JPH08502060A

JPH08502060A - 血餅−溶解タンパク質の部位−特異的放出用医薬組成物

Info

Publication number: JPH08502060A
Application number: JP6508918A
Authority: JP
Inventors: ヘーレマンス，ジヨハンナ・ルイゼ・マリア; クルフト，コルネリス; グロメリン，ダニエル・ジヤン・アン
Original assignee: ステイヒテイング・ボール・デ・テヒニシエ・ベテンシヤツペン
Priority date: 1992-10-05
Filing date: 1993-10-05
Publication date: 1996-03-05
Also published as: WO1994007537A1; EP0662841B1; NL9201722A; DE69321131D1; CA2146324A1; AU5345494A; ATE171073T1; NO951219D0; NO951219L; EP0662841A1

Abstract

(57)【要約】血餅の治療用医薬組成物、および血餅の検出のための診断用組成物が記載され、その組成物は標的デバイスとしてプラスミノーゲンが結合したリポソームまたは他の生分解性コロイドキャリアーを有し、そして血餅−溶解特性としてプラスミノーゲン活性化因子（特に組織−型プラスミノーゲン活性化因子：ｔＰＡ）を有し、該方法ではａ）プラスミノーゲンのフィブリンに対する親和性は本質的に維持されたままでプラスミノーゲンをリポソームに結合し；そしてｂ）プラスミノーゲンとプラスミノーゲン活性化因子との相互反応が減少するような条件下でプラスミノーゲン活性化因子をリポソームに包含させる。出発物質として精製されたプラスミノーゲンを使用して、プラスミノーゲンをリポソームに結合させる方法についても記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】血餅−溶解タンパク質の部位−特異的放出用医薬組成物本発明は血餅の部位で特異的な血餅−溶解タンパク質を放出するための医薬組成物に関する。急性心筋梗塞は通常、血餅が完全にまたは実質的に１つの冠状動脈を閉鎖することにより起こる。また血餅は血液循環において別の急性または慢性異常に関与することがよくある。このような症状を治療するために血餅−溶解タンパク質を使用することが知られている。そのようなタンパク質は血液に存在するプラスミーゲンのプラスミンへの転換を介して（プラスミンは次にフィブリンを分解できる）直接的、または間接的に血餅の崩壊を導くことができる。しかし、血餅−溶解タンパク質を投与すると血餅崩壊も至ること所で起こり、そして血液循環中にプラスミーゲンの活性化が起こる結果、出血および血栓塞栓合併症が起こることが欠点である。この全身的な影響を避けるために、血餅−溶解タンパク質は全血液中ではそれらの作用を発揮できないが、血餅を治療する部位だけで発揮できることが必要である。この特異性を達成するために、血餅−溶解タンパクをカプセル化し、その全体に血餅−探索物質を施すことによる、さまざまな提案が成されてきた。国際特許出願公開第90/07924号明細書は、遊離アミノ基を含有する免疫グロブリンのような標的分子を、チオール官能基を提供するリポソームとカップリングさせる方法を開示する。このカップリングは二官能性試薬であるスクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピネートをアミノ基およびチオール基と反応させて行われる。リポソームは診断薬を含むことができる。ポリエチレングリコールまたはポリ乳酸のような親水性ポリマーで修飾したリポソームから成るリポソーム組成物（その中に抗利尿剤、抗凝固剤または抗腫瘍剤が存在できる）は国際特許出願公開第91/055454号明細書に開示されている。国際特許出願公開第90/14078号明細書では、血栓症の治療のために注入可能な調製物が記載され、その調製物はその中心（コアー）の水性媒質中にプラスミノーゲン活性化因子を含有する半透過性または分解性のマイクロカプセル（リポソーム）を含んで成る。この明細書ではリポソームは好ましくは“部位−特異的” であると述べているが、そのような標的−方向性の放出についての尺度は記載されていない。欧州特許出願公開第450,479号明細書および同363,712号明細書は、一方では組織型プラスミノーゲン活性化因子のような血栓分解剤に結合でき、そして他方では活性化血小板またはフィブリンに特異的である二特異的モノクローナル抗体を開示し、この抗体は血餅を抑制するために使用される。これらの既知医薬品は十分に特異的ではなく、かつ／または血餅の部位に十分に効果的に供給されないか、あるいはその薬剤が身体に固有のものでないため免疫原性の可能性がある、という点で不利である。本発明の目的は血餅を効果的かつ安全に治療できる医薬組成物およびその調製法を提供することである。驚くべきことには、プラスミノーゲンに対して活性化因子が高モル比であってもプラスミノーゲンとプラスミノーゲン活性化因子との自然な相互作用は、次のように減少できることが分かった。それは、プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン活性化因子の意図する機能を完全に残したまま、プラスミノーゲン活性化因子を血餅−溶解タンパク質として、そしてプラスミノーゲンを標的デバイスとして含むように調製した微粒子調製物による。したがって本発明は血餅に対して親和性を示す標的デバイス、および血餅−溶解タンパク質としてプラスミノーゲン活性化因子を有する生分解性のコロイド状キャリアーを含む医薬組成物であって、その標的デバイスがコロイド状キャリアーに結合しているプラスミノーゲンである組成物に関する。生分解性コロイドキャリアーは特にリポソームである。通常リポソームはリン脂質および／またはステロール、ならびに糖脂質および他の構成物から作られた微小胞であり、その小胞は水−含有区分を包含すると理解されている。リン脂質も部分的または全体的にポリエチレングリコールのような親水性ポリマーで修飾できる。微小胞は単ラメラまたは多重ラメラ、あるいは別の状態であることができる。キャリアー粒子の直径は臨界的なものではなく、そして一般的には20nm− 10μmの範囲であり、より特別には100nm−1μmの間である。ポリシアノアクリレート、ゼラチンまたはアルブミンナノパーティクル（nanoparticle）のような他の生分解性コロイド系も使用できる。生分解性コロイドキャリアーの性質を変形（特にリポソームの二層構造：例えばそれぞれ飽和または不飽和脂肪酸残基を含有する“ゲル”または“流体”状の二層、あるいは二層中のコレステロールの存在）することにより、特異的な使用に従う本発明の医薬組成物のヒトまたは動物体内における放出特性およびクリアランスを調和できる。例えば急性心筋梗塞には迅速な血餅溶解が必要であり、したがって血栓溶解剤の素早い溶解が必要である。次に短い循環時間で十分である。一方深部静脈の治療には比較的長い期間の低いレベルの血栓溶解剤の投与が必要である。コロイドキャリアーを例えばポリエチレングリコールで修飾することにより、24時間にわたって単回用量の注入でよい組成物が調製できる。適当なプラスミノーゲン活性化因子はウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ−プラスミノーゲン複合体、組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA、フィブリノキナーゼ）、吸血コウモリプラスミノーゲン活性化因子のような動物プラスミノーゲン活性化因子および同様な活性化因子、ならびにそのようなプラスミノーゲン活性化因子のキメラの、突然変異の、切断された、および化学的に修飾された類似体である。好ましくは本発明の組成物は天然に存在するプラスミノーゲン活性化因子、および／またはヒト起源のプラスミノーゲン活性化因子であり、より詳細には天然に存在するtPAのような血栓崩壊剤である。tPAの利点は生理的な条件下で、すべての種類のフィブリンについて高い特異性および高い親和性を有することである。天然に存在するプラスミノーゲン、特にglu1−プラスミノーゲンおよびglu2− プラスミノーゲンのようなglu−プラスミノーゲンは、本発明の組成物用の標的デバイスとして好ましく使用される。lys-プラスミノーゲンおよびmini-プラスミノーゲンのようなプラスミノーゲン誘導体も、場合によっては使用できる。可能な限り、プラスミノーゲンはフィブリンとの反応に適するコンフォーメーション状態にある。プラスミノーゲンとキャリアー微粒子とのカップリングは、実質的に第一アミン類のような不純物を含まないプラスミノーゲンが使用された場合に向上し得る。特に使用するプラスミノーゲン（モルあたり）は、140molより少ない、特に70molより少ない遊離第一アミン（ε-アミノカプロン酸（EACA）のような）を含有する。より好ましくはプラスミノーゲンはモルあたり20molより少ない、好ましくは13.3molより少ない第一アミンを含有し、カップリング反応ですべて予想される標準的な達成度は、mlのプラスミノーゲンあたり6.5mg付近であり、そしてより高濃度のプラスミノーゲンが使用された場合は比例して混入物が低濃度である必要がある。例えばプラスミノーゲン１molあたり13.3molより多くのEACAを最初に含有するプラスミノーゲン調製物の場合は、必要とされる低濃度の第一アミン濃度は特殊な精製法（例えば大量の過剰容量を有するカラムを使用するゲル濾過）により得られる。そのような精製法を使用すると、プラスミノーゲンはフィブリンを認識するために好都合な構造で得られることも分かった。キャリアーの付加量は使用目的に応じて変化できる。リポソームはリン脂質１ μmolあたり少なくとも10^-6、そしてより好ましくは少なくとも10^-5μmolのプラスミノーゲン活性化因子を含有する（１μmolのリン脂質は約750μgに相当する）。プラスミノーゲン活性化因子は本質的にリン脂質の内側および／または脂質二重層に位置するが、部分的には外表面にも存在する。標的デバイスとして作用するプラスミノーゲンは、好ましくはキャリアーの外表面に化学的に結合している。プラスミノーゲン−キャリアー付加生成物のフィブリンに関する親和定数が、遊離のプラスミノーゲンよりも大きくなるように各キャリアー微粒子は１つより多くのプラスミノーゲン分子を含有する。このましくは各キャリアー粒子は平均で少なくとも10個のプラスミノーゲン分子を有する。より特別にはキャリアー微粒子あたり10-1000個のプラスミノーゲン分子が結合している。１μmolあたりのリン脂質に対するμmolのプラスミノーゲンで表すと、その付加量は好ましくは1.6×10^-5 −1.6×10^-3である。本発明による組成物の生分解性コロイドキャリアーは、他の薬剤、添加剤または助剤（別の血栓崩壊剤のような）、あるいはインビボで放出速度を制御する薬剤またはインビトロでキャリアーの安定性を制御するを薬剤を含有できる。例えばリポソームは、様々な浸透圧により血栓崩壊剤を意図する部位で放出することを促進するように高等張性であることができる。本発明の組成物は多様な形態であることができ、それは例えば水性分散物または粉末である。凍結−乾燥粉末は特に長期間の保存に適する。アミノ酸または糖などの凍結防止剤も存在できる。また組成物は水性溶液、塩、安定剤および他の助剤のような許容できる賦形剤を含有できる。また組成物は非−カプセル化のプラスミノーゲン活性化因子も含有できる。医薬組成物は様々な病理過程（特に人間の）の治療に使用できる。これらの使用には、（急性）心筋梗塞、静脈深部血栓症、肺塞栓症および血栓を妨害しないフィブリンの形成の治療がある。組成物は静脈中、動脈中、筋肉中、腹腔中、経皮的、皮下的等のそれ自体既知の投与法で投与できる。使用する量および濃度は当業者によって決定できるが、部分的には血栓の部位での生物的利用性に基づき、ならびに体重、健康状態および年齢のような身体的パラメーターに基づき定めることができる。上記の組成物が投与される時、同時に、あるいは前以て非−カプセル化プラスミノーゲン活性化因子を混合効果を達成するため、すなわち非−カプセル化活性化因子の素早い予備的効果（“ボーラス：bolus”）ならびにカプセル化活性化因子の遅延効果を達成するために使用することも可能である。 tPAの血餅部位での放出は、放出−制御物質の存在にのみ影響されるだけでなく、血液成分による複合体の不安定化により、キャリアー材料上のプラスミノーゲンの分布変化または補体−媒介分解にも影響されうる。また本発明は血液血餅に親和性を示す標的デバイスを備えた生分解性コロイドキャリアーを含んで成る組成物の調製方法であって、ａ）プラスミノーゲンのフィブリンに対する親和性を維持したまま実質的に第一アミン類を含まないプラスミノーゲンをコロイドキャリアーに結合させ；そしてｂ）所望により、医薬品または診断薬をコロイドキャリアー中に包含させる、方法に関する。特にプラスミノーゲンは上記のように１molのプラスミノーゲンあたり70molより少ない遊離アミンを含んで成る。このようにして調製された組成物はそのままで使用することができる。しかし血栓崩壊剤または他の医薬品、あるいは放射性同位体のような診断薬、ガス気泡および他の検出しうる物質も本法のキャリアーに包含できる。本発明はまた上記のような血餅の治療のための医薬組成物の調製法に関する。本発明の方法の好適な変法は、以下の工程を含んで成る：ａ）プラスミノーゲンのフィブリンに対する親和性を実質的に維持したままプラスミノーゲンをリポソームに結合させ：そしてｂ）プラスミノーゲンとプラスミノーゲン活性化因子の相互反応が減少するような条件下で、プラスミノーゲン活性化因子をリポソーム中に包含させる。本発明の方法で使用するリポソームは、それ自体既知の方法、例えばF.Szoka およびD.PapahadjopoulosによりAnn.Rev.Biophys.Bioeng.9.467-508(1980)に記載された“フィルム”法、“エタノール注入”法（S.BatzriおよびE.D.Korn,Bio chim,Biophys,Acta 298,1015(1973)）、または “エーテル注入”法（D.W.DeamerおよびA.D.Bangham,Biochim.Biophys.Acta.394 ,483(1976)）あるいは“逆相蒸発小胞”（F.SzokaおよびD.Pap ahadjopoulos、Pr oc.Natl Acad.Sci.USA ,75.4194(1978)）により調製できる。このようにして調製されたリポソームは単ラメラ、または多重ラメラであることができる。他のリポソームまたは分解性コロイドキャリアー類、ならびにそれらの他の調製法も使用できる。ａ）工程で、プラスミノーゲンを好ましくはコロイドキャリアーに共有結合させる。プラスミノーゲンとキャリアーとの結合は、例えばタンパク質に導入されたチオール基とキャリアー中に存在する活性化された二重結合との反応、またはペプチドのカップリング様式としてそれ自体既知の別法に基づき起こり得る。リポソームへの結合がチオール反応による場合には以下のａ）の副工程を分化でき、これは良好な結果を導くことが分かった：ａ１）プラスミノーゲンのメルカプト基−含有誘導体（例えばメルカプトアシル誘導体）への転換（この段階でタンパク質中のリシン残基のような遊離のアミノ基は、誘導体へ転換される）：このために適当な試薬はスクシンイミジルアセチルチオアセテート（SATA）であり、カップリングおよび脱アセチル化（ヒドロキシルアミンを使用）後、タンパク質のメルカプトアセチル誘導体を導く（R.J.S.Duncanら、Anal.Biochem.132,68-73(1983)、およびR.A.Schwendene rら、Biochim.Biophys.Acta 1026,69-79(1990)）；ε−アミノカプロン酸のようなアミンがほとんど無いプラスミノーゲンを使用する場合、プラスミノーゲン１分子あたり3-9個のチオール基を導入することが可能であが、一方市販されているglu-プラスミノーゲンを使用するときはわずか0-1.8個のチオール基を導入できるにすぎない；ａ２）メルカプト基と反応できる固定基が付いたリポソームの調製；この種類の適当な固定基は例えばマレイミド基であり、そのために適当なマレイミド−ホスファチジル化合物をリン脂質成分に包含させることができる；適当なそのような化合物の例は［4-（p-マレイミドフェニル）ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン（MPB-PE）である（F.J.Martinら、J.Biol.Chem.257,286-288(1982) を参照のこと）；ａ３）プラスミノーゲン誘導体と固定基が付いたリポソームとの反応；上述の例の場合には、次の反応はチオール化プラスミノーゲンとマレイミド基が付いたリポソームとの反応である；この反応は適当な緩衝液中で進行する；ａ４）リポソームに結合したプラスミノーゲンの非結合プラスミノーゲンからの分離は、例えば超遠心による。プラスミノーゲンのリポソームへの他の適当なカップリング方法は、リポソームを親水性ポリマーで修飾し（国際特許出願公開第91/05545号明細書に記載されるように）、次にプラスミノーゲンをポリマー鎖の末端にカップリングさせる。親水性ポリマーは例えば2,000−5,000の間の分子量を有するポリエチレングリコールであることができ、例えば末端カルボキシル基を有するポリエチレングリコールおよびジステアリルホスファチジルエタノールアミンおよびカルボジイミドのようなカップリング活性化剤を使用して共有結合によりリポソームと結合できる。プラスミノーゲンは次にカルボジイミドのようなカップリング活性化剤を使用して修飾リポソームとカップリングできる。本発明の方法においてはプラスミノーゲンをコロイドキャリアーに結合させる別の方法も使用できる。使用可能な方法は、例えばグルタルアルデヒドによるカップリングであり、それは一方がタンパク質（プラスミノーゲン）のヒドロキシル基またはアミノ基であり、もう一方がキャリアーのヒドロキシル基またはアミノ基である（V.P.Torchilinら、Biochem.Biophys.Res.Commun.85,983-990(1978) に記載されている）。D.L.UrdalおよびS.Hakomoro.によりJ.Biol.Chem.255.1050 9-10516(1980)に記載されているアビジン−ビオチン反応も使用できるが、この反応ではアビジンがキャリアーに結合し、そしてビオチン化タンパク質に結合できる。さらにA.A.Bogdanovら、FEBS Letters 231,381-384(1983)に記載された方法も使用でき、それによればキャリアー表面のタンパク質は、N-ヒドロキシスルホスクシンイミドの存在下でカルボジイミドでの活性化により固定化できる。これら技術の変法およびジスルフィド結合の形成のような他の技法も使用できる。プラスミノーゲンのカップリングは、できるかぎりプラスミノーゲンのフィブリンへの結合能力が完全に維持されるように行われなければならない。チオエーテルの形成によるカップリングの場合には、プラスミノーゲン活性化因子の結合に対してキャリアー上に残る固定基を保護するためにコロイドキャリアーは好ましくはシステインのようなチオールで工程ｂ）の前に処理される。この工程はａ４）工程の前または後に行われる。ｂ）工程において、プラスミノーゲンおよび／またはプラスミノーゲン活性化因子はプラスミノーゲンのプラスミノーゲン活性化因子による転換が減少するように、または遮断されるように処理される。換言すれば比較的少量の基質（プラスミノーゲン）および比較的大量の酵素（プラスミノーゲン活性化因子）が存在する所である場合でもプラスミノーゲンが転換されないように、あるいは少量のみが遊離のプラスミノーゲン活性化因子によりプラスミンに転換されるように処理される。またこの処理は好ましくは可逆的であるので、プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性化因子により血餅の部位で転換されることができる。プラスミノーゲン活性化因子によるプラスミノーゲンの転換は低温および／または低ｐＨ、特に約４（3-5）のｐＨで減少できることがわかった。例えば塩化亜鉛のようなハロゲン化金属または例えばε−アミノカプロン酸（EACA）またはオルニチンのような5-7個の炭素原子を有するアミノアルカノール酸のような他の薬剤もこの目的のために使用できる。血餅認識に必要であり、そしてカップリング中に減少するフィブリンに対するプラスミノーゲンの親和性は、組成物の投与後に再獲得することができる。ｂ）工程において、プラスミノーゲン活性化因子はタンパク質の既知カプセル化法により、コロイドキャリアー中に包含されることができる（リポソーム中への包含については、C.KirbyおよびG.Gregoriadis,Biotechnolo gy 2,979(1984)またはM.B.Ballyら、Biochim,Biophs.Acta 812,66(1985)を参照にされたい）。それは本明細書に含まれる物理的カプセル化法である。 tPAはプラスミノーゲン活性化因子の存在下でリポソームの凍結−解凍により比較的大量に包含できることが分かった。好ましくは凍結−解凍は数回行う。凍結−解凍前に、リポソームを適当な緩衝液中に溶解し、損失を防ぐために場合によってはそこにTween80のような表面−活性剤を加える。緩衝液のｐＨは約3-8であり、好ましくは約４である。カプセル化に使用するために必要な濃度および量も所望する最終生成物の組成物により決定される。上記に記載した工程の順番が好ましいが、本発明の血餅−分解組成物は次の方法を使用して調製することもできる：ｃ）プラスミノーゲン活性化因子を生分解性コロイドキャリアー中に包含し、そしてｄ）プラスミノーゲンのプラスミノーゲン活性化因子との相互反応が減少するような条件が必要である場合には、フィブリンに対するプラスミノーゲンの親和性を実質的に維持したままプラスミノーゲンをコロイドキャリアーに結合させる。この方法では、リン脂質または他のキャリアー成分は最初に固定基が提供され、その後固定基を例えばメルカプト化合物により可逆的に保護することができる。次にキャリアー粒子が形成され、そしてプラスミノーゲン活性化因子がカプセル化され、その後固定基から保護が除去される。もしプラスミノーゲン活性化因子がキャリアー中に完全にカプセル化されるならば、上記の活性化因子との相互反応を低下させることは完全にまたは部分的に省略できる。プラスミノーゲンを次にカップリング試薬によりキャリアー中の固定部位に結合させる。上記記載のようにして得られた組成物をさらに処理し、適当な使用目的のために作成することができる。好ましくは組成物を工程ａ）の後、工程ｂ）の前または後、あるいは工程ｄ）の後に凍結−解凍する。凍結−乾燥は例えばアルギニンのようなアミノ酸、あるいは例えばラクトースまたはマンニトールのような糖あるいは糖アルコールのような凍結防止剤の存在下で行うことができる。この方法では、使用前に再構成され、使用するまで漏出、分解またはプラスミン形成の危機にさらされることが無い、安定な生成物が得られる。本発明は以下の“キット”と呼ばれる組成物の組み合わせに関するものでもある。そのようなキットの１つの態様は、少なくとも１つの上記医薬組成物、および場合によってはさらに組成物の調製および投与手段を含んで成る。さらに、キットは混合投与のために別個のプラスミノーゲン活性化因子を含んで成ることもできる。別の態様のキットでは、標的デバイスとしてプラスミノーゲンが結合した生分解性コロイドキャリアーを含む少なくとも１つの医薬組成物（したがってこれはカプセル化されたプラスミノーゲン活性化因子が無い）、ならびにプラスミノーゲン活性化因子を含有する組成物を含んで成る。プラスミノーゲン活性化因子の全部または一部が使用前に組成物に包含される。さらに別の態様ではキットは一方で遊離アミンが低いプラスミノーゲンが結合した生分解性コロイドキャリアーを含有する組成物を、そして他方では場合によっては使用前にコロイドキャリアー中に包含されることができる医薬品または診断薬を含んで成る。実施例Ｉ glu-プラスミノーゲンの精製 80mgのタンパク質を含有する市販の高濃度のglu-プラスミノーゲン溶液3mlの部分を、100mlの容量を有し、そしてSephadex G25メディウムが充填された１メーターのカラムで、10mM HEPES緩衝液を使用して精製した。この精製で１molのg lu-プラスミノーゲンあたり45molのε−アミノカプロン酸を除去した。この精製段階でチオール−導入SATA反応（下記参照）中にタンパク質の反応性の上昇が示された：一方未精製試料については１molのglu-プラスミノーゲンあたり１mol付近のSHが導入され、この数は精製試料に関しては１molのglu-プラスミノーゲンあたり9molのSHに上昇した。純粋なEACAを精製したglu-プラスミノーゲン試料に加えると、SATA反応に対する反応性が減少し、その減少量は１molのglu-plgあたり14molのEACAで約半分であり、そして10および100倍高いEACA濃度でそれぞれ１mol SH／mol、および0.1m ol SH／molglu-plgに累進的に減少した。プラスミノーゲンのチオール化 10mM HEPES緩衝液（135mMの塩化ナトリウムおよび1mM EDTAを含有）に溶解した73μMのglu-プラスミノーゲンを室温で20分間、pH7.5にて584μMのスクシイミジル（アセチルチオ）酢酸（SATA）と一緒に、1:100のDMF：緩衝液の容量比であるジメチルホルムアミド（DMF）中でインキュベーションした。混合物をSephade xG-50カラムで分離した。タンパク質画分を280nmの吸収を測定することにより検出した。画分を合わせて-20 ℃に保存した。タンパク質濃度はWesselおよびLowry（（R.K.Scopes、タンパク質精製；理論と実際（Protein Purification;Principles and Practice）、第二版、スプリンジャー：Springer(1987)278-283を参照）法を使用して測定した。アセチルチオアセチルタンパク質（glu-プラスミノーゲン-ATA）は、新に調製した0.5Mのヒドロキシルアミン．HCl溶液（25mM EDTAを含有する0.5M HEPES、pH =7.5）で、容量比が10:1のタンパク質溶液：ヒドロキシルアミン溶液で処理することにより脱アセチル化した。遊離のスルフィドリル基の濃度を次に5,5'-ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）で、G.L.Ellman、Arch.Biochem.Biophys.82,70-7 7(1959)の方法を使用して測定した。ヒドロキシルアミン溶液自体の吸収により起こる誤差を避けるために、この測定には誘導体に転換しないタンパク質およびヒドロキシルアミンの両方を含むブランクを使用した。８：１のSATA：タンパク質に関しては、市販のglu-プラスミノーゲン、または精製したglu-プラスミノーゲンのどちらを使用するかに応じて１molのglu-プラスミノーゲンあたり0.5-9 S H基を取り込むことが可能であることが分かった。リポソームの調製タンパク質分子用に固定基が付いたリポソームはホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロールおよび［4-（p-マレイミドフェニル）ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン（MPB-PE）を38.5:4:16:0.5-1.5のモル比で出発物質として使用して、F.SzokaおよびD.Papahadjopoulos,Ann.Rev.B iophys.Bioeng .9.467-508(1980)の方法に順じて調製した。MPB-PEはF.J.Martin およびD.papahadjopoulos、J.Bio1.Chem.257(1),286-288(1982)の方法を使用して調製した。リポソームを孔の大きさが0.6μm(1×)、0.4μm(1×)および0.2μm(3×)であるポリカーボネート膜を通して押し出した。押し出した後の平均直径は（動的光散乱で測定）、0.24±0.01μmであった。リポソームを10mM HEPES（135mM NaClおよび1mM EDT Aを含有する）中で調製した。過塩素酸で破壊した後リン脂質の濃度をC.H.Fiske およびY.Subbarow,J.Biol.Chem.66 375-400(1925)の方法を使用して測定した。チオール化プラスミノーゲンのリポソームへのカップリング得られたリポソームにチオアセチル-glu-プラスミノーゲンを種々の量で加え、そして混合物を30、75または120分間インキュベーションした。リン脂質濃度はHEPES、pH7.4中で6.7μmol/mlであり、そしてタンパク質濃度は0.5-2.5mg/ml であった。インキュベーション容量は0.5mlであった。カップリング反応は50μl のN-エチルマレイミド（HEPES中で8mM）を加えて停止し、そしてリポソームを遊離のタンパク質から超遠心（４℃で80,000×g、45分間を２回：ベックマン（Bec kman Instruments））により分離した。遊離のglu-プラスミノーゲン、誘導体の glu-プラスミノーゲンおよびリポソームのglu-プラスミノーゲン活性を、P.Frib ergerら、Heamostasis 7,138-145(1978)の方法を使用してストレプトキナーゼで活性化して測定した。プラスミノーゲン試料を過剰モルのストレプトキナーゼとインキュベーションし、そして複合体の活性を合成基質S-2251（H-D-Val-Leu-Ly s-pNA）の転換に基づき測定した（測定は反応生成物pNA（パラニトロアニリド）の405nmでの吸収により測定した）。SATA誘導体に転換したglu-プラスミノーゲンの活性は未処理のglu-プラスミノーゲンと比較して幾分減少したことが分かった。リポソームに結合したglu-プラスミノーゲンの酵素活性は元の活性の68％（ ±６％）まで減少したことが分かった（すなわちSATA誘導体に転換前）。glu-プラスミノーゲンのフィブリンへの結合の測定タイターテックプレート（Titertek plates）をフィブリノーゲン層で覆い、そして次にトロンビンで活性化し、約0.33nmol/cm²の密度でフィブリンモノマーの層を持つプレートを得た。glu-プラスミノーゲンとプレートの未処理部分との非−特異的な結合を避けるために、得られたプレートをTween20で処理した。15n mol/lのglu-プラスミノーゲン試料（血漿中の１％プラスミノーゲン濃度）を室温で、pH7.4にて一晩インキュベーションした。上澄みを回収して、結合した画分を緩衝液で３回洗浄した。両画分のプラスミノーゲン濃度を上記のS-2251の転換で測定した。これで結合したタンパク質の割合を計算できた。リポソームのgl u-プラスミノーゲンのインキュベーションに使用した濃度は遊離タンパク質の濃度と同じであった。緩衝液は0.05M Tris-HCl、0.85％NaClおよび0.01重量％のTw een20を含有した。このTweenの濃度ではリポソームの認識できる分解は起こらなかった。リポソームにカップリングされたglu-プラスミノーゲンのフィブリン− 結合能力を、遊離のglu-プラスミノーゲンと比較した。全タンパク質に対するフィブリン−結合タンパク質の比をプラスミノーゲンの両方の状態について、15nm ol/lのglu-プラスミノーゲンの固定低濃度について算出した。リポソーム画分のタンパク質密度はリン脂質１molあたり50μgであった。フィブリンに結合したリポソームタンパク質の画分は遊離のタンパク質の10倍以上多かった。この効果を添付の第１図に示す。この図ではプラスノミーゲン−リポソームの付加生成物（ ▼）および遊離プラスノミーゲン（▲）の結合をプラスノミーゲン濃度の関数として１時間あたりの吸収単位で示す。空のリポソームを遊離タンパク質に加えたとき、フィブリンとの結合は起こらなかった。実施例II 組織−型プラスノミーゲン活性化因子を含有するリポソームの調製リポソーム（実施例Ｉの方法により調製）を0.05% Tween80の存在下または非存在下で、75、100および150μmol/mlのリン脂質濃度の緩衝液中（10mM Tris,13 5mM NaCl,pH7.5；または0.1Nクエン酸、0.264Mシュクロース、pH4；あるいは0.1 Nクエン酸、0.029Mシュクロース、pH4）に懸濁した。組織−型プラスノミーゲン活性化因子（tPA）をこの懸濁液に37、92および185μg/ml濃度で加えた。リポソームのカプセル化能力を上げるためにリポソームを次に５回凍結−解凍した。非カプセル化tPAを45分間、４℃で150,000×gの超遠心により除去した。超遠心の間、上澄みから非カプセル化tPAの損失を避けるために0.05％のTween80を緩衝液に含ませた。実施例III 標的デバイスとしてのプラスノミーゲン付加リポソームおよび組織−型プラスノミーゲン活性化因子を含有するリポソームの調製プラスノミーゲン−含有およびtPA-含有リポソームを実施例ＩおよびIIに記載したように調製した。フィブリンが存在しない場合は、tPAによるプラスミノーゲンの転換率は低い。さらに低pH（3-5）および／またはEACA（7mMまで）または金属ハロゲン化物の添加より、転換率の減少が達成される。実施例IV 組織−型プラスノミーゲン活性化因子を含有するリポソームのインビボでの挙動 tPAを含有するリポソーム（実施例IIのように調製し、tPAは¹²⁵Ｉにより標識されている）を、３兎の健康なウサギ（人工的な血餅を持たない）に注入した。血液試料を５分毎に採血し、そしてTween80によりリポソームを破壊した後tPA活性を測定した。結果を第２図に示す。３つの直線（△、○、▽）は３兎のウサギに関する。平均的なリポソームtpAの半減値は約140分であり、これは実質的に遊離tPAよりも長く（ウサギでは約2.5分）、遊離tPAよりも消失が遅いリポソーム区分中に包含されたtPAを示す。実施例Ｖ PEG-ヘッドグループ（PEG-headgroup）に結合したプラスノミーゲン付加リポソーム：ラットにおいて長い循環時間を持つプラスノミーゲン含有リポソーム PEG-DSPE（ポリエチレングリコール−ジステアリルホスファチジルエタノールアミン）基に結合したプラスノミーゲンを付加したリポソームは、DSPEをポリオキシエチレン−ビス（酢酸）と77単位のポリオキシエチレンとをカップリングさせることにより調製し（KungおよびRedemann,Biochim.Biophys.Acta 862,435-43 9(1986)を参照）、カップリング生成物を大豆ホスファチジルコリンおよびコレステロールと、5.4:67.6:27のモル比で混合した（G.Blumeら、Biochim.Biophys.A cta 1149,180-184（1993）も参照）。ラットに静脈注射した後、比較的低いクリアラス速度および長い循環時間がこれらプラスノミーゲン-PEG-リポソームに見られた：注射24時間後、非-PEG-含有リポソームは元の投与量の４％であるのに比べ、プラスノミーゲン-PEG-リポソームは元の投与量の18.4％が未だ循環していた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月１４日【補正内容】明細書血餅−溶解タンパク質の部位−特異的放出用医薬組成物本発明は血餅の部位で特異的な血餅−溶解タンパク質を放出するための医薬組成物に関する。急性心筋梗塞は通常、血餅が完全にまたは実質的に１つの冠状動脈を閉鎖することにより起こる。また血餅は血液循環において別の急性または慢性異常に関与することがよくある。このような症状を治療するために血餅−溶解タンパク質を使用することが知られている。そのようなタンパク質は血液に存在するプラスミーゲンのプラスミンへの転換を介して（プラスミンは次にフィブリンを分解できる）直接的、または間接的に血餅の崩壊を導くことができる。しかし、血餅−溶解タンパク質を投与すると血餅崩壊も至ること所で起こり、そして血液循環中にプラスミーゲンの活性化が起こる結果、出血および血栓塞栓合併症が起こることが欠点である。この全身的な影響を避けるために、血餅−溶解タンパク質は全血液中ではそれらの作用を発揮できないが、血餅を治療する部位だけで発揮できることが必要である。この特異性を達成するために、血餅−溶解タンパクをカプセル化し、そして全体を血餅−探索物質として提供することによる、さまざまな提案が成されてきた。国際特許出願公開第90/07924号明細書は、遊離アミノ基を含有する免疫グロブリンのような標的分子を、チオール官能基を提供するリポソームとカップリングさせる方法を開示する。このカップリングは二官能性試薬であるスクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピネートをアミノ基およびチオール基と反応させて行われる。リポソームは診断薬を含むことができる。ポリエチレングリコールまたはポリ乳酸のような親水性ポリマーで修飾したリポソームから成るリポソーム組成物（その中に抗利尿剤、抗凝固剤、tPAまたは抗腫瘍剤が存在できる）は国際特許出願公開第91/055454号明細書に開示されている。国際特許出願公開第90/14078号明細書では、血栓症の治療のために注入可能な調製物が記載され、その調製物はその中心の水性媒質中にプラスミノーゲン活性化因子を含有する半透過性または分解性のマイクロカプセル（リポソーム）を含んで成る。この明細書ではリポソームは好ましくは“部位−特異的”であると述べているが、そのような標的−方向性の放出についての測定は記載されていない。損失を防ぐために場合によってはそこにTween80（商標）のような表面−活性剤を加える。緩衝液のｐＨは約3-8であり、好ましくは約４である。カプセル化に使用するために必要な濃度および量も所望する最終生成物の組成物により決定される。上記に記載した工程の順番が好ましいが、本発明の血餅−分解組成物は次の方法を使用して調製することもできる：ｃ）プラスミノーゲン活性化因子を生分解性コロイドキャリアー中に包含し、そしてｄ）プラスミノーゲンのプラスミノーゲン活性化因子との相互反応が減少するような条件が必要である場合には、フィブリンに対するプラスミノーゲンの親和性は実質的に維持したままプラスミノーゲンをコロイドキャリアーに結合させる。この方法では、リン脂質または他のキャリアー成分は最初に固定基が提供され、その後固定基を例えばメルカプト化合物により可逆的に保護することができる。次にキャリアー粒子が形成され、そしてプラスミノーゲン活性化因子がカプセル化され、その後固定基から保護が除去される。もしプラスミノーゲン活性化因子がキャリアー中に完全にカプセル化されるならば、上記の活性化因子との相互反応を低下させることは完全にまたは部分的に省略できる。プラスミノーゲンを次にカップリング試薬によりキャリアー中の固定部位に結合させる。上記記載のようにして得られた組成物をさらに処理し、適当な使用目的のために作成することができる。好ましくは組成物を工程ａ）の後、工程ｂ）の前または後、あるいは工程ｄ）の後に凍結−解凍する。凍結−乾燥は例えばアルギニンのようなアミノ酸、あるいは例えばラクトースまたはマンニトールのような糖あるいは糖アルコールのような凍結防止剤の存在下で行うことができる。この方法では、使用前に再構成され、使用するまで漏出、分解またはプラスミン形成の危機にさらされることが無い、安定な生成物が得られる。本発明は以下の“キット”と呼ばれる組成物の組み合わせに関するものでもある。そのようなキットの１つの態様は、少なくとも１つの上記医薬組成物、および場合によってはさらに組成物の調製および投与手段を含んで成る。さらに、キットは混合投与のために別個のプラスミノーゲン活性化因子を含んで成ることもできる。別の態様のキットでは、標的デバイスとしてプラスミノーゲンが結合した生分解性コロイドキャリアーを含む少なくとも１つの医薬組成物（したがってこれはカプセル化されたプラスミノーゲン活性化因子が無い）、ならびにプラスミノーゲン活性化因子を含有する組成物を含んで成る。プラスミノーゲン活性化因子の全部または一部が使用前に組成物に包含される。さらに別の態様ではキットは一方で遊離アミンが低いプラスミノーゲンが結合した生分解性コロイドキャリアーを含有する組成物を、そして他方では場合によっては使用前にコロイドキャリアー中に包含されることができる医薬品または診断薬を含んで成る。実施例Ｉ glu-プラスミノーゲンの精製 80mgのタンパク質を含有する市販の高濃度のglu-プラスミノーゲン溶液3mlの部分を、100mlの容量を有し、そしてSephadex G25メディウムが充填された１メーターのカラムて、10mM HEPES緩衝液を使用して精製した。この精製で１molのglu-プラスミノーゲンあたり45molのε−アミノカプロン酸を除去した。この精製段階でチオール−導入SATA反応（下記参照）中にタンパク質の反応性の上昇が示された：一方未精製試料については１molのglu-プラスミノーゲンあたり１mol付近のSHが導入され、この数は精製試料に関しては１mol のglu-プラスミノーゲンあたり9molのSHに上昇した。純粋なEACAを精製したglu-プラスミノーゲン試料に加えると、SATA反応に対する反応性が減少し、その減少量は１molのglu-plgあたり14molのEACAで約半分であり、そして10および100倍高いEACA濃度でそれぞれ１mol SH/mol、および0.1mo l SH/molglu-plgに累進的に減少した。プラスミノーゲンのチオール化 10mM HEPES緩衝液（135mMの塩化ナトリウムおよび1mM EDTAを含有）に溶解した73μMのglu-プラスミノーゲンを室温で20分間、pH7.5にて584μMのスクシイミジル（アセチルチオ）酢酸（SATA）と一緒に、1:100のDMF：緩衝液の容量比であるジメチルホルムアミド（DMF）中でインキュベーションした。混合物をSephade x（商標）G-50カラムで分離した。タンパク質画分を280nmの吸収を測定することにより検出した。画分を合わ 0.5mlであった。カップリング反応は50μlのN-エチルマレイミド（HEPES中で8mM ）を加えて停止し、そしてリポソームを遊離のタンパク質から超遠心（４℃で80 ,000xg、45分間を２回：ベックマン（Beckman Instruments））により分離した。遊離のglu-プラスミノーゲン、誘導体のglu-プラスミノーゲンおよびリポソームのglu-プラスミノーゲン活性を、P.Fribergerら、Heamostasis 7,138-145(197 8)の方法を使用してストレプトキナーゼで活性化して測定した。プラスミノーゲン試料を過剰モルのストレプトキナーゼとインキュベーションし、そして複合体の活性を合成基質S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-pNA）の転換に基づき測定した（測定は反応生成物pNA（パラニトロアニリド）の405nmでの吸収により測定した）。 SATA誘導体に転換したglu-プラスミノーゲンの活性は未処理のglu-プラスミノーゲンと比較して幾分減少したことが分かった。リポソームに結合したglu-プラスミノーゲンの酵素活性は元の活性の68％（±６％）まで減少したことが分かった（すなわちSATA誘導体に転換前）。glu-プラスミノーゲンのフィブリンへの結合の測定タイターテックプレート（Titertek plates）をフィブリノーゲン層で覆い、そして次にトロンビンで活性化し、約0.33nmol/cm²の密度でフィブリンモノマーの層を持つプレートを得た。glu-プラスミノーゲンとプレートの未処理部分との非−特異的な結合を避けるために、得られたプレートをTween（商標）20で処理した。15nmol/lのglu-プラスミノーゲン試料（血漿中の１％プラスミノーゲン濃度）を室温で、pH7.4にて一晩インキュベーションした。上澄みを回収して、結合した画分を緩衝液で３回洗浄した。両画分のプラスミノーゲン濃度を上記のS- 2251の転換で測定した。これで結合したタンパク質の割合を計算できた。リポソームのglu-プラスミノーゲンのインキュベーションに使用した濃度は遊離タンパク質の濃度と同じであった。緩衝液は0.05M Tris-HCl、0.85％NaClおよび0.01重量％のTween（商標）20を含有した。このTween（商標）の濃度ではリポソームの認識できる分解は起こらなかった。リポソームにカップリングされたglu-プラスミノーゲンのフィブリン−結合能力を、遊離のglu-プラスミノーゲンと比較した。全タンパク質に対するフィブリン−結合タンパク質の比をプラスミノーゲンの両方の状態について、15nmol/lのglu-プラスミノーゲンの固定低濃度について算出した。リポソーム画分のタンパク質密度はリン脂質１molあたり50μgであった。フィブリンに結合したリポソームタンパク質の画分は遊離のタンパク質の10倍以上多かった。この効果を添付の第１図に示す。この図ではプラスノミーゲン−リポソームの付加生成物（▼）および遊離プラスノミーゲン（▲）の結合をプラスノミーゲン濃度の関数として１時間あたりの吸収単位で示す。空のリポソームを遊離タンパク質に加えたとき、フィブリンとの結合は起こらなかった。実施例II 組織−型プラスノミーゲン活性化因子を含有するリポソームの調製リポソーム（実施例Ｉの方法により調製）を0.05％Tween（商標）80の存在下または非存在下で、75、100および150μmol/mlのリン脂質濃度の緩衝液中（10mM Tris,135mM NaCl,pH7.5；または0.1Nクエン酸、0.264Mシュクロース、pH4；あるいは0.1Nクエン酸、0.029Mシュクロース、pH4）に懸濁した。組織−型プラスノミーゲン活性化因子（tPA）をこの懸濁液に37、92および185μg/ml濃度で加えた。リポソームのカプセル化能力を上げるためにリポソームを次に５回凍結−解凍した。非カプセル化tPAを45分間、４℃で150,000×gの超遠心により除去した。超遠心の間、上澄みから非カプセル化tPAの損失を避けるために0.05％のTween（商標）80を緩衝液に含ませた。実施例III 標的デバイスとしてのプラスノミーゲン付加リポソームおよび組織−型プラスノミーゲン活性化因子を含有するリポソームの調製プラスノミーゲン−含有およびtPA-含有リポソームを実施例ＩおよびIIに記載したように調製した。フィブリンが存在しない場合は、tPAによるプラスミノーゲンの転換率は低い。さらに低pH（3-5）および／またはEACA（7mMまで）または金属ハロゲン化物の添加より、転換率の減少が達成される。実施例IV 組織−型プラスノミーゲン活性化因子を含有するリポソームのインビボでの挙動 tPAを含有するリポソーム（実施例IIのように調製し、tPAは¹²⁵Ｉにより標識されている）を、３兎の健康なウサギ（人工的な血餅を持たない）に注入した。血液試料を５分毎に採血し、そしてTween（商標）80によりリポソームを破壊した後tPA活性を測定した。結果を第２図に示す。３つの直線（△、○、▽）は３兎のウサギに関する。平均的なリポソームtpAの半減値は約140分であり、これは実質的に遊離tPAよりも長く（ウサギでは約2.5分）、遊離tPAよりも消失が遅いリポソーム区分中に包含されたtPAを示す。実施例Ｖ PEG-ヘッドグループ（PEG-headgroup）に結合したプラスノミーゲン付加リポソーム：ラットにおいて長い循環時間を持つプラスノミーゲン含有リポソーム PEG-DSPE（ポリエチレングリコール−ジステアリルホスファチジルエタノールアミン）基に結合したプラスノミーゲンを付加したリポソームは、DSPEをポリオキシエチレン−ビス（酢酸）と77単位ポリオキシエチレンとカップリングさせることにより調製し（KungおよびRedeman,Biochim.Biophys.Acta 862,435-439(198 6)を参照）、カップリング生成物を大豆ホスファチジルコリンおよびコレステロールと、5.4:67.6:27の比で混合した（G.Blumeら、Biochim.Biophys.Acta 1149, 180-184(1993)も参照）。ラットに静脈注射した後、比較的低いクリアラス速度および長い循環時間がこれらプラスノミーゲン-PEG-リポソームに見られた：注射24時間後、非-PEG-含有リポソームは元の投与量の４％であるのに比べ、プラスノミーゲン-PEG-リポソームは元の投与量の18.4％が未だ循環していた。９．工程ａ）において、ａ１）プラスノミーゲンをメルカプト基−含有誘導体に転換し、ａ２）メルカプト基と反応できる固定基を付けた生分解性コロイドキャリアーを調製し、ａ３）プラスノミーゲン誘導体と固定基を付けたコロイドキャリアーとを反応させ、そしてａ４）生分解性コロイドキャリアーに結合したプラスノミーゲンを非−結合プラスノミーゲンから分離することによりプラスノミーゲンが結合する請求の範囲第７または８項記載の方法。１０．コロイドキャリアーが工程ｂ）の前にシステインのようなチオールで処理される請求の範囲第９項記載の方法。１１．工程ｂ）において約３−８のｐＨが使用される請求の範囲第８ないし１０項のいずれか１項記載の組成物。１２．工程ｂ）でハロゲン化金属および／またはアミノアルカノール酸が使用される請求の範囲第８ないし１１項のいずれか１項記載の組成物。１３．血餅−分解特性を有する組成物の調製方法であって、ｃ）プラスノミーゲン活性化因子を生分解性コロイドキャリアー中に包含し、そしてｄ）プラスノミーゲンのフィブリンに対する親和性を本質的に維持して、場合によってはプラスノミーゲンとプラスノミーゲン活性化因子との相互反応が減少するような条件下でプラスノミーゲンをコロイドキャリアーに結合させる、ことを含んでなる方法。１４．工程ｂ）または工程ｃ）においてそれぞれプラスノミーゲン活性化因子がコロィドキャリアー中に、プラスノミーゲン活性化因子の存在下で凍結 −解凍することにより包含される請求の範囲第８ないし１３項のいずれか１項記載の方法。１５．工程ａ）、ｂ）またはｄ）の後、場合によっては凍結防止剤の存在下で組成物が凍結−乾燥される請求の範囲第７ないし１４項のいずれか１項記載の方法。１６．生分解性コロイドキャリアーがリポソームである請求の範囲第７ないし１５項のいずれか１項記載の方法。１７．請求の範囲第１ないし６項記載の少なくとも１つの医薬組成物、およびプラスノミーゲン活性化因子を含む組成物を少なくとも含んで成るキット。１８．少なくとも標的デバイスとして特にプラスノミーゲンが結合した生分解性コロイドキャリアー、特にリポソームを含む医薬組成物、およびプラスノミーゲン活性化因子を含む組成物を少なくとも含んで成る血餅の治療に適するキット。１９．請求の範囲第７項記載の方法を使用して調製された組成物、および医薬品または診断薬を含む組成物を少なくとも含んで成るキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者グロメリン，ダニエル・ジヤン・アンオランダ・エヌエル―3583ブイピーユトレヒト・フレデリクヘンドリクストラート 98

Claims

【特許請求の範囲】１．血餅に親和性を示す標的デバイスを含有し、そして血餅−溶解タンパク質を含有する生分解性コロイドキャリアーを含んで成る組成物であり、血餅−溶解タンパク質がプラスノミーゲン活性化因子であり、そして標的デバイスがコロイドキャリアーに結合したプラスノミーゲンであることを特徴とする、血餅の治療用医薬組成物。２．プラスノミーゲン活性化因子が組織−型プラスノミーゲン活性化因子（tPA ）である請求の範囲第１項記載の組成物。３．プラスノミーゲンがglu−プラスノミーゲンである請求の範囲第１または２項記載の組成物。４．生分解性コロイドキャリアーがリポソームである請求の範囲第１ないし３項のいずれか１項記載の組成物。５．１μmolのリポソームリン脂質あたり少なくとも10^-6μmolのプラスノミーゲン活性化因子を含む請求の範囲第４項記載の組成物。６．リポソームあたり１０−１０００分子のプラスノミーゲンが結合している請求の範囲第４または５項記載の組成物。７．ａ）１molのプラスノミーゲンあたり７０molより少ない遊離第一アミン類を含有する6.5mg/ml濃度のプラスノミーゲンを、プラスノミーゲンのフィブリンに対する親和性を実質的に維持したままで、生分解性コロイドキャリアーに結合させ；そしてｂ）所望により生分解性コロイドキャリアーに医薬品または診断薬を包含する、方法である血餅に対して親和性を示す標的デバイスを持つ生分解性コロイドキャリアーを含んで成る組成物の調製方法。８．ａ）プラスノミーゲンを、プラスノミーゲンのフィブリンに対する親和性を実質的に維持したままで、生分解性コロイドキャリアーに結合させ；そしてｂ）プラスノミーゲンとプラスノミーゲン活性化因子との相互反応が減少するような条件下でプラスノミーゲン活性化因子を生分解性コロイドキャリアーに包含する、方法である血餅−分解特性を有する組成物の調製方法。９．工程ａ）において、ａ１）プラスノミーゲンをメルカプト基−含有誘導体に転換し、ａ２）メルカプト基と反応できる固定基を付けた生分解性コロイドキャリアーを調製し、ａ３）プラスノミーゲン誘導体と固定基を付けたコロイドキャリアーとを反応させ、そしてａ４）生分解性コロイドキャリアーに結合したプラスノミーゲンを非−結合プラスノミーゲンから分離することによりプラスノミーゲンが結合する請求の範囲第７または８項記載の方法。１０．コロイドキャリアーが工程ｂ）の前にシステインのようなチオールで処理される請求の範囲第９項記載の方法。１１．工程ｂ）において約３−５のｐＨが使用される請求の範囲第８ないし１０項のいずれか１項記載の組成物。１２．工程ｂ）でハロゲン化金属および／またはアミノアルカノール酸が使用される請求の範囲第８ないし１１項のいずれか１項記載の組成物。１３．血餅一分解特性を有する組成物の調製方法であって、ｃ）プラスノミーゲン活性化因子を生分解性コロイドキャリアー中に包含し、そしてｄ）プラスノミーゲンのフィブリンに対する親和性を実質的に維持して、場合によってはプラスノミーゲンとプラスノミーゲン活性化因子との相互反応が減少するような条件下でプラスノミーゲンをコロイドキャリアーに結合させる、ことからなる方法。１４．工程ｂ）または工程ｃ）においてプラスノミーゲン活性化因子がコロイドキャリアー中に、プラスノミーゲン活性化因子の存在下で凍結−解凍することにより包含される請求の範囲第７ないし１２項のいずれか１項記載の方法。１５．工程ａ）、ｂ）またはｄ）の後、場合によっては凍結防止剤の存在下で組成物が凍結−乾燥される請求の範囲第６ないし１３項のいずれか１項記載の方法。１６．生分解性コロイドキャリアーがリポソームである請求の範囲第７ないし１５項のいずれか１項記載の方法。１７．請求の範囲第１ないし６項記載の少なくとも１つの医薬組成物、およびプラスノミーゲン活性化因子を含む組成物を少なくとも含んで成るキット。１８．少なくとも標的デバイスとして特にプラスノミーゲンが結合した生分解性コロイドキャリアー、特にリポソームを含む医薬組成物、およびプラスノミーゲン活性化因子を含む組成物を少なくとも含んで成るキット。１９．請求の範囲第７項記載の方法を使用して調製された組成物、および医薬品または診断薬を含む組成物を少なくとも含んで成るキット。