JPH08504565A - 高分子のトランスロケーションシグナル促進核輸送 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規の受容体媒介輸送システムを用いて核内へタンパク質あるいはヌクレオチド配列を導入するための方法。本輸送システム構造体は、細胞受容体結合ドメイン、細胞質トランスロケーションドメイン、および核トランスロケーションシグナルドメインを含有する。前記システムはいったん核内へインターナライズされると機能する機能性高分子を輸送することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 高分子のトランスロケーションシグナル促進核輸送 発明の分野 本発明は細胞核内へ異物を導入する方法に関する。より詳細には、本明細書は 新規のトランスロケーションシグナル促進輸送システムを用いて核内へヌクレオ チド配列あるいはタンパク質を輸送するための方法を開示する。 発明の背景 一定の必要なタンパク質の発現における欠損によって明らかになった遺伝病に 苦しんでいる人々が普通の生活を送るためには、このようなタンパク質の治療用 量を付加する必要がある。現在、このような治療法は主として必要なタンパク質 の定期的な外因性導入を行う寿命維持療法である。このような定期的治療法は、 （ＨＩＶへの相当に高い曝露率をもっている血友病患者に対してのように）厄介 で、費用が高くつき、時には危険である。 ＤＮＡ（欠損タンパク質をコードする）、およびその他のヌクレオチド配列お よびポリペプチド（欠損タンパク質の発現を調節する）を遺伝性欠損症に苦しん でいる患者の細胞内へ導入することによってこのようなタンパク質欠損を付加す るためには生体分子的操作を利用する ことが望ましい。例えば、このような治療法には血友病患者のためには第VIII因 子に対する遺伝子および調節因子の導入、そして遺伝性気腫あるいは成人呼吸窮 迫症候群（ＡＲＤＳ）に苦しんでいる患者のためにはα−アンチトリプシンの導 入が含まれる。このようなアプローチは癌患者において迷入腫瘍細胞を再転換す ることにさえ拡張することができる。このような治療的転換を達成するための最 も魅力的方法は、欠損遺伝子産物をコードしている遺伝子を体細胞の核内へ輸送 することである。遺伝子発現のための哺乳類細胞内への異種ＤＮＡのin vitro輸 送はこれまで３種類のアプローチによって達成されてきた。第１のアプローチは 、細胞に感染し、特異なＲＮＡおよびタンパク質種の形でウイルス性ＤＮＡを発 現するウイルスの自然能力を利用している（Cournoyer et al.，1991．「原始ヒ ト造血祖先細胞内へのアデノシンデアミナーゼの遺伝子転移」、Human Gene The rapy，2：203：Rosenberg et al.，1990．「ヒトへの遺伝子転移：進行性黒色腫 を有する患者のためのレトロウイルス遺伝子形質導入により修飾された浸潤性リ ンパ球を用いる免疫療法」、New England Journal of Medicine，323：570）。 特に、様々な細胞型の感染を許容し、多数の様々な異種遺伝子の発現を許容する ベクターシステムとして哺乳類レトロウイルスが利用されてきた。レトロウイル スおよびそれらの組換え形は細胞表面上の特異受容体を通して細胞に結合すると 考えられており、その後それらはエン ドサイトーシス（細胞内取り込み）によってインターナライズされる。いったん エンドサイトーシスされると、ウイルスはエンドソームを分裂させ、分解を逃避 し、細胞核内への侵入を許容すると考えられている機序によってエンドソーム− リソソーム経路を回避することができる。 第２のアプローチは、外因性ＤＮＡを含有する人工脂肪親和性小胞と細胞標的 とを融合させる（Felgner et al.，1987．「リポフェクション：高度に有効な脂 質媒介ＤＮＡトランスフェクション方法」．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84： 7413）。エンドソーム関連分解は回避され得るであろうと仮説が立てられている ので、脂肪親和性小胞融合を通しての核へのDNAの輸送は可能であると考えられ ている。 第３の細胞内へ異種DNAを導入するための非特異的アプローチは、外因性DNAと DEAEデキストランのようなポリカチオン担体とを混合することによって（McCutc han et al.，1968．「ジエチルアミノエチル・デキストランを用いてのシミアン ウイルス40デオキシリボ核酸の感染性の増強」、J．Natl.，Cancer Inst．41：3 51）、あるいはリン酸カルシウムと複合させることによって（Graham et al.，1 973．「ヒトアデノウイルス５ＤＮＡの感染性アッセイのための新しい方法」、V irology，52：456）達成される。 外因性ＤＮＡとポリカチオン担体あるいはリン酸カル シウムとの混合物はその後生きている細胞と一緒にインキュベートされる（即ち 、トランスフェクションステップ）。ＤＮＡの取り込みあるいはエンドサイトー シスは発現された表現型のその後の選択によって、典型的には相補性あるいは抗 体反応性表面マーカーによって監視することができる。細胞によるＤＮＡ取り込 みの機序はまだその大部分が分かっていないが、一般にはＤＥＡＥデキストラン あるいはリン酸カルシウムがリソソーム細胞コンパートメントのヌクレアーゼ活 性からＤＮＡを保護し、その後に発現が発生する核への逃避が続くと考えられて いる。トランスフェクション方法を用いての発現の有効性増大は、クロロキンの ようなリソソーム向性剤（Luthman et al.，1983．「クロロキン処理細胞の高有 効性ポリオーマＤＮＡトランスフェクション」、Nucl．Acids Res.，11：1295） がトランスフェクション混合物に含まれているときに達成できる。リソソーム向 性剤は明らかに分解の活性化のために必要な相当に低いｐＨを増大させることに よってＤＮＡのリソソーム破壊を低下させる。 そこで、異種ＤＮＡを哺乳類細胞内へ導入するために数種のin vitro方法が提 案されてきた。しかし、これらの既知の方法には使用中において固有の欠点があ る。遺伝子発現のin vitroアプローチを治療量の遺伝子産物を発現するために遺 伝子材料を核へ輸送する問題へ翻訳するためには、数多くの問題および考察を処 理しなければ ならない。 これらの問題には下記のような事項が含まれるが、これらに限定されない。す なわち、治療を受けることが可能な特定疾患に苦しんでいる人への実際的な遺伝 子適用、特定細胞型あるいは臓器への重要な遺伝子のターゲティング、細胞によ る遺伝子の有効な取り込み、核への遺伝子のターゲティング、および遺伝子産物 の有効な発現の維持である。例えば、レトロウイルスはin vitroツールとしては 有益ではあるが、in vivoで使用する場合には、非常に広範な細胞型特異性、ゲ ノムの複製を許容するための細胞分割の必要性、いったん核内へ挿入された遺伝 子の発現が有効ではないこと、そしてヒトへの安全性に疑問があることを含めて 相当に多くの問題がある。 そこで、重要な遺伝子産物を発現することができるＤＮＡ断片へ静電的に結合 されているタンパク質の取り込みを媒介する特異細胞表面受容体を使用する努力 がなされてきた。これはオロソムコイド結合ポリ-Ｌ-リシンから構成される複合 体を塩橋によって細菌誘導性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ （ＣＡＴ）遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡに結合できたという観察によっ て初めて可能になった。細胞へのこの複合体の供与はアシアロ糖タンパク受容体 による取り込みおよびＣＡＴ遺伝子の短期間の発現を許容した（Wu et al.，198 9，「in vitroでのHepＧ２肝癌細胞へターゲティングされた遺伝子輸送の証拠」 、Biochemistry 27：887）。 しかし、重要な遺伝子産物を実際に発現する細胞数は複合体をエンドサイトーシ スする数より数桁小さく、これは取り込み後に複合体の相当に大きな細胞質内分 解が生じることを示唆している。 宿主細胞の感染後にアデノウイルスが他のウイルスと同様に細胞内破壊を回避 し、そのゲノムを細胞核へターゲティングするという観察によってもう１つ別の アプローチが与えられた（Curiel et al.，1991．「トランスフェリンポリリシ ン媒介遺伝子輸送のアデノウイルス増強」、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，88 ：8850）。アデノウイルスのカプシドタンパク質を「脱穀（uncoat）」する、そ してエンドソーム-リソソーム経路からの早期逃避を許容するアデノウイルス粒 子の能力が利用された。この研究グループは、この場合にはルシフェラーゼ遺伝 子産物の発現強化を媒介するためにアデノウイルス粒子を数キロベースから約50 キロベースの範囲内のＤＮＡへ静電的に結合されたトランスフェリン-ポリ-Ｌ- リシンの混合物へ添加した（Cotten et al.，1992．「不完全な、あるいは化学 的に不活性化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いての小型 および大型（48キロベース）遺伝子構造体の高度に有効な受容体媒介輸送」、Pr oc．Natl．Acad．Sci.，USA，89：6094）。アデノウイルスカプシドの添加を行 わないとルシフェラーゼ遺伝子の発現は非常に低かったが、他方アデノウイルス カプシドの添加を行うと発現は数桁分増大した（Wagner et al.， 1992、「トランスフェリンポリシリン／ＤＮＡ複合体へのアデノウイルス結合は 受容体媒介遺伝子輸送およびトランスフェクションされた遺伝子の発現を大きく 増強する」、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89：6099）。しかし、ウイルスに よるカプシドの脱穀を用いた場合でさえ、発現のための核へのトランスフェリン -ＤＮＡ複合体の輸送は本質的にランダムで、このような方法へ不確実さの要素 を導入することになる。 アデノウイルス促進遺伝子輸送方法の主要な短所は、報告されている発現のレ ベル増強を達成するための品質が未知である、化学的に誘導されるタンパク質- ＤＮＡ-ウイルス複合体の冗長な準備に成功の可否が依存している点である。さ らにもう１つの短所は望ましい細胞標的上でのトランスフェリンおよびアデノウ イルス両方の受容体の随伴性発現が必要とされる点である。 発明の概要 本発明は、哺乳類細胞の核への治療価値を有するタンパク質あるいはＤＮＡ- タンパク質複合体の有効な、再現可能な、かつターゲティングされた輸送を提供 するためのトランスロケーションシグナル促進システムであり、我々のアプロー チは、細胞内へ侵入し、細胞質トランスロケーションシグナルの助けを借りてエ ンドソームから出て細胞質内へ入るように指令する、そしてさらに特異的核ター ゲティングシグナルの助けを借りて核へ進むよ うに指令するような特異機能を実施するウイルスだけではない一部のタンパク質 の自然能力を利用する。 本開示は、一般に表面外傷の部位で患者に感染する、だが線維芽細胞および主 として肝臓へ、そして二次的に腎臓および脾臓のような臓器へ全身性にその毒性 （ビルレンス）をターゲティングすることもあり得る、緑膿菌（Pseudomonas ae ruginosa）の外毒素Ａを用いての細胞特異ターゲティングおよび細胞間トランス ロケーションを示す。外毒素Ａは４つのドメインから構成されており、これらの ドメインはアミノ末端から始まってドメインIa、II、IbおよびIIIとして組織化 されている（Allured et al.，1986．「3.0オングストロームの解像度での緑膿 菌の外毒素Ａの構造」、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，83：1320（図１）。 ドメインＩａ（アミノ酸 １-252）は外毒素を細胞表面受容体へ特異的に結合 させる。ドメインII（アミノ酸253-364）はエンドソームの低ｐＨコンパートメ ントにおいて活性化後に特異的に開裂され、外毒素の遠位領域をエンドソームか らトランスロケーションさせる外毒素の領域である。ドメインIII（アミノ酸405 -613）はリボソーム関連タンパク質伸長因子２を不活性化させる毒素のＡＤＰリ ボシル化活性を含有する。ドメインＩｂは機能性ドメインというよりむしろ構造 性ドメインであると思われる（アミノ酸365-404）。その取り込みおよび細胞質 への輸送における各ステップのために重要である外 毒素タンパク質の特徴は、（Siegall et al.，1989，「プソイドモナス（シュー ドモナス）外毒素のII、IbおよびIIIドメインの機能的分析」、J．Biol．Chem. ，264：14256）の中で述べられている。 さらに、癌化学療法の目的で毒素活性を一定の細胞の細胞質へターゲティング させるために他の非毒素関連受容体結合ドメインをＡＤＰリボシル化ドメインII Iへ付着させるキメラ分子を構成することができる。外毒素ＡドメインＩａおよ びIIを無関係のドメイン、この場合には細菌性ヌクレアーゼであるバルナーゼを 哺乳類細胞の細胞質へ輸送するために使用できることもまた証明されている（Pr ior et al.，1992，「プソイドモナス外毒素ＡのドメインIIにより媒介されたト ランスロケーション：サイトゾル内へのバルナーゼの輸送」、Biochemistry．31 ：3555）。 我々は治療使用の遺伝子およびタンパク質の両方を細胞核へ輸送するための他 のシステムの不完全さを克服する新規の有効なシステムについて説明する。ＤＮ Ａあるいはタンパク質の核ターゲティングおよび輸送のために設計された分子シ ステムのシェーマは図２に示されている。この図２は治療的介入のために核への 高分子をターゲティングするために必要とされる決定的に重要なドメインの好ま しい配置を示している。 本輸送システムの決定的に重要な特徴は、受容体結合ドメインである「Ｘ」、 細胞質トランスロケーションド メインである「II」、核トランスロケーションシグナルドメインである「ＮＴＳ 」、そしていったん核内へインターナライズされると作用する機能的高分子「Ｚ 」である。実施例として、図３は特異担体タンパク質の構造、図４は外毒素Ａ結 合ドメインのための細胞受容体へのターゲティングタンパク質のタンパク質担体 媒介輸送のシェーマを図示している。図３に描出された実施態様においては、受 容体結合ドメイン（「Ｘ」）はプソイドモナス外毒素Ａ遺伝子から誘導されたド メインＩａであり、機能性ドメイン（「Ｚ」）はβ-ガラクトシダーゼであるが 、その核輸送は５-ブロモ-４-クロロ-３-インドイル-β-D-ガラクトピラノシド （Ｘ-gal）基質の存在下において青色の呈色によって測定される。この輸送シス テムは、この構造体のアミノ末端から始まって、ＳＶ40Ｔ抗原からの核ターゲテ ィングシグナル（ＮＴＳ）、およびβ-ガラクトシダーゼの機能型であるプソイ ドモナス（シュードモナス）外毒素ＡからのドメインＩａおよびIIから構成され る。ドメインＩａは、特異細胞表面受容体へ結合することによって線維芽細胞の ような外毒素Ａ受容体を含有する特別な細胞型へ、あるいは肝臓のような臓器へ 向かわせるための自然な手段を提供する。 タンパク質-担体複合体はエンドサイトーシスによって細胞内へインターナラ イズされ、さらにこの複合体はエンドソーム内へ飲み込まれることになる。その 成熟の過程中に、エンドソームのｐＨはより酸性になり、それ に基づいてドメインIIのｐＨ駆動開裂が発生するが、これはこのドメインの活性 化であり、タンパク質の遠位部分（ドメインII、ＮＴＳおよびβ-ガラクトシダ ーゼの部分）から細胞質へのトランスロケーションの重要な鍵である（図３参照 ）。いったん細胞質に入ると、この場合は通常は核内において機能する以外は細 胞質において翻訳されるＳＶ40のウイルス性タンパク質から誘導されている核タ ーゲティングシグナル（ＮＴＳ）の存在が、タンパク質-担体複合体から核への 急速なトランスロケーションを促進する細胞質タンパク質と相互作用する。いっ たん核に入ると、この場合にはβ-ガラクトシダーゼから誘導されたポリペプチ ド・ドメインは適切に自由に機能することができる。 ドメインＩａを他の受容体結合ドメイン（例えば、転換成長因子アルファ（Ｔ ＧＦ-α）、あるいはジフテリア毒素のような毒素由来リガンド）によって置換 できること、そしてβ-ガラクトシダーゼも同様に他のタンパク質ドメイン、例 えば転写因子によって置換できることは当業者によって理解されるであろう。後 者の場合には、核内で自然に発見される可能性がある他のタンパク質ドメインが β-ガラクトシダーゼと置換されるときには、それらは既にそれらの内部でコー ド化された核トランスロケーションシグナル（ＮＴＳ）をもっている可能性があ るので、追加のＮＴＳを包含させることはおそらく不必要であることが理解され るであろう。同様に、当業者 はＳＶ40核トランスロケーションシグナルドメインをイーストα-２、ＧＡＬ-４ のような他のものと置換できることを理解できよう。 さらにまた、最初のタンパク質ドメインも最後のタンパク質ドメインも連続的 ポリペプチド鎖である必要はなく、むしろ独立して合成され、化学修飾によって アミノ末端あるいはカルボキシル末端へ付着させることができることも理解され るであろう。さらにタンパク質ドメインを核へ輸送する目的で上述の輸送システ ムにおいてドメインＩａを非タンパク質受容体結合ドメインに置換できることも 理解されるであろう。最後に、ある実施態様では上述のようなキメラ分子の輸送 は全身性血液循環内へ注射することによってin vivoにおいて単純にターゲティ ングすることができる。 ＤＮＡのような核酸を核へ輸送する目的で、図２に明示されているキメラ構造 体の唯一の変更は、ドメイン「Ｚ」がもはや機能性ポリペプチドドメインではな く、むしろＤＮＡ結合ドメインである点である。このＤＮＡ結合ドメインは特異 的あるいは非特異的のいずれかで静電的結合によってＤＮＡ断片へ付着させられ ており、これはセンスあるいはアンチセンスのオリゴヌクレオチド、あるいは複 製、調節、転写および／または翻訳塩基配列シグナルを含む発現可能な遺伝子の いずれかを含んでいる。 図５は、遺伝子療法のために核酸（ＤＮＡ）を細胞核 へ輸送するために設計されたタンパク質担体を図示したものである。図６は、Ｄ ＮＡ結合のために使用されるタンパク質担体の構造を示したもので、そこでは受 容体結合ドメイン（「Ｘ」）はプソイドモナス外毒素Ａ遺伝子から誘導されたド メインＩａであり、ドメインIIおよびＮＴＳドメインは上述の通りであり、ドメ イン（「Ｚ」）はガラクトシダーゼをコードするプラスミドＤＮＡ分子と静電相 互作用するために使用されるポリ-Ｌ-リシンの範囲である。 上述したように、ドメインＩａは輸送システム-ＤＮＡ複合体分子を細胞受容 体へ結合させるために使用されている。エンドサイトーシスおよびインターナラ イゼーションおよびエンドソームの成熟の終了後、ドメインIIのｐＨ依存性開裂 が発生し、その後に先端を切り取られた（truncated）複合体の細胞質へのトラ ンスロケーションが続くが、そこではＮＴＳドメインおよびそれらの各結合タン パク質が複合体を核内へ輸送する。ＮＴＳドメインは核への複合体のトランスロ ケーションを媒介する細胞質タンパク質へ結合する。いったんトランスロケーシ ョンが生じると、核プロセスはＤＮＡそれ自体からＤＮＡ結合ドメインを巻き戻 しすることができ、その後に治療タンパク質をコードするＲＮＡの転写および翻 訳が続き、さらに適切な場合はターゲティングＤＮＡの複製が続くことがある。 ポリ-Ｌ-リシンおよびポリ-Ｄ-リシン、核トランスロ ケーションシグナル塩基配列（「ポリ−ＮＴＳ」）の反復、オルチニン、プトレ シン、スピルミジン、スペルミン、ヒストンおよびその他の塩基配列非特異性基 礎ＤＮＡ結合タンパク質、およびホメオボックスドメインのような塩基配列特異 性ＤＮＡ結合タンパク質を含めて、ＤＮＡに結合するポリペプチドドメインには 他の多数の例があることは分かっている。当業者は、合成化学リンカーのような 輸送システムへＤＮＡを接続するための手段として他のポリカチオン高分子に置 換できる点を理解できるであろう。ポリ-Ｌ-リシン（あるいは-Ｄ-）を除くと、 他の型のＤＮＡ結合タンパク質はコード化されたＮＴＳシグナルを内部にもって いる。このような場合には、最終構造体にＮＴＳドメインを追加する必要はない であろう。これらのＤＮＡ結合ドメインはキメラ分子の一部として連続的に翻訳 される、あるいは化学修飾によって基礎構造体へ付着させることができる。ポリ -Ｌ-リシンの使用への代替策には、核発現に対してターゲティングされたＤＮＡ 構造体の内部での短い特異ＤＮＡ塩基配列を含めねばならないが、これは特異Ｄ ＮＡ結合タンパク質、例えばホメオボックスドメインあるいはその他の転写因子 によって結合され得るであろう。遊離したポリ-Ｌ-リシンあるいはポリ-Ｄ-リシ ンはその後引き続いての遺伝子発現を促進するためにＤＮＡ分子自体の崩壊に役 立つように添加することができる。上述のように、プソイドモナス外毒素Ａの受 容体結合ドメインＩａを他の 受容体結合ドメインと置換できることが認識されるであろう。 下記の詳細な説明の項で述べるように、本発明に従ってＤＮＡあるいはタンパ ク質を核へ上首尾で輸送するための鍵は、（１）細胞質へのトランスロケーショ ンを媒介するためのプソイドモナス外毒素ＡドメインIIあるいはその機能的に等 価のものの使用、（２）核へのトランスロケーションを媒介するための核ターゲ ティングシグナルの使用を含む。 発明の詳細な説明 実施例１プソイドモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ）遺伝子のクローニング ゲノムＤＮＡはMarmur et al.，1961．「微生物からデオキシリボ核酸を単離 するための方法」、Journal of Molecular Biology，3：208により記載された方 法に従って、最初に外毒素Ａを産生すると報告された（Liu．P.，1966．「緑膿 菌の様々な分画が病因において果たす役割、III。in vitroおよびin vivoで産生 された致死性毒素の同定」、Journal of Infectious Diseases，116：481）細菌 株、緑膿菌ＰＡ103（アメリカ式培養コレクション、29260）から調製する。 ゲノムＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼNotＩおよびEcoRＩを用いて開裂さ せ、その後0.8％低溶解性アガ ロースゲル上で電気泳動法により分離させ、そこから−２から2.6キロベース対 の領域を削り取り（外毒素Ａ遺伝子セグメントの予想される大きさは2.3キロベ ース。Gray et al.，1984．「Escherichia coliにおける緑膿菌の外毒素Ａ構造 遺伝子のクローニング、ヌクレオチド配列および発現」、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA.，81：2645）、ＤＮＡを溶離する。精製されたNotＩ-EcoRＩ ＤＮＡを1 5℃で16時間に渡ってＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる反応においてNotＩおよびEcoR Ｉ（Promega Corp.，マディソン、ウィスコンシン州）を用いて事前に開裂され ているバクテリオファージ、すなわちλgt11のホスファターゼ化腕へ連結させる 。 ＤＮＡをStratagene Corp（サンディエゴ、カリフォルニア州）から入手した 相補的パッケージング抽出物を用いて感染性粒子内ヘパッケージする。約1,000 個の組換えλ粒子は指示菌であるEscherichia coli Ｙ 1090上に置き、ニトロセ ルロースフィルター上に上げる。ＤＮＡはManiatis et al.，1982．「分子クロ ーニング。実験室マニュアル」、（コールドスプリング・ハーバー、ニューヨー ク州）に説明されているようにin situで溶解させる。その後フィルターをジゴ キシゲニン-dＵＴＰ（Boehringer Mannheim Biochemicals，インディアナポリス 、インディアナ州）の存在下でオリゴヌクレオチドＧＴ105Ｆ（５’-ＧＧＡＴＣ ＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣ）（ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ．１）およびＧＴ103Ｒ（５’-ＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＧＧＣ ＧＡＴＧＡＣＴＧＡＴ）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）を用いて開裂された緑膿菌 ＰＡ103ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって調製されたプソイドモナス外毒素Ａ（ＥＴ Ａ）のＩａドメインに相当するＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション によってふるい分けする。 容易な操作のためにBluescriput ＫＳ＋プラスミドべクター（Stratagene Cor p.，サンディエゴ、カリフォルニア州）内へ再クローニングされているＤＮＡの 小規模調製のために陽性プラーク（溶菌斑）を増幅させる。様々なＥＴＡドメイ ンのそれ以上の増幅および修飾のための鋳型源として2.3キロベースのＥＴＡゲ ノムＤＮＡを使用する。 実施例２プソイドモナスＥＴＡドメインＩａおよびIIのクローニング 実施例１からの2.3キロベースのＤＮＡをＥＴＡ遺伝子の結合（Ｉａ）ドメイ ンおよび細胞質トランスロケーション（II）ドメインのポリメラーゼ鎖反応媒介 増幅のために使用し、ドメインＩａおよびIIをコードするＤＮＡ塩基配列を増幅 させ、さらにクローニングするためにオリゴヌクレオチドＧＴ105Ｆ（５’-ＧＧ ＡＴＣＣ ＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＣＴ Ｃ）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）およびＧＴ106Ｒ２（５’-ＡＡＧＣＴＴＧＧＴ ＧＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴ）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）を使 用し、その後に細菌細胞および昆虫細胞における非分泌型ポリペプチドとしてド メインを下流発現させる。 制限部位BamHＩおよびHindIII（上記の下線部分）はオリゴヌクレオチドの５ ’端内へ取り込まれてドメインの下流のクローニングおよび操作を促進する。細 菌発現プラスミドpSE380（Invitrogen Corporation、サンディエゴ、カリフォル ニア州）においてＮ末端ドメインＩａおよびIIをもっているポリペプチドの分泌 を達成するために、プソイドモナス外毒素Ａシグナルペプチド配列（ＧＴＯ01Ｓ ＰＦ：ＴＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧ） （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）をコードするＤＮＡ塩基配列内でプライムする前進 オリゴヌクレオチドを用いてクローンの第２バージョンを用意した；昆虫細胞発 現システムにおける分泌のためには、豊富なバクロウイルスエンベロープ糖タン パク、gp67（Stewart et al.，1991，「昆虫特異性毒素遺伝子を含有する改善さ れたバクロウイルス殺虫剤の構成」、Nature，352：85）のシグナル塩基配列内 の前進オリゴヌクレオチドコード化を使用する（ＧＴＯ02ＳＰＦ：ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＣＴＡＣＴＡＧＴＡＡＡＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴ ＡＡＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴＡＴＴＧＴ ＴＴＴＡＴＡＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＣＴＧＣ ＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣ）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ ．５）。図７ａはBamHＩ-BspHＩ/HindIII ＤＮＡカセットとしてのドメインＩａ およびIIの修飾形を示している。 実施例３核トランスロケーションシグナルの調製 タンパク質あるいはタンパク質-ＤＮＡ複合体の核へのターゲティングを促進 するために、明確に特徴付けられている哺乳類ウイルスＳＶ40（Garcia-Bustos et al.，1991、「核タンパク質局在」、Biochemics et Biophysica Acta．1071 ：83）からの核トランスロケーションシグナル（ＮＴＳ）ドメインを構造体の調 製に含める。 ＳＶ40ＮＴＳドメインを調製するために相補的５’HindIII制限部位を有する ２種の重複している合成オリゴヌクレオチド、つまりＧＴ108Ｆ：５’-ＡＧＣＴ ＴＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＧＧＴＣＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６） およびＧＴ108Ｒ：５’-ＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＧ ＧＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７）を使用する。図７ｂはこの方法によってHindII I-HindIIIカセットとして作り出され、増幅されたＮＴＳドメインを示している 。このカセットはその後ＥＴＡドメインＩａおよびIIの３’端でＴ４ＤＮＡリガ ーゼによって連結される。ＥＴＡ ＩＡ-IIに対比させたHindIII- HindIII ＳＶ40ＮＴＳカセットの位置は図７ｄに示されている。 実施例４Escherichia coli lac z遺伝子のクローニング 核へターゲティングされるタンパク質を視覚的に検出する手段として、β-ガ ラクトシダーゼをコードする細菌性lac Ｚ（’lac Ｚ）遺伝子のアミノ末端不完 全版を含む構造体を調製する。このＤＮＡセグメントはオリゴヌクレオチドＧＴ 107Ｆ（５’-ＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴ ＧＧＣＧＴＴ）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）およびＧＴ107Ｒ（５’-ＣＴＧＣＡ Ｇ ＣＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧ）（ ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）を用いてlac Ｚ遺伝子含有プラスミドｐＣＨＩ10（Ph armacia）ピスカタウェイ、ニュージャージー州）の増幅によって入手した。図 ７ｃはHindIII-PstＩカセットとしての’lac Ｚ遺伝子塩基配列を示している。 実施例５標的タンパク質の核輸送のためのタンパク質担体の構造、ＥＴＡドメインＩａお よびII／ＮＴＳ／β-ガラクトシダーゼ 図７ｄはプソイドモナスＥＴＡドメインＩａおよびII、ＳＶ40ＮＴＳドメイン および’lac Ｚ遺伝子をコードし ているＤＮＡカセットのアッセンブリーを示している。ＥＴＡ IA-II ＤＮＡカ セットはＰＣＲ増幅プライマー内に含まれている共通HindIII制限部位を用いて Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによってＮＴＳおよびlac Ｚ ＤＮＡカセットに連結され ている。最終ＤＮＡ構造体は数種のバクロウイルス発現プラスミド（例えばＰＶ Ｌ1393：Webb et al.，1990，「組換えバクロウイルスを用いるタンパク質の発 現」、Technique-A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology，2：1 73）の１つを用いるバクロウイルスシステムにおける発現のために、あるいはＴ ７プロモーター特異性発現を使用するｐＥＴのような高発現プラスミドベクター 内への組入れによる細菌宿主における発現（Studier et al.，1986，「クローニ ングされた遺伝子の選択的ハイレベル発現を目指すためのバクテリオファージＴ ７ ＲＮＡポリメラーゼの使用」、J．Mol．Biol.，189：113）によってプラスミ ドベクター内へ挿入される。 バクロウイルスあるいは細菌のいずれかにおいて発現されたタンパク質構造体 は、タンパク質Ａを通して連結される抗β-ガラクトシダーゼ抗体カラムを通し て細胞溶解物および／または媒質から精製される。このように調製したタンパク 質は、外毒素Ａ感受性哺乳類細胞（例えば、Ｌ-Ｍ細胞、アメリカ式培養コレク ションＣＣＬ 1.2、あるいはChang liver cells、アメリカ式培養コレクション ＣＣＬ 13）を用いてのin vitroインキュベー ションによって、および／または肝臓および／または二次的臓器部位のいずれか へのin vivoターゲティングのために哺乳類血液循環内への注射後に機能性β-ガ ラクトシダーゼを核へターゲティングするために適している。 核ターゲティングの成功の可否は、組織化学的にＸ-gal基質が無色から機能性 β-ガラクトシダーゼを示す青色へ転換することによってアッセイする。β-ガラ クトシダーゼおよび／またはＥＴＡ Ｉａドメインに置換された他のドメインと 一緒に使用するために類似の構造体を調製することができる。 実施例６ＥＴＡドメインＩａおよびII／ＮＴＳ／カチオンポリペプチドの構成 図８は、「Ｚ」ドメインの位置でポリカチオン範囲をもっている連続的ポリペ プチドのための好ましい配置を示している。この実施例では、我々はポリカチオ ン範囲としてポリ-Ｌ-リシンを使用している。ポリリシンポリペプチドセグメン トは５’端にHindIII制限部位および３’端にPstＩ部位を含有している（’lac Ｚにおけると同様に）200−300塩基のポリＡＡＡ／ＡＡＧ（リシン・コドン）の 合成ＤＮＡセグメントから生成される。PstＩ部位のすぐ近位には翻訳を終結さ せるためにＴＡＧ、ＴＧＡあるいはＴＡＡのような停止コドンが置かれている。 ポリリシンを使用する替わりに、ＳＶ40塩基配列から 誘導された20−30という数のＮＴＳ反復（ＳＶ40核ターゲティングシグナルはポ リカチオンであるので）、あるいはそれらが他のもっと長い核ターゲティングシ グナル由来の場合はもっと少数の反復を含有するＤＮＡセグメントを使用するこ とができる（図９）。これらの相違するポリカチオンセグメントのいずれか１つ をＥＴＡ IA-II/ＮＴＳ（BamHＩ-HindIII-HindIII）カセットから構成されるコ ア構造体の３’端で連結することができる（図７ｄ参照）。 さらに連続的に翻訳されるポリペプチドのようにβ-ガラクトシダーゼドメイ ンに対してポリカチオン置換へのもう１つの代替策として、類似の作用を達成す るために例えばポリリシンがウイルスあるいはバクロウイルス発現ＥＴＡ IA-I I-ＮＴＳコア構造体へ化学修飾によって共有的に結合され得ることは高く評価さ れるであろう（図10）。 実施例７ＥＴＡドメインＩａおよびII／ＮＴＳ／ＤＮＡ結合タンパク質の構成 図11は、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（ドメイン「Ｚ」）を調製するための 代替方法を示している。このポリペプチドドメインは特異ＤＮＡ塩基配列に結合 する数種の核タンパク質のいずれか、例えばホメオボックスドメインあるいはイ ーストＧＡＬ４タンパク質から誘導 される。これらのドメインはこれらのドメインをコードしているゲノムＤＮＡあ るいはｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅される。増幅されたドメインの５’端お よび３’端に含まれているのはHindIIIおよびPstＩ制限部位であり、これらは’ lac Ｚあるいはポリリシンドメインを構成するためにも使用される。我々の実施 例では、短く定義されたＤＮＡ塩基配列が核内における発現のためにターゲティ ングされるＤＮＡ遺伝子の構成に含まれており、これらのドメインのうちの１つ 以上をＤＮＡに結合するために使用でき、引き続いての複雑な形成には非共有的 に付加された基礎タンパク質あるいはポリ-Ｌ-リシン（あるいはポリ-Ｄ-リシン ）のようなポリカチオンへの付加が含まれるであろう。 実施例８発現のためのＤＮＡの核輸送のためのタンパク質担体-ＤＮＡ複合体の構成 、β- ガラクトシダーゼをコードするプラスミドヘリンクされたＥＴＡドメインＩａお よびII／ＮＴＳ／ポリ-Ｌ-リシン 図12はβ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を発現する目的で哺乳類細胞 の核へＤＮＡ構造体を輸送することができるタンパク質担体を調製するための好 ましい方法を示している。上記に説明したＥＴＡ IA-IIドメインは、アンプラ イマー内に含まれている共通HindIII制限部位を用いてＴ４ ＤＮＡによってＮ ＴＳドメインへ 連結されている。このＤＮＡ構造体は数種のバクロウイルス発現プラスミドの１ つ（例えば、ｐＶＬ1393：Webbetal.，1990，「組換えバクロウイルスを用いる タンパク質の発現」、Technique・A Journal of Methods in Cell and Molecula r Biology，2：173）を用いて、あるいはＴ７プロモーター特異発現を用いるｐ ＥＴのようなプラスミドベクター内への取り込みによる細菌宿主における発現に よって（Studier et al.，1986，「クローン化遺伝子の選択的ハイレベル発現を 目指すためのバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの使用」、J．Mol． Biol.，189：113）バクロウイルスシステムにおける発現のためにプラスミドベ クター内へ挿入される。 発現されたタンパク質担体は、基礎タンパク質に結合するカルボキシルメチル セファロースのようなアニオン交換カラムを通す従来のイオン交換クロマトグラ フィーによって細胞溶解物および／または媒質から精製する。市販入手可能なポ リ-Ｌ-リシン（40,000mol.wt.）をその後従来のＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシン イミド）化学を用いることによってＥＴＡ IA-II/ＮＴＳドメインへ結合させる 。結合しなかったポリ-Ｌ-リシンはリン酸塩緩衝食塩水中に溶解させたSephadex Ｇ-100（あるいはその等価物）を通すクロマトグラフィーによって除去する。 化学反応産物である生成タンパク質担体をその後、２Ｍ ＮａＣｌ、10mM Tr is-ＨＣｌ、ｐＨ7.5 １mM ＥＤＴＡ 中で市販入手可能なβ-ガラクトシダーゼをコードする哺乳類発現プラスミドｐ Ｃ Ｈ110（Pharmacia製、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）と一緒にイン キュベートし、透析によって150mM ＮａＣｌへ希釈する。タンパク質-ＤＮＡ複 合体の形成は１％アガロース上でゲル電気泳動法により測定するが、アガロース 上ではプラスミドＤＮＡ単独が7.2kbの相対分子マーカー重量位置でその超コイ ル形で移動し、他方超コイルＤＮＡとＥＴＡ IA-II/ＮＴＳ/ポリ-Ｌ-リシンと の複合体はアガロースゲルの一番上で移動するが、これは非常に高分子量複合体 であることを示している。結合されなかったＤＮＡはセファロースゲルビーズ基 質上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離される。この方法で調製さ れたタンパク質担体-ＤＮＡ複合体は外毒素Ａ感受性哺乳類細胞（例えば、Ｌ-Ｍ 細胞、アメリカ式培養コレクションＣＣＬ1．2あるいはChang liver cells、ア メリカ式培養コレクションＣＣＬ13）を用いてのin vitroインキュベーションに よって、および／または肝臓および／または二次的臓器部位へin vivoターゲテ ィングするために哺乳類血液循環内へ注射した後に核へターゲティングするため に適している。 核ターゲティングの成功の可否は、その後組織化学的に無色のＸ-gal基質が機 能的β-ガラクトシダーゼを示す青色へ転換することによってアッセイすること ができる。 塩基配列一覧 （１）一般情報： （ｉ）特許出願人：マイルズ社（Miles Inc．） （トーマス Ｒ バーネットおよびラチンドラ Ｃダス） （ii）発明の名称：高分子のトランスロケーションシグナル促進核輸送 （iii）塩基配列の数：９ （iv）通信宛て先： （A）宛て先：マイルズ社 （B）所番地：400モルガン・レーン （C）市名：ウェストヘイブン （D）州名：コネチカット （E）国名：米合衆国 （F）ＺＩＰ番号：06516 （ｖ）コンピュータ・リーダブル・フォーム： （A）媒体の型：フロッピーディスク （B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ （C）オペレーティングシステム：ＭＳ-ＤＯＳ （D）ソフトウエア：Word Perfect 5.1 （vi）現在の特許出願書データ： （A）特許出願書番号： （B）提出日： （C）分類： （vii）弁理士／代理人に関する情報： （A）名称：バーバラ Ａ シャーニー弁護士 （B）登録番号：第29,862号 （C）関連／協議事項番号：ＭＷＨ314 （viii）遠距離通信に関する情報： （A）電話：（203）937-2340 （B）FAX：（203）937-2795 （２）塩基配列ＩＤ ＮＯ：１についての情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド35個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Gray et al． （B）掲載雑誌名：Proc．Natl．Acad．Sci．USA （C）巻：81 （D）頁：2645 （E）発行年：1984 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴ ＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧ ＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧ ＡＣＣＴＣ 35 （３）塩基配列ＩＤ ＮＯ：２に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド30個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Gray et al． （B）掲載雑誌名：Proc．Natl．Acad．Sci．USA （C）巻：81 （D）頁：2645 （E）発行年：1984 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡ ＡＡＧＴＧＣＡＧＧＣ ＧＡ ＴＧＡＣＴＧＡＴ 30 （４）塩基配列ＩＤ ＮＯ：３に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド29個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Gray et al． （B）掲載雑誌名：Proc．Natl．Acad．Sci．USA （C）巻：81 （D）頁：2645 （E）発行年：1984 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧ ＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡ ＣＧ ＡＡＧＣＧＣＴ 29 （５）塩基配列ＩＤ ＮＯ：４に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド32個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Gray et al． （B）掲載雑誌名：Proc．Natl．Acad．Sci．USA （C）巻：81 （D）頁：2645 （E）発行年：1984 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＴＣＡＴＧＡＴＣＣＴ ＧＡＴＡＣＣＣＣＡＴ ＴＧ ＧＡＴＴＣＣＣＣ ＴＧ 32 （６）塩基配列ＩＤ ＮＯ．５に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド138個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Stewart et al． （B）掲載雑誌名：Nature （C）巻：352 （D）頁：85 （E）発行年：1991 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣ ＴＡＣＴＡＧＴＡＡＡ ＴＣ ＡＧＴＣＡＣＡＣ ＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡ 40 ＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡ ＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧ ＡＴ ＧＧＴＡＡＧＣＧ ＣＴＡＴＴＧＴＴＴＴ 80 ＡＴＡＴＧＴＧＣＴＴ ＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＧ ＧＣＧＣＡＴＴＣ ＴＧＣＣＴＴＴＧＣＧ 120 ＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴ ＴＣＧＡＣＣＴＣ 138 （７）塩基配列ＩＤ ＮＯ：６に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド27個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Benditt et al． （B）掲載雑誌名：Proc．Natl．Acad．Sci．USA （C）巻：86 （D）頁：9327 （E）発行年：1989 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＡＧＣＴＴＣＣＴＡＡ ＧＡＡＧＡＡＡＣＧＴ ＡＡ ＧＧＴＣＡ 27 （８）塩基配列ＩＤ ＮＯ：７に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド27個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Benditt et al． （B）掲載雑誌名：Proc．Natl．Acad．Sci．USA （C）巻：86 （D）頁：9327 （E）発行年：1989 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ ＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴ ＴＡＣＧＴＴＴＣＴＴ ＣＴ ＴＡＧＧＡ 27 （９）塩基配列ＩＤ ＮＯ：８に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド36個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Kalnins et al． （B）掲載雑誌名：ＥＭＢＯ Ｊ． （C）巻：２ （D）頁：593 （E）発行年：1983 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣ ＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧ ＧＧ ＡＡＡＡＣＣＣＴ ＧＧＣＧＴＴ 36 （10）塩基配列ＩＤ ＮＯ：９に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A）長さ：ヌクレオチド39個 （B）型：核酸 （C）鎖構造：一本鎖 （D）トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型： 他の核酸−オリゴヌクレオチドプライマー （iii）出版物に関する情報： （A）著者：Kalnins et al． （B）掲載雑誌名：ＥＭＢＯ Ｊ． （C）巻：２ （D）頁：593 （E）発行年：1983 （iv）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴ ＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣ ＡＣ ＣＡＧＡＣＣＡＡ ＣＴＧＧＴＡＡＴＧ 39

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 受容体結合ドメイン、細胞質トランスロケーションドメイン、核トランス ロケーションドメインを含有するポリペプチドと、前記ポリペプチドへ選択され た高分子を結合するための手段とからなる合成物。 ２． 前記高分子がヌクレオチド、オリゴペプチド、ポリペプチドから構成され るグループ、およびタンパク質、第VIII因子をコード化するヌクレオチド配列、 α-１-アンチトリプシンをコード化するヌクレオチド配列、遺伝子発現の調節因 子であるポリペプチド、β−ガラクトシダーゼから選択されている請求項１記載 の合成物。 ３． 前記受容体結合ドメインが特異細胞受容体に対する毒素誘導リガンドであ り、ジフテリア毒素あるいはプソイドモナス外毒素Ａから誘導されている請求項 １記載の合成物。 ４． 前記細胞質トランスロケーションドメインがプソイドモナス外毒素Ａから 誘導されている請求項１記載の合成物。 ５． 前記核トランスロケーションドメインがＳＶ40核酸塩基配列、酵母α-２- 核酸塩基配列、およびＧＡＬ-４核酸塩基配列から構成されるグループから選択 されている請求項１記載の合成物。 ６． 前記高分子を核トランスロケーションドメインへ結合するための手段がポ リ-Ｌ-リシン、ポリ-Ｄ-リシン、 ポリＮＴＳ、オルニチン、プトレシン、ヒストン、ＧＡＬ-４、ホメオボックス ドメイン、スペルミジンおよびスペルミンから構成されるグループから選択され ているポリカチオン高分子である請求項１記載の合成物。 ７． ａ）受容体結合ドメイン、細胞質トランスロケーションドメイン、核トラ ンスロケーションドメインを含有するポリペプチドと、前記ポリペプチドへ選択 された高分子を結合させるための手段とを標的細胞へ適用するステップと、 ｂ）細胞を前記ポリペプチドと一緒にインキュベートするステップと、 ｃ）アッセイにより転移を測定するステップと、 を含む、標的細胞核内へ外因性高分子を挿入するための方法。 ８． ポリペプチドが請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、または請求項 ６に記載されている通りである請求項７記載の方法。