throughout the reaction Cascade was used to optimize the yield. 20 ml by cascade incremental synthesis 75 A from the reaction solution260All units Rp configuration phosphoroty An oate oligonucleotide CCGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13) was obtained.Example 4 Phosphorothio with racemic mixture of intersugar linkages using automated DNA synthesis Synthesis of Eate Oligonucleotides   Oligonucleotides can be prepared by automated DN using hydrogen phosphonate chemistry in a conventional manner. A synthesizer (Applied Biosystems model 380B) [Agrawetal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 85: 7079 (1988)]. After the final coupling process, By oxidizing the sesame with sulfur in carbon disulfide / triethylamine / pyridine A phosphorothioate linkage was generated. After sulfur oxidation, ammonium hydroxide The oligonucleotide is dissociated from the support using standard deprotection The protecting group was removed. Phosphorothioate oligonucleotides are oligonucleotide Column (OPC; ABI, Foster City, CA) chromatograph And HPLC (using Beckman System Gold HPLC) ). The HPLC-purified oligonucleotide was subsequently And gel electrophoresis on 20% acrylamide / 7 M urea or H for analysis. The final purity was evaluated by PLC. Oligonucleotide sequence certainty And iodine oxidation in water / water and standard sequencing. These oligos Nucleotides are of all possible Rp and Sp isomers at each phosphorus bond. Including mixtures of combinations.Example 5 T7 RNA Polymers for Thermodynamic and Kinetic Hybridization Analysis Synthesis of complementary DNA or RNA sequences using an enzyme   The synthesis of short complementary DNA oligonucleotides with natural phosphodiester linkages Performed using standard automated synthesis on an ABI model 380B DNA synthesizer. The correct length oligonucleotide is purified by HPLC and sequenced using standard techniques. Were determined.   Use T7 RNA polymerase to prepare short hybridization assays. New complementary RNA oligonucleotides were synthesized. Required to synthesize short RNA High concentration and large amount of T7 RNA polymerase to initiate many cycles Ze was needed. Because of this need, T7 RNA polymerase has An E. coli strain containing the NA polymerase expression vector, BL21 / pAR1219 (B Brookhaven National Laboratory, Upton, (Obtained from New York). Approximately 300,000 by isolation from 2L cells Yielded 500,000 units of T7 RNA polymerase. Absorbance value = 1. 2A600. This is sufficient for the synthesis of short (10-30 nucleotide) RNA species. Concentrated. For the synthesis, an ABI synthesizer (ABI, Foster City, CA) ) Using the T7 promoter, and the complementary target sequence and T7 promoter. A template containing the hybridization sequence was synthesized. Templates and The promoter is purified by HPLC and the correct species is present for enzymatic synthesis. To be there. Synthesized product is 20% polyacrylamide / 8M Purified on urea gel and sequenced by conventional methods.Example 6 Heat denaturation   Oligonucleotides (phosphorothioate oligonucleotides of the invention or Others) along with complementary DNA or RNA oligonucleotides 100 mM ionic strength buffer at 4 μM standard concentration for each oligonucleotide Solution (89.8 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.2 mM EDTA). Heat the sample to 90 ° C. First using an or Response II spectrophotometer (Corning) The absorbance was measured. The sample is then gradually cooled to 15 ° C. The change in absorbance was monitored in nm. Raise the temperature by 1 degree, read the absorbance and melt. The denaturation profile was analyzed by taking the first derivative of the curve. Data is also available at Tm and And Delta G were determined using two-phase linear regression analysis. Of these exams The results are shown in Table 1. Example 7 Synthesis of radiolabeled oligonucleotide   Determine binding stringency of various phosphorothioate oligonucleotides For quantification, a filter binding assay was utilized. That is, these are DNA or Or the tendency to hybridize with RNA to form heteroduplexes. Weighed. These assays require a radiolabeled oligonucleotide.   Phosphorothioate oligonucleotides having all Rp intersugar linkages are represented by S purified from p monomer [35S] -Synthesized from monomer by enzymatic method. Automatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides containing chiral intersugar linkages For this purpose, an oligonucleotide containing a hydrogen phosphonate was synthesized and then pyridine / Elemental in carbon disulfide mixture [35[S] in the presence. Obtained radioactive label e Suphorothioate oligonucleotides are prepared by OPC chromatography and HP It can be purified by LC. Nitrocellulose filter for target mRNA And bake at 80 ° C. for 2 hours, blocking, followed by radiolabeled phosphorothio Hybridized with oate oligonucleotide. Combined stringency Can be performed after increasing the temperature or in the elution buffer (eg, Tris NaCl buffer). Radiolabeled oligonucleotide eluted from the filter after increasing the Was evaluated by quantifying the The eluted oligonucleotide is also In an anion exchange HPLC protocol using a socratic phosphate buffer Also evaluated by their mobility. The results show that a racemic mixture of The mobility was compared with that of a standard oligonucleotide prepared as follows.Example 8 Nuclease digestion   Phosphorothioate oligonucleotides in medium containing 10% fetal calf serum (FCS) Determination of the nuclease degradation rate of nucleotides was determined by using a 10% heat inactivated Performed in Rubecco's Modified Essential Medium (DMEM). At 55 ° C before adding to the medium Thermal inactivation of FCS was performed for 1 hour. Racemic and chirally pure sugar linkages Oligonucleotides with different resistance to nuclease digestion separately Was tested. 66 μg / ml of each oligonucleotide was separately added to the medium, Incubation was performed at 37 ° C. at the time intervals shown in Table 2. Aliquots of 15 μl Take 15 μl of 0.1 M Tris-HCl (pH 8.3) containing 9 M urea, 0.1 μl. Added to 1 M boric acid and 2 mM EDTA. Mix aliquots by vortexing And stored at -20 ° C. On 20% polyacrylamide / 7M urea slab gel Was used for polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) analysis. After electrophoresis "S tins All "(Sigma. Chem. Co., St. Louis, M. The gel was stained with O). After destaining, the gel was subjected to an UltraScan XL apparatus. (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala , Swedeu) were analyzed by laser densitometry. Perform integration And data are the percentages from full length (n) to n-1 before incubation. Expressed as a decrease. Oligonucleotides with chirally pure intersugar linkages of Rp The results for the tide sequence CCGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 6) are shown in Table 2.   As is evident from Table 2, phospholipids having substantially chirally pure intersugar linkages Rothioate oligonucleotides are phosphorothioate having racemic intersugar linkages. It showed higher nuclease digestion resistance than the target oligonucleotide.Example 9 RNase H analysis   Racemic and substantially chirally pure phosphorothios with intersugar linkages Eats were analyzed for sensitivity to RNase H. Oligonucleotide (RN A 2 fold molar excess over A) and 5 μg (3.1 kb) synthesized in vitro mRNA (using T7 RNA polymerase promoter) was added to 5 μl of RNas Incubated for 30 minutes at 60 ° C. in eH hybridization buffer . The sample was gradually cooled to room temperature, then 3.7 mg / ml BSA, 20 units E. coli RNase H (Promega), 142 mM DTT, 1 50 mM KCl and 3 mM MgClTwoWas adjusted to Sample is 30 minutes at 37 ° C while Incubated. Next, the sample was extracted with phenol and precipitated with ethanol. % Agarose gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining. Was. Gel the markers simultaneously with the sample to determine the approximate length of the RNA sample Shed.Example 10   Patients suffering from HCV-induced hepatitis were treated in Example 3 or Oligo # 259 (SEQ ID NO: 1) synthesized according to the method of Example 19, GO # 260 (SEQ ID NO: 2), oligo 270 (SEQ ID NO: 3), oligo # 330 ( Column 4) or oligo 340 (SEQ ID NO: 5). 1-1000 μg / kg of oligonucleotide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier. Intramuscular or intramuscular administration. Treatment is repeated as needed until disease is eliminated be able to.Example 11   Patients suffering from inflammatory diseases mediated by ICAM-1 were treated with ISIS-230 2, ie synthesized according to Example 3 or Example 19, the sequence GCCCAAGCTG Treat with an oligonucleotide having GCATCCGTCA (SEQ ID NO: 6). 1-100 Incorporation of 0 μg / kg body weight oligonucleotide in pharmaceutically acceptable carrier And administer intravenously or intramuscularly. Treatment as needed until disease is eliminated Can be repeated.Example 12   Patients with retinitis caused by cytomegalovirus were treated with ISI S-2922, ie synthesized according to Example 3 or Example 19, the sequence Treat with oligonucleotide having GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG (SEQ ID NO: 7) Pharmaceutically acceptable carrier for oligonucleotide of 1-1000 μg / kg body weight And administered intravitreally. The treatment is It can be repeated as needed until the infection is eliminated.Example 13   Patients with PKC-α-mediated cancer were treated with ISIS-3521, Synthesized according to Example 3 or Example 19, the sequence GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA ( Treat with oligonucleotide having column number 8). 1-1000 μg / kg body The heavy oligonucleotide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier and injected intravenously or Is given intramuscularly. Treatment may be repeated as necessary until disease is eliminated it can.Example 14   Patients with C-raf kinase-mediated cancer were treated with ISIS-5132, That is, the sequence TCCCGCCTGTGACATGCA was synthesized according to Example 3 or Example 19. Treat with an oligonucleotide having TT (SEQ ID NO: 9). 1-1000 μg / kg of oligonucleotide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier. Intramuscular or intramuscular administration. Treatment is repeated as needed until disease is eliminated be able to.Example 15   Patients with C-raf kinase-mediated cancer were treated as in Example 3 or ISIS-2503 synthesized according to Example 19 (SEQ ID NO: 10), ISIS Has -2570 (SEQ ID NO: 11) or ISIS-6957 (SEQ ID NO: 12) Treated with an oligonucleotide. 1-1000 μg / kg body weight oligonucleotide Otide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier and administered intravenously or intramuscularly . The treatment can be repeated as necessary until the disease is eliminated.   Compounds 1, 2 and 3 of Examples 16, 17 and 18, respectively, were et al. [Nucleic Acids Res. , 19: 5883 (19 91)] and Sec and Lesnikowski [Methods in Molecular Biology, S.M. Agrawal, Ed. , V olume20, p. 285, 1993).Example 16 Synthesis of 2-chloro-1,3,2-oxathiaphospholane (1)   Pyridine (1 mol), benzene (400 mL), 2-mercaptoethanol (0.5 mol) and phosphorus trichloride (0.5 mol) at room temperature for 30 minutes Stir. The pyridinium chloride is filtered off and the solvent is evaporated under reduced pressure to reduce the crude product. Purify by distillation under pressure. Collect fractions boiling at 70-72 ° C / 20mmHg And31Characterized by P NMR.Example 17 Synthesis of N, N-diisopropylamino-1,3,2-oxathiaphospholane (2) Success   Compound 1 (0.2 mol) was dissolved in n-pentane (300 mL), and Ropyramine (0.4 mol) is added dropwise. The reaction mixture is stirred at room temperature for 30 minutes Then, diisopropylamine hydrochloride was filtered off and the solvent was evaporated under reduced pressure to give a crude product. The product is purified by vacuum distillation. Product 2 boils at 70 ° C./0.1 mmHg To obtain the fraction31Characterized by P NMR and mass spectrometry .Example 18 5'-O-dimethoxytritylthymidine-3'-O- [2-thiono-1,3,2 -Oxathiaphospholane] (3)   5'-O-dimethoxytritylthymidine (10 mmol) and 1H-tetra The sol (11 mmol) is dried in vacuo and dissolved in dichloromethane (25 mL) . Compound 2 (11 mmol) is added to the solution and the reaction mixture is stirred at room temperature for 2 hours . Dry elemental sulfur (15 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. ,put. Then unreacted sulfur is filtered off and the filtrate is concentrated under reduced pressure. Residue Dissolve in chloroform (3 mL), silica gel (230-400 mesh) column Purify by chromatography, first chloroform, then chloroform: meta Elute with phenol (97: 3). By column chromatography on silica gel To give separate diastereomeric species of compound 3. Compound 3 is dissolved in ethyl acetate , Loaded on a silica gel 60H column. Elution using ethyl acetate as elution solvent Is monitored by HPTLC (silica gel 60, ethyl acetate as a developing solvent) You. The fraction containing the separated diastereomer of compound 3 was concentrated under reduced pressure to give a residue. To31P NMR and HPLC (Licrosspher Si100, 5 μM , Ethyl acetate as eluent, flow rate 3 mL / min). Fast elution The fraction corresponds to the Sp diastereomer and the late eluting fraction is the Rp diastereomer. You.Example 19 5'-OH nucleosides in solid-phase automated synthesis and diastereomerically pure Stereospecific control of the reaction with compound 3   Applied Biosystems (Foster City, CA) Using a Dell 380B automated DNA synthesizer, following the method of Stec et al. 5 '-OH nucleoside and diastereomerically pure nucleoside oxathiapho The reaction between suphoranes, for example compound 3, is carried out using 1,8-diazabicyclo as a catalyst. (5.4.0) Requires the use of undec-7-ene (DBU). Automated DN A used to bind oligonucleotides to a support matrix in synthesis Since some commercially available linkers are unstable to DBU, Decoration is required. For oligonucleotide synthesis by the oxathiaphospholane method Suitable linkers are resistant to DBU and are concentrated at room temperature with concentrated ammonium hydroxide. With a "succinic-sarcosinyl" linker that can hydrolyze within one hour is there. (A) Attached to a solid matrix using a “succinic-sarcosinyl” linker Of 5'-O-dimethoxytrityl nucleoside   (1) N-Fmoc-sarcosine (Bachem Bioscience, I nc. , Philadelphia, PA) (1.6 mmol) with long-chain alkyl Amine-CPG (LCA-CPG, Sigma, St. Louis, MO) (2 g) and dried under vacuum. Anhydrous DMF (5 mL), pyridine (0.5 mL ) And DCC (2.4 mmol) were added and the reaction mixture was shaken at room temperature for 12 hours. Was. Then the solvent was filtered off and the support was treated with methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1). 1: 1, 3 x 20 mL). Support is 10% of piperidine in pyridine The N-Fmoc protecting group was removed by treatment with 10 mL of the solution. N-monkey The cosinylated LCA-CPG was converted to methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1: (1, 3 x 20 mL) and dried under vacuum.   (2) 5'-O-dimethoxytrityl nucleoside was added to DMF (2 mL), As described in (1), in the presence of lysine (0.2 mL) and DCC (50 mg). Added to the sarcosinylated LCA-CPG thus obtained. The reaction mixture was cooled to room temperature for 12 hours. Shaking for an hour, then methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1: 1, 3 × 2 0 mL). After drying, the support was washed with N-methylimidazole: THF (1 m L) and acetic anhydride / lutidine (1 mL) for 15 minutes. Next, the support Methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1: 1, 3 × 10 mL), followed by Washed with acetonitrile (3 × 10 mL) and then dried under vacuum. (B) Next, the diastereomerically pure activated nucleoside was added at a 300-fold molar Oligos bound to a sarcosine LCA-CPG support in the presence of excess DBU Added above nucleotides. The diastereomer of the activated nucleoside is Before use in the ring reaction, column chromatography (silica gel 60H) Using ethyl acetate as the elution solvent, elution was performed using HPTLC (silica gel 60, (Ethyl acetate as open solvent). The synthesis protocol is It is shown in Table 3.   The diastereomeric purity of the phosphorothioate oligonucleotide is31P N By MR, HPLC (Licrosspher Si100, 5AM, eluent) Ethyl acetate at a flow rate of 3 mL / min), enzymatically or by electrophoresis. Can be determined.Example 20 Treatment of disease states in human patients   The oligonucleotides of the present invention can be used to treat various disease states . Treatment of a patient diagnosed with a particular disease state may take place in a pharmaceutically acceptable regimen. Administering an effective dose of the oligonucleotide to the patient by a suitable route. Yes Effective oligonucleotide doses will determine the disease state to be treated, the severity of the disease state and Depends on the age of the patient being treated. The effective dose of oligonucleotide is its IC50 Which is a routine method for those skilled in the art. There Indicates the effective dose of the oligomer is determined by the pharmacokinetic software program TopFit. Can be determined. For example, oligonucleotide dose Is from 0.01 μg / kg of body weight (for children), depending on the progress of the disease state It varies up to 100 g (for adults). Similarly, the frequency of administration will depend on the progression of the disease state. It will vary from once or more a day to once every 20 years.   The route of oligonucleotide administration will depend on the disease state to be treated. For example, inflammation Administration of oligonucleotides to patients treated for sexually transmitted diseases may be oral or direct. It can be performed by the intestinal route. In the case of treatment of patients suffering from AIDS, The most effective method of nucleotide administration may be by the oral route or by subcutaneous injection U. Cancer, for example, breast cancer, can be treated by subcutaneous injection, while colon cancer can be treated. It can be treated by oral or rectal administration of lignonucleotides. Central nervous system A system disease or disorder is one in which the oligonucleotide is delivered to the patient's spine or brain. For example, it will be best treated by intrathecal or intraventricular administration.   Following oligonucleotide administration, patients should be monitored for relief of symptoms associated with the disease state. Can be naughty. Second, the severity of the disease state and its responsiveness to treatment Thus, the dose can be adjusted (increased or decreased).   The oligonucleotides of the invention can be administered in combination with other traditional therapies. Would be preferable. Oligonucleotides for the treatment of patients suffering from AIDS AZT, sulfasalazine for the treatment of inflammatory diseases such as ulcerative colitis ( Sulfasalazine), and 5-fluoroura for the treatment of colon cancer It can be administered in combination with an agent such as sill, but is not limited thereto.   It is also desirable to administer maintenance therapy to patients who have been successfully treated for the disease state. Would be good. Dose and dose of oligonucleotide administration as part of a maintenance regimen The frequency is 0.01 μg to 100 g per kg of body weight, once a day or From the above, it varies up to once every several years.Example 21 Intraventricular administration of oligonucleotides   Intraventricular drug delivery, which delivers drugs directly to the patient's brain, can reduce brain afflictions. It would be desirable to treat patients with. This mode of oligonucleotide administration To do this, a silicone catheter was surgically introduced into the ventricle of the human patient's brain, A subcutaneous infusion pump (Medtronic Inc.) was surgically implanted in the abdomen. . , Minneapolis, MN) [Cancer Research ch, 44: 1698 (1984)]. Inject oligonucleotide using pump Accurate dose adjustment and dose scheduling with the aid of external programming equipment Make changes to the rules. The reservoir capacity of the pump is 18-20 mL and the infusion rate is It will range from 0.1 mL / h to 1 mL / h. Daily and monthly dosing frequency and Dose of the drug to be administered in the range of 0.01 μg to 100 g per kg of body weight Depending on, the pump reservoir can be refilled at 3-10 week intervals. pump Is performed by percutaneously piercing the self-sealing septum of the pump.Example 22 Intrathecal administration of oligonucleotides   Intrathecal drug delivery to introduce drugs into the patient's spine may have central nervous system disorders. It would be desirable for the treatment of patients who do. Perform this oligonucleotide administration route To achieve this, a silicone catheter is surgically placed in the L3-4 lumbar spine space of a human patient. And connected to a subcutaneous infusion pump surgically implanted in the upper abdomen [T he Annals of Pharmacotherapy, 27: 912. (1993) and Cancer, 41: 1270 (1993)]. Use pump Injection and accurate with the aid of external programming equipment Adjust dose and change dose schedule. Pump storage capacity is 18- 20 mL and infusion rates will range from 0.1 mL / h to 1 mL / h. every Frequency of administration from day to month and 0.01 μg per kg of body weight of drug to be administered Pump reservoirs may be replenished at 3-10 week intervals, depending on the dose range Can be charged. The pump is refilled once percutaneously through the self-sealing septum of the pump. It is performed by piercing.Example 23   Patients with AIDS were treated with ISIS-5320, ie, Example 3 or An oligonucleotide synthesized according to Example 19 and having the sequence TTGGGGTT (SEQ ID NO: 17) Treat with nucleotides. Oligonucleotide of 1-1000 μg / kg body weight The drug is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier and administered intravitreally. The treatment is It can be repeated as needed until removed.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C07H 21/04 C07H 21/04 B (31)優先権主張番号 08/468,447 (32)優先日 1995年6月6日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 08/468,569 (32)優先日 1995年6月6日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 08/469,851 (32)優先日 1995年6月6日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 08/470,129 (32)優先日 1995年6月6日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 08/471,966 (32)優先日 1995年6月6日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 08/471,967 (32)優先日 1995年6月6日 (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD ,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CZ, DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,HU,I L,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK ,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK, MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,R U,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR ,TT,UA,UG,US,UZ,VN──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI C07H 21/04 C07H 21/04 B (31) Priority claim number 08 / 468,447 (32) Priority date June 6, 1995 (33) Priority country United States (US) (31) Priority number 08 / 468,569 (32) Priority date June 6, 1995 (33) Priority country United States (US) (31) Priority Claim number 08 / 469,851 (32) Priority date June 6, 1995 (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 470,129 (32) Priority date June 1995 6th (33) Priority Country United States (US) (31) Priority Number 08 / 471,966 (32) Priority Date June 6, 1995 (33) Priority Country United States (US) (31) Priority number 08 / 471,967 (32) Priority date 199 June 6, 5 (33) Priority Claimed States United States (US) (81) Designated States EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU , MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD) , SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD , MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, J, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号 6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号12または 配列番号17により表され、ヌクレオシドユニットの少なくとも75%は、Sp ホスホロチオエート3’−5’結合により一緒に結合されているオリゴヌクレオ チド。 2.ヌクレオシドユニットのすべてがSpホスホロチオエート3’−5’結合に より一緒に結合されている、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。 3.請求項1記載のオリゴヌクレオチドおよび許容しうる担体を含む組成物。 4.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号 6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号12または 配列番号17により表され、ヌクレオシドユニットの少なくとも75%は、Rp ホスホロチオエート3’−5’結合により一緒に結合されているオリゴヌクレオ チド。 5.ヌクレオシドユニットのすべてがRpホスホロチオエート3’−5’結合に より一緒に結合されている、請求項4記載のオリゴヌクレオチド。 6.請求項4記載のオリゴヌクレオチドおよび許容しうる担体を含む組成物。[Claims] 1. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or Represented by SEQ ID NO: 17, at least 75% of the nucleoside units have Sp Oligonucleotides linked together by phosphorothioate 3'-5 'linkages Chid. 2. All of the nucleoside units are in Sp phosphorothioate 3'-5 'linkages. 2. The oligonucleotide of claim 1, which is more joined together. 3. A composition comprising the oligonucleotide of claim 1 and an acceptable carrier. 4. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or Represented by SEQ ID NO: 17, at least 75% of the nucleoside units have Rp Oligonucleotides linked together by phosphorothioate 3'-5 'linkages Chid. 5. All of the nucleoside units are in Rp phosphorothioate 3'-5 'linkages. 5. The oligonucleotide of claim 4, which is more joined together. 6. A composition comprising the oligonucleotide of claim 4 and an acceptable carrier.
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