JPH08504820A - インシュリン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｂ鎖の２６位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏ残基を含み、所望によりその他の位置に修飾を有するヒトインシュリンの類似体は、修飾された物理化学的および薬動力学的性質を表わす。これらの類似体は、安定であり且つ低い自己会合傾向を示すため、高血糖症の処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン類似体 本発明は、人間用医薬の分野、特に糖尿病の処置における医薬分野に属するも のである。最も詳細には、本発明は、ヒトインシュリン分子の類似体、これら類 似体の使用方法およびこれらインシュリン類似体を含む医薬組成物に関するもの である。 真性糖尿病は、身体組織が炭水化物を正常な速度で酸化できないことを特徴と する代謝性疾患である。インシュリンの不足が糖尿病の病態の最も重要な因子で ある。ここ７０年の間、糖尿病に罹患している人々は、制御された量のインシュ リンを投与されることで大変助けられてきた。１９８０年代初期までは、糖尿病 患者の使用するインシュリンは、動物の膵臓、一般に牛および豚の膵臓から単離 された。組み替えＤＮＡ技術の導入と共に、大量の天然ヒトインシュリンならび に天然および非天然に存在するヒトインシュリン類似体の産生が可能となった。 これらのインシュリン類似体は、天然のヒトインシュリンと比較した場合異なる 物理的および化学的性質を示す。 天然ヒトインシュリンはＢ鎖の２６位にチロシン残基を含む。このチロシン残 基をアラニン残基により置換すると、溶液中で天然ヒトインシュリンよりも低い 自己会合の傾向を示す類似体Ａｌａ（Ｂ２６）ヒトインシュリンが生成する。こ のＡｌａ（Ｂ２６）ヒトインシュリン類似体はさらに、通常のヒトインシュリン より安定であり且つ速い作用速度を有する。Ｂ２６位の残基はグリシン、バリン 、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンによっても置換することができる。 本発明は、天然ヒトインシュリンＢ鎖のアミノ酸２６をチロシンからアラニン 、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンに変化させること により修飾したヒトインシュリンの類似体に関するものである。この分子はさら に、天然ヒトインシュリンＡ鎖の２１位、ならびに天然ヒトインシュリンＢ鎖の １位および３位が修飾されていてよい。該インシュリン類似体は、より安定であ り、且つ二量体化または高分子量型への自己会合の傾向が低く、それにより、天 然ヒ トインシュリンの生物活性を保持しつつ、相対的により迅速な活性の発現を行な う。 さらに、本発明に係る類似体の有効量をそれを必要とする患者に投与すること による高血糖症の処置方法が開示され特許請求される。さらに、本発明に係るイ ンシュリン類似体の有効量を１またはそれ以上の薬学上許容し得る賦形剤と組み 合わせて含有する医薬組成物が開示され特許請求される。 本明細書に開示され特許請求される本発明の目的のために、以下の用語および 略語を下記のように定義する。 Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩ − 天然ヒトインシュリンのＢ鎖の２６位のチロシン 残基がアラニン残基に変化しているヒトインシュリン類似体。 ＢＨＩ − 生合成ヒトインシュリン。 架橋 − システイン残基間のジスルフィド結合の形成。正しく架橋した天然 ヒトインシュリンまたはインシュリン類似体は３個のジスルフィド橋を含んでい る。第一のジスルフィド橋はＡ鎖の６位および１１位のシステイン残基間にある 。第二のジスルフィド橋は、Ａ鎖の７位のシステインをＢ鎖の７位のシステイン に連結している。第三のジスルフィド橋は、Ａ鎖の２０位のシステインをＢ鎖の １９位のシステインに連結している。 Ｇｌｙ（Ｂ２６）ＨＩ − 天然ヒトインシュリンのＢ鎖の２６位のチロシン 残基がグリシン残基に変化しているヒトインシュリン類似体。 Ｉｌｅ（Ｂ２６）ＨＩ − 天然ヒトインシュリンのＢ鎖の２６位のチロシン 残基がイソロイシン残基に変化しているヒトインシュリン類似体。 Ｌｅｕ（Ｂ２６）ＨＩ − 天然ヒトインシュリンのＢ鎖の２６位のチロシン 残基がロイシン残基に変化しているヒトインシュリン類似体。 Ｐｒｏ（Ｂ２６）ＨＩ − 天然ヒトインシュリンのＢ鎖の２６位のチロシン 残基がプロリン残基に変化しているヒトインシュリン類似体。 配列番号１ − 配列： ［式中、ＸａａはＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＳｅ ｒである］ を有するヒトインシュリンＡ鎖の類似体である、配列表に開示される第一番目の 配列。 配列番号２ − 配列： ［式中、１位のＸａａはＰｈｅまたはＡｓｐであり、３位のＸａａはＡｓｎまた はＡｓｐであり、２６位のＸａａはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅま たはＰｒｏである］ を有するヒトインシュリンＢ鎖の類似体である、配列表に開示される第二番目の 配列。 Ｖａｌ（Ｂ２６）ＨＩ − 天然ヒトインシュリンのＢ鎖の２６位のチロシン 残基がバリン残基に変化しているヒトインシュリン類似体。 本明細書中使用されるアミノ酸の略語は全て、連邦法施行規則３７§１．８２ ２（ｂ）（２）（１９９０）に開示されるように米国特許庁により承認されてい るものである。 本発明は、 配列番号２ と正しく架橋した、式： 配列番号１ で示されるインシュリン類似体またはその薬学上許容し得る塩［式中、配列番号 １（インシュリンＡ鎖）の２１位のＸａａはＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、 Ａｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；配列番号２（インシュリンＢ鎖）の１位の ＸａａはＰｈｅまたはＡｓｐであり;配列番号２の３位のＸａａはＡｓｎまたは Ａｓｐであり、そして配列番号２の２６位のＸａａはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、 Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｒｏである］に関するものである。Ｂ鎖（配列番号２） の２６位の好ましいアミノ酸残基はＡｌａおよびＧｌｙであり、この位置の最も 好ましい残基はＡｌａである。アスパラギンは２１位において最も特に好ましい アミノ酸である。本発明に係る一つの類似体は、インシュリンＢ鎖（配列番号２ ）の１位に通常見いだされるアミノ酸残基を除去することによって作り出すこと ができる。配列番号２の１位の好ましいアミノ酸はＰｈｅであり、配列番号２の ３位の最も好ましい残基はＡｓｎである。本発明に係る特に好ましいインシュリ ン類似体は、配列番号１の２１位のＸａａがＡｓｎであり、配列番号２の１位の ＸａａがＰｈｅであり、配列番号２の３位のＸａａがＡｓｎであり、そして配列 番号２の２６位のＸａａがＡｌａであるインシュリン類似体である。当業者に知 られる標準的生化学用語では、この特に好ましい類似体はＡｌａ（Ｂ２６）ヒト インシュリンである。 本発明に係るインシュリン類似体は、亜鉛を含む溶液または亜鉛を含まない溶 液のいずれにおいても、二量体化傾向またはそれ以外の高分子量型への自己会合 傾向が低い。この類似体は溶液中で通常単量体であるので、投与時に活性の迅速 な発現が達成される。 上に述べたように、本発明はインシュリン類似体の薬学上許容し得る塩を包含 する。好ましいこのような塩は、亜鉛、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、 カルシウム塩またはこれらの塩の組合せである。 本発明に係るインシュリン類似体は、古典的（溶液）方法、固相法、半合成法 およびより最近利用可能となった組み替えＤＮＡ法を包含する様々な認められた ペプチド合成技術のいずれかによって製造することができる。 固相技術においては、アミノ酸配列を、最初の、不溶性の、樹脂に支持させた Ｃ末端アミノ酸から順次組み立てる。固相法のための技術は、Ｊ．ステュワート 等、ソリッド−フェイズ・ペプタイド・シンセシス、フリーマン・アンド・Ｃｏ ．、サンフランシスコ、１９６９により記載されている。 一般に固相法では、所望のペプチドのＣ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸 を不溶性樹脂支持体に固定し、次いでこの樹脂に支持させたＣ末端アミノ酸から ペプチド鎖の形成を開始する。個々のアミノ酸を、所望のアミノ酸配列が得られ るまで順に導入する。別法として、小さなペプチドフラグメントを製造し、所望 の順序でこのペプチド鎖に導入することもできる。ペプチド鎖は合成の間ずっと 樹脂に結合したままであり、鎖の完成時にこのペプチドを樹脂から開裂させる。 ペプチド鎖は、Ｃ末端部分のカルボキシ基と、係る結合のための部位として樹 脂マトリックス上に存在する特異なメチレン基との間に形成されるエステル結合 によって、ポリスチレン樹脂に結合する。 アミノ酸は、ペプチド結合の形成のための当分野で良く知られる技術を用いて 結合させる。一つの方法は、アミノ酸を、そのカルボキシ基がペプチドフラグメ ントの遊離Ｎ末端アミノ基とより反応し易くなるような誘導体に変換することを 含む。例えば、保護アミノ酸をクロロ蟻酸エチル、クロロ蟻酸フェニル、クロロ 蟻酸ｓｅｃ−ブチル、またはクロロ蟻酸イソブチルと反応させることにより、ア ミノ酸を混合酸無水物に変換することができる。別法として、アミノ酸は、２， ４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ｐ−ニ トロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、または１−ヒ ドロキシベンゾトリアゾールから形成されるエステルのような活性エステルに変 換することもできる。 もう一つの結合方法は、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ ） またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のような適当な結合 試薬の使用を含む。その他の適当な結合試薬は当業者にとって明らかであろう。 シュローダーおよびルブケ、ザ・ペプタイズ、アカデミック・プレス、１９６５ 、ＩＩＩ章を参照されたく、これは引用して本明細書の一部とする。 ペプチド合成において使用される各アミノ酸のα−アミノ基は、反応性α−ア ミノ官能基を含む副反応を防止するため、結合反応の間保護せねばならないとい うことが理解されるべきである。さらに、或る種のアミノ酸は反応性側鎖官能基 （例えば、スルフヒドリル、ε−アミノ、β−およびγ−カルボキシ、イミダゾ ール、グアニドおよびヒドロキシ）を含んでおり、係る官能基もまた最初のおよ びこれに続く結合工程の両方の間保護されねばならないということが理解される べきである。好適な保護基は当分野で知られている。例えば、プロテクティヴ・ グループス・イン・オーガニック・ケミストリー、Ｍ．マコーミー編、プレナム ・プレス、Ｎ．Ｙ．、１９７３および米国特許４６１７１４９号を参照されたく 、これは引用して本明細書の一部とする。 特定の保護基の選択に際し、或る種の条件を遵守せねばならない。α−アミノ 保護基は、（１）結合反応に使用される条件の下でα−アミノ官能基を不活性と しなければならず、（２）側鎖保護基を除去せず、且つ当該ペプチドフラグメン トの構造を変えない条件の下で、結合反応後に容易に除去され得なければならず 、そして（３）結合直前の活性化の際のラセミ化の可能性を排除せねばならない 。側鎖保護基は、（１）結合反応に使用される条件の下で側鎖官能基を不活性と しなければならず、（２）α−アミノ保護基の除去に使用される条件の下で安定 でなければならず、そして（３）ペプチド鎖の構造を変えない反応条件の下で、 所望アミノ酸配列の完成時に容易に除去され得なければならない。 ペプチド合成にとって有用であることが知られている保護基は、それらの除去 に用いられる試薬との反応性が異なるということは、当業者には明らかであろう 。例えば或る種の保護基、例えばトリフェニルメチルおよび２−（ｐ−ビフェニ リル）イソプロピルオキシカルボニルは極めて不安定であって、緩和な酸条件下 で開裂することができる。別の保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ − アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびp−メトキシ ベンジルオキシカルボニルはそれ程不安定でなく、これらの除去のためには中等 度に強い酸、例えばトリフルオロ酢酸、塩酸、または酢酸中の三弗化ホウ素を必 要とする。さらに別の保護基、例えばベンジルオキシカルボニル、ハロベンジル オキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキ シカルボニル、およびイソプロピルオキシカルボニルはさらに不安定性が低く、 これらを除去するためにはより強い酸、例えば弗化水素、臭化水素、またはトリ フルオロ酢酸中の三弗化ホウ素酢酸錯化合物が必要である。 所望のペプチド配列が完成したならば、この保護ペプチドを樹脂支持体から開 裂させ、全ての保護基を除去せねばならない。開裂反応および保護基の除去は同 時にまたは段階的に遂行することができる。樹脂支持体がクロロメチル化ポリス チレン樹脂である場合、ペプチドを樹脂に固定している結合は、Ｃ末端部分の遊 離カルボキシ基と樹脂マトリックス上に存在する多数のクロロメチル基の一つと の間に形成されるエステル結合である。この固定している結合は、エステル結合 を切り樹脂マトリックスに浸透することができることが知られている試薬によっ て開裂され得るということが理解されるであろう。一つの特に簡便な方法は、液 体無水弗化水素での処理によるものである。この試薬はペプチドを樹脂から開裂 させるのみならず全ての保護基を除去するであろう。したがって、この試薬を使 用することにより完全に脱保護されたペプチドが直ちに得られる。保護基を除去 することなくペプチドを開裂させたい場合は、保護ペプチド−樹脂にメタノリシ スを施してＣ末端カルボキシ基がメチル化された保護ペプチドを生成させる。次 いでこのメチルエステルを緩和なアルカリ条件下で加水分解して遊離Ｃ末端カル ボキシを生成させることができる。次に、ペプチド鎖上の保護基を、液体弗化水 素のような強酸で処理することにより除去することができる。特に有用なメタノ リシスの技術は、Ｇ．ムーア等、ペプタイズ、第５回米国ペプチドシンポジウム 会報、Ｍ．グッドマンおよびＪ．マイエンホーファー編、ジョン・ウィレイ、Ｎ ．Ｙ．、１９７７、５１８−５２１頁の技術であり、ここでは保護ペプチド−樹 脂はクラウンエーテルの存在下にメタノールおよびシアン化カリウムで処理され る。 保護ペプチドを樹脂から開裂させるもう一つの方法は、アンモノリシスまたは ヒドラジン処理による方法である。所望ならば、得られたＣ末端アミドまたはヒ ドラジドを遊離Ｃ末端カルボキシに加水分解し、保護基を常套的に除去すること ができる。 Ｎ末端α−アミノ基上に存在する保護基は、保護ペプチドを樹脂支持体から開 裂させる前またはこれと同時に、優先的に除去できることもまた理解されるであ ろう。 本発明に係るインシュリン類似体のＡおよびＢ鎖は組み替えＤＮＡ法によって も製造することができる。これらの製造においては、所望のＡまたはＢ鎖のペプ チドをコードしているヌクレオチド配列を、このような合成のための現在では常 法となっている技術を用いて製造する。これらの方法は一般に、所望のコード化 配列のフラグメントおよびその相補配列の両者をコードしているオリゴヌクレオ チドの製造を含む。このオリゴヌクレオチドは、コード化配列の一つのフラグメ ントが相補配列の二つのフラグメントと重複、そしてその逆を与えるように設計 される。このオリゴヌクレオチドを対形成させて合し、最終的に所望の遺伝子配 列を生成させる。 この配列を、クローニングベクター中に、これがコードしているペプチド生成 物が発現され得るような位置で挿入する。プロインシュリンおよびプロインシュ リン類似体を発現し得るプラスミドの組み立てが、チャンス等、欧州特許公開第 ０３８３４７２号（１９９０年８月２２日公開）に記載されており、その教示全 体を引用して本明細書の一部とする。 本発明に係るインシュリン類似体のＡおよびＢ鎖は、組み替えＤＮＡ技術を用 いてプロインシュリン様前駆体分子を経て製造することもできる。フランク等、 ペプタイズ：シンセシス−ストラクチャー−ファンクション、第７回米国ペプチ ドシンポジウム会報、Ｄ．リッチおよびＥ．グロス編（１９８１）を参照された く、これは引用して本明細書の一部とする。 いかに製造されようとも、個々のＡおよびＢ鎖の結合の工程は、チャンス等、 ペプタイズ：シンセシス，ストラクチャー・アンド・ファンクション：第７回米 国ペプチドシンポジウム会報（１９８１）（これは引用して本明細書の一部とす る）の方法によって達成できる。 以下の実施例は本発明の例示手段として提供するものであり、本発明を限定す るものと解釈してはならない。 実施例１ Ａｌａ（Ｂ２６）ヒトインシュリン。 表記のインシュリン類似体を、デスペンタペプチド（Ｂ２６−３０）ヒトイン シュリンおよび合成ペンタペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを 使用して酵素的半合成（逆プロテオリシス）によって製造した。ペンタペプチド は固相ペプチド合成によって製造し、一方デスペンタペプチドヒトインシュリン は、Ｈ．Ｇ．ギャトナー（１９７５）、ホッペーザイラーズ・ツァイトシュリフ ト・フュア・フィジオロギッシェ・ケミー、３５６巻１３９７−１４０４頁の教 示に実質上従って配列２６−３０を除去するペプシン加水分解反応により、生合 成ヒトインシュリン（イーライ・リリー・アンド・カンパニー、インディアナポ リス）から誘導した。 このペプチドは、ＡＢＩ合成機４３０ＡまたはＡＣＴ Ｉモデル２００合成機 のいずれかで合成した。ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂な らびに保護されたｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸およびペプチド合成用の前もってパッケ ージに入れられた殆どの試薬はアプライド・バイオシステムズ・Ｉｎｃ．から購 入した。ペンタペプチドは通常のＨＦ開裂により樹脂から開裂させた。９０％Ｈ Ｆおよび１０％ｍ−クレゾール中０℃で１時間の開裂を実施し、ＨＦを減圧で蒸 発させた。ペプチドを冷無水エーテルを用いて直ちに沈澱させ、やはり冷無水エ ーテルで数回洗浄し、最後に１０％酢酸に溶解し凍結乾燥した。 表記インシュリン類似体の製造のために、デス−ペンタペプチドヒトインシュ リン４００ｍｇおよび合成ペンタペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔ ｈｒ７３０ｍｇを８５％１，４−ブタンジオールおよび１５％１Ｍトリスを含有 する溶液３６ｍｌ中で合し、濃ＨＣｌを用いてｐＨを７．０−７．１に調節した 。蛋白溶液に添加する前に、キモトリプシン４０ｍｇを０．０１Ｎ ＨＣｌ ４ ０ ０μｌに溶解した。結合反応を２５℃で４．５時間持続し、逆相ＨＰＬＣにより 監視し、次いで冷却したアセトン１０容量を加えることにより停止させた。遠心 により沈澱を集め、エーテルで洗浄し、可溶化するに充分なグアニジンＨＣｌを 含有する１０％酢酸２５ｍｌに溶解し、次いでセファデックスＧ５０（スーパー ファイン、５ｘ２００ｃｍ）カラムに適用し、１モル酢酸を用いて４℃で溶出し た。所望の画分をプールし、逆相ＨＰＬＣカラムゾルバックスＣ８（２．１２ｘ ２５ｃｍ）に付し、４５−７０％のＢ緩衝液の直線勾配により７６０分間２．５ ｍｌ／分で溶出した。溶出緩衝液は、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．１） を含有する緩衝液Ａ、ならびに５０％緩衝液Ａおよび５０％ＣＨ３ＣＮを含有す る緩衝液Ｂであった。ヴィダックＣ１８カラム（２．１２ｘ２５ｃｍ）および４ ５−７０％Ｂ緩衝液の直線勾配、２．５ｍｌ／分で構成される溶出でさらなる精 製を行なった。移動相は、緩衝液Ａとしての０．１％ＴＦＡおよび緩衝液Ｂとし ての０．１％ＴＦＡ／５０％ＣＨ３ＣＮの溶液で構成される。最終的に、凍結乾 燥した蛋白３８ｍｇが得られ、これを種々の分析に付した。高速原子衝撃質量分 析（ＦＡＢ／ＭＳ）の結果は分子量５７１５．６（理論値：５７１５．４）を与 えた。モル基準としてのアスパラギン酸に基づくアミノ酸組成は以下の通りであ った（括弧内は理論的アミノ酸比率である）： Ａｓｐ、３．００（３）；Ｔｈｒ、２．８９（３）；Ｓｅｒ、２．７５（３）； Ｇｌｕ、７．２４（７）；Ｐｒｏ、１．０６（１）；Ｇｌｙ、４．００（４）； Ａｌａ、２．００（２）；Ｃｙｓ、５．２４（６）；Ｖａｌ、３．３６（４）； Ｉｌｅ、１．４１（２）；Ｌｅｕ、６．１２（６）；Ｔｙｒ、２．８３（３）； Ｐｈｅ、２．８７（３）；Ｈｉｓ、２．２２（２）；Ｌｙｓ、０．９９（１）； Ａｒｇ、１．００（１）。 本発明に係る他のインシュリン類似体を上の開示と実質上同じ方法で製造した 。出発材料としてペンタペプチドＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを使 用してインシュリン類似体Ｇ１ｙ（Ｂ２６）ＨＩを製造した。出発材料としてペ ンタペプチドＶａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを使用して類似体Ｖａｌ （Ｂ２６）ＨＩを製造した。出発材料としてペンタペプチドＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐ ｒｏ −Ｌｙｓ−Ｔｈｒを使用して類似体Ｌｅｕ（Ｂ２６）ＨＩを製造した。出発材料 としてペンタペプチドＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを使用して類似 体Ｉｌｅ（Ｂ２６）ＨＩを製造した。出発材料としてペンタペプチドＰｒｏ−Ｔ ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを使用して類似体Ｐｒｏ（Ｂ２６）ＨＩを製造し た。これら類似体の各々の試験は、これらの化合物が速効性インシュリン類似体 として有用であることを立証した。 実施例２ サイズ排除ＨＰＬＣ。 様々な濃度のＡｌａ（Ｂ２６）ＨＩを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｎａ ２ＨＰＯ４および０．００１％ＮａＮ３（ｐＨ７．５）を含有する移動相で溶出 するデュポンゾルバックスＧＦ−２５０（０．９４ｘ２５ｃｍ）カラムによるク ロマトグラフィーに付した。このカラムを１ｍｌ／分および２４℃で使用した。 分配係数（Ｋｄ）は分子の平均半径に関係する。等式Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（ Ｖｉ−Ｖｏ）において、Ｖｅは試料の溶出容量であり、Ｖｏはブルー・デキスト ランの溶出により決定された排除容量であり、そしてＶｉはＤＬ−ジチオトレイ トールの溶出により決定された包含容量である。インシュリンの分配係数（Ｋｄ ）はインシュリン濃度の増加と共に有意に低下し、これはインシュリンが高濃度 で凝集する傾向がある事を示している。インシュリンのＢ２６のチロシン残基を アラニン残基に置き換えると、或る条件の下で凝集をなくし濃度に依存しないＫ ｄを導くらしいインシュリン類似体が作り出された。 実施例３ 平衡変性。 平衡変性実験を、ブレムズ等（１９９０）、バイオケミストリー、２９巻９２ ８９−９２９３頁（この教示全体を引用して本明細書の一部とする）の教示に従 って実施した。平衡変性は、漸増する濃度のグアニジンを用いた遠紫外円二色性 によって測定した。Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩの変性遷移は３．３ＭのＧｄｎＨＣｌ で始まった。変性の自由エネルギー（△Ｇ）はＡｌａ（Ｂ２６）ＨＩについて４ ．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであったが、これはＢＨＩについての値と同じである。中 間点（［変性］／［天然］＝１）のＧｄｎＨＣｌ濃度は、ブレムズ等、１９９１ 、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻１６１１−１６１５頁、により過去に測 定 されたヒトインシュリンについての５．０Ｍと比較して、Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩ については５．３Ｍであった。 実施例４ 平衡超遠心。 インシュリンの凝集性を沈降平衡超遠心によって測定した。各類似体の会合状 態を、Ａ．Ｈ．ピーカーおよびＢ．Ｈ．フランク（１９７２）、バイオケミスト リー、１１巻４０１３−４０１６頁（この教示全体を引用して本明細書の一部と する）に記載の技術を用いて測定した。蛋白を５０ｍＭ塩化ナトリウム−５０ｍ Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液に溶解し、ｐＨを７．２に調節した。蛋白濃度をＡｖｉ ｖ１４ＤＳ分光光度計（レイクウッド、Ｎ．Ｊ．）を用いて測定した。ｍｇ／ｍ ｌを基準としてＢＨＩの吸光係数は１．０５であり、一方Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩ の吸光係数は０．８００であった。ＢＨＩの単量体分子量はＢＨＩについて５８ ０８でありＡｌａ（Ｂ２６）ＨＩについて５７１６であった。この溶液の一部に 、原子分光学によって濃度が測定されているＺｎＣｌ２の保存溶液を用いて亜鉛 を添加した。蛋白のモル数に対する亜鉛のモル数の比は常に０．５とした。６穴 チタニウムローターおよび光電走査吸収光学系を備えたスピンコモデルＥ分析用 超遠心機中、２２℃で沈降平衡実験を行なった。平衡走査が２５時間において始 まる前に平衡に達するよう、オーバースピーディング法を使用した。より希釈し た溶液には標準的な１２ｍｍのセンターピースを使用し、濃縮液には注文製の３ ｍｍの木炭を充填したエポンセンターピースを使用した。沈降は理想的であると 想定し、様々な半径における重量平均分子量を、式： Ｍｗ＝ＲＴ／（１−ｖｐ）ｗ２・１／ｒ・１／ｃ−ｄＣ／ｄｒ ［式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度であり、ｗは速度であり、ｒは半径 であり、Ｃは濃度であり、そしてｐは溶媒密度である］ から算出した。Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩはＢＨＩと同じ部分比体積、即ち０．７３ ｍｌ／ｇを有すると想定した。重量平均分子量を単量体分子量で除し、蛋白の総 濃度と比較した。Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩはＢＨＩより低い自己会合の傾向を示し た。例えば、３．５ｍｇ／ｍｌ（または１００単位／ｍｌ）においてインシュリ ンは単量体分子量の約６．５倍の重量平均分子量を持っている。Ａｌａ（Ｂ２６ ） ＨＩは単量体分子量の約３．２倍の重量平均分子量を示した。蛋白１モル当り０ ．５モルの亜鉛の存在下では、インシュリンは主として０．５ｍｇ／ｍｌまで六 量体である。対照的に、Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩははるかに会合が少ない。蛋白濃 度が増すにしたがってＡｌａ（Ｂ２６）ＨＩは分子量において六量体を上回る種 に会合する。 実施例５ レセプター結合。 本発明に係るインシュリン類似体の生理作用が、以下のインビトロインシュリ ンレセプター結合検定で示された。ヒト胎盤膜の調製および結合検定を、グルプ ソ等（１９８８）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ．Ｍｅｔａｂ．、６７ 巻１９４−１９７頁（この教示全体を引用して本明細書の一部とする）により記 載された改良法によって実施した。この方法は、ヒト胎盤膜蛋白３０ないし５０ μｇを、およそ１０ｆｍｏｌの125Ｉ−インシュリンおよび種々の濃度の非標識 インシュリンまたは類似体と共に、最終容量５００μｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥ Ｓ、ｐＨ７．８、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳ Ｏ４、８ｍＭグルコースおよび０．２５％ＢＳＡ中、４℃で１８時間インキュべ ートすることを採用した。膜は、０．１％ポリエチレンイミンで前処理したグラ スファイバーフィルター上に細胞収穫機を用いて集めた（スカートン、ライアー 、ノルウェー）。置換曲線を、ＥＣ50（最大結合の半分を置換するのに必要な用 量）値の決定のためのＰｒｅｆｉｔ／Ａｌｌｆｉｔを用いて４パラメータモデル に当てはめることにより、結合データを分析した。４回の実験からのデータは、 ヒトインシュリンは０．３４±０．０５ｎＭのＥＣ50示し、一方Ａｌａ（Ｂ２６ ）ＨＩは、インシュリンの８９％力価であると解釈される０．３９±０．０２ｎ ＭのＥＣ50を示すことを立証した。。 実施例６ 動物実験。 本発明に係るインシュリン類似体の生理作用が、以下のインビボ検定系におい て示された。 チャールズ・リヴァー・ラボラトリーズ（ポーティッジ、ＭＩ）からの正常な 雄性スプラーグ・ドーレイラットを試験動物として使用した。これらは１６０− １８０ｇの体重範囲で取得し、光サイクルを制御した（点灯午前７：００−午後 ７：００)消灯午後７：００−午前７：００）７５゜Ｆの動物室に1週間保持した 。動物はピューリナ・ラット・チャウ５００１を自由に摂取させた。各検定に使 用するラットを、使用前に１６時間絶食させた。これらは最初に使用された時、 約２００ｇの体重であった。絶食体重が約２７５ｇに達した時（３週間以上）、 この動物はもはや使用しなかった。５匹の対照動物および５匹の実験動物をこの 試験に使用した。蛋白を０．０５Ｎ ＨＣｌ（ｐＨ１．６）に溶解して１００μ ｇ／ｍｌの保存溶液を得た。ここから正常食塩水で幾つかの希釈液を作成し、ラ ットに皮下注射した。時刻０ならびに投与の３０分、１時間、２時間、３時間お よび４時間後に血液試料１００μｌを各ラットの尾静脈から採取した。グルコー スオキシダーゼ法（シグマ・ケミカル・Ｃｏ．）によりグルコースを比色的に測 定した。時刻０の値からの血中グルコースの変化パーセントを各ラットについて 算出し、最終結果を、その日の対照群における平均の変化で補正した、実験群に おける平均変化パーセント±ＳＥＭとして表わした。 各用量についてのグルコース最下点でのグルコース変化のパーセントを表わす 、異なる濃度の被験化合物を用いた試験から、用量反応曲線を描いた。この曲線 から、最大の血糖低下反応の半分をもたらした蛋白の皮下用量（μｇ／ｋｇ）と してＥＤ50値を決定した。ヒトインシュリンのＥＤ50は７．８±０．１（ｎ＝３ ）、一方Ａｌａ（Ｂ２６）ＨＩのＥＤ50は８．９±０．７（ｎ＝２）であって、 これはインシュリンの８８％の力価であると解釈される。 豚のモデルで行なった研究もまたＡｌａ（Ｂ２６）ＨＩ類似体が速効性インシ ュリンとして有用であることを証明した。ヒトインシュリンと比較してほぼ２倍 量のＡｌａ（Ｂ２６）ＨＩが皮下注射から４０ないし６０分以内に吸収される。 前述のように、本発明に係るインシュリン類似体は、二量体化またはそれ以外 の高分子量型への自己会合の傾向が低い。したがって、１またはそれ以上の該類 似体を投与する時、迅速な活性の発現が達成される。本発明に係るインシュリン 類似体は、Ｂ鎖の２６位にアラニン残基を含むインシュリン類似体の有効量を、 それを必要とする患者に投与することにより、高血糖症の処置に有効である。本 明細書中使用される「有効量」という語は、血糖レベルを治療的または予防的に 低下させまたは維持するために必要な本発明に係る１またはそれ以上のインシュ リン類似体の量を意味する。この量は、典型的には、一日当り約１０単位から約 ６０単位までまたはそれ以上（またはおよそ２９単位／ｍｇと想定して約０．３ ないし約２ｍｇ）の範囲とすることができる。しかしながら、実際に投与される インシュリン類似体の量は、処置される状態（即ち高血糖症の原因）、投与され る特定の類似体、選択された非経口投与経路、年齢、体重および個々の患者の反 応および患者の徴候の重篤度を包含する関連状況に照らし、医師により決定され るであろう事が理解されるべきである。故に、上記の用量範囲は、いかなる様式 によっても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 本発明に係るインシュリン類似体は、Ｂ鎖の２６位にアラニン残基を含む少な くとも一つのインシュリン類似体の有効量を１またはそれ以上の薬学上許容し得 る賦形剤または担体と組み合わせて含有する医薬組成物によって、それを必要と する患者（即ち、高血糖症に罹患している患者）に投与される。これらの目的の ため、該医薬組成物は典型的には約１００単位／ｍｌを含有するよう、または該 インシュリン類似体の有効量を含有する類似の濃度に調合することができる。こ れらの組成物は、必ずという訳ではないが典型的には性質上非経口的であり、当 分野で良く知られる非経口用生成物のための常套的賦形剤または担体を用いて、 様々な技術のいずれかによって製造することができる。例えば、レミントンズ・ ファーマシューティカル・サイエンシズ、１７版、マック・パブリッシング・カ ンパニー、イーストン、ＰＡ、ＵＳＡ（１９８５）を参照されたく、これは引用 して本明細書の一部とする。例えば、非経口投与のための投与型は、Ｂ鎖の２６ 位にアラニン残基を含む少なくとも一つのインシュリン類似体の所望量を、水性 媒体のような注射に適した非毒性液体媒質中に懸濁または溶解し、この懸濁液ま たは溶液を滅菌することによって製造することができる。添付するバイアルまた は媒質を、投与前の混合の目的のために供することができる。非経口投与に適合 させた医薬組成物は、水および水混和性有機溶媒、例えばグリセリン、胡麻油、 落花生油、水性プロピレングリコール、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド等のよ うな希釈剤、賦形剤および担体を使用する。このような医薬組成物の例は、薬学 上許容し得る緩衝剤で緩衝化でき、発熱性物質を含まない、Ｂ鎖の２６位にアラ ニン残基を含むインシュリン類似体の無菌等張水性食塩水溶液を包含する。さら に、この非経口投与用医薬製剤はフェノールまたはメタクレゾールのような保存 剤を含有させることができる。水酸化ナトリウムまたは塩酸のような最終生成物 のｐＨを調節する物質もまた使用できる。 本発明に係るインシュリン類似体はさらに、経鼻投与に好適な医薬組成物に調 合することもできる。このような組成物は欧州特許出願０２００３８３ Ａ３号 に詳細が開示されており、これは引用して本明細書の一部とする。簡潔に述べる と、このような組成物は、１またはそれ以上の薬学上許容し得る希釈剤、実質上 亜鉛を含まないインシュリンのアルカリ金属塩、アンモニウム塩、または遊離酸 の薬学上許容し得る量、そして所望により、（１）オレイン酸またはそのエステ ルもしくは塩、（２）液体型のソルビタン脂肪酸エステル、（３）ソルビタン脂 肪酸エステルの液体型ポリオキシエチレン誘導体、および（４）液体型のヒドロ キシポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン共重合体 、より成る群から選ばれる少なくとも一つの吸収促進剤の吸収促進量と共に調合 される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号２と正しく架橋している配列番号１の式で示されるインシュリン 類似体またはその薬学上許容し得る塩［式中、配列番号１の２１位のＸａａは、 Ａｓｎ、ＡｓＰ、ＧＩｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒより成る群から 選ばれ、配列番号２の１位のＸａａは、ＡｓｐまたはＰｈｅより成る群から選ば れ、配列番号２の３位のＸａａはＡｓｐまたはＡｓｎより成る群から選ばれ、そ して配列番号２の２６位のＸａａはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅお よびＰｒｏより成る群から選ばれる］。 ２．配列番号１の２１位のＸａａがＡｓｎである請求項１に記載のインシュリ ン類似体。 ３．配列番号２の１位のＸａａがＰｈｅである請求項２に記載のインシュリン 類似体。 ４．配列番号２の３位のＸａａがＡｓｎである請求項３に記載のインシュリン 類似体。 ５．配列番号２の２６位のＸａａがＡｌａである請求項４に記載のインシュリ ン類似体。 ６．配列番号２と正しく架橋している配列番号１の式で示されるインシュリン 類似体またはその薬学上許容し得る塩［式中、配列番号１の２１位のＸａａは、 Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒより成る群から 選ばれ、配列番号２の１位のＸａａは、ＡｓｐまたはＰｈｅより成る群から選ば れ、配列番号２の３位のＸａａはＡｓｐまたはＡｓｎより成る群から選ばれ、そ して配列番号２の２６位のＸａａはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅお よびＰｒｏより成る群から選ばれる］を薬学上許容し得る希釈剤中に含有する医 薬製剤。 ７．配列番号１の２１位のＸａａがＡｓｎであり、配列番号２の１位のＸａａ がＰｈｅであり、配列番号２の３位のＸａａがＡｓｎであり、そして配列番号２ の２６位のＸａａがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ、Ｌｅｕ，ＩｌｅおよびＰｒｏより 成る群から選ばれる、請求項６に記載の医薬製剤。 ８．配列番号２の２６位のＸａａがＡｌａである請求項７に記載の医薬製剤。 ９．配列番号１で示される化合物を配列番号２で示される化合物と架橋させる ことからなる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のインシュリン類似体を 製造する方法。 １０．請求項９に記載の方法により製造されたインシュリン類似体。