JPH08500828A

JPH08500828A - ファルネシルトランスフェラーゼの同定、特性評価および阻害方法、ならびにその組成

Info

Publication number: JPH08500828A
Application number: JP6506619A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，マイケル・エス; ゴールドスタイン，ジョゼフ・エル; ライス，ユーヴァル; マースターズ，ジェイムズ・シー，ジュニア
Original assignee: ボード・オヴ・リージェンツ，ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム; ジェネンテック，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-08-24
Filing date: 1993-08-24
Publication date: 1996-01-30
Also published as: US6083917A; CA2142990A1; WO1994004561A1; EP0656903A1; AU4839193A

Abstract

(57)【要約】_p 21^rasなどの癌関連rasタンパク質を含む、各種細胞タンパク質のファルネシル化に関与する哺乳動物のファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの同定、特性評価および阻害の方法と組成を開示した。また、ラットおよびヒトのファルネシルトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに分子クローニングおよび二つのサブユニットの同時発現にしたがって組替え手段によりファルネシルトランスフェラーゼを調製する方法および組成、ならびにこの酵素を検定同定する方法および組成、酵素を阻害して_p21^rasなどのタンパク質の発現を防止する抗癌剤を同定するためにスクリーニングプロトコルに精製酵素を使用する手続きを開示した。さらに、偽りの酵素基質あるいは純粋の阻害剤いずれかの作用を持ち、酵素の阻害に使用できる化合物群を開示した。このうち、最も強力な阻害剤は、テトラペプチドの第三の位置にフェニルアラニンが存在し、アミノ末端がシステインであるものである。構造と特性が確定している改良阻害剤も開示した。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ファルネシルトランスフェラーゼの同定、特性評価および阻害方法、ならびにその組成この出願は、1990年4月18日出願のアメリカ合衆国一部継続出願第07／510、706 号の、1992年8月25日付与のアメリカ合衆国特許第5、141、851号の、1990年11月20 日出願の一部継続出願第07／615、715号の、1991年4月18日出願のPCT出願第US91 ／02650号の一部継続出願の、1992年1月16日出願の一部継続出願第07／822、011 号の、1992年8月24日出願の同時係属中の出願第07／935、087号の一部継続出願である。アメリカ合衆国政府は、助成金第5-PO1-HL20948号に基づき、権利を一部共有する場合がある。技術分野本発明はp21^rasタンパク質のファルネシル化の原因である酵素、ファルネシルトランスフェラーゼ（Farnesyltransferase）の改良ペプチド系阻害剤、特に特性と構造を改良したペプチド系「純粋」阻害剤に関する。本発明者らは、阻害性能を維持したまま細胞に取り込まれることができることを阻害剤設計の指針としてきた。このたび、必ず「純粋」阻害剤としての特性を与えることができる、ペプチド阻害剤の構造特性を見い出して、この改良を完成した。背景技術近年、各種癌の発現や進行に関与する細胞事象の解明が進んできた。正常な細胞が変化して行き、あるいは突然変異して癌になる、遺伝子の同定を中心にして多大の研究がなされてきた。遺伝子研究の結果、突然変異によって広範囲の各種腫瘍を発現させる各種の遺伝子群が実際に同定されるようになった。ras遺伝子群は、多くのヒトの腫瘍、事実上すべての腫瘍群の腫瘍の突然変異に関与することが多い、相互に密接に関係する遺伝子の一群である（例えば、Bos、1989参照）。事実、ras遺伝子が変化している場合は、ヒト腫瘍の腫瘍遺伝子として同定されることがきわめて多い（Barbacid、1987）。 ras遺伝子群は、三つの遺伝子H-ras、K-rasおよびN-ras、からなっていて、分子量約21、000を持つ同種のタンパク質をコードする（Barbacid、1987）。これらのタンパク質はp21^rasとも呼ばれ、形質膜の内表面と結合して細胞の成長を制御する、GTP結合タンパク質および加水分解タンパク質群からなっている（Hancock ,et al., 1989;Scheler et al., 1989）。p21^rasタンパク質が過剰産生されたり、突然変異すると、GTP-ase活性が失活して細胞分割が無統制に行われることになる（Gibbs et al., 1989）。rasのトランスフォメーション活性はタンパク質と膜との位置関係に依存しているが、この依存性はファルネシル基の付加によって与えられるものと考えられている（Hancock et al., 1989;Casey et al., 198 9）。約十年前に、タンパク質の共有結合イソプレニル化（covalent isoprenylatio n）を立証する一つの報告がなされている。これは、数種の真菌類のから分泌されるペプチド交配因子が、C-末端システインに続いているチオエーテルリンケージに付着したファルネシル基を含有していることを証明したものである（Kamiya et al., 1978; Sakagami et al., 1981）。その後Saccharomyces cerevisiaeの交配A-因子と、動物細胞のファルネシル化タンパク質の研究が行われ、ファルネシル化の機序が明らかになった。始め、ファネシル化されるシステインは、タンパク質のC末端から第四番目の残基である（Hancock, et al., 1989; Schelter e tal., 1989;Gutierrez et al., 1989）。翻訳直後、順序はまだ全く分かっていないが一連の事象が起こり（in a sequence of events whose order is not yet totally established）、ファルネシル基がこのシステインに付着し、タンパク質がこの残基のC-末端側で開裂して、システインの遊離COOH基がメチル化される（Hancock et al., 1989; Gutierrez et al., 1989; Lowry et al., 1989; Clar ke et al., 1988）。これら反応はすべて、Saccharromycesの活性Ａ因子の分泌に必要とされる（Scheler et al., 1989)。これまでに知られているp21^rasタンパク質類は、全部ではないにせよ、そのほどんとがこの欠くことができないシステインを含んでいて、このシステインは酵母の交配因子と同様に、ファルネシル化、タンパク質分解およびCOOH-メチル化で加工される（Hancock et al., 1989; Scheler et al., 1989; Gutierrez et a l.,1989; Lowry et al., 1989; Clarke et al., 1988）。ファルネシル化された p21^rasは形質膜との結合が緩いため、大部分が塩と共に形質膜から放出される（ Hancock et al., 1989）。膜と結合後、ファルネシル化C-末端システインに近い位置において、システインに結合しているチオエステルリンケージ中で、p21^ras の一部にパルミテートが付加され、p21^rasはさらに修飾（modified）される（Ha ncock et al., 1989）。このようにパルミチル化（palmitylation）されるとタンパク質の疎水性が高まり、形質膜によりしっかりと固定される。 rasが関連する癌の発現ではファネシル化が重要な事象であることは明白であると考えられているが、これまではこの事象の性質がはっきりしていなかった。例えば、どんな性質の酵素、あるいは酵素類がras腫瘍形成に関与したり、腫瘍細胞がファネシル化するのに必要なのかが、これまで不明であったのである。p2 1^rasなどの癌関連タンパク質のファネシル化を引き起こす機序が解明されれば、広範囲の各種癌の腫瘍遺伝子表現型の発現を制御したり、阻害できる方法、さらには薬剤を開発することができよう。言うまでもなく、このような発見がなされれば癌治療の大きな第一歩となるはずである。発明の要旨本発明は、ファネシル基が腫瘍形成rasタンパク質類を含む各種タンパク質類に移行することによって、腫瘍形成過程に関与するファルネシル：タンパク質転移酵素（farnesyl:protein transferase)、すなわちCAAXファルネシルトランスフェラーゼと呼ぶ酵素の同定と評価について、従来技術の一以上の欠陥を解決しようとしてなされたものである。特に、本発明は哺乳動物のファルネシル：タンパク質転移酵素のサブユニットの分子クローニング、この酵素の天然または組替え酵素の精製、この酵素を阻害できるタンパク質およびペプチド物質、および阻害化合物を同定する検定方法に関する。従って、本発明の第一の目的は、組織を選択してこれから採取した天然酵素を精製し、または構成するサブユニットが発現できる宿主細胞の組替え酵素を精製して、容易にファルネシルトランスフェラーゼを得る手段を提供することにある。上記の精製方法はすべてのファルネシル：タンパク質転移酵素の精製一般に用いることを提案する。本発明の第二の目的は、比較的純粋な形でこれらの酵素を得て、特にp21^rasタンパク質の組織においてファルネシルトランスフェラーゼ活性を軽減したり、またはこの酵素を阻害することができる化合物の同定を予測的に検定（predictive assays））する手段を提供することにある。本発明の第三の目的は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害活性を示し、且つ癌、特にrasが関連する癌の治療に使用できる可能性がある化合物をクラスごとに同定することにある。ファルネシル：タンパク質転移酵素の特性評価したがって、一実施態様において、本発明は次の基準により特性評価した、精製ファルネシル：タンパク質転移酵素（CAAXファルネシルトランスフェラーゼ）を含有する組成物に関する。ａ）ファルネシル受容部分を持つタンパク質またはペプチドに、ファルネシルが移行するのを触媒することができる、ｂ）適当なマトリックスに結び付けたTKCVIM（配列番号９）を含む、アフィニテイクロマトグラフィ媒質（medium）に結合させることができる、ｃ）ゲル濾過クロマトグラフィで分子量約70,000〜約100,000を示す、およびｄ）次のペプチドのいずれかにより阻害されるファルネシルトランスフェラーゼ活性を持つ i） TKCVIM （配列番号9） ii） CVIM （配列番号10）および iii） KKSKTCVIM （配列番号11）本発明で言う「ファルネシル受容部分を持つタンパク質またはペプチドにファルネソール（farnesol）が移行するのを触媒する」なる表現は、酵素がファルネシル受容部分に付着する配列を持つタンパク質を認識して、全transファルネシルピロリン酸（all-trans farnesyl pyrophosphate）から、通常は全transファルネソールの形で、ファルネソールがこのタンパク質に移行するのに触媒として作用する、本発明のファルネシルトランスフェラーゼ酵素の機能特性を意味する。したがって、「ファルネシル受容部分」なる語は、酵素がこれを認識して、ファルネシル基を付着させるすべての配列、通常は短いアミノ酸認識配列を意味する。ファルネシル受容部分は、標的タンパク質のカルボキシ末端にある四個のアミノ酸配列として、タンパク質の他の部分とは区別されてきた。また、この四個のアミノ酸配列はC-A-A-X （seq. id no:12）で、「C」はシステイン残基であり、「A」は脂肪族アミノ酸であり、「X」はどのアミノ酸でも良いとの特性評価がなされてきた。言うまでもなく、「脂肪族アミノ酸」とは当業者に周知のごとく、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、メチオニン、バリン、などのように脂肪族側鎖を持つすべてのアミノ酸を意味する。本発明に最も好ましいアミノ酸としてはバリンとイソロイシンを挙げることができるが、規定位置にありさえすればどの脂肪族アミノ酸でもファルネシル受容部分の範囲内にはいるものと信じられている。また、酵素は、脂肪族アミノ酸でなくても、水酸化アミノ酸（セリン）を含むペプチド（CSIM; 配列番号13）も認識できることが証明されている。もちろん、本発明で使用できる、ファルネシル受容部分を持つタンパク質やペプチドの代表例としては、p21^H-ras、p21^K-ras、p21^K-rasBおよびp21^N-rasを始めとするp21^rasである。したがって、本開示には、広範囲の、ファルネシル受容部分を持つ各種ペプチジル配列が含まれることは明らかである。上記で概略したように、本発明者らはファルネシルトランスフェラーゼ酵素が適当なマトリックスと組み合わせたTKCVIM（配列番号 9）ペプチドからなるアフィニテイクロマトグラフィ媒質（medium）に結合することができることを見い出した。ファルシネルトランスフェラーゼ酵素のこの特徴は、本発明者らがこの酵素の単離方法を開発している際に発見されたものである。驚くべきことに、TKCV IM（配列番号9）と同様に、CVIM（配列番号10）を適当なクロマトグラフィマトリックスに組み合わせると、タンパク質の精製度が顕著に上昇することが判明した。これは恐らく酵素とペプチジル配列の間で相互反応と結合が行われることによるものと考えられる。また、このペプチド中に恐らくファルネシル受容部分が存在しているので、この相互反応が起こると仮定することもできよう。「適当なマトリックスと組み合わせたTKCVIM（配列番号9）からなるアフィニテイクロマトグラフィ媒質（medium）に結合することができる」と言う表現は、タンパク質が下記で特定する条件で上記のような媒質（medium）に結合できることを意味する。もちろん、pH6以下などと言う、普通ならばファルネシルトランスフェラーゼ酵素がこのような媒質（medium）と効果的に結合できない条件もある。しかしながら、本発明で開示する技術を実施すれば、この重要な目的を達成することができる。当業者に知られている数多くのクロマトグラフィマトリックスを用いて本発明を実施することができる。本発明者らとしては、TKCVIM（配列番号 9）などのペプチド類、あるいはこれにがCVIM（配列番号10）構造を取り入れたペプチド類が容易に付着し、洗浄も難しくないCH-セファロース4Bを使用することが好ましいと考えている。しかしながら、本発明は決してCH-セファロース4Bを使用することに限定されるものではなく、当業者に知られているすべてのアフィニテイクロマトグラフィ実施用マトリックスを本発明の範囲内に入れることができる。その例としては、リンカーを共有結合している固体マトリックスなど、ならびにビオチンを含むペプチド類を結合する際に使用することができる、共有結合的に結び付いているアビジン（covalently associated avidin）を含有するマトリックスを挙げることができる。本発明のファルネシルトランスフェラーゼ酵素はゲル濾過クロマトグラフィにより分子量が通常は70,000〜100,000であることが分かっている。スパーロース（Superose）12カラムにより、下記で説明するカラムサイズ、サンプルローデイングおよびパラメーターを用いて比較したところ、ファルネシル：タンパク質トランスフエラーゼもこの分子量を持つことが同定された（For comparison purpo ses, this molecular weight was identified for farnesyl protein transfera se through the use of a Superose 12 column, using a column size, sample load and parameters as described herein below）。クロマトグラフィ技術が異なるとその実施条件によっては、ファルネシルトランスフェラーゼタンパク質の見かけ分子量が実施例で述べる好ましい技術によって同定したものと異なる可能性もある。したがって、下記で述べる実施例においては開示する技術の正確性に関係する時にのみ、ファルネシルトランスフェラーゼの分子量の測定と範囲の同定に言及するものとする。ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼには二つのサブユニットがあり、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS／PAGE）により定量した分子量は各々約45〜50kDaであることが確認されている。これらのサブユニットはαおよびβ と名付けられおり、αサブユニットはβサブユニットよりもやや高い位置を泳動するので、αサブュニットはやや大きいと思われる。トリプシンペプチド配列分析と分子クローニングから、αおよびβサブユニットは異なる遺伝子によってコードされているタンパク質としての明確な性質が確認されている。その後ラットの脳のサブユニットから採取したペプチド配列が、DNAコード配列で予想されたアミノ酸配列と一致していることが見い出されている。表Ｉに示す配列は、ラットの精製ファルネシルトランスフェラーゼのαおよび βサブユニットから単離したトリペプシンペプチドを高速液体（HPLC）クロマトグラフィで精製して得たものである（Reiss et al., 1991）。各ペプチドは単一のHPLCピークで表される純純種である。星印はアミノ酸配列決定の際にはっきりしなかった残基である。各サブユニット（上記に示す）の６個のペプチドのすべてのアミノ酸配列は、ペプチド配列の一部の下で見られる相違点を除き（except for the differences inedicated below certain of the peptide sequences）、各cDNAクローン（配列番号1）から予想されたアミノ酸配列の連続した断片内にある。本発明者らは、ホロ酵素がゲル電気泳動で単離することができる全trans［³H］ファルネシルピロリン酸（FPP）と、安定な錯体を形成することを見い出した。［³H］FPPは酵素と共有結合することなく、酵素が変性すると無変化のまま放出される。p21^H-rasなどの受容体と共にインキュベートすると、錯体は結合している［³H］FPPから［³H］ファルネシルをrasタンパク質に移行する。さらに、橋かけ実験結果からp21^H-rasがβサブユニットと結合することが立証され、［³H］FP Pはαサブユニットと結合する可能性もあることが分かった。これが真実であるとすれば、αサブユニットがプレニルピロリン酸の担体として作用し、FPPをp21^H-ras にデリバリーして、p21^H-rasをβサブユニット結合させる反応機序が考えられる。興味深いことに本発明者らが最近、αサブユニットが別のプレニルトランスフェラーゼ、すなわちゲラニルゲラニルトランスフェラーゼに共有されており、このゲラニルゲラニルトランスフェラーゼがras関連のタンパク質類に炭素2 0個のゲラニルゲラニルを付着させていることを発見した。ファルネシルトランスフェラーゼ酵素類について発見されたもう一つの特性としては、上記で述べたファルネシル受容部分とある程度関連しながら、ペプチド類またはタンパク質類、特にある構造的特徴がある短いペプチド類によって阻害されることが挙げられる。本発明で言う、「阻害される」なる語は全ての程度の阻害を意味し、本発明の目的においては完全な阻害のみに限定しない。したがって、ファルネシルトランスフェラーゼ活性のあらゆる程度の部分的阻害、あるいは相対的軽減を「阻害される」なる語の範囲内に含めるものとする。この意味の阻害には、薬剤が代替して酵素基質となり、したがってこの薬剤がrasタンパク質に優先してファルネシル化する現象と、化合物の酵素基質としての関与なしに起こる阻害とを含めるものとする。ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの製造本発明はさらに、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素類、および特に哺乳動物のファルネシルトランスフェラーゼ類（CAAXファルネシルトランスフェラーゼ類）の同定と単離の方法に関する。本発明で開示するファルネシルトランスフェラーゼの単離法は、天然タンパク質の精製、あるいは分子クローニングおよび構成するサブユニットの同時発現（co-expression）により産生された組替え酵素の精製のどちらにも適用できるものと信ぜられる。また、本発明で開示する精製法の重要な特徴は、本発明者らが見い出した短いペプチド配列を使用することにある。このペプチド配列は酵素と結合して、クロマトグラフィマトリックスに付着する。このマトリックスをアフィニテイクロマトグラフィに使用して、酵素を相対的な程度まで精製する（such matrices may, in turn, be used in connection with affinity chromatography to purify th e enzyme to a relative degree）。したがって、本発明は一実施態様において次の工程からなるファルネシルトランスフェラーゼ酵素の製造方法に関する。 (a) 酵素を含む細胞抽出液を調製する、 (b) アフィニテイクロマトグラフィ媒質（medium）で、この抽出液のアフィニテイクロマトグラフィを行って、酵素を媒質に結合させる。媒質（medium）は適当なマトリックスに結びつけた、ファルネシルトランスフェラーゼ結合ペプチドからなっている。 (c) 媒質（medium）を洗って不純物を取り除く、および (d) 洗った媒質（medium）から酵素を溶出する。このように精製法の第一段階では、単に酵素を含む細胞抽出液を調製する。本発明者らはこの酵素が低塩分の緩衝液などの緩衝液に溶解することを見い出しが、所望の組織からタンパク質を抽出する、あるいは酵素を構成するサブユニットが発現することができる組替え細胞からタンパク質を抽出する初期段階では、事実上すべてのこの種の緩衝液を使用できること提案している。本発明者らは、二価のキレート剤（例えば、1mM EDTAや1mM EGTA）ならびにフェニルメチルスルホニルフロライド（PMSF）および／またはロイペプチンを含むpH7.5の、50mMトリス塩酸緩衝液が、好ましいとしている。当業者は、酵素が緩衝液で抽出可能であり、且つその後活性に著しい悪影響がない限り、上記以外の各種緩衝液も所望にしたがって使用できることを理解するであろう。天然酵素の精製に関する実施態様においては、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素を得るための組織を選択することは重要な意味を持っていない。現実には、ファルネシルトランスフェラーゼは、生きている細胞ならば事実上どれにでも含まれていると考えられる。したがって、組織を選択するとすれば、通常は実施者にとって最も便利な組織を選ぶことであろう。培養ハムスター細胞を始めとして、これまでに研究されたほどんとの系において、ファルネシルトランスフェラーゼの作用は同じように進行することが観察されており、単離源が異なっていても品質は同様であると考えられる。最良の実施態様において、本発明者らは入手が容易なラットの脳から天然酵素を単離してきた。しかしながら、数多くの他の入手源、特に肝臓やヒト胎盤、さらには網状赤血球などの哺乳動物の組織、あるいは酵母からでさえも、直接に天然酵素を単離することが考えられる。当業者は、本開示とから見て、本発明で開示する技術が上記のようなファルネシルトランスフェラーゼすべてに一般適用できることを理解するであろう。さらに、本発明により組替え細胞から酵素を精製することができることを理解しなければならない。組替え宿主細胞は、構成するサブユニットを選択して、DN A断片にサブユニットをコードさせ、これを発現または同時発現（co-expressed ）させる。本発明で開示する天然ファルネシルトランスフェラーゼの単離技術により、このような組替え宿主細胞のタンパク質を、細菌由来、真核細胞由来の別なく精製することができると信ぜられている。細胞抽出液の調製が完了したら、アフィニテイクロマトグラフィ前に、酵素を二つの部分精製工程に掛けることが好ましい。これらの工程は先ず、沈澱によって汚染物質の一部を取り除くため、30%飽和硫酸アンモニウムによる予備処理を行う。続いて、50%飽和硫酸アンモニウムで処理して、ファルネシルトランスフェラーゼを沈澱させる。ペレット化した酵素は適当な緩衝液、例えばDTT 1mMとZ nCl₂20μMを含む20mMトリス-塩酸緩衝液（pH 7.5）に溶解し、同じ緩衝液で透析した後、さらに次の精製工程にかける。最良の実施態様において、酵素を含有する透析溶液を、Mono Qなどのイオン交換樹脂を含むカラムに入れる。カラムを洗って汚染物質を除いた後、同じ緩衝液中でNaCl 0.25〜1.0Mの勾配で酵素を溶出する。各分画の酵素活性を検定して、活性酵素を含有する分画をプールして、下記に述べるアフィニテイカラムに使用する。上記で述べた予備精製工程は好ましい実験手続きであって、この実験手続きの代わりに、他の樹脂によるイオン交換クロマトグラフィ、あるいはゲル濾過クロマトグラフィなどの、同等の効果がある他の方法を容易に実施することもできる。また、これらの工程を省略して、直接、粗細胞抽出液のアフィニテイクロマトグラフィを実施することも可能である。予備精製工程後、適当なマトリックスに結び付けた、ファルネシルトランスフェラーゼ結合ペプチドを含有するアフィニテイクロマトグラフィ媒質（medium）で、抽出液のアフィニテイクロマトグラフィを実施する。好ましいファルネシルトランスフェラーゼ結合ペプチドとしては、通常は、アミノ酸少なくとも４個の長さを持つペプチドからなり、カルボキシ末端に-C-A₁-A₂-X配列をもつものが好ましい。式中、 C= システイン A₁= アミノ酸ならばどれでも良い（脂肪族、芳香族またはヒドロキシ）。 A₂= 脂肪族アミノ酸、好ましくはロイシン、イソロイシンまたはバリン、および X= 最も好ましくはメチオニンまたはセリン、より好ましくはグルタミンまたはシステイン、および好ましくはロイシン以外のいずれかのアミノ酸。上記の一般式の範囲内で本発明に好ましい結合ペプチドとしては、-C-V-I-M（配列番号10）、-C-S-I-M（配列番号13）および-C-A-I-M（配列番号14）などの構造が挙げられる。これらの構造はすべて自然界でファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼが作用していると考えられる天然タンパク質類中に存在していることが分かっている。特に好ましいものは、上記の結合配列を持ち、長さがアミノ酸約4〜約10個程度の比較的に短いペプチド類である。最も好ましいものはT-K -C-V-I-M（配列番号 9）で、本発明者らはファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの単離にこのものを効果的に使用した。このように一般精製法の工程を進んで、次の段階では媒質（medium）から不純物を取り除く単純洗浄を行う。すなわち、アフィニテイマトリックスで抽出液のアフィニテイクロマトグラフィを行った後、不純物は取り去るがファルネシルトランスフェラーゼが媒質（medium）に比較的完全に残る方法で、マトリックスを洗うことが望ましい。本発明で使用したものなど、マトリックスの洗浄には公知の技術が各種あるが、そのすべての洗浄方法を本発明の範囲内に含めるものとする。もちろん、酵素を放出したり、あるいはこれを変化させたり、変性させる緩衝液を使用することは望ましくない。したがって、緩衝液としては、変性を起こさない洗剤を含有するオクチルグリコシド緩衝液などを模式的に使用し、例えばタンパク質を変性する作用があるカオトロピック洗剤を含む緩衝液、pHが低い（例えば、7以下）、あるいはイオン強度が高い（例えば、1.0M以上）緩衝液は、結合している酵素をアフィニテイマトリックスから溶出させる傾向があるので避けることが望ましい。マトリックスに結合した酵素を、例えば中等度のイオン強度で、pHが実質的に中性の緩衝液で充分に洗った後、同様の緩衝液ではあるがpHを下げた（例えば、 pH値約4ないし5.5）ものを用いると、酵素を特異的に結合させてあってもカラムから溶出させることができる。このpH値であれば、この酵素は下記で詳細説明する好ましいアフィニテイマトリックスから溶出することが模式的に分かっている。単純にアフィニテイクロマトグラフィ法を用いれば本発明の利点を達成できると信ぜられているが、ゲル濾過法などの精製法を追加して用いると、より大きな利点を得ることができる。例えば、本発明者らはセファクリル（Sephacryl）S-2 00高分解能ゲルカラムをタンパク質の精製に用いて著しい利点を挙げることができることを見い出した。しかしながら、本開示は決してセファクリルS-200の使用にのみ限定されることはなく、事実上いかなるタイプのゲル濾過法を使用してもある程度の利点があると信ぜられている。例えば、スーパーロース（Superose ）、アガロース、あるいはセファデックスなどの媒質によるゲル濾過法を使用しても良い。上記の各種方法を使用することにより本発明者らは、全transファルネシルピロリン酸からファルネソールを移行する能力で測定する比活性が比較的に高い、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素組成物を開発することに成功した。本発明においては活性1単位を、実施例中で述べる条件下で全transファルネシルピロリン酸（FPP）から酸沈澱性のp21^H-ras中にファルネソールを一時間当り1pmol移行できる酵素の量と定義する。この定義により、最良の実施態様において本発明は比活性がタンパク質1mgにつき約5〜約10単位のファルネシルトランスフェラーゼ組成物に関する。さらに、最も最良の実施態様において、本発明はファルネシルトランスフェラーゼ比活性がタンパク質1mgにつき約500〜約600,000である組成物に関する。したがって、上記の単位の定義から言うと、本発明者らは本発明で開示する技術により約600,000単位／mgまでの比活性を持つ組成物を完成させたことになる。ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼのサブユニットのクローン形成本発明の重要な特徴は、単離されたDNA断片と、哺乳動物のファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ（CAAXファルネシルトランスフェラーゼ）のαおよびβサブユニットをコードする組替えベクター、さらにはDNA技術を応用してこれらポリペプチドの一、好ましくはその両方を発現する組替え宿主細胞を造ることに関する。本発明で言う「DNA断片」とは、ある特定種の総ゲノムDNA（total genomic DN A））から遊離している単離DNA分子を意味する。したがって、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼのサブユニットをコードするDNA断片とは、DNAを採取した種の総ゲノムDNAからは単離され、離れて、このコード配列を含有しているDNA断片を意味する。この「DNA断片」と言う語には、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを始めとして、ベクターの調製に用いられたり、ベクターそのものに用いられるDNA断片を含めるものとする。特定の実施態様において本発明は、ラット脳のファルネシルトランスフェラーゼサブユニットαおよびβとそれぞれ一致するアミノ酸配列中に、配列番号1または配列番号3のアミノ酸配列を含むファネシルタンパク質トランスフェラーゼサブユニットをコードしている、DNA配列を取り込んでいる単離DNA断片と組替えベクターに関する。さらに、他の特定実施態様において本発明は、ヒトのファルネシルトランスフェラーゼサブユニットαおよびβとそれぞれ一致するアミノ酸配列中に、配列番号5または配列番号7のアミノ酸配列を含むファネシルタンパク質トランスフェラーゼサブユニットをコードしている、DNA配列を取り込んでいる単離DNA断片と組替えベクターに関する。したがって、この組替えベクターと単離断片とは、αまたはβサブユニットのコード領域（coding regions）そのものを各種含んでいる。これらのコード領域は原コード領域が選択的に変性されたり、修飾されたものである場合もある（coding regions bearing selected alte rations or modifications in the basic coding region）。あるいはまた、これらの組み替えベクターと単離断片とは、より大きなポリペプチドをコードしていて、前記ポリペプチドがサブユニットを取り替える場合にもファネシルトランスフェラーゼ活性を付与する配列を含んでいる場合もある。しかしながら、本発明のこの特徴は配列番号1や2および配列番号5や6（αサブユニット）、あるいは配列番号3や4および配列番号7や8（βサブユニット）などの特定核酸およびアミノ酸配列のみに限定されるものではない。したがって、本発明により調製したDNA断片は、各種のアミノ酸配列を持つ生物機能が同等なタンパク質類、あるいはペプチド類をコードすることができる（Accordingly, DNA segments prepared in accordance with the present invention may also enc ode biologically functional equivalent proteins or peptides which have v ariant amino acid sequences）。天然の核酸配列とその配列によってコードされているタンパク質に存在することで知られている、冗長なコドン（condon red unda ncy）や同等な機能（functional equivalency）の結果として、このような配列が起こることがある。反対に、アミノ酸の特性を変えるために、組替えDNA技術を応用してタンパク質の構造を変えることによって機能が同等なタンパク質類や、ペプチド類を作り出すことができる。上記で述べたペプチド配列情報を使用して、ファルネシルトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットをコードするcDNAの組替えクローンを形成した。また、このペプチド配列情報を用いて、サブユニットに特異的なオリゴヌクレオチド類を調製した。このようなオリゴヌクレオチド類はクローンバンクの直接ハイブリダイゼーションスクリーニングに用いることができた。しかしながら、本発明者らは、ペプチド配列を用いてPCR増幅用プライマーと、選択されたサブユニット遺伝子の部分配列を調製し、基礎DNA配列（underlying DNA sequence）を確認した上で、クローンバンクのスクリーニングに使うより長い、より特異的なプローブをつくる方法を選択した。本発明者らは、ファルネシルトランスフェラーゼサブユニットに特異的な配列のスクリーニングには、ポリA⁺RNAから調製したcDNAクローンバンクを使用することを選択した。しかしながら、使用するクローンバンクのタイプは重要ではなく、所望の場合には、ゲノムクローンバンク（genomic clone bank）を使用することもできる。同様に、ファルシネルトランスフェラーゼ酵素は天然界にかなり遍在していると思われるので、RNAとそれによるクローンバンクの調製には事実上どの真核細胞源を使っても良い。例を挙げるとするば、酵母、哺乳動物、植物、真核寄生生物、それにウイルス感染細胞ですらもポリA⁺RNAの供給源とすることができる。始めにタンパク質は哺乳動物源（ラット）から精製されたので、RNA源としてラットあるいはヒトの細胞系などの哺乳動物の細胞を使うと特別な利点があると考えられる。もちろん、細胞を選択して比較的高水準のファルネシルトランスフェラーゼ酵素が得られるように、先ず細胞系を試験する。ラットの脳、PC12（ラットの副腎腫瘍細胞系）およびKNRK（新生ラットの腎臓細胞系）は、高水準の内因性ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性を持っているので本発明者らの所望するところであった。スクリーニング法に使用するcDNAクローンバンクは、タイプが特に重要であるとは言えない。しかしながら、好ましくはparticle packaging systemを使って、λgt10やλgt11などのファージ系バンクを調製して使用すると特別の利点がある可能性がある。ファージ系cDNAバンクは、比較的容易に多数の組替え体を調製してスクリーンできるので好ましい。ここでも、cDNAそのものを調製する方法は特に重要であるとは考えられない。しかしながら、本発明者らは大きな分子のmR NAを逆転写する場合の困難を考えて、オリゴdTと任意開始のcDNA（randomly pri med cDNA）の両方を使用して成功した。クローンバンクが完成すれば、バンクのスクリーンには方法が沢山ある。例えば、前記したサブユニットペプチド配列を使ってヌクレオチドプローブ調製し、クローンバンクを直接スクリーニングする。より好ましい方法として、上記の配列を使ってプライマーを作り、このプライマーでPCR系反応を増幅した後、選択したサブユニット遺伝子の配列部分によって本当の基礎DNA配列（the actual un derlying DNA sequence）を確認して、より長い、より特異的なプローブを調製してさらにスクリーニングする方法が挙げられる。これらのプライマーは3'および／または5'配列の濃縮したcDNAクローンバンク(cDNA clone banks which are enriched for 3' and／or 5' sequence）の調製にも使用することができる。このことは、例えば当初調製したバンクで長さが全長以下のクローン（less than a full length clone）しか得られない場合に重要である。当初のスクリーニングで全長以下のクローンができた場合、必要に応じて5'および／または3'拡張法（5' and 3' extension technology）を適用して、配列全体を得ることができる。本開示により、ファルネシルトランスフェラーゼサブユニットのクローンを拡張する方法（The techniques for obtaining an extended f arnesyl transferaze subunit clone）が当業者に明らかになる。使用した方法はFrohman et al.（1988）が開示しているもので、逆転写を末端デオキシトランスフェラーゼに尾引きすることと（reverse transcription, tailing with term inal deoxytransferase）、さらに最後にPCRを実施することを併用するものである。本発明のDNA断片を各種の適用に使用することを提案する。例えば、特に有用な適用としては、各サブユニットまたは構造がこのサブユニットに由来するタンパク質またはペプチドを組替え生産する、あるいは二つのサブユニットを同時発現（co-expression）させて、ホロ酵素を組替え生産することが挙げられる。さらに、ファルネシルトランスフェラーゼをコードする本発明のDNA断片を使って、核酸プローブまたはプライマーを造る。そして、このプローブやプライマーを、例えばファルネシルトランスフェラーゼ遺伝子、またはこれに関連するゲノム配列の同定やクローニング、さらにまたサブユニット発現の研究などに使用する。ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼのサブユニットの発現先ず、クローン形成されたサブユニットの発現について述べる。適当な（所望の場合には全長の）クローンが得られたならば、cDNA由来、あるいはゲノム由来いずれの場合でも発現系を造って、サブユニットの一つ、好ましくは両方を組替えにより調製する。当業者に公知の組替え発現方法を使って、DNA断片を原核系または真核系の発現に適合させることができる。サブユニットの片方、あるいは両方の発現には事実上どんな発現系でも使用することができると考えられている。これまでも、酵素の両サブユニットを、上手に真核発現系で同時発現（co-exp ressed）させて、活性酵素を産生することができたが、汎用ファルネシルトランスフェラーゼの調製には細菌の発現系が最終的には好ましいと思われる。細菌系では両サブユニットのcDNAは別個に発現され、コードされたタンパク質はSchist os oma japonicum グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合体として発現されてきた。細菌の発現は使用の容易さと産出物の量の点から、最終的には真核発現以上に多くの利点があると信ぜられている。さらに、宿主細胞と、αおよびβサブユニットの両方をコードするDNA断片とを、同時トランスフォメーションさせることは活性酵素を得る簡便な手段である。しかしながら、別々に発現させておいて、後から再構成する方法も間違いなく本発明の範囲内に入るものである。cDNA とゲノム配列は真核発現に好適である。宿主細胞はゲノムの転写遺伝情報を加工して、機能力があるmRNAを産生し、このmRNAがタンパク質に翻訳される。同様にして、ファルネシルトランスフェラーゼサブユニットの片方、好ましくは両方の発現には、ほどんとすべての真核発現系を用いることができる、例えばバキュロウイルス系、グルタミンシンターゼ系またはジヒドロ葉酸レダクターゼを用いることができると信ぜられている。しかしながら、最良の実施態様においては、複製開始点を取り込んでいるプラスミドベクターおよび効果的な真核プロモーター遺伝子、例えばpCMV5などのpCMV種の真核ベクターが最も有用であると考えられる。この方法で発現する場合には、コード配列をプロモーター遺伝子の隣に置いて制御させる。このようにコード配列をプロモーター遺伝子の制御下に置くためには、タンパク質の転写読み枠の転写開始部位の5'末端を、プロモーター遺伝子（の、例えば3'）の「下流」約1番目と約50番目のヌクレオチドの間に置くことが当業者間で知られている。真核発現を行おうとする場合、クローンされた原断片に始めからポリアデニル化部位（例えば、5'-AATAAA-3'）が含まれていなかったため、酵素を含む転写単位にこれを組み込むことを模式的に所望することがある。この場合には模式的に、転写停止前の位置で、タンパク質の停止部位の「下流」約30番目〜2000番目のヌクレオチドの間にポリA添加部位を置く。上記で述べたように、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素産生の実施態様では、αおよびβサブユニットを同じ細胞において同時発現（co-expressed）することを提案する。これは、各々がα-またはβ-のコードをしているDNAのどちらかを持っている、二つの異なる組替えベクターを、細胞にを同時移入することにより達成することができる。そうではなくて、サブユニット両方のコード領域（ coding regions）を含む単個の組替えベクターを作り、この単個のベクターを細胞に移入してサブユニットを発現させても良い。このどちらの場合でも、「同時発現（co-expression）」なる語は、ファルネシルトランスフェラーゼのαとβ サブユニットの両方が同じ組替え細胞中で発現することを意味する。本発明によりファルネシルトランスフェラーゼのサブユニットの片方、好ましくは両方が発現する場合、常用されている宿主細胞の事実上どれでも用いることができる。例としては、真核発現に模式的に用いられている細胞系、例えば239 、AtT-20、HepG2、VERO、HeLa、CHO、WI 38、BHK、COS-7、RINおよびMDCKの細胞系を挙げることができる。本発明の真核発現の実施態様で使用するのに好ましいものは、ヒト胚芽腎臓細胞系（human embryonic kidney cell line）である293 である。上記の一般指針によれば、ファルネシルトランスフェラーゼDNAの好ましい発現方法は、ヒト胚芽腎臓293細胞にpFT-αまたはp-FT-βと呼ぶ発現ベクターを移入する方法である。pFT発現ベクターは、ヒトのサイトメガロウイルスの主要なごく初期の（major immdiate early）遺伝子の、プロモーター・エンハンサー領域を含むプラスミドであるpCMV5から構築する（Andersson et al., 1989）。核酸のハイブリダイゼーション本発明で開示するDNA配列は、核酸のハイブリダイゼーションの実施態様におけるプローブあるいはプライマーとしても有用である。その意味では、約10番目のヌクレオチドから約30番目のヌクレオチドまでの長さにおける、配列番号2、配列番号4、配列番号6および配列番号8の配列に一致するオリゴヌクレオチドフラグメントが特に有用であり、さらに例えば40番目、50番目、60番目までの長さから全長まで（up to full length）のより長い配列が最も有用である。この核酸プローブは、ファルネシルトランスフェラーゼのサブユニットをコードする配列と、特異的にハイブリット形成することができ、各種の実施態様に有用である。最も重要なことは、サンプル中の相補的配列の存在を検出するための各種の検定にこのプローブが使えることである。しかしながら、配列情報を使って変異体種のプライマーや、他の遺伝子構成に使用するプライマーを調製することを始めとして、他の用途も考えられる。長さがヌクレオチド約10個のハイブリダイゼーションプローブを用いて、安定で選択性を持つ二重分子（duplex molecule）を造ることができる。しかしながら、ハイブリッドの安定性と選択性を増進して、得られるハイブリッド分子の品位と程度を高めるためには、長さ塩基10個より長い相補的配列を持つ分子が、一般的に好ましい。また、ヌクレオチド15個ないし20個、あるいは所望の場合にはもっと長い遺伝子の相補的長さ（complementary stretches）を持つ核酸分子を設計することが好ましい。このようなフラグメントは、例えば化学的手段によりフラグメントを直接合成する、アメリカ合衆国特許第4,603,102号のPCR法などの核酸複製法（nucleic acid reproduction technology）（引用することにより本発明の一部とする）を適用する、あるいは配列を選択して組替え体産生用組替えベクターに導入することによって容易に調製することができる。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ファルネシルトランスフェラーゼの遺伝子またはcDNAの相補的長さを持つ、二重分子（duplex molecules with co mplementary stretches）を選択的に形成することができ、この性能を利用することができる。予定している適用次第によっては、ハイブリダイゼーションの条件を調整して、標的配列に合わせていろいろな程度の選択性を持つプローブを造ること所望する場合がある。高い選択性を必要とする適用では、模式的に比較的に厳格なハイブリッド形成条件、例えば塩分を低く抑えおよび／または温度は高くする0.02M-0.15M NaClで50℃〜70℃の条件を選択する。このように選択した条件は、プローブとテンプレートあるいはプローブと標的鎖との間で均衡を欠く場合にほどんと耐容性がなく、ファルネシルトランスフェラーゼ遺伝子の単離に特に好適である。もちろん、一部の適用では例えば、基礎テンプレート（underlying template ）とハイブリッド形成させた変異体プライマー鎖（a mutant primer strand hyb ridized to an underlying template）を用いて変異体を調製する場合、あるいは関連種または機能同等体などのファルネシルトランスフェラーゼコード配列を単離しようとする場合、通常は緩いハイブリダイゼーション条件でもヘテロ二本鎖を形成することができる（less stringent hybridization conditions will t ypically be needed in order to allow formation of the heteroduplex）。このような場合、塩分は0.15M-0.9M、温度は20℃〜55℃の範囲の条件が所望される。この条件で雑種形成する種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、正のハイブリッド形成シグナルとして容易に同定することができる（Cross-hy bridizing species can thereby be readily identified as positively hybrid izing signals with respect to control hybridizations）。いずれにせよ、ホルムアミドを増量して添加すると条件が厳しくなり、昇温する場合と同様にハイブリッド二重体が不安定になる。このように、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作することが可能であり、一般に所望の結果によっては選択することができる。ある実施態様では、本発明の核酸配列と、標識などの適当なハイブリダイゼーション測定手段とを併用することが有利である。検出可能のシグナルを与えることができるアビジンおよび／またはビオチンなどの放射能性、酵素性その他のリガンド類を始めとして、広範な種類の適当な指示手段が当業者に知られている。最良の実施態様では、放射能性その他の環境上好ましくない試薬ではなく、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、あるいはペルキシダーゼなどの酵素ラベルを使用することが所望される。酵素ラベルの場合、着色指示基質が知られているが、これは目視あるいは分光測定法により相補的核酸（complementary nucleic ac id）を含有するサンプルを用いて、具体的にハイブリダイゼーションを同定するものである。一般的に言って、本発明で開示するハイブリダイゼーションプローブは、溶液によるハイブリダイゼーションにも有用であるし、固相を用いる実施態様においても有用である。固相を用いる実施態様では、検体であるDNA（またはRNA）を、選択したマトリックスまたは表面に吸収させるか、付着させる。そして、所望の条件下で選択したプローブを用いて、このようにして固定した一重鎖の核酸の特異的なハイブリダイゼーションを行う。条件は特定の基準（例えば、G+C含量、標的核酸のタイプ、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ、など）に基づいて、特定の状況によって選択する。ハイブリッド形成した表面を洗って、非特異的に結合しているプローブの分子を取り除き、標識によって特異的なハイブリダイゼーションを検出したり、また定量も行う。生物学的に機能が同等のアミノ酸類上記したように、ファルネシルトランスフェラーゼ（CAAXファルネシルトランスフェラーゼ）のサブユニット構造を修飾あるいは変更して、所望するもとの酵素に似た特性、あるいは異なる特性を持つ分子にすることができる。例えば、タンパク質構造のあるアミノ酸のを他のアミノ酸と置換しても、例えば抗体の抗原結合領域、あるいは基質分子の結合部位などの構造との相互結合性能を大きく失うことがないようにすることができる。タンパク質の生物機能活性はその相互作用性能と性質によって決って行くのであるから、アミノ酸配列をタンパク質配列中で（または、もちろん、その基礎DNAコード配列（its underlying DNA coding seqence））を置換して、もとのタンパク質に似た特性、あるいは置換相手を覆い隠す（counterveiling）（例えば、拮抗剤対作動薬）特性を持つタンパク質を得ることができる。したがって、本発明者らはペプチド類の生物有用性や生物活性を大きく損なうことなく、ペプチド類の配列（または、その基礎DNA（underly ing DNA））をいろいろ変えて見ることを考えている。このように分子を変化させる場合には、アミノ酸類のヒドロパシックインデックス（hydropathic index）を考慮にいれても良い。タンパク質に相互作用性生物機能を付与する際、アミノ酸のヒドロパシックインデックスが重要であることは当業者によって一般に理解されている（Kyte & Doolitte, 1982）。アミノ酸を、同じ様なヒドロパシックインデックスあるいはスコアーを持つアミノ酸で置換すると、同じ様な生物活性を持つタンパク質になることは知られている。アミノ酸各々には疎水性と電荷特性に基づくヒドロパシックインデックスが与えられている。即ち、イソロイシン（+4.5）、バリン（+4.2）、ロイシン（+3.8）、フェニルアラニン（+2.8）、システイン／シスチン（+2.5）、メチオニン（+1.9）、アラニン（+1.8）、グリシン（-0.4）、スレオニン（-0.7）、セリン（-0.8）、トリプトファン（-0.9）、チロシン（-1.3）、プロリン（-1.6）、ヒスチジン（-3.2）、グルタミン酸塩（-3.5）、グルタミン（-3.5）、アスパラギン酸塩（ -3.5）、アスパラギン（-3.5）、リシン（-3.9）およびアルギニン（-4.5）。アミノ酸の相対的なヒドロパシック特性が、置換によって得られるタンパク質の二次構造を決め、こんどはこの二次構造によってこのタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、阻害剤、受容体、抗体、抗原などとの相互作用が形成される。アミノ酸を、同様のヒドロパシックインデックスを持つアミノ酸で置換すると、生物機能が同等のタンパク質ができることは当業者に知られている。このように転換する際には、ヒドロパシックインデックスが好ましくは±2以内、より好ましくは±1以内、最も好ましくは±0.5以内であるアミノ酸で置換する。親水性が同様のアミノ酸を置換して、生物機能が同等なタンパク質あるいはペプチドを得て、これを免疫の実施態様で使用することができる。引用することにより本発明の一部とする合衆国特許第4,554,101号では、隣接するアミノ酸の親水性によって制御されて、タンパク質の親水性平均値がその部位で最高となり、免疫原性と抗原性、すなわちこのタンパク質の生物特性と相関する、と述べている。合衆国特許第4,554,101号で詳細が述べられているが、次の親水性値がアミノ酸残基に与えられている。アルギニン（+3.0）、リシン（+3.0）、アスパラギン酸塩（+3.0±1）、グルタミン酸塩（+3.0±1）、セリン（+0.3）、アスパラギン（+0.2）、グルタミン（+0.2）、グリシン（0）、スレオニン（-0.4）、プロリン（-0.5±1）、アラニン（-0.5）、ヒスチジン（-0.5）、システイン（-1.0）、メチオニン（-1.3）、バリン（-1.5）、ロイシン（-1.8）、イソロイシン（-1 .8）、チロシン（-2.3）、フェニルアラニン（-2.5）およびトリプトファン（-3 .4）。アミノ酸を、同様な親水性値のアミノ酸で置換すると生物的に同等の、特に免疫的に同等なタンパク質を得ることができることが理解されている。このような転換を行う際には、親水性値が好ましくは±2以内、より好ましくは±1以内、最も好ましくは±0.5以内のアミノ酸で置換する。これまでに概略したように、アミノ酸の置換は一般に側鎖置換基が、例えば大きさ、求電子特性、電荷などが相対的に似ていることに基づいて行われる。このような特性を考慮して行う置換の代表例は、当業者によく知られいる通り次を挙げることができる。すなわち、アラニンまたはグリシンとセリン、アルギニンとリシン、グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩、セリンとスレオニン、およびロイシンとイソロイシンがある。これまでアミノ酸を変えることによって形成される機能が同等のポリペプチド類について述べてきたが、この転換はコードDNAを変えることによって実施するものであること、遺伝子暗号は劣化しやすく、二個以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があることを了解すべきである。ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの阻害剤本発明にとって第一義的に重要であることは、これまでに述べてきたファルネシル受容配列の一つなど、ファルネシル受容配列を取り込んでいるタンパク質あるいはペプチドは、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼを阻害する機能も持っていて、したがって、新しい抗癌療法の出発点ともなり得ることが発見されたことである。特に、ファルネシル受容ペプチド類は、p21^rasなどの天然基質のファルネシル化を阻害するのに役立つ偽りの基質としての機能と、それ自体がファルネシル化しない直接阻害剤としての機能を、二つながら効果的に達成できることも見い出された。後者のカテゴリーに入る化合物は、それ自体は阻害反応によって消耗されることはなく、阻害機能を続けることができる「純粋阻害剤」であり、その意味で重要である。これら二つのタイプの化合物は、例えば既に冒されている細胞のp21^rasのファルネシル化を阻害する手段となる意味で、本発明のきわめて重要な特徴となっている。本発明のファルネシルトランスフェラーゼ阻害に関する実施態様は、広い意味でp21^ras以外のペプチドまたはタンパク質である、ラミンaまたはラミンb（lami n a or lamin b）、もしくは酵母交配のA因子に関する。これらのペプチドや、タンパク質は構造内にファルネシル受容配列を含んでいて、ファルネシルトランスフェラーゼによるp21^rasのファルネシル化をさらに阻害することができる。最良の実施態様において、本発明のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は -C-A₁-A₂-Xなるアミノ酸を持つファルネシル受容または阻害アミノ酸配列含んでいる。式中、 C = システイン A₁ = いずれかのアミノ酸（脂肪族、芳香族またはヒドロキシ） A₂ = 脂肪族アミノ酸、好ましくはロイシン、イソロイシン、またはバリン X = 最も好ましくはメチオニンまたはセリン、より好ましくはグルタミンまたはシステイン好ましくはロイシン以外のいずれかのアミノ酸過去においてはXアミノ酸はどのアミノ酸でもよいとされたこともあったが、近年にいたり、Xは最も好ましくはメチオニンまたはセリン、より好ましくはグルタミンまたはシステイン、好ましくはロイシン以外のいずれかのアミノ酸、がよいことが発見された。ロイシンは別の酵素、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの基質となることで知られており、このペプチドはカルボキシ末端アミノ酸として使用すべきではない（Seabra et al., 1991）。ファルネシル受容または阻害アミノ酸配列は、通常はタンパク質またはペプチドのカルボキシ末端に置き、システイン残基がカルボキシ末端から第四番目の位置に来るようにする。最良の実施態様においては、阻害剤は比較的に短いペプチド、例えば長さがアミノ酸約4個ないし約10個のペプチドである。今日まで試験された阻害剤の中で最も好まれたものは、上記のC-A-A-X（配列番号12）認識構造を取り込んでいるテトラペプチドである。ペプチドが短ければ短いほど、生物系がより多くこのペプチドをの吸収するし、短いペプチドであれば阻害の実施前に壊されたり、なんらかの原因で生物的に無効となる可能性がすくないので、最終的にはより短いペプチド類を用いて本発明を実施することが好ましい。しかしながら、本発明者が調製試験した結果、手ごろな濃度、例えば約1ないし3μM（50%阻害濃度範囲0.1 〜0.5μM）で、酵素活性を事実上完全に阻害することが証明されたた多くの好適な阻害ペプチドがある。広い意味では、IC₅₀が0.01μM〜10μMである化合物もファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤としていくらかの有用性があると思われるが、より好ましくはIC₅₀ が0.01μM〜1μMの化合物である。最も好まくは、IC₅₀が0.01μM〜0.3μMの化合物である。これまでに調製試験されたものの中で、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害のIC₅₀が0.01〜10μMであることを証明された代表的なペプチドは、CVIM （配列番号 10）、KKSKTKCVIM （配列番号 11）、TKCVIM （配列番号 9）、RASNRSCAIM （配列番号 15）、TQSPQNCSIM （配列番号 16）および次のテトラペプチド類である。 CIIM （配列番号 17）、CVVM （配列番号 18）、CVLS （配列番号 19）、CVLM（配列番号 20）、CAIM （配列番号 14）、CSIM （配列番号 13）、CCVQ （配列番号 21）、CIIC （配列番号 22）、CIIS （配列番号 23）、CVIS （配列番号 24 ）、CVIA （配列番号 25）、CVIL （配列番号 26）、CLIL （配列番号 27）、CL LL （配列番号 28）、CTVA （配列番号 29）、CVAM （配列番号 30）、CKIM（配列番号 31）、CLIM （配列番号 32）、CFIM （配列番号 33）、CVFM （配列番号 34）、CVIF （配列番号 35）、 CEIM （配列番号 36）、CGIM （配列番号 37）、CPIM （配列番号 38）、CVYM （配列番号 39）、CVTM （配列番号 40）、CVPM （配列番号 41）、CVSM （配列番号 42）、CVIV （配列番号 43）、CVIP （配列番号 44）、CVII （配列番号 4 5）、CVWM （seq id no:46）、CIFM （配列番号 47）各種のペプチド類が合成試験されたので、どのペプチド配列が特に高い阻害活性を持つかを、同一の阻害活性（IC₅₀）を達成する濃度の低さを比較して示すようになった。興味あることには、受容部位の配列を少し変えると阻害活性が失われることが見い出された。すなわち、TKCVIMをTKVCIMに変えるとペプチドの阻害活性が逆転する。また、グリシンでCAAX中の脂肪族アミノ酸の一つを置換すると阻害活性が下がるのが観察された。しかしながら、上記で述べた一般式を守っていさえすればファルネシルトランスフェラーゼを阻害する構造を得ることができる。特に重要な発見は、CAAX （配列番号 12）配列の三番目の位置にフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香族残基を取り込むと、「純粋」阻害剤になることを見い出したことである。本発明に言う、「純粋」ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤なる語は、自らファルネシル化の酵素基質の作用をしないものを意味する。これは阻害剤が阻害過程で消耗されることなく、完全な阻害機能を続けることができる点で特に重要である。純粋阻害剤として作用することが確認されている代表的な化合物には、CVFM （配列番号 34）、CVWM （配列番号 46）、CVYM （配列番号 39）、CIFM （配列番号 47）、CV （pC1-F）M、L-ペニシラミン-VFM（L-penicillamine-VFM）およびL-ペニシラミン-VIM （L-penicillamine-VIM）がある。したがって、純粋阻害剤は阻害アミノ酸配列を取り込んでいて、受容配列を持っていない。阻害配列には一般に芳香族部分があり、芳香族部分はカルボキシ末端アミノ酸の前末端基と結び付き、またこのカルボキシ末端アミノ酸は芳香族である場合でも、そうでない場合でも芳香族構造の取り込みができるように修飾されていることを特徴としている（Goldst einet al., 1991））。重要なことは、純粋阻害剤のCVFM （配列番号 34）は本発明者らが今日まで同定したものの中で最良の阻害剤であることである。関連ペプチドであるCFIM （配列番号 33）が「純粋」阻害剤でないことに注目すべきである。このペプチドの阻害活性はファルネシル化の基質としての作用によるものである。フルオロ、クロロまたはニトロ誘導体などの置換基をフェニル環に結合させることによって、CVFMペプチドの酵素阻害剤としてを効力を増進することができる。この例としてパラクロロフェニルアラニンがあり、試験の結果「純粋」阻害活性があることが証明されている。フェニルアラニンのフェニル基をより複雑な疎水性物質で置換することもできる。これらの疎水性物質にはナフチル環系が含有されている。阻害剤製薬の実施態様において、阻害剤の構造中に疎水性を向上させる部分を挿入して、細胞のペプチジル構造の取り込みを増進するすることを提案する。この意味で、ある実施態様において、親油特性を向上すると考えられる脂肪酸またはポリイソプレノイド側鎖を阻害剤に付加して、細胞の取り込みが増進することを提案する。構造を変える可能性は他にも、ベンジル、フェニルまたはアシル基を、好ましくはファルネシル受容部位から充分に離れた位置、例えばペプチドのアミノ末端でアミノ酸構造に付加することが挙げられる。このようにした構造は親油性の向上に役立つと考えられる。この点、修飾CVIMなどのN-アセチル化およびN-オクチル化ペプチド類は高い阻害活性を保持するが、その反面S-アセトアミドを付加したCVIMでは阻害活性の喪失が大きいことが観察されている。この他にも、「純粋」ペプチド系阻害剤を調製する場合、阻害剤設計上考慮しなければならない重要な構造特性が発見されている。特に「純粋」阻害剤を実現するためには、N-末端に正に負荷されたα窒素を付加すること（a positively c harged alpha nitrogen at the N-terminus）が必要であることを見い出した。つまり、アシル化（例えば、アセチルまたはオクタノイル基の付加）またはN-末端でアミノ酸が付加されることによってこの正の負荷がなくなり、しかも細胞間からこの付加された構造が取り除かれていない場合、あるいは実験系でこの構造を使ってN-末端システイン上の正に負荷されたα窒素を暴露する場合、この阻害剤はファルネシル化して、純粋阻害剤として役に立たない。したがって、純粋阻害剤を所望し、例えば細胞の取り込みを向上するために修飾しようとする場合、必ず最後には作用部位のN-末端システインの上に正で負荷されたα窒素を付加する必要があることを考慮にいれなくてはならない。標的細胞に入り込む時点で、N-末端システインの上に正で負荷されたα窒素を保持する、または暴露する実施態様は各種のものが考えられる。一般的には、α窒素に正の電荷を保持する基（例えば、アルキル、置換アルキル、フェニル、ベンジルなど）を、N-末端システインに付加する。あるいはオキソプロリナーゼ、エステラーゼ、トリプシン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、トランスペプチダーゼなどの正常な細胞活動、または加水分解や脱アシルなどの細胞内プロセスによって取り除かれると、負荷された窒素を暴露する基を付加する。もちろん、負荷されている窒素（charged species）が細胞膜を超えるには、大きくはないが、いくらかの困難がある。この場合、リポソームや、担体分子などの担体組成物を使用したり、正の電荷を一時的に消去する基を付加しても良い。より詳しくは、N-末端に除去不能の修飾を加える場合には、正に負荷された窒素を保持し、ペプチドの疎水性を増進する修飾が好ましい。この例としては、R₁ R₂R₃N-ペプチドがあげららる。この式中R₁、R₂、R₃は、H、アルキル、フェニル、ベンジル、置換フェニル、置換ベンジルなど、または次に掲げるものなどの環状アザ構造である。除去可能の構造を形成することは特別な利益となる場合がある。このような構造として、システインα窒素および／またはチオール側鎖の両方を取り囲むようにN-末端システインを修飾することが挙げられる。この例には、2-置換チアゾリジン-4-カルボン酸があり、この化合物は細胞内で加水分解されてシステインを露出させる（unmask）（Nagasawa et al., 1984）。次にこの一例を掲げる。このカテゴリーの他の構造として、2-オキソ-チアゾリジン-4-カルボン酸がある。この化合物はC-S結合においてオキソ-プロリナーゼによって分割されてシステインを露出する（Hazelton et al., 1986）。このカテゴリーの構造としては次が挙げられる。他の実施態様において、次の構造による除去可能な修飾をN-末端に加えることを考えている。この例として、酵素分割で除去できるように上記の構造をアシル修飾することが挙げられる。これには、例えば生体内または細胞培養基において脱アシルする R=CH₃COのN-アセチル構造も含まれている（Hazelton et al., 1986））。これとは異なり、次のようなフェニルカルバメートは細胞内エステラーゼ類に分割されて、阻害剤とCO₂を遊離する。また、他の例として次のようなN-末端ピログルタミル基を含有することが挙げられる。この基はピログルタミルアミノペプチダーゼにより分割されて、阻害剤を放出する。トリプシンや、キモトリプシンに感受性をもつ構造も考慮している。トリプシンに感受性を持つ構造としては、テトラペプチドシステインのN-末端に、L-アルギニンやL-リシンを付加すること、あるいはL-リシンまたはL-アルギニンカルボキシ末端を含むタンパク質またはペプチドを付加することが挙げられる。これらの構造の一例を次に示す。図中トリプシン感受性の部位も示している。同様の構造で、キモトリプシン感受性を付与するものも考慮している。これらの構造では、L-フェニルアラニン、L-チロシンまたはL-トリプトファン部分、あるいはこれらのアミノ酸を含有するペプチドまたはタンパク質をアミノ末端に取り込んでいる。同様に、次に掲げる部分が γ-グルタミルトランスペプチダーゼにより除去可能なγ-グルタミル誘導体も考慮している。細胞内で加水分解されて遊離N-端末を放出する他の修飾も考慮している。この例として次のようなN-マンニッヒ塩基構造、 R=フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、などまたは、次のようなシッフ塩基構造を挙げることができる。本発明ではさらにまた、阻害性タンパク質類またはペプチド類の構造を修飾して、例えばプロテアーゼによる劣化傾向を低下させたり、あるいは除去して、体内における安定性を増進することができると考えている。例えば、D-アミノ酸またはオルニチンやタウリンのように通常ではタンパク質中では見い出されないアミノ酸など、プロテアーゼ類によって認識分割される可能性が少ないアミノ酸類を使用して、有用な構造の修飾を行うことができると考えている。この他にも、ペプチドを環化すること、アシル基によってペプチド結合のNH基を誘導体化することなどが挙げられる。ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの検定さらに他の実施態様において、本発明は組成物中のファルネシルトランスフェラーゼ（CAAXファルネシルトランスフェラーゼ）を検定する方法に関する。この検定系によって天然または組替えファルネシルトランスフェラーゼ酵素類の単離と精製の後処理（follow）が行えるばかりでなく、酵素阻害剤として有望な酵素のスクリーニング検定法開発の緒口となるものであり、本発明の重要な特徴となっている。この点は下記で詳細説明する。一般的はにこの検定方法は、ファルネソールが、受容タンパク質あるいはペプチドに移行するのを触媒する、ファルネシルトランスフェラーゼ活性を有すると思われる組成物の性能を、測定することからなる。上記で述べたように、ファルネシル受容タンパク質またはペプチドは、一般にはファルネシルトランスフェラーゼ基質として作用し、且つ-C-A-A-Xである認識部位を含有するタンパク質またはペプチドと定義されている。この検定プロトコルは、反応の間、通常は全transファルネシルピロリン酸を、ファルネソール供与体として使って実施する。全transファルネシルピロリン酸のファルネシル部分に標識し、ファルネシル受容タンパク質またはペプチド中でこの標識、例えば放射能標識の外観を測定検定する。上記で述べた酵素の特性評価の場合と同様に、検定に用いるファルネシル受容配列は、一般的には-C-A-A-X （配列番号 12）と定義することができるが、最良の実施態様では、有用な酵素基質であることが分かっているC-V-I-M （配列番号 10）、-C-S-I-M （配列番号13）、-C-A-I-M （配列番号14）などを使用しても良い。カルボキシ末端配列が-C-A-A-X （配列番号 12）であるほどんとのタンパク質やペプチドもファルネシルトランスフェラーゼ検定に使用しても成功すると信ぜられる。検定に使用するファルネシル受容タンパク質またはペプチドとしては、p21^rasタンパク質が好ましい。下記で詳細説明するが、天然基質の周りで基質として作用したり、あるいは天然基質そのものとして作用して、ファルネシル化と天然基質とを隔離する「偽りの受容体」としての性能を持ち、あるいはそれ自体ファルネシル化しない「純粋」阻害剤としての性能を持つ阻害物質を同定する場合に、特にこのことが言える。p21^rasのような天然基質を使う利点はいくつもあるが、その一つは天然基質と偽りの基質とを分けてファルネシル化の程度を相対的に分析できることである。しかしながら、単に酵素の比活性だけを検定する場合、例えば必ずしも示差標識を使用することを必要としない場合、あるいは阻害を調べることを必要としない場合、ファルネシル受容体として長さアミノ酸約4個〜約10個で、カルボキシ末端に認識シグナルを取り込むことができる短いペプチド類を使用するのが便利である。ファルネシル受容タンパク質またはペプチドの代表例としては、CVIM （配列番号10）、KKSKTKCVIM （配列番号11）、TKCVIM （配列番号9）、RASNRSC AIM（配列番号15）、TQSPQNCSIM （配列番号16）、CIIM （配列番号17）、CVVM （配列番号18）およびCVLS （配列番号19）を挙げることができるが、これらに限定はされない。候補物質の検定さらに他の実施態様において、本発明は新しいファルネシルトランスフェラーゼ阻害化合物を同定する方法に関する。本発明においてはこれらの新しい阻害物質を「候補物質」と言う。このスクリーニング法はファルネシルトランスフェラーゼを阻害する目的に役立つ化合物のどれでも一般的に同定するのに有用であることが証明されるであろる。さらにまた、この点で有用な化合物は必ずしもタンパク質系化合物、あるいはペプチジル化合物に限定されるものではないと考えられる。事実、スクリーニング検定を使って同定するのに最も有用な化合物は、非ペプチジル的な性質を持つ、例えば酵素によって認識結合され、堅い結合その他の化学手段によって酵素を失活させるのに役立つ化合物であることが証明されるであろう。したがって、これらの実施態様においては、本発明は一般的には次の工程からなる、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素を阻害する候補物質の性能を測定する方法に関する。（a）ファルネシル部分をファルネシル受容物質に移行することができるファルネシルトランスフェラーゼ酵素からなる酵素組成物を得る、（b）候補物質と酵素組成物とを混合する、そして（c）候補物質の存在下で、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素がファルネシル部分をファルネシル受容基質に移行する性能を測定する。この候補物質スクリーニング検定の重要な特徴は、天然あるいは組替えファルネシルトランスフェラーゼ酵素組成物を、例えば、上記で説明したように、相対的に純粋な形で調製しなければならないことである。酵素阻害を特異的に検定するするには、少なくとも相対的に純粋な製剤がなければできないことが、候補物質スクリーニング検定の重要な特徴であり、この点、酵素に対する影響を考えずに抽出液中の他の物質に対する阻害効果を測定する場合と異なる。いずれにせよ、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素の単離に成功したことから、初めて、この癌関連酵素の阻害に使える化合物を同定できるようになったのである。候補スクリーニング検定の準備と実施はきわめて簡単で、多くの点で上記で述べた酵素活性の測定検定と関連がある。天然あるいは組替え酵素の比較的純粋な製剤を用意した後、好ましく、阻害物質が含まれていると言う点を除いては、、酵素がファルネシルトランスフェラーゼ機能を発揮できる条件において、候補物質と酵素製剤とを混合する。この混合物には、通常p21^rasのような知られているファルネシル受容基質を添加する。こうして、候補物質の存在下で、ファルネシル受容基質のファルネシル化を相対的に低下させる候補物質の性能を測定する。したがって、相対的に純粋な酵素の活性、しかも混合したもの以外の候補物質の関与を受けていない活性を、候補物質の存在下で測定して、候補物質の相対的阻害力を評価することができる。ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの阻害方法さらに他の実施態様において本発明は、上記で述べたペプチジル化合物群の一つなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、あるいは候補スクリーニング検定によって同定した候補物質の有効濃度により酵素を処理することよりなる、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素の阻害方法に関する。言うまでもなく、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素を阻害することにより、ras関連癌などの各種の癌を治療できる点で、これは本発明の重要な特徴である。このような阻害剤を使って癌患者または前癌患者の悪性細胞のrasタンパク質にファルネシル基が付着するのを防止すれば、癌の治療あるいは改善に貢献できるし、また単独療法としても、化学療法、切除術、放射線療法など他の癌療法との併用療法としても有用であると信ぜられる。簡単な図面の説明図１ラット脳の部分精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼによる［³H］FPPからp21^H-rasへのファルネソールの移行。標準検定液おのおのは、p 21^H-ras 40μM（●）または０（▲）、［³H］FPP 10pmolesおよび部分精製ファルネシルトランスフェラーゼ3.5μgを含有していた。複製サンプルは37℃で表示時間インキュベートし、TCA沈澱性（TCA-precipitable）放射能を実施例に示す方法で測定した。内枠の表はp21^H-rasの不存在下、存在下で1時間行った反応による、12%SDSポリアクリルアミド中のアリコートの泳動を示している。ゲルはEn tensify溶液（DuPont）で処理、乾燥して、-70℃で2日間XARフィルムに暴露した。図２ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの基質飽和曲線。パネルA 標準検定液おのおのは、部分精製ファルネシルトランスフェラーゼ1.8μg、p21^H ^-ras 40μM、［³H］FPP （250,000 dpm）、および各種含量の標識化されていないFPPを含有して、［³H］FPPの最終濃度が表示量となるようにした。パネルB 標準検定液おのおのは、部分精製ファルネシルトランスフェラーゼ3.2μg、［³H ］FPP 10pmol、および表示量のp21^H-rasを含有していた。このp21^H-rasは表示しているヌクレオチド50μMと共に30℃で45分間インキュベートし、トリス-塩酸10 mM（pH7.7）、EDTA 1mM、DTT 1mM、およびMgCl₂ 3mMを含む緩衝液中で室温によりG-50セファデックスゲル濾過カラムを通したものであった。両方のパネル共に、検定は37℃で1時間、二回づつ実施した。TCA沈澱性放射能の測定方法は実施例で説明してある通りに行った。図3 ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの二価カチオンの必要性。標準検定液おのおのは、［³H］FPP 10pmol、部分精製ファルネシルトランスフェラーゼ2.5μg、p21^H-ras 40μM、EDTA 0.15mMおよびZnCl₂（●）かMgCl₂（▲ ）のいずれかの表示量を含有していた。インキュベートは37℃で1時間、二回づつ実施した。TCA沈澱性放射能の測定方法は実施例で説明してある通りに行った。図4 p21^H-rasに移行した［³H］FPP由来の放射性物質の同定。パネルA 実施例で説明する通り、標準検定液のアリコートをヨウ化メチルにより分割した。パネルB ヨウ化メチルを省略した以外は同様にして他のアリコートを処理した。分割後抽出液を窒素下で乾燥し、リン酸25mMおよび表示しているイソプレノイド標準液おのおの6nmolesを含有する50%（v／v）アセトニトリル0.4mlに再懸濁した。100% アセトニトリル／リン酸でもう一回10分間洗ったこと以外は、Casey et al.,（1 989）が開示した方法と同様にして、この混合液の逆相HPLC（C18, Phenomex）を行った。イソプレノイド標準液は205nmにおける吸光度によって同定した。図中、C₁₀ は全transゲラニオール、C₁₅は全transファルネソール、C₂₀は全transゲラニルゲラニオールである。図5 Mono Qカラムによるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼのクロマトグラフィ。 Mono Qカラム（10×1-cm）をDTT 1mM、ZnCl₂ 20μMおよびNaCl 0.05Mを含有する 50mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.5）で平衡化し、これにラット脳（200mg）の30〜5 0%硫酸アンモニウム分画を入れた。カラムをNaCl 0.05Mを含有する同一の緩衝液 24mlで洗い、NaCl 0.05M〜0.25Mの24ml-直線勾配によりを溶出した後（followed by a 24ml-linear gradient from 0.05 to 0.25 NaC1））、NaC1 0.25Mを含有する同一の緩衝液24mlでもう一回洗った。その後NaCl 0.25〜1.0Mを含有する同一の緩衝液112mlの直線勾配で流速1ml／minにより酵素を溶出させた。これから分画をおのおの4mlづつを採取した。標準法（o）により各分画のアリコート（2 μl）のファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性を検定した。各分画のタンパク質含量（●）を280mMにおける吸光度から推定した。図6A ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ精製の各種段階における SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 30〜50%硫酸アンモニウム分画（レーン1）10μg、Mono Q分画（レーン2）3μg、およびペプチドアフィニテイーカラム（レーン3）約90ngをSDS-10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛け、タンパク質バンドを銀染色により検出した。ゲルに充填した各サンプルのファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性は、レーン1、2および3について、おのおの0.1、0.8および54単位／レーンであった。マーカータンパク質標準液の分子量を図中に示す。電気泳動条件は10% miniゲルを30mAで1時間流した。図6B 精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ペプチドアフィニテイ精製カラム分画（右レーン）約0.7μgのSDS-10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこない、タンパク質バンドをクーマシーブルー染色（Coomassie Blue Stain）により検出した。マーカータンパク質標準液の分子量（左レーン）を図中に示す。コンデイテイランク（Conditilank）は1時間当り［³ H］FPP p21^H-ras 3.78pmolが形成された。ペプチド△、○および○は、野生型ヒトp21^H-rasタンパク質のCOOH末端10、6および4のアミノ酸に一致する。ペプチド□および▲はコントロールペプチドである。図7 ファルネシル：タンパク質トランフェラーゼのゲル濾過アフィニテイ精製ファルネシルトランスフェラーゼ（タンパク質〜1μｇ）を、N aCl 0.2M、DTT 1mMおよび0.2%オクチル-β-D-グルコピラノシドを含有する50mM トリス塩酸緩衝液（pH 7.4）中で流速0.2ml／minのスーパーローズ-12 （25×0. 5-cm）カラムによりゲル濾過した。分画はおのおの0.5mlづつを採取した。パネルA 各反応検定液に0.2%オクチル-β-D-グルコピラノシドを含有している以外は、標準法と同様にして、各分画のアリコート6μl中のファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性を検定した。カラムはチログロブリン（670kDa）、γ-グロブリン（158kDa）、オボアルブミン（44kDa）、ミオグロビン（17kDa）、およびビタミンB12（1.35kDa）で校正した。矢印は158-kDaおよび44-kDaマーカーの溶出位置を示している。パネルB 各分画のアリコート0.42mlをCentricon 30濃縮機（Amicon）で40μlに濃縮し、この濃縮液25μlを10% SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルは硝酸銀で染色し、タンパク質マーカー（一番右のレーン）で校正した。図8 ペプチドによるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性の阻害各標準検定液には、［³H］FPP 10pmol、部分精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ1.8μg、p21^H-ras40μMおよび10 mM DTT 3μlに添加した競合ペプチドの表示濃度が含有されていた。37℃で1時間インキュベートした後、TCA 沈澱性放射能を実験方法（Experimental Procedures）の記載にしたがって測定した。各数値はインキュベート三回（ペプチドなし）の平均値、またはインキュベート一回（+ペプチド）の値である。EDTA 20 mMを含有させて、平行してインキュベートを行ってブランク値0.11 pmol／hを得た。このブランクは「コントロールの%値」の計算前に各数値から減算した。ブランク値減算後の「100%コントロール値」は1時間当り［³H］FPPp21^H-ras 3.78pmolが生成された。ペプチド△ 、○および●は、野生型ヒトp21^H-rasタンパク質のCOOH末端10、6および4のアミノ酸に一致する（seq id nos:10, 9および11）。ペプチド□（CNFDNPVSQKTT, 配列番号 48）および▲（TKVCIM, 配列番号49）はコントロールペプチドである。図9 ペプチドによるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性の阻害インキュベートは図8の説明の記載通りに行った。「100%コントロール値」は1 時問当り［³H］FPPp21^H-ras 2.92pmolが形成された。ブランク値は0.20pmol／h であった。各ペプチドのCOOH末端10は、図9に表示のタンパク質の残基からなっていた。ペプチドKNNLKDCGLFは配列番号50であり、KKSKTKCVIMは配列番号11であり、TQSPQNCSIM配列番号16であり、RASNRSCAIMは配列番号15である。図10 CVIM （配列番号10）のテトラペプチド類縁体によるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性の阻害各標準検定液には、［³H］FPP 15pmol、部分精製ファルネシルトランスフェラーゼ4〜7.5μg、p21^H-ras 30または40μMおよび競合テトラペプチドの表示濃度が含有されていた。30または60分後p21^H-rasに付着している［³H］ファルネシルの量を、実施例IIの方法の欄の記載通りにトリクロロ酢酸により沈澱させて測定した。各数値はインキュベート二回または三回（ペプチドなし）の平均値、またはインキュベート一回（+ペプチド）の値である。各テトラペプチドは、同一濃度のCVIM （配列番号10）を用いて、別個の実験を行って試験した。CVIMの阻害値（点線）は実験21回の平均値であり、この実験の「100%コントロール値」は13pm ol min^-1mg protein^-1 であった。K₁濃度は、このテトラペプチドの50%阻害濃度である。この図で表示されているのは、CAIM （配列番号14）、CVIA （配列番号 15）、CVAM （配列番号30）、CKIM （配列番号31）、CLIM （配列番号32）、CVL M （配列番号20）、CVIL （配列番号26）、CVKM （配列番号51）およびCVIK （配列番号52）である。図11 CVIM （配列番号10）のフェニルアラニン含有類縁体によるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性の阻害図10の説明の記載通りにして、表示濃度の競合テトラペプチドの存在下で酵素活性を測定した。この図で表示されているのは、CFIM （配列番号33）、CVFM （配列番号34）およびCVIF （配列番号35）である。図12 CVFM （配列番号53）による、p21^H-ras（A）およびビオチン化（Biotin ylated）KTSCVIM （配列番号53）（B）のファルネシル化の阻害パネルA 各反応検定液には、［³H］FPP 15pmol、精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ4.5または6ng、p21^H-ras 40μMおよび競合テトラペプチドの表示濃度が含有されていた。37℃で30分インキュベートした後p21^H-rasに移行した［³H］ファルネシルの量を、標準フィルター検定法により測定した。図に示す数値は実験二回の平均である。「100%コントロール値」は16及び19nmol min^-1mg protein^-1 であった。パネルB 各反応検定液には、［³H］FPP 15pmol、精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ4.5または6ng、ビオチン化KTSCVIM （配列番号 53）3.4μM、および競合テトラペプチドの表示濃度が含有されていた。37℃で30分インキュベートした後、［³H］ファルネシルで標識されたペプチドをストレプタビジン-アガロース（streptavidin-agarose）で捕集、洗った後、取り込まれていない［³H］FPP から分離し、シンチレーション計数を行った。図に示す数値は実験三回の平均値である。「100%コントロール値」は10、17および21nmol min^-1mg protein^-1であった。この図で表示されているのは、CVFM （配列番号34）およびCVIM （配列番号10）である。図13 修飾テトラペプチドによるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性の阻害図10の説明の記載通りにして、この図に表示している各種濃度のテトラペプチドの存在下で酵素活性を測定した。パネルAおよびパネルBの「100%コントロール値」はそれぞれ9.3および9.2pmol min^-1mg protein^-1であった。図14 CVIM （配列番号10）を単個のアミノ酸で置換して形成したテトラペプチドによるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの阻害図10および11の説明の記載通りにして、図14に表示する競合テトラペプチドの存在下で酵素活性を測定した。各テトラペプチドは0.01〜100μMの範囲の七つの濃度で試験した。テトラペプチドの50%阻害濃度を阻害曲線から計算した。単線および二重線のアンダーラインはおのおの、哺乳動物と真菌タンパク質COOH末端の配列を示している。これらの配列はファルネシル化し易いものである（表III参照）。 CXIMは配列番号54であり、CVXMは配列番号55であり、およびCVIXは配列番号56である。図15 精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼによりCVIM（配列番号10）はファルネシル化するが、CVFM （配列番号34）はファルネシル化しない。標準検定液（25μl）には、［³H］FPP（44,000dpm／pmol） 17pmol、精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ 5ng、オクチル-β-D-グリコシド 0.2%（w／v）および図に表示されているテトラペプチド3.6μMが含有されていた。37℃で15分インキュベートした後、検定液全部をポリグラムSIL Gシート（Pol ygram SIL G sheet）（Brinkmann Instrument）に載せ、N-プロパノール／濃縮N H₄OH／水（6:3:1）を含有する溶媒系中で、4時間薄層クロマトグラフィを行った。しかる後TLCシートを乾燥し、エンハンススプレー（ENHANCE Spray）（Dupont -New England Nuclear）をスプレーして、-70℃で25時間コダックX-OMT ARフィルムXAR-5に露出した。図16 ラットのファルネシルトランスフェラーゼαおよびβサブユニットから誘導したペプチドのアミノ酸配列の情報により形成したcDNAプローブパネルA プライマーα1（配列番号57）およびプライマーα2（配列番号58）は、実施例II Iで説明するように、図示しているペプチド（配列番号59）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を得るため、ラットのゲノムDNAによるPCRに使用した。ヌクレオチド配列5'-ATIGAGTTAAACGCAGCCAACTATACGGTCTGGCACTT-3'（配列番号 64の残基6〜54による特異的な例）は、ラット脳のcDNAライブライリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。パネルB（上側）プライマーβ1（配列番号60）およびプライマーβ2（配列番号61）は、実施例II Iで説明するように、図示しているペプチド（配列番号63）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を形成するため、ラットのゲノムDNAによるPCRに使用した。パネルB（下側）上記のPCR配列番号62から誘導されたペプチドをコードするヌクレオチド配列。配列すべてが配列番号62に含まれているプライマーβ3およびプライマーβ4を合成し、実施例IIIで説明するように、cDNAの3'末端の増幅用プライマーとして使用した。図17 酵母の配列RAM2内のものと同一である、ラットのファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニット（FT-α）（配列番号1）配列内のアミノ酸の同定。アミノ酸残基は左側に番号がふってある。同一のアミノ酸は箱枠で囲って示している。酵母の配列RAM2はHe at al.（1991）によって報告されている。同一ではない残基は図示省略。図18 酵母の配列DPR1／RAM1内のものと同一であるラットのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニット（FT-β）（配列番号3）配列内のアミノ酸の同定。アミノ酸残基は左側に番号がふってある。同一のアミノ酸は箱枠で囲って示している。酵母の配列DPR1／RAM1はGoodman at al.（1988）によって報告されている。同一ではない残基は図示省略。図19 組織（A&C）と培養細胞（B&D）におけるラットのファルネシルトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットmRNAの分布。パネルA&C 図示している組織から総RNA（total RNA）を単離し、アリコート（30μg）の1.5 %アガロースゲルによる電気泳動を行い、ナイロン膜にブロットしてブロット分析を行った。ラットのファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニット（A）またはβサブユニット（Ｂ）に特異的な、一重鎖で、しかも³²Pで均一に標識されているcDNAプローブ二個の混合物を用いて、42℃で20時間ハイブリダイゼーションを実施した。プローブはおのおのヌクレオチド〜500個の長さを持ち、2×10^６ cpm／mlを使用した。フィルターは、0.2%（w／v）SDSを含有する0.2×SSCを用いて、68℃で１時間洗った後、70℃で2〜4日間コダックXAR-5フィルムに暴露した。隣接するレーンで走るRNA標準液の位置を左側に示す。負荷のコントロールとして、同一のフィルターを、始めはラットのシクロフィリン（cyclophilin）c DNA（2×10^６ cpm／ml）に一致する、³²Pで標識された49-員（49-mer）オリゴヌクレオチドで再プローブし、第二回目はラットのグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のcDNAに、³²Pで均一に標識されているものたもの（-1.2kb）で再プローブした（4×10^６cpm／ml）。このようにして再プローブされたフィルターを、洗う度毎に、その後-70℃で12時間露出した。パネルB&C ラット脳、KNRK細胞およびPC12褐色細胞腫におけるα（C）およびβ（D）ファルネシルトランスフェラーゼサブユニットmRNAの発現。AおよびBで説明しているように、各サンプル（10μg）のポリ（A）⁺RNAをとり、そのアリコートのブロット分析を行った後、-70℃で12時間露出した。その後、A&Bで説明しているように、同一のフィルターをラットのシクロフィリンcDNAから誘導した³²P-オリゴヌクレオチドで再プローブした。このフィルターは-70℃で12時間XAR-5フィルムに露出した。図20 移入293細胞で発現したラットのタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットのイムノブロット分析。サンプルの10％ゲルによるSDS／PAGEを行い、ニトロセルロースに移した。フィルターはウサギ抗αサブユニットIgG-Y533 1μｇ／ml（A）またはウサギ抗βサブユニットIgG-X287 5μg／ml（B）と共にインキュベートし、続いて¹²⁵Ｉで標識されたヤギ抗ウサギIgG （1×10^６cpm／ml）と共にインキュベートした。レーン1および3 ラット脳のファルネシルトランスフェラーゼの部分精製Mono Q分画20μg。レーン2、4、5、6、7 次のプラスミドを移入された293細胞のシトゾル20μg。 pFT-α+pFT-β1（レーン2および7）、pFT-α+pFT-β1rev（レーン4）、 pFT-αrev+pFT-β1（レーン5）、pFT-αrev+pFT-β1rev（レーン6）フィルターは-70℃で（A）48時間または（B）16時間コダックXAR-5フィルムに露出した。分子量マーカーを図に示す。プラスミドpFT-αrevおよびpFT-β1revは逆配向（コードをしていない）に挿入されたcDNAを含有している。図21 ラットのタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットを正または逆（rev）配向にコードするcDNAを移入された293細胞のシトゾル抽出液のファルネシルトランスフェラーゼ活性。細胞には図示しあるプラスミド３μg＋pVA 1μgを移入した。各検定サンプルには、図示してある用量のシトゾル抽出液、トリス-塩酸50mM（pH 7.5）、ZnCl₂ 50μM、KCl 20mM、MgCl₂ 3mM、ジチオトレイトール1mM、オクチル-β-グルコピラノシド0.4％（v／v）、p21^H-ras40μM、および全trans［³H］ファルネシルピロリン酸15pmol（15,335dpm／pmol）を含有して、総量を25μlとした。試験管を37℃で10分間インキュベートした後、p21^H-rasに付着した［³H］ファルネシルの量を測定した。各数値はインキュベート二回の平均である。図22 EDTAで処理したタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼの反応配列の概略図。図23 タンパク質ファネシルトランスフェラーゼとCVFM（●）およびN-AcCVFM （▲）とタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼの示差相互作用（differen tial interaction）。パネルA p21^H-rasのファルネシル化の阻害。標準検定液は、p21^H-ras40μM、ファルネシルトランスフェラーゼ（Mono Q 分画）5μg、［³H］ファルネシルピロリン酸 0.5μM（15,178dpm／pmol）、およびCVFM（●）またはN-AcCVFM（▲）の図示している濃度を含有していた。37℃で 30分間インキュベートした後、p21^H-rasに付着した［³H］ファルネシルをトリクロロ酢酸で沈澱させて、その量を測定した。各数値はインキュベート二回の平均である。「100％コントロール値」は、タンパク質1mg当り24.3pmol／minであった。パネルB テトラペプチドのファルネシル化。標準検定液は、［³H］ファルネシルピロリン酸 2.4μM（9515dpm／pmol）、アフィニテイ精製タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ〜5ng、およびCVFM （●）またはN-AcCVFM（▲）の図示している濃度を含有していた。37℃で15分間インキュベートした後、反応検定液の薄層クロマトグラフィを実施し、実施例の記述通りに定量した。濃度0.4、1.2および3.6μM（0.65、0.76および0.57pmol／ tube）のSVIM（非ファルネシル化ペプチド）を用いる平行反応によりブランク値を求め、ブランク値を対応する実験値から引いて、CVIMおよびN-AcCVIMの値とした。図24 CIFM（●）およびN-AcCIFM（▲）とタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼの示差相互反応。パネルA p21^H-rasのファルネシル化の阻害。パネルB テトラペプチドのファルネシル化。これらの実験は図23の解説に記載されいるものと同一の濃度で実施された。図25 CVFMの存在下におけるN-オクタノイルCVFMのファルネシル化の低減。各反応検定液は、［³H］ファルネシルピロリン酸 2.4μM（11,574dpm ／pmol）、アフィニテイ精製タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ〜5ng、図示している濃度のN-オクチルCVFM、およびCVFM 0（●）または3.6μM（▲）を含有していた。37℃で15分間インキュベートした後、反応検定液の薄層クロマトグラフィを実施し、実施例Ｖの記述通りに定量した。ペプチドを含有しないで平行反応を行うことによりブランク値0.58pmol／tubeを求め、各実験値からこのブランクを減算した。図26 ヒトのファルネシルトランスフェラーゼαサブユニットをコードする全長cDNAの、ヌクレオチド配列（配列番号6）と推定アミノ配列（配列番号5）、ならびにこれらとラットのαサブユニットのアミノ酸配列との比較。アミノ酸には、左側に番号がつけてある。アミノ酸残基1は開始剤として推定したメチオニンである。ヒトのファルネシルトランスフェラーゼαサブユニットのタンパク質（配列番号5）が翻訳された379アミノ酸配列を、ヌクレオチド配列（配列番号6）の下に示す。ラットのタンパク質と異なるアミノ酸残基は箱枠で囲み、ラットの配列に一致するアミノ酸はヒト配列の下に示してある。図27 ヒトのファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットをコードする部分cDNAの、ヌクレオチド配列（配列番号8）と推定アミノ配列（配列番号7）、ならびにこれらとラットβサブユニットのアミノ酸配列との比較。ヌクレオチドには右側に番号がついている。アミノ酸には左側に番号をつけ、ラットタンパク質に一致する残基の番号は括弧内に入れてある。ヒトの部分的ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットcDNAが翻訳された 387アミノ酸配列（配列番号7）を、ヌクレオチド配列の下に示す。ラットのタンパク質と異なるアミノ酸残基は箱枠で囲んであり、相違点はヒト配列の下に示してある。最良の実施態様の説明次に掲げる実施例により、本発明者らが見い出した哺乳動物のファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ酵素の同定方法、精製方法ならびにその検定方法およびこれらの酵素を阻害するために使用できる新化合物のスクリーニング方法を説明する。さらにまた、本発明の結果開発された、それ自体これらの酵素を阻害するのに用いることができる各種のペプチジル化合物を説明する。当業者は、次の実施例で開示する技術は、本発明者らが本発明の実施のためによく機能する研究手続きとして発見したものであって、最良の発明の実施方法であると考えられることを理解するであろう。しかしながら当業者は、本発明から下記に開示する特定の実施態様内で多くの変更をすることが可能であるし、また本発明の精神と範囲を離れることなく同様の結果を得ることも可能であることも理解すべきである。実施例Ｉファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの製造と特性評価 1．材料ペプチド類はペニンシュラ研究所（Peninnsula Laboratories）から入手するか、あるいは標準法により合成した。ペプチドはすべてHPLCで精製し、組成はアミノ酸分析によって同定した。使用直前、各ペプチドをジチオトレイトール（DT T）10mM中に濃度が0.8mMとなるように溶解し、希釈はすべてDTT10mMによって行った。Davisson et al.（1986）の方法により無標識の全transファルネシルピロリン酸（FPP）を合成した。［³H］ファルネシルピロリン酸（20 Ci／mmol）はニューイングランドヌークレアー（New England Nuclear）に外注して合成させた。ゲラニオールおよびファルネソール（いずれも全trans）はアルドリッチケミカル（Aldrich Chemical）から入手した。全transゲラニルゲラニオールはR.Coa tes（イリノイ大学）から入手した。組替え野生型ヒトp21^H-rasタンパク質は、pXVR系の発現ベクター（Feig etal. ,1986）であるpAT-rashの細菌発現系（カリフォルニア州ラジョラ市ラジョラ癌研究財団Channing J.Derから供給； La Jolla Cancer Research Foundation,La Jolla,Ca）により生成した。プラスミドはE.Coli JM105に導入した。組替えp21^H ^-ras タンパク質は、DEAEセファセル（Sephacel）とセファデックスG-75を用いて、シーケンシャルクロマトグラフィから細菌抽出液の高速上澄み液を溶出させて4℃で精製した。純度はSDSゲルのクーマシーブルー染色で測定した結果では〜90％であった。精製p21^H-rasは、DTT 1mM、 EDTA 1mM、MgCl₂ 3mM、およびGDP 30μMを含有する10mM塩酸緩衝液（pH 7.5）により、15mg／mlまで濃縮して、-70 ℃で複数のアリコート（multiple aliquots）で貯蔵した。2．ファルシネルタンパク質トランスフェラーゼ活性の検定ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ活性は、全trans［³H］ファルネシルピロリン酸（［³H］FPP）からp21^H-rasに移行する³H-ファルネソールの量を測定して決定した。標準反応検定液は最終容量を25μlとし、次の濃度の成分を含有していた。すなわち、トリス-塩酸（pH 7.5））50mM、 ZnCl₂ 50μM、 KC l 20mM、DTT 1mMおよびp21^H-ras40μM。さらに、この検定液には、［³H］FPP（〜30,000dpm／pmol）10pmoleおよび部分精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ1.8〜3.5μg（下記参照）も含有していた。検定液を12×75-mmの硼珪酸製の試験管にいれて37℃で1時間インキュベートした後、始めに4％SDS 0.5ml 、続いて30％トリクロロ酢酸（TCA）0.5mlを添加して反応を止めた。試験管を振とうし、45〜60分間氷上に放置した後、6%TCA／2%SDS溶液2mlを添加した。検定液をHoefer濾過器（FH 225）の2.5-cmガラスファイバーフィルターで濾過した。試験管は同じ溶液2mlで二回洗い、各フィルターは6%TCA 2mlで五回洗って、乾燥し、シンチレーション計数器で計数した。活性1単位は、標準条件下において［³H］FPPから酸沈澱性のp21^H-rasへ1時間当り1pmolの［³H］ファルネソールを移行する酵素量と定義する。3．ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの精製別段の説明がある場合を除き、全ての工程は4℃で実施する。工程1−硫酸アンモニウム分留トリス-塩酸（pH 7.5）50mM、EDTA 1mM、EGTA 1mM、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）0.2mM、およびロイペプチン0.1mMを含有する氷冷緩衝液10 0ml中で、スプレイグドウリーラット（Sprague-Dawley rats）（100〜150g）の雄50匹から採取した脳を均質化して、抽出液を60,000×gで70分間回転させた。上澄み液を固体硫酸アンモニウムで30％飽和させ、氷上で30分間攪伴した後、12 ,000×gで10分間遠心分離して、沈澱したタンパク質を取り除いた。このようにして得た上澄み液を硫酸アンモニウムで調整して50％飽和させると、ペレットが形成された。このペレットを、DTT 1mMとZnCl₂ 20μMを含有する20mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.5）〜20m1中に溶解し、先ず同じ緩衝液4リットルで4時間透析し、その後同じ組成の新しい緩衝液で12時間透析した。透析物を多数のアリコートに分け、-70℃で貯蔵した。工程2−イオン交換クロマトグラフィ Mono Q 10／10カラムとFPLCシステム（FPLC system,Pharmacia LKB Biotechno logy）とにより、30〜50％硫酸アンモニウム分画（タンパク質200mg）の一部のクロマトグラフィを行った。カラムの操作は図5の説明の記載通りに行った。 NaClの0.3と0.4Mとの間で溶出する分画に、トランススフェラーゼ活性の主要部分が含まれていた。このようにして得た分画をプールし、多数のアリコートに分割して、-70℃で貯蔵した。工程3−アフィニテイクロマトグラフィ次のようにしてp21^K-rasBタンパク質のCOOH末端アミノ酸6個に一致するペプチドを含むカラムを調製した。ペプチドTKCVIM （配列番号9）15mgを、メーカーの指示にしたがって活性化CH-セファロース4B（Pharmacia LKB Biotechnology）1gと結合して、スラリー2.5mlを形成した。このスラリーをカラムに入れ、結合しない余剰のペプチドは、0.1M酢酸ナトリウム（pH 4.0）と0.1Mトリス塩酸緩衝液（ pH 8.0）それぞれ40カラム容量づつを用いて交互に10回繰り返し洗って取り除いた。緩衝液には両方ともNaCl 1MとDTT 10mMを含有させた。カラムは20mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.2）とアジ化ナトリウム0.02％中に4℃で貯蔵した。カラムにペプチド1mlを入れ、NaCl 0.1MとDTT 1mMを含む50mMトリス-塩酸緩衝液（pH 7.5）（緩衝液A）で平衡化した後、10ml中にMono Q精製物を15mgを含む溶液（Fifteen mg of Mono Q-purified material in 10ml）を入れた。酵素含有溶液を室温でカラム内を三回循環させた。カラムをオクチル-β-D-グルコピラノシド2％（w／v ）を含む緩衝液A（緩衝液B）20mlで洗った。DTT 1mM、NaCl 0.1Mおよびオクチル -β-D-グルコピラノシド0.2%を含む50mMトリス-スクシネート（pH5.0）20mlで酵素を溶出させた。このpH5の溶出液をCF25 Centriflo限外濾過コーン（Amicon）中で、10倍の過剰緩衝液Bを用いて二回濃縮洗浄して、1mlとした（出発原料の10 倍濃縮）。工程4−ゲル濾過図7の説明の記載通りに、スーパーロース12（Superose 12）カラムを用いてアフィニテイ精製ファルネシルトランスフェラーゼ（〜1μg）のクロマトグラフィを行った。図1〜4、8および9の酵素特性評価実験では、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの部分精製分画を使用した。この酵素を上記の工程1および2で調製した後、Mono Q精製物 6mgを2mlに濃縮して、1.6×50-cmセファクリルS-200高分解能ゲル濾過カラム（a 1.6×50-cm Sephacrl S-200 high resolution gel filt ration column）（Pharmacia LKB Biotechnology）に充填した。DTT 1mM、NaCl0 .2M、ZnCl₂ 20μMおよびオクチル-β-D-グルコピラノシド0.2％を含む50mMトリス-塩酸緩衝液（pH 7.5）で平衡化して、同じ緩衝液を流速15ml／hourで用いて溶出させた。実験には、タンパク質含量1mg、初度活性40%のピーク分画のみを使用した。4．［³H］FPPから移行した³H-イソプレノイドの同定 Casey et al. （Casey et al.,1989）の方法の変法を次のように実施した。簡単に言うと、標準トランスフェラーゼ25μlづつを用いて37℃で二つの反応を1 時間実施した。混合液をプールし、プールしたサンプル50μlからアリコート25 μlを取り、これを2%（w／v）SDSで250μlに希釈した。この混合液を同量の30%T CA中に沈澱させ、ニトロセルロース（デイスク7mm）で濾過、6%TCA／2%SDSで二回洗い、続いて5%TCAで五回洗った後、トリプシン8μgで消化して、ヨウ化メチルで分割した。放出された³H-イソプレノイドをクロロホルム／メタノール中に抽出して、図4の説明の記載通りに逆相HPLC装置でクロマトグラフィを行った。5．その他の方法 Laemmli（Laemmli,1970）の記述にしたがって、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。ゲルは広範囲SDS-PAGE標準液（Bio-RAd）で校正した。抽出液のタンパク質含量は、アフィニテイ精製物のそれを除きLowry,et al.（Lowrye t al.,1951）の方法で測定した。アフィニテイ精製物のタンパク質含量は、SDS ゲル電気泳動とクーマシー染色を行った後、ウシ血清アルブミンマーカー（M_r66 ,000）と比較推定した。6．成績および考察当初、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ酵素を同定する目的で、ラットの脳シトゾルを硫酸アンモニウムで分画し、Mono Qカラムを用いて活性分画のイオン交換クロマトグラフィを行った後、セファクリルS-200（Sephacryl S -200）によりゲル濾過を実施した。図1は、このカラムの活性分画は時間依存性を持ちながら、37℃で［³H］ファルネソールからトリクロロ酢酸沈澱性のp21^H-r ^as に放射能を取り込んだことを示している。取り込まれた放射能は、SDSポリアクリルアミドゲル（差込み図）上で予想された通り分子量〜21kDaのバンドとして目視することができた。最大速度の50%を示す［³H］ファルネシルピロリン酸濃度は約0.5μMであった（図2A）。また、p21^H-rasの最大速度50%の濃度は約5μ Mであって、p21^H-rasを加水分解できないGTPまたはATPの類縁体、あるいはGDPによって平衡化した場合も、同様の結果を得た（図2B）。 p21^H-rasを基質とした場合、EDTA 0.15mMでトランスフェラーゼ活性が阻害されたが、この阻害は濃度0.1〜1.0mMの塩化亜鉛または塩化マグネシウムで逆転した（図3）。塩化亜鉛の濃度を高くすると、阻害が起こるのが観察された。移行した物質が［³H］ファルネソールであったことを確認するため、トリクロロ酢酸に沈澱した物質を洗ってトリプシンで消化し、放射能をヨウ化メチルで放出し、生成物の逆相HPLCを行った。ヨウ化メチルが放出した物質は、全transファルネソール（C₁₅）の真正な標準液と共に移動するのが認められた（図4A）。若干の放射能がゲラニオール（C₁₀）標準液前にカラムから出るのが認められたが、これはヨウ化メチル処理をする場合でも、しない場合でも同様であった。溶出が早すぎた物質は、放射能がヨウ化メチルでは放出されないトリプシンペプチドの一部であると信ぜられた。図5は、Mono Qカラムから溶出したファルネシルトランスフェラーゼ活性の溶出プロフィルである。この活性は塩化ナトリウム0.35Mで溶出したもので、単個の急なピークとして観察された。 Mono Qカラムから溶出したピーク分画をプールした。さらに、p21^K-rasBのカルボキシル末端アミノ酸6個に一致する共有結合ペプチドをカラムに入れたものを用いて、プールしたピーク分画のアフィニテイクロマトグラフィを実施した。ファルネシルトランスフェラーゼ活性はすべてカラムに吸収されたが、pH 5.0のトリス-スクシネートでカラムから溶出させると当初の活性の50%が回復した。表IIはラットの脳50個を出発原料とする模式的精製工程の結果を要約したものである。硫酸アンモニウムによる沈澱、Mono Q クロマトグラフィおよびアッフィニテイクロマトグラフィ後では、ファルネシルトランスフェラーゼは61,000倍に精製され、その収率は52%であった。最終比活性は約600,000単位／mgであった。図6Aは、銀染色で目視した精製各段階におけるタンパク質のSDSゲル電気泳動プロフィルを示している。ペプチドのアフィニテイカラムから、見かけ分子量50 ,0 00のサブユニットの単個のタンパク質バンドを得た。感受性が高い条件で精製酵素のSDSゲル電気泳動を行うと、50kDaのタンパク質が分割して、目視ができる二つの近接した、ほぼ等モル量のバンドとなった（図6B）。 50kDaバンドがファルネシルトランスフェラーゼ酵素であることを確認するため、アフィニテイカラム精製物質をゲル濾過した。図7は、既知の分子量を持つマーカーの挙動から判断して見かけ分子量70〜100kDaに一致するこのカラムの位置から、ファネシルトランスフェラーゼ活性と50kDaバンドとが、一緒に溶出したことを示している。ファルネシルトランスフェラーゼがペプチドアフィニテイカラムに付着することから、この酵素が短い配列を認識できるのではないかと考えられた。このペプチド認識の特異性を試験するため、各種のペプチドがp21^H-rasとファルネシルトランスフェラーゼ活性を競合する性能を測定した。そこで、p21^K-rasBのカルボキシル末端アミノ酸6個（TKCVIM、配列番号9）に一致するペプチドを用いてアフィニテイクロマトグラフィを行った。予想通り、このペプチドはp21^H-rasを競合阻害した（図8の白丸）。競合にはこの末端配列の中アミノ酸4個（CVIM、配列番号10）（黒丸）で充分であった。これら2個の短いペプチドの効果は、この配列最後の10個のアミノ酸を含むペプチド（KKSKTCVIM、配列番号11）に劣らなっかった。ヘクサペプチド（TKVCIM、配列番号9）のCOOH末端で、システインを第3の位置から第4の位置に転位させただけで、阻害活性は大幅に低下した（黒三角）。無関係なペプチド（an irrelevant peptide）は阻害しなかった（黒四角）。図9は、アミノ酸10個からなり、COOH末端から第4の位置にシテインを持つペプチド4個それぞれの阻害活性を比較したものである。ヒトのp21^K-rasBCOOH末端に一致するペプチドおよびヒトのラミンAとラミンB（human lamin A and lamin B ）はすべて、ファルネシル化を阻害した。これらのペプチドはすべて生体内でプレニル化（prenylated）することで知られている（Casey et al.,1989、Farnswor th et al.,1989）。他方、ラットGiαl配列に一致するペプチドは、生体内でファルネシル化することが観察されない40kDaのペプチドであるが、これはファルネシルトランスフェラーゼ反応で競合をしなかった。説明を省略したデータでは、p21^H-ras（CVLS、配列番号19）、p21^N-ras（CVVM 、配列番号18）、およびp21^H-rasA（CIIM、配列番号17）のCOOH末端に一致する、アミノ酸10個のペプチドはすべて、ファルネシル化反応を競合した。実施例 II ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの特性評価その二本実施例においては、一連のテトラペプチドがファルネシル移行をp21^H-rasと競合する性能を検定して、これらのテトラペプチドの、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼをラット脳のp21^H-rasに結合させる性能を推定した。最高の親和力を持つペプチドの構造はCys-A1-A2-Xであって、式中A1とA2は脂肪族アミノ酸であり、XはC-末端メチオニン、セリンまたはフェニルアラニンであった。負荷された残基がA1の位置に置かれると親和力は僅かに低下したが（Charged residues reduced affinicty slight at the A1 position）、A2とXの位置だと低下が極端であった。効果的な阻害剤として、ファルネシル化することで知られている、すべての動物細胞タンパク質のCOOH末端に一致するテトラペプチドが挙げられる。対照的に、知られている唯一の例であるゲラニルゲラニル化タンパク質（中性Gタンパク質 γサブユニット）のCOOH末端に一致する、テトラペプチドCAIL（ｓｅｑid no：65）はファルネシル移行検定で競合することが認められず、これら2個のイソプレン類は相異なる酵素によって移行されることが示唆された。また、p2l^K-rasBのCOOH末端に一致するビオチン化ヘクサペプチドはファネシル化し、ペプチドの少なくとも一部はトランスフェラーゼの基質の役割を果たしていることが示唆された。これらのデータは、あるモデルが、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼには疎水性のポケットがあって、これがシステインおよび最後のアミノ酸2個と相互反応してテトラペプチドを認識するとしているのと一致している。1．材料と方法ａ．ペプチド類ペプチド類は確立された方法である固相合成法（Stewart et al.,1984）によって調製した。テトラペプチド類はFmoc化学（Fmoc chemistry）を用いるMillig en 9050合成装置によって合成した。最後の残基の脱保護後、樹脂の一部を用いてCVIMをN-アセチルで修飾したペプチドを調製した。これは装置とは別に、無水酢酸とジメチルホルムアミドのpH8（ジイソプロピルエチルアミンで調整）溶液中で行った。アセチル化および非アセチル化ペプチドは、トリフロロ酢酸：フェノール（95：5）にスカベンジャーとしてエタンジオール約1mlを加えた溶液50ml で分割した。tBoc化学（tBoc chemistry）を用いるApplied Biosystems Model 4 30合成装置によりCVIMのN-オクチル修飾ペプチドを合成した。オクチル基はオクタン酸を用いて、アミノ酸サイクル（cycle）に添加した。HF（mls）：樹脂（g ）：アニソール（ml）を比率10：1：1で用いて、0℃でペプチドを樹脂から分割した。これらのペプチド類をBeckman C18逆相カラム（21.1cm×15cm）に入れて、高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）を行い、トリフロロ酢酸0.1％（v／v）を含む水-アセトニトリル勾配により溶出することによりペプチド精製を実施した。これらすべてのペプチド類の素性を高速原子衝撃（FAB）質量分析により確認した。各ペプチドは使用直前、ジチオトレイトール（DTT）10mM中に濃度0.8mMとなるように溶解した。希釈はすべてDTT10mMで行った。ビオチン化KTSCVIM（配列番号53）をApplied Biosystems 430A合成装置で合成した。ビオチン基の添加は、N-末端保護基を除いた後で、ペプチドを樹脂から分離する前に行った。詳しくは、ビオチン4-ニトロフェニルエステルの4倍過剰モルを、ジメチルホルムアミド75mlに樹脂0.5gを溶解したpH8の溶液に加え、室温で5時間反応させた。分割、同定、および精製は上記で説明した通り実施した。 S-アセトアミドCVIM（配列番号10）を合成するため、精製CVIMをDTT15mMを含む0.5Mトリス-塩酸緩衝液0.1mlに溶解して、最終濃度を1mMとした。試験管に窒素を2分間流して密閉、37℃で2.5時間インキュベートしてシステイン残基を減らした後、ヨウ化アセトアミドと加えて最終濃度を35mMとした。37℃で15分間インキュベートし、DTT10mMを加えて反応を停止させた。FAB分光測定とHPLCによりCVIMが完全にアセチル化されていることを確認した。成生物の分子量は、予想していた S-アセトアミドCVIM分子質量と一致していた。ｂ．ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの定量標準定量法により、実施例Ｉで説明した全trans［³H］FPPから組替えヒトp21^H ^-ras への［³H］ファルネシル移行量を測定した。各反応混合液は次の濃度の成分を含有して、最終濃度を25μlとした。すなわち、トリス塩酸（pH7.5）50mM、Zn Cl₂ 50μM、KCl 30mM、DTT 1mM、p21^H-ras30または40μM、［³H］FPP（12〜23,0 00dpm／pmol）15mpol、部分精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ（Mono Q分画、実施例Ｉ参照）4〜7.5μg、および3μ1の10mMDTTに添加してある表示濃度の競合ペプチド。37℃で30〜60分間インキュベートした後、トリフロロ酢酸沈澱性のp21^H-ras中に存在している［³H］ファルネシルの量を、実施例Ｉで説明したフィルター検定法により測定した。酵素を含まないインキュベートを平行実施してブランク値（［³H］FPP投入値の＜0.6%）を測定して、「コントロール%値」の計算から減算した。ｃ．［³H］FPPからビオチン化KTSCVIMペプチドへの［³H］ファルネシルの移行この検定は、rasタンパク質類の主要素であるCys-AAX（配列番号12）を含有するペプチドはファルネシルトランスフェラーゼによるプレニル化の基質の役割を果たすことができる事実を利用するものである。p21^K-rasBの末端アミノ酸4個を含有するヘプタペプチドは、p21^H-rasに一致するCOOH末端ペプチドの20〜40倍の親和力ともっているので、このヘプタペプチドをモデル基質として選択した。また、ビオチン化ペプチドを基質として使用すると、反応生成物である［³H］ファルネシル化ペプチドをストレプタビジンアガロース（streptavidinagarose）のような固形支持体で捕促することができる。そうすれば、結合されている［³H］ファルネシル化ペプチドを洗い、取り込まれていない［³H］ FPPから分離して、シンチレーション計数をすることができる。ビオチン修飾KTSCVIM（配列番号53）は確立された方法である固相ペプチド合成法を用いるApplied Biosystems 430A合成装置により合成する。ビオチン基の添加は、リシン保護基を取り除いた後で、ペプチドを樹脂から分割する前に実施する。ビオチン化ペプチドの同一性と純度はアミノ酸定量分析および高速原子衝撃（FAB）質量分析で確認する。ビオチン化KTSCVIM（配列番号53）のアリコートは、DTT1mMとエタノール50%を含有する10mM酢酸ナトリウム（pH3）緩衝液0.6mlに溶解して、最終濃度を0.67mg ／mlまたは601μMとする。この溶液は4℃で少なくとも1ケ月は貯蔵することができる。使用直前、このペプチド溶液をDTT 1mMで希釈して、ペプチド濃度を18μM にする。標準反応混合液は次の成分を含有して、最終容量を25μlとする。すなわち、トリス-塩酸（pH7.5）50mM、ZnCl₂ 50μM、KCl 20mM、DTT 1mM、オクチル -β-グルコピラノシド0.2％（v／v）、［³H］FPP（15〜50、000dpm／pmol）10〜1 5pmol、ビオチン化KTSCVIM（配列番号53）3.6μMおよび酵素2〜4単位。これを0. 5mlのシリコン製マイクロフュージ（microfuge）試験管にいれ、37℃で30〜60分間インキュベートした後、ウシ血清アルブミン2mg／ml、SDS2%、およびNaCl 150 mMを含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）200μlを添加して反応を停止させる。ストレプタビジンアガロース（streptavidin-agarose）（Bethesda Research La boratories, Cat. No.5942SA）を良く混合して、そのアリコート25μlを取って添加し、混合物を室温で30分間緩やかに振盪して、［³H］ファルネシル化ペプチドがビーズに最大限結合するようにする。その後混合物をマイクロフュージ（microfuge）（12、500rpm）で1分間回転させてビーズを採取する。上澄み液を捨て、ウシ血清アルブミン2mg／ml、SDS 4% 、およびNaCl 150mMを含む20mMトリス-塩酸緩衝液（pH 7.5）0.5mlでビーズを3 回洗う。ペレットを同じ緩衝液50μlに再懸濁して、角度を付けて上端を切断した200 μlのピペッター（pipettor）を用いるシンチレーションバイアルに移す。試験管に残ったビーズは上記の緩衝液25μlで洗って採取し、ピペッターと共にバイアルに加える。酵素を含まずに平行してインキュベートを行い、ビーズに付着している放射能をブランク値とするが、これは［³H］FPP投入値の0.5%以下でなくてはならない。2．成績ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼとの親和力を尺度としてペプチドのスクリーニング実験を実施した。この実験ではペプチドがp21^H-rasと競合することにより、ラット脳の部分精製ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼを触媒として、［³H］FPPから［³H］ファルネシルを受け取る性能を試験した。ペプチド類の標準品としては、p21^K-rasBのCOOH末端配列に一致するテトラペプチドCVIM（配列番号10）を採用した。図10は一連の模式的実験を示すもので、これらの実験ではCVIM（配列番号10）のシステインに続く3つの位置おのおのをアラニン（パネルA）、リシン（パネルB）またはロイシン（パネルC）で組織的に置換した。実験の度毎に、成績をCVIMによる成績と比較した。アラニンとリシンは位置A1でのみ受け入れられた。これらのアミノ酸を位置A2またはXに挿入すると、50%阻害濃度から推定して酵素に対する親和力が30倍以上も低下した。ロイシンは位置A2で受け入れられたが、位置Xに挿入すると親和力が低下した。位置A2のイソロイシンをフェニルアラニンで置換すると、50%阻害濃度が25nM であることから推定して、酵素親和力が6倍向上した（図11）。フェニルアラニンを他の二つの位置のどちらに挿入しても、この効果は認められなかった。 p21^H-rasを基質として用いる検定の他に、p21^H-rasBのCOOH末端アミノ酸4個を含んでいるビオチン化ヘプタペプチド、すなわちKTSCVIMを基質とする検定も行った（Barbacid, 1987）。ビオチンを樹脂に付着しているペプチドに結合させて、このビオチンをNH₂-末端に付着させた。［³H］ファルネシル化成生物は、上記 c. 節で説明したように、ストレプタビジン（streptavidin）を塗膜したビーズに結合させることによって単離した。図12は、p21^H-rasか、ビオチン化ヘプタペプチドのどちらかを受容体として用いると、CVFM（配列番号34）はCVIM（配列番号10）よりも強力であることを示している（それぞれ、パネルAおよびB）。これまでの他の実験では部分精製酵素を使って行われたが、図12の実験ではアフィニテイで精製した、均質なファルネシル：タンパク質トランフェラーゼを使用して実施された。ヨウ化アセトアミドで誘導体を造ると阻害活性を喪失するとの所見から、テロラペプチドの阻害にはシステインを遊離スルフヒドリル基で置換することが必要である可能性が予想される（図13A）。また、N-アセチルCVIMとN-オクチルCVIM の阻害活性（図13B）がCVIM（図13A）のそれと較べて同様であることから分かるように、NH₂-末端を遮断する必要はない。図14は、CVIM配列を置換して行った競合検定すべての成績を要約したものである。成績は、阻害50%を達成するのに必要なペプチド濃度に換算して示している。表IIIは、タンパク質19個のCOOH端末に一致するテトラペプチド類を試験した実験結果を要約したものである。これらのテトラペプチドの多くはファルネシル化することで知れれており、これらの研究の意味するところを次の3章で考察する。 3. 考案本章のデータは、実施例Ｉで述べた、p21^rasに関連するファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの観察を補足するものである。さらに、これらのデータにより、この酵素の認識部位がCys-A1-A2-Xのアミノ酸4個に限られていることが示されている。これらの実験の標準配列としては、ペプチドCVIMが用いられた。このペプチドは濃度0.15μMで、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼ5 0%を阻害した。さらに、この枠内に各種のアミノ酸を置換導入して、0.025μM（ CVFM、配列番号34）〜50μM（図14）の濃度スペクトルで50%阻害を達成するペプチドを生成した。一般的に言って、位置A1およびA2に非極性脂肪族または芳香族アミノ酸を導入すると最も高い阻害活性が得られた。導入条件はA1よりもA2が厳しかった。位置 A1にリシンまたはグルタミン酸を含有するペプチドを導入すると、それぞれ0.7 および1.5μMで50%阻害が達成された。ところが、これら二つの残基を位置A2に導入すると、酵素との親和力が50倍以上低下した。グリシンとプロリンを位置A1 に導入すると阻害活性はやや低下し（50%阻害濃度が4および8μM）、位置A2ではより大幅に低下した（8および20μM）。位置Xの導入条件が最も厳しかった。CVIX（配列番号56）の組織ではメチオニンが好ましい残基であったが、しかしフェニルアラニンとセリンも受け入れられ、活性は僅かに低下したにすぎなかった（それぞれ0.5および1μM）。脂肪族残基とプロリンはこの位置ではまったく駄目で（disruptive）、50%阻害濃度は5〜 11μMであった。グルタミン酸、リシンおよびグリシンはまったく受け入れられなかった。これらの50%阻害濃度は40μM以上であった。既知のタンパク質COOH末端に一致するテトラペプチドを用いるの実験を行ったが（表III）、結果は概して、CVIM（配列番号10）を置換したペプチドによる結果と同調していた。しかしながら、この実験ではグルタミンとシステインが位置 X （CCVQおよびCIIC、配列番号21および22）に良く受け入れられたとの新しい情報を得ることができた。これらのペプチドはすべて、無傷の完全な細胞内（表III のアステリスクで示してある）でファルネシル化することで知られているが、上記で概略した法則に従って、すべて比較的低濃度でファルシネル化を阻害した（ 5μM以下）。ただし、CTVA（配列番号29）配列、すなわちR. toruloides（Akada et al.,1989）だけはそうではなかった。このペプチドは30μMと言う高い濃度でしか、ラット脳のファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの50%阻害を達成することができなかった。この真菌種のファルシネルタンパク質トランスフェラーゼは、ラット脳のとは異なる特異性をもっている可能性がある。ウシ脳のGタンパク質のCOOH末端γサブユニット（Gautam et al.,1989; Robis haw et al.,1989）に一致する、ペプチドCAIL（配列番号65）は、ファルネシル化をp21^H-rasと効果的に競合することはできなかった。これまでに試験してきた 50%阻止濃度のうちで、最高の濃度であった（100μM）。この阻害活性はCVIL（配列番号26、12μM）またはCAIM（配列番号14、0.15μM）より低かった。したがって、位置A1にアラニン、それに位置Xにロイシンを組み合わせることはどの単個の置換よりも有害である。ヒト脳（Yamane et al.,1990）とラットPC12細胞（ Mumby etal., 1990）のGタンパク質γサブユニットにはファルネシルではなくて、ゲラニルゲラニルが含まれていることが証明されている点から考えて、この所見は特に適切である。これらの所見から、CAIL（配列番号65）には別個のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、それに恐らくは他の関連配列が存在していることが示唆される。ビオチン化ヘプタペプチドの実験（図12B）では、短いペプチドの少なくとも一部が酵素基質の役割を果たしていることが確認されている。反応速度とp21^H-r ^as またはビオチン化ヘプタペプチドいずれかの濃度とを関連づける飽和曲線は複雑で、捉えどころがない（sigmoidal）。各種ペプチドの阻害曲線は、古典的な競合阻害曲線とは異なっている。最後に、実施例Ｉで述べているように、精製酵素の最大速度は比較的に遅い。これらの所見では、ペプチドと酵素の結合は単なる平衡反応ではなく、配座の変更が必要なために結合が遅くなる可能性があることを示唆している。位置A1がアミノ酸の特異性に寛容であることが観察されたが、これはこの位置の残基がファルネシルトランスフェラーゼと直接接触するのではなく、システインおよび位置A2とXの残基が接触していることを示唆するものである。あるファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの活性部位の研究モデルでは、ペプチド基質は広がりを持つ配座（an extended conformation）に存在し、この配座には酵素の大きな疎水性ポケットがあって、CAAX含有基質と相互作用をしている。実施例 III ラットのファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼαおよびβサブユニット cDNAの組替えクローン形成この実施例では、ラットのファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼのα およびβサブユニット両方に一致するcDNAの組替えクローン形成を取り扱う。使用した方法は、上記で詳細説明した、ペプチド配列の情報を応用してPCR配列決定に特異的なプライマーを調製する。その後、PCR配列を使用してcDNAライブラリーのスクリーニングを行うプローブを造る。本発明者らの研究所では、最近これらcDNAおのおののクローン形成を完成発表した（Chen et al., 1991）。1．方法ａ．一般方法下記で説明するクローニング反応については、Sambrook et al., （1989）の一般分子生物法を実施した。cDNAクローンはバクテリオファージM13またはプラスミドpUCベクターにサブクローンし、一般的な配列決定プライマーまたは特異的固有の遺伝子プライマーを使用してチェインターミネーター法（Sanger et al ., 1977）により配列決定を行った。配列決定反応は、好ましくはApplied Biosystems Mod el 370A DNA アミノ酸配列決定装置上で、T7 DNAポリメラーゼ（Tabor et al.,1 987）と³⁵Pで標識されたヌクレオチドとの組合せ、またはTaqポリメラーゼと蛍光標識をつけたヌクレオチドとの組合せを用いて実施する。ラット組織から全細胞RNA（total cellular RNA）を単離するためには、チオシアン酸グアニジニウム（guanidinium thiocycanate）／CsCl遠心分離法を好ましく用いた。その反面、RNAを細胞系から単離するには、グアニジニウムHCl法が好ましかった（Chirgwin et al.,1979）。また、ポリA⁺RNAは、Sambrook et al. ,（1989）およびAviv et al., （1972）の方法を用いて、オリゴ（dT）-セルロースクロマトグラフィによって単離した。³²Pで標識した一重鎖プローブを使用するノーザンブロットハイブリダイゼーション法は、Lehrman et al., （1987）の記述に従って実施した。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ用のc DNAプローブはKarl Normington（University of Texas Southwestern Medical C enter at Dallas）から入手した。ファルネシルトランスフェラーゼのαまたはβサブユニットのどちらにも特異的なポリクロナール抗血清は、各サブユニットから誘導した合成ペプチドによりウサギを免疫して調製した。抗体Y533は、αサブユニットのcDNAクローンの予想アミノ酸配列から誘導した、配列LQSKHSRESDIPASV（配列番号67）を持つ合成ペプチドに対して産生させた。抗体X287は、βサブユニットのトリプシン消化から誘導した合成ペプチドIQATTHFLQKPVPGFEE（配列番号68）を用いて産生させた。各ペプチドは、マレイミド安息香酸N-ヒドロスクシンイミドエステル（maleimid obenzoic acid N-hydrosuccinimide）（Sigma Chemical Co.）を用いてKeyhole limpetヘモシアニンに結合させた（Harlow & Lane, 1988）。各抗体ごとに、ニュージーランド白ウサギ3匹づつ結合ペプチド600μgをフロイントアジュバントに溶解したもので免疫した。（Seabra et al., 1991; Chen et al., 1991）の記述に従ってイムノブロット法を実施した。ラットPC12褐色細胞腫細胞、ラットKNRK細胞（CRL1569）およびヒト胚腎臓293 細胞をそれぞれThomas Sudhof（University of Texas Southwestern Medical Ce nter at Dallas）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（the Americ an Type Culture Collection）およびArnold J. Berk（University of Californ ia, Los Angeles）から入手した。ｂ．PCRおよびプローブの合成適当なプローブを造るてめの配列を誘導するためには、Saiki et al., （1988 ）およびLee at al., （1988）が述べているように、ラットゲノムDNAをPCR用テンプレートに使うことができる。本発明では、ペプチド配列を考慮して、適当な PCRプライマー使用することにより、αまたはβサブユニット遺伝子の一部分の配列決定を行った（表Ｉに示す）。その後、PCRを使って、ラットのファルネシルトランスフェラーゼの精製αまたはβサブユニットのいずれかから誘導した、トリプシンペプチドをコードするラットのゲノムDNAを得た（図16）。αおよび βサブユニットのPCRプライマーは、図16に示すペプチドのNH₂-とCOOH-末端配列に基づいて合成し、このプライマーには表示してある縮重（degenerate）イノシンコドンを含有させた（図16）。PCRプライマーには、［γ-³²P］ATPにより末端標識をつけた。増幅したDNAフラグメントはおのおの12%アクリルアミドゲルから溶出し、マクサム−ギルバート法（Maxam et al., 1980）により配列決定を行った。二つのプライマーの間のヌクレオチド配列の翻訳により、表示してあるペプチドと同一のアミノ酸配列を持つペプチドが生成された。 PCR生成物のDNA配列を用いて、ペプチドに一致する領域とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブを合成し、ライブラリーの直接スクリーニングに使用した。αサブユニットのプローブとしては、ヌクレオチド配列5'-ATIGAGTTA AACGCAGCCAACTATACGGTCTGGCACTT-3'を持つ38-員（38-mer）のプローブ（配列番号 64の残基6〜54による特異的な例）を合成した。また、βサブユニットにはプライマーβ3およびプライマーβ4と呼ぶ二つのプライマーであって、それぞれヌクレオチド配列5'-GCGTACTGTGCGGCCTC-3'（配列番号62の残基1〜17）と、5'-GGCCT CAGTAGCCTCTCTCACCAAC-3'（配列番号62の残基12〜36）を持つものを合成した。 βサブユニットのプライマーは、Frohman et al., （1988）が記述しているように、DNAの3'-末端の増幅に使用した。ラットのKNRK細胞ポリ（A）⁺RNAは、（d T）₁₇-アダプター5'-GACTCGAGTCGACATCGA（T）₁₇-3'（配列番号69）を用いて逆転写した。ポリ（A）⁺RNA 4μg、（dT）₁₇-アダプター 2.5μg、およびマロニー（Moloney）ネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（Bethesda Research Laboratorie s） 100単位を含む反応混合液50μlを37℃で1時間インキュベートした。逆転写したcDNAは、pH8.0の10mMトリス-塩酸緩衝液、EDTA 1mMで50倍に希釈し、次のようにして特異的なPCR増幅を行った。すなわち、希釈cDNA 10μl、アダプタープライマー（5'-GACTCGAGTCGACATCG-3'）25pmol、配列番号69の残基1〜17およびプライマー3 25pmolを沸騰した後、TaqIポリメラーゼと共にPCRを40サイクル実施した（95℃で40秒と、58℃で1分と72℃で3分）。増幅したPCR生成物はアガロースゲルで電気泳動を行い、ナイロン膜に移して³²Pで標識したプライマー4でプローブした。ハイブリッド形成するDNAフラグメントを溶出し、フェノール／クロロホルムで抽出して、第二のPCR反応のテンプレートとして使用した。アダプタープライマーとプライマー4それぞれ25pmolづつを用い、上記と同じ増幅プロトコルにより反応を実施した。再増幅したDNAフラグメントをゲルで精製し、RsaI またはTaqIで分割して、M13ベクターにサブクローンして、DNA配列決定と、その後の一重鎖M13プローブの形成とに使用した。このM13プローブをプローブBと名付けた。PCRで誘導したクローンのDNA配列は、50-員のオリゴヌクレオチドプローブの形成に使用した。このプローブをプローブAと名付けた。その後、全長の βサブユニットcDNAを得る目的で、プローブAおよびBをcDNAライブラリーのスクリーニングに使用した（下記の βサブユニットの章を参照）。ｃ．cDNAライブラリーおよびクローン形成 Invitrogenから供給されたcDNA合成キットを用いて、バクテイリオファージλ gt10内に、ラットのPC12細胞ポリ（A⁺）RNAとオリゴ（dT）で開始したKNRK細胞の二重鎖cDNAとのライブラリーを構築した。これらの細胞は、ファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼmRNAに富んでいる点で好ましかった。cDNAライブラリーの構築方法は沢山あるが、Invitrogen社の上記キット特に便利な方法であるので、本発明ではこれを使用した。cDNAそのものは、オリゴ（dT）で開始したcD NAと、ランダムにヘクサマー（hexamer）で開始したcDNAの両方を用いて調製して、適当なリンカーと結合したが、この場合好ましいプライマーはEcoR1／Not1 であった。1kbより大きなcDNAを、1%アガロースゲルを用いて、サイズにより分画し、EcoR1で分割したλgt10 DNA（Stratagene）に結合して、ライブラリー作成用のcDNA含有ベクターの組立を完了した。生体内でDNAパッケージ（packaging ）抽出物によって組替えλファージのパッケージ（packaging）後、ファージを宿主種のE. coli C600 hfl−細胞に塗布した。αサブユニットクローン形成ラット脳のライブラリー、約1×10⁶プラークをスクリーニングした。複製フィルター（duplicate filters）を6×SSC（1×SSC=pH7.0の塩化ナトリウム150mM／酢酸ナトリウム15mM）中で、³²Pで標識したプローブ1×10⁶cpm／ml （上記参照）とハイブリッド形成をさせた。1.4kbの挿入断片を持つ正のクローン、すなわちλRB-7を同定して、プラークで精製した。プレートライゼートからファージDN Aを取り、バクテリオファージM13とpBluescriptベクターにサブクローンして、D NA制限地図を作成し、配列決定を行った（Sanger et al., 1980）。最初に得たクローンが全長ではなかったので、完全な配列を得る目的で、Ref. 34の記載の通り、5'-末端の増幅を行った。先ず、λRB-17の5'-末端に一致するM 13プローブを用いて、KNRK細胞ライブラリーをスクリーンした。複製フィルターを、プローブ1×10⁶cpm／mlを含むホルムアミド50%（v／v）中でハイブリッド形成させた。正のクローンをPCRで分析して、最も大きな挿入断片持つクローン（ λKNRK-3）を精製して、分析のためサブクローンした。cDNA末端の5'高速増幅法（5' Rapid Amplification of cDNA End Procdure （5'RACE）（34））を用いて λKNRK-3の5'末端を拡張した。増幅生成物（RACE-5'）から誘導したM13プローブを用いて、ラットのこう丸ライブラリー（Clontechから購入）をスクリーンし、ヌクレオチドの位置53まで拡張したλRTHを得た。 cDNAの最も遠い5'末端を得るため、ラットこう丸のポリ（A）⁺RNAからプライマー拡張λgt10ライブラリーを構築した。マロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素を用い、RAGE-5'の5'末端に近い配列に一致するオリゴヌクレオチドにより第一の鎖の合成を開始した。37℃で1時間インキュベートした後、反応を70℃で5 分間加熱した。そこで、熱安定性rTth逆転写酵素（Perkin-Elmer）5単位を加え、さらに反応を70℃で30分間続けた。第二の鎖を合成後、cDNAをEcoRI／NotIリンカーに結合した。過剰のリンカーは、Centricon 100 微量濃縮装置（Microcon centrator）（Amicon）により取り除いた。λRTHの配列からヌクレオチド54〜10 4を取り、これに一致する³²Pで標識したプローブで、約5×10⁵のプラークをスクリーンした。正のクローン25個が同定された。ファージDNAをプレートライゼートから調製し、最も長いクローンの一つの挿入断片、すなわちλPE-7をサブクローンして、配列決定した（Sanger et al., 1980）。βサブユニットクローン形成約5×10⁵のプラークを複製フィルターに移入した。フィルター１個をホルムアミド10%（v／v）中で、³²Pで標識した50-員オリゴヌクレオチド（プローブ A、上記の通り）1×10⁶cpm／mlとハイブリッド形成させた。フィルターもう1個をホルムアミド50%中で、一重鎖M13プローブ（プローブ B、上記の通り）1×10⁶cpm／mlとハイブリッド形成させた。〜2.3kbの挿入断片を持つ正のクローン1個（λdT-7）を両方のプローブで同定し、プラークで精製した。λdT-7のプレートライゼートからファージDNAを単離して、M13およびpUC ベクターにサブクローンし、配列決定して制限地図を作成した。 cDNAの最も遠い5'末端を得るため、λdT-7の5'末端に一致するM13プローブを用いて、「5'-引き延ばし（5'-stretch））」cDNAライブラリー（Clontechから購入）をスクリーンした。複製フィルターを、このプローブ1×10⁶cpm／mlを含むホルムアミド50%中でハイブリッド形成させた。スクリーンした5×10⁵のプラークの中、正のクローン6個をプラークで精製し、NaCl 100mM、MgSO₄ 8mM、pH7. 5のトリス-HCL 50mMおよびゼラチン0.01%（w／v）を含む緩衝液0.2ml中にこれを溶出させた。独特のEcoR1のクローニング部位を回るλgt10配列の右腕あるいは左腕に一致するプライマーと、ラットのタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼcDNA（λdt-7）とを併用して、PCR反応を実施した。PCR生成物はアガロースゲルで分析し、最も長く拡張されたクローン（λRB-23）はサブクローンして、さらに分析した。ｄ．発現ベクターヒトのサイトメガロウイルスのごく初期の大きな遺伝子（major immediately early gene））の、プロモーター・エンハンサー領域を含むプラスミドであるpC MV5中に、ラットのファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットの発現ベクターを構築した（Anderson et al., 1989）。5'-非翻訳領域と全コード領域の塩基対20個を含むPvuIIフラグメントをクローンλRTH-Bから切除し、SmaIが消化したpCMV5と両配向で結合した。位置37〜42のPvuII部位の上流であるヌクレオチドの位置39の5'-非翻訳領域においてイントロンが存在する点を除き、プラスミドλRTH-BはλRTHと同一である。このようにして得たプラスミドをpFT-α（正しい配向）とpFT-αrev（逆の配向）と名付け、制限地図で特性評価を行った。 pCMV5中に、ラットのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットの発現ベクターを構築した（Anderson et al., 1989）。ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニット全5'-非翻訳領域とcDNAのコード領域を含む、EcoR1フラグメントをクローンλRB-23から切除し、EcoR1が消化したpCMV5と両配向で結合した。このようにして得たプラスミドをpFT-β（正しい配向）とpFT-βrev（逆の配向）と名付け、制限地図で特性評価を行った。ｅ．DNAの移入ヒト胚腎臓293細胞を37℃で、培地A（ダルベッコ改良型イーグル培地にウシ胎児血清10%（v／v）、ペニシリン100単位／ml、およびストレプトマイシン100μg ／mlを加えたもの）で単層増殖を行った。0日、6×10⁵細胞／100-mmペトリ皿を培地Aに接種した。1日、細胞を入れた各皿に、表示のプラスミド3μgとpVA（アデノウイルスVA RNA_Iをコードするプラスミド、Akusja et al., 1987 ）1μgとを硫酸カルシウム法（Sambrook et al., 1989）により移入した。2日、新しい培地Aを加えた。4日、ペトリ皿2枚から細胞の採取を行い、プールした。pH7.5のトリス−HCl 50mM、ZnCl₂ 50μM、MgCl₂ 3mM、KCl 20mM、ジチオトレイトール1mM 、およびオクチル-β-グルコピラノシド0.4%（w／v）を含む緩衝液0.4ml中で、2 5-ゲージ針により吸気を繰り返して細胞を分割した。4℃で1時間100、000×gの遠心分離を行ってシトゾル抽出液を得、その上澄み液分画0.16〜5.4μgを使用して、［³H］ファルネシルピロリン酸からp21^H-rasタンパク質への［³H］ファルネシル移行量を測定して、ファルネシルトランスフェラーザ活性を検定した。2．成績ａ．αサブユニットクローン形成と配列分析ファルネシルトランスフェラーゼαサブユニットから誘導された、トリペプシンペプチドの5'-と3'-末端をコードする縮重オリゴヌクレオチドプローブを、ラットゲノムDNAのPCRのプライマーとして使用した（図16A）。増幅された生成物をプローブとして使用し、ランダムにヘクサヌクレオチドによって開始され、λ gt 10にクローンされている、ラット脳のcDNAライブラリーをスクリーンした。この方法により、ポリA領域からヌクレオチドの位置345（この位置は配列番号12のように、mRNAの最後の配列を意味する）まで広がったλRB-17を得た。 αサブユニットをコードするmRNAの5'-末端には、極端にGC塩基対に富む配列が含まれていた（ヌクレオチド71〜205のGCの76%、さらにヌクレオチド116〜145 のGCの90%）。逆転写酵素を用いてプライマーを拡張してこの領域を横切ろうと幾度も試みたが、終結が早すぎたり、接合していないイントロンをコードする生成物ばかりが形成された。したがって、mRNAの5'-末端を得るために他の戦略を取ることとなった（詳細は上記方法の章参照）。これまでに得たcDNA配列の複合体を使用して、mRNAの配列全体（配列番号2）を造った。このmRNAはアミノ酸377個からなるタンパク質（配列番号1）をコードし、分子量計算値は44053であった。cDNA配列は第一のメチオニンコドンの上流には終結コドンを含有していなかったが、このメチオニンが真の開始コドンであったと信ぜられる。移入実験において、形成された組替えタンパク質の分子量がイムノブロット法では、ラット脳の精製αサブユニットの分子量と区別がつかなかったことからも（下記参照、図20）、この見方が裏打ちされている。もしcDNAが不完全であったとするならば、イニシエーターとしてのメチオニンは得られた配列の5' 末端の上流にあり、したがってこのcDNAによって産生されたタンパク質は、真のタンパク質よりも少なくとも2kDa小さくなくてはならない。このような違いはゲル電気泳動で検出されていた筈である。 αサブユニットcDNAの最も注目すべき特徴は、NH₂-末端近くに連続している9 個のプロリン残基が糸のようにつながっていることであり（配列番号2中で）、これらのプロリンのコドンによって、この領域が極端にGCに富んでいることの多くを説明することができると判断された。このmRNAは、精製αサブユニットをトリプシンで消化した後に得られる、ペプチドの配列に一致する配列を含んでいた。微量のタンパク質の配列決定をするために、一時的に使用した位置だけに食い違いが発生した（表Ｉ参照）。ラットのαサブユニットのアミノ酸配列と、He et al .（1991）が配列を報告した酵母RAM2との間に僅かながら相同が認められた。酵母RAM2配列の残基と同一である、αサブユニットアミノ酸配列の残基を図17で箱枠に入れて示している。最近、Kohl et al.が、ウシのファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットに一致する部分cDNAクローンのクローン形成を報告している（Kohl et al., 1991）。このクローンでコードされる329個のアミノ酸は、ラットのファルネシルトランフェラーゼαサブユニットの対応領域と95%同一である。ラットのファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニット（アミノ酸377個）と、He et al. （1991）が発表した酵母RAM2遺伝子生成物（アミノ酸316個）とを比較すると、二つのタンパク質はCOOH末端残基211個のうち39%が同一であり、酵母ではRAM2が、哺乳動物のファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットに当たることを示唆している。ｂ．βサブユニットのクローン形成と分析ラットのゲノムDNAと、ラット脳の精製酵素から得られるトリプシンペプチドをコードする予想（potential）配列に一致する縮重オリゴヌクレオチドプライマー（プライマーβ1およびプライマーβ2、それぞれ配列番号60および61）とのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ラットのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットの一部をコードする独特なDNA配列を得た（図16B）。増幅生成物の配列に基づいて、二つの独特なプライマー（プライマーβ3およびβ4、それぞれ配列番号62の残基1〜17および12〜36）を合成した（図16B）。これらのプライマーを3'末端増幅戦略（Frohman et al., 1988）に用いて、培養したラットの腎臓細胞（KNRK細胞）から単離したmRNAによりcDNAを調製し、これから増幅フラグメントを得た。このフラグメントを使って、ラットの褐色細胞腫PC12細胞で組み立てたcDNAライブラリーから、ほどんと全長に近いcDNA（λdt-7）を含むバクテリオファージを同定するプローブを調製した。最後に、λdt-7の5'末端のフラグメントを用いて、ラット脳のcDNAライブラリー（配列番号4）から、全長のファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットcDNA（λRB-23）を含有するクローンを同定した。ラット脳のファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットのcDNAは、5'-非翻訳領域では塩基対59個、そのすぐ後のタンパク質コード領域では塩基対1314個、そして3'-非翻訳領域では塩基対1091個を含有している（配列番号4）。また、 cDNAはアミノ酸437個からなるタンパク質（配列番号3）をコードし、ラット脳のファルネシルトランスフェラーゼの精製βサブユニットを、トリプシンで消化して得られるペプチドの配列に一致する配列を含んでいる。タンパク質とcDNAの配列間でいくらかの細かい食い違いがあることは確かであるが、これらの食い違いはペプチドのCOOH末端近くで起こっていて、存在する微量ペプチドの配列決定に曖昧さがあることが原因であった（表Ｉ参照）。 cDNAクローンは第一のメチオニン（配列番号3のアミノ酸1）の上流に枠内ターミネーターコドンを内蔵していなかった。このメチオニンは、Kozakの法則（Koz ak, 1984）による開始によい場所に存在しており、またcDNAは動物細胞内に移入するとβサブユニットと同じ大きさのタンパク質をコードするので（下記参照）、これがイニシエーターであるメチオニンであると思われる。λdt-7はオリゴ-d tが開始したcDNAライブラリーから得たものであったが、このクローンはポリAの領域を含んでいなかったし、またコンセンサス（consensus）ポリアデニル化配列も含有していなかった。しかしながら、RNAブロット法ハイブリッド形成実験および発現実験（下記参照）では、このクローンは全長であることが示唆された。ラット脳のファルネシルトランスフェラーゼのβサブユンットの分子量計算値は、48、679であった。アミノ酸組成は特に注目すべき特徴を示さなかった。等電点は5.99であった。疎水性をプロットして分析したが、大きな疎水配列を認めなかった。 GenBankおよびEMBLデータバンクのサーチの結果、二つのタンパク質が著しく似ていること、Saccharomyces cerevisiae酵母のタンパク質がDPR1-RAM1であること、および酵母には機能は同定されていないが読み枠が働いていることが分かった（ORF2）。βサブユニットと酵母のDPR1-RAM1遺伝子成生物とには、明かに広く同一性が存在していることは明かであった（図18）。これら二つのタンパク質全般にわたって配列が同じである（全体の37%）が、両末端では同一性は低下し、酵母タンパク質はアミノ酸6個短くなっている。酵母DPR1-RAM1配列の残基と同一であるβサブユニットアミノ酸配列（配列番号3）の残基を図18の箱枠に入れて示す。 Kohl et al. （1991）の校正刷り論文の注釈では、ウシのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットのクローン形成に成功したこと、およびこのクローンはラットのβサブユニットと96%相同であることが述べられていた。しかしながら、kohl et al.（1991）はβサブユニットと一致する実際の配列は開示しなかった。ｃ．ノーザンブロット法分析 αサブユニットcDNAから誘導し、³²Pで標識したプローブを用いノーザンブロット法によりRNAを分析した結果では、単個の〜1.75kbのmRNAが、肺、心臓、腎臓、脳、副腎、こう丸を始めとする多数の組織に存在していることが認められた（図19A）。こう丸のmRNA含量は他の組織の数倍大きかったが、このことは他の組織間でも数回繰り返して観察された。これと同じ大きさのmRNAが、腎臓（KNRK 細胞）と副腎髄質（PC12細胞）から誘導したラットの培養細胞系のうち二つの系に認められた（図19B）。 βサブユニットcDNAから誘導し、³²Pで標識したプローブを用いノーザンブロット法によりRNAを分析した結果では、検査した組織の中、肝臓と脾臓を除くすべてのラットの組織に、〜2.5kbのハイブリッドを形成するmRNAが存在するのを認めた（図19C）。mRNAの適当量をこれらの組織から採取して、これによる濾過法を実施し、結果をシクロフィリン（cyclophilin）とグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼのコントロールプローブとのハイブリッド形成を行って確認した。脳及び副腎は、他の組織よりやや多量のファルネシルトランスフェラーゼβ サブユニットのmRNAを含有していることが観察された。さらに、定量分析を行って図19Cの偏差が有意であるか、否かの判定をする必要がある。ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットのmRNAは、cDNA配列を持つ二つのラットの培養細胞系にも認められた（図19D）。このうち、PC12細胞は2.5kb の遺伝情報を持ち、反面KNRK細胞には二つの遺伝情報があり、その中の一つは2. 5kbのmRNAよりも小さかった（図19D）。小さい遺伝情報がβサブユニットプローブと雑種形成した別の遺伝子生成物であるのか、あるいはこのmRNAが対立遺伝子の遺伝情報を加工する別のプロセスであるのかを判定することはできなかった。ｄ．同時発現と安定性哺乳動物のpCMV発現ベクター中で、αおよびβサブユニット両方のcDNAコード領域のクローンを正しい配向と逆の配向で形成した。cDNAはリン酸カルシウムが介在する移入方法でヒトの腎臓293細胞に導入し、タンパク質はαおよびβサブユニットに特異性を持つ抗体を用いるイムノブロット法で検出した。いずれの場合もイムノブロット法では、ラット脳の精製ファルネシルトランスフェラーゼα およびβサブユニットと区別できない、分子量を持つタンパク質がcDNAによって発現された（図20）。 αサブユニットは、βサブユニットをコードしているcDNAが正しい配向で同時に移入されて初めて、検出し得る量になった（図20A）。同様に、βサブユニットも、正しい配向のαサブユニットcDNAが移入されると、検出量が増加した（図 20B）。さらにまた、p21^rasファルネシルトランスフェラーゼ活性の有意量をシトゾル抽出液で測定しようとする場合にも、これら二つのcDNAを正しい配向で移入することが必要であった（図21）。3．考察 αサブユニットのアミノ酸配列の輪郭は明らかになってきたが、その触媒としての役割はまだ正しく同定されていない。タンパク質のデータベースを相同性を対象としてサーチしたが、プロリンの長い糸を含むタンパク質を除いては、αサブユニットが他のタンパク質と有意の類似性を持つことを認めることはできなかった。プロリン含有タンパク質としては、ラットおよびヒトのプロテインホスファターゼ2Bの触媒性サブユニット、マウスの網膜牙腫関連タンパク質pp105、およびDictyostelium discoideumタンパク質チロシンキナーゼ-1などの、明かに関係がないタンパク質類を挙げることができる。また、αサブユニットの構造は、これまでに知られている哺乳動物のファルネシルピロリン酸シンセターゼまたは酵母ヘクサプレニルピロリン酸シンセターゼなどのプレニルトランスフェラーゼと有意の類似性を持っていない。これまでの資料では、αサブユニットは、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性を示す異なるβサブユニットを持つ、別のプレニルトランスフェラーゼによって共有されていることが示唆されている（Seabra et al., 1991）。αサブユニットが共有されていて、安定するために数個存在するβサブユニットの一つと錯体をつくるのだとすれば、細胞はβサブユニットすべてを満足させるに充分なαサブユニットを維持するだけで、毒性であるかも知れない過剰のαサブユニットは蓄積しないメカニズムである筈である（Chen et al., 1991）。さらにまた、上記のデータは、ラットのファルネシルトランスフェラーゼのα およびβサブユニットは、移入されたヒトの293細胞中で単独で発現する場合、ファルネシルトランスフェラーゼ活性を示さないことを明らかにしている。しかしながら、これら二つのサブユニットが同時発現（co-expression）すると、活性酵素が産生される。発現に関するこのようなデータは、ファルネシルトランスフェラーゼは、αおよびβサブユニット両方の触媒活性を必要とするヘテロダイマーであるとする前報の結論を裏書している（Chen et al., 1991）。さらに、移入実験の結果では、哺乳動物の細胞は、ファルネシルトランスフェラーゼのどちらのサブユニットでも、相手方のサブユニットが存在しないかぎり、高い水準の蓄積を行わないことを示している。このことは、βサブユニットの同時発現にほどんと完全に依存して蓄積する、αサブユニットに特に当てはまる。αサブユニットはβサブユニットが存在しないと急速に劣化する可能性がある。しかしながら、パルス-チェイス、標識づけ実験を行わないで、mRNAの安定または翻訳の面でのコントロールを廃止することはできない。ラットのβサブユニットと、従来から報告されている酵母のDPR1-RAM1遺伝子生成物の配列が類似している（Goodman et al., 1990）ことから、後者は哺乳動物のファルネシルトランスフェラーゼのペプチド結合サブユニットの、酵母における同等物であることが示唆されている。これらの所見は、酵母の遺伝子成生物はファルネシルトランスフェラーゼのサブユニットの一つをコードしているのではないかとの疑問が正しかったことを確認すると共に、このタンパク質がE.Coli 内で単独に発現する場合ファルネシルトランスフェラーゼ活性を示さない（Good man et al., 1988; Schafer et al., 1990）原因を説明している。さらに、RAM2と呼ぶ第二の座の変異体もまた、酵母のファルネシルトランスフェラーゼ活性を混乱させている（disrupt）（Goodman et al., 1990）。RAM2細胞のこの欠点はDPR1-RAM1変異体と交配することによって補正している。この所見は、RAM2遺伝子生成物が酵母のファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットであることを示唆している。He et al. （1991）のより最近の報告によると、E.Coli内でRAM1とRAM2とが同時発現すると、合成A因子基質をファルネシル化する抽出液が分泌された。しかしならが、別のクローンの抽出液を混合すると、ファルネシルトランスフェラーゼ活性のごく一部約3.5%が回復した。保存してあるラットのβサブユニットとDPR1-RAM1タンパク質の配列を調べても、ペプチド結合部位らしいものは何も明らかにすることはできない。ラットのタンパク質（残基35〜41）には、プレニルシンセターゼ4個の配列に似た配列LXD DXXE（配列番号70）が含まれている。このプレニルシンセターゼ4個のうち、Ile 、LeuまたはValの後に、プレニルピロリン酸結合部位であると信ぜられている配列XDDXXD（配列番号70の残基2〜7）が続いているのである（Ashby and Edwards, 1990）。この配列はDPR1-RAM1の同じ位置で見い出すことはできないし、このことがβサブユニットにおいてどのような意味をもっているかも定かではない。ファルネシルトランスフェラーゼ反応には2価のカチオン二つ（Mg⁺⁺およびZn⁺⁺）を必要とするが、βサブユニットには明かな金属結合部位が見あたらない。最近、本発明者らは精製酵素製剤を用いて、Zn²⁺とMg²⁺の触媒としての別の役割と、ラットのタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼのプレニルピロリン酸結合部位が持つ特異性を検討した。要約すると、化学の橋かけ法で測定すると、p21^H-rasと酵素の結合はEDTAを透析すると消失し、ZnCl₂を添加すると回復した。ゲル濾過法で測定すると、別の基質の全transファルネシルトランスフェラーゼの結合には、2価のカチオンと関係がなかった。酵素結合ファルネシル基を、結合しているp21^H-rasに移行させるためには、Mg²⁺が必要であった。ゲラニルゲラニルピロリン酸は、ファルネシルピロリン酸と同等の親和力でプレニルピロリン酸結合部位に結合したが、ゲラニルゲラニル基のp21^H-rasへの移行は能率的ではなかった。ゲラニルゲラニル基は、ラット脳のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの良き基質であると信ぜられているタンパク質であるロイシンを、COOH 末端で含有する修飾p21^H-rasには移行しなかった（Seabra et al., 1991）。本発明者らは、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼは、最も可能性が高い位置としてはペプチド結合部位にZn²⁺を含有する金属酵素であると結論している。そうであればこそ、カルボキシペプチダーゼAや、アンギオテンシン転換酵素などの、いくつかのメタロペプチダーゼとも類似するのである。これらの金属酵素をスクリーンするために、以前開発された戦略は、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼの阻害剤の探求にも役立つであろう。このようにして、これらのデータは、ラットの脳から採取したタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼの酵素学について、いくつかの新しい点を提起する。すなわち、1) 求める酵素は固く結合した2価のカチオン、最も可能性があるものとしてはZn²⁺を含有しているが、EDTAの透析によりこのカチオンを取り除くことができる、2) Zn²⁺はペプチド基質の結合に必須であり、恐らくはβサブユニットに付着している、3) この酵素はFPPとGGPPを同様の親和力で結合するが、ファルネシル基だけを、配列CAAXの末端がメチオニン、セリン、グルタミン、またはシステインである受容体でけに移行する。ただし、末端がロイシンであってはならない、4) プレニルピロリン酸の結合にはカチオンを必要としない、および5 ) 結合しているファルネシル基を結合されている受容ペプチドに移行する場合には、Mg²⁺を必要とする。 EDTA処理のタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼの反応配列を、グラフに要約して図22に示す。EDTA処理の酵素は、事前にZn²⁺結合を必要とすることなく、FPPを結合する。ペプチド結合にはZn²⁺を必要とするが、FPP結合からは独立している。基質両方が結合すれば、Mg²⁺依存性の移行反応が進行する。細胞の構成上、酵素はZn²⁺と錯体を形成することが期待される。これらの条件下では、このメカニズムは単純な、任意順位型の二つの酵素反応で、FPPおよびペプチドいずれの受容体も、どのような順序で酵素と結合しても良い。ペプチド結合にZn²⁺を必要とすることから、カルボキシペプチダーゼAなど、いくつかのメタロペプチダーゼはZn²⁺を必要とすることが（Lipscomb, 1974）、想起される。この場合、Zn²⁺はペプチド結合のカルボニル基とアミノ基に配位して、後に分割できる。ファルネシルトランスフェラーゼの場合には、Zn²⁺は受容ペプチド上でシステインのスルフヒドリル基に配位すると思われる。もし、この通りのメカニズムであるとすれば、Zn²⁺が配位するペプチドに酷似する阻害剤であれば、効果的なファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤になる筈である。この戦略は、そのままでカルボキシペプチダーゼに類似する亜鉛金属酵素であるアンギオテンシン転換酵素の阻害剤設計で使われた戦略（Petrillo and Ondetti, 1982）に似ている。 GGPPは、ファルネシルトランスフェラーゼ上にあるプレニルピロリン酸結合部位を、FPPと競合することができる。このため、細胞に統制問題が起こる可能性がある。もし、FPPとGGPPとが細胞内で同じ様な濃度であるとすれば、ファルネシルトランスフェラーゼは常に競合の末抑制されてしまう。したがって、細胞内ではGGPP濃度はFPP濃度より低いと考えられる。FPPはこの経路で大量生産されるコレステロールの中間体である（Goldstein and Brown, 1990）。反面、GGPPが何かの別の代謝産物に転換しているのか、否かが分かっていないし、それどころか、ゲラニルゲラニル修飾タンパク質が発見されるまで（Farnsworth et al., 1 990; Rilling et al., 1990）、動物の細胞に存在していることすら理解されていなかったのである。かくして、細胞内ではFPP濃度がGGPP濃度より高い水準にあるため、GGPPとの競合が起こらないと考えられる。 αサブユニットがプレニルリン酸結合に関与し、且つファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットとロイシン認識ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのそれとが同一であるとすれば、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの一成分としてのαサブユニットは異なる行動をする筈である。しかしながら、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼがFPPによって抑制されると、細胞内の酵素機能が失活するのでその可能性はない。この問題の解決は、ロイシン認識ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼが精製されて、そのαサブユニットがファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットと同一であるのか、あるいは単に類似しているに過ぎないのかを判定できるようになるまで待たなくてはならない。プレニルピロリン酸とファルネシルトランスフェラーゼとは、2価のカチオンから独立して結合することが観察されている。この点、ファルネシルトランスフェラーゼは、イソペンテニルピロリン酸とアリルピロリン酸の結合を触媒してFP Pを形成するプレニルトランスフェラーゼと似ている（King and Rilling, 1977 ）。これら二つの酵素は移行反応では2価のカチオン（Mg²⁺またはMn²⁺）を必要とする点でお互いに似ている。説明を省略した実験では、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ反応において、Mn²⁺はMg²⁺を置換することを認めた。また、これら二つの酵素は、FPPシンセターゼがホモダイマーであって、Zn²⁺を必要としない点では異なっている（Rilling, 1985）。酵母のプレニルトランスフェラーゼについては、ごく最近、これまで仮定とされてきた（putative）酵母のプレニルトランスフェラーゼの二つのβサブユニットが、BET2（Rossi et al., 1991））と、CAL1（Ohya et al., 1991）として同定された。これらの配列は両方とも、DPR1／RAM1遺伝子成生物と、ラット脳のファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットに似ている。BET2遺伝子が突然変異すると、酵母の分泌経路で小胞の移動を取り扱う二つの小さなGTP結合タンパク質（YPT1とSEC4）が膜に付着できなくなる（Rossi et al., 1991））。これらのタンパク質は、最近動物の細胞でゲラニルゲラニル化されることが証明された配列CCで終結する（Khosravi-Far et al., 1991）。第二の仮定（putative） βサブユニットはCAL1遺伝子によってコードされているが、カルシウムが奪われたときに酵母が細胞周期のコントロールに必要とするものである。遺伝子論においては、このプレニルトランスフェラーゼは、末端がCys-X-X-Leu（配列番号71 ）配列であり、ゲラニルゲラニル化されると信ぜられている二つのタンパク質を標的としていることが、これまでに示唆されている（Ohya et al., 1991）。これまで述べてきた酵母実験や動物実験の結果を纏めると、ペプチドと各種プレニルトランスフェラーゼとの結合に介在する、密接に関連するβサブユニット群が存在することが示唆されている。さらにまた、これらの酵素全てが同じαサブユニットを持っているのか、あるいは同様に、αサブユニット群が存在するのか問題は、今後の判定を待たなくてはならない。実施例 IV ヒトのファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼのαおよびβサブユニットの組替えクローン形成本発明者らは、ヒトのファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼの、αおよびβサブユニット両方をコードするcDNAのクローン形成に成功した。これは、本発明で説明したラットのファルネシル：タンパク質トランスフェラーゼから得た情報により、分子クローン形成法を用いて実施したものである。1．αサブユニットのクローン形成と配列の分析ヒトのレチナールλgt10 cDNAライブラリー（Jeremy Nathans, Johns Hopkins University Medical School, Baltimore, MDから入手）から約1×10⁶プラークを取り、本発明およびChen et al.,（1991a）が開示したラットのファルネシルトランスフェラーゼαサブユニットのcDNAの5'末端に一致し、³²Pで標識したプローブを用いてスクリーンした。ホルムアミド50%（v／v）と一重鎖M13プローブ 1×10⁶cpm／mlを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（hybridization buffe r with 50%（v／v）containing 1×10⁶cpm／ml of a single-stranded M13 prob e））中において、42℃でフィルターのハイブリッド形成を行い、55℃でIXSSC（塩化ナトリウム150mMおよびクエン酸ナトリウム15mM、pH7）およびSDS0.5%（w／ v）により洗った。 αサブユニットcDNAから誘導し、³²Pで標識したプローブにより、ヒトのレチナールcDNAライブラリーをスクリーンしたところ、数個の正のクローンが同定された。これらのクローンは、始めは、λgt10の左右の腕に一致するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により特性を評価した。最も長い挿入断片を含む正のクローンはプラークで精製し、ファージDNAを調製し、さらにcDNA挿入断片をBluescript（Stratagene）SKIIベクターにサブクローンして、特異的なオリゴヌクレオチドを用い、制限地図の作成とDNA配列の決定（Sanger et al., 1980）を行った。クローニングしたcDNAでコードされた、ヒトのファルネシルトランスフェラーゼの、ヌクレオチド配列は、配列番号6で表される。このコード領域の後に、524 個のヌクレオチドからなる3'-非翻訳領域が続き、非翻訳領域はポリ（A）の尾部で終結する。クローニングしたcDNAは、379個のアミノ酸からなるヒトのαサブユニットタンパク質をコードし、ラットの推定配列よりもアミノ酸2個長い配列番号5で表される（図26）。全体として、ヒトのファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットは、タンパク質としてはラットのαサブユニットと93%同一である（図26）。コード領域では、ヒトのcDNAのヌクレオチド配列は、ラットのそれと79%同一である。ヒトのファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットcDNAと、ラットのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットcDNAとを、移入法により一緒にヒトの腎臓293細胞系に導入すると、活性酵素が産生する。ラットのサブユニット両方をコードするcDNAを293細胞に同時移入する場合も同様である（本発明で開示した）。2．βサブユニットのクローン形成と配列の決定 PCRを用いて、ヒトのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットに特異的なプローブを調製した。ヒトの前立腺ポリ（A）RNAの第一の鎖の合成を行い（生成物をテンプレートとして（Chen et al., 1991a; 1991b）、また、本発明およびChen et al.,（1991b）の開示と同様にして、ラットのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットから形成したプライマー対（primer pair）を用い、PCRを実施した。このようにして増幅した300bpの生成物の配列を決定して、ヒトのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットと一致することを証明した。ヒトのレチナールλgt10 cDNAライブラリーから1.5×10⁶プラークを取り、PCR 生成物と一致し、³²Pで標識したプローブによりスクリーニングしたところ、正のクローン9個が同定された。最も大きな挿入断片を含む正の生成物をプラークにより精製し、ファージDNAを調製し、cDNA挿入断片をM13およびpUC18ベクターにサブクローンして制限地図の作成とDNA配列の決定（Sanger et al., 1980）を行った。ヒトのファルネシルトランスフェラーゼβサブユニットのヌクレオチド配列は、このようにして得られた部分cDNAクローンによりコードされ、配列番号8で表される。この部分cDNAクローンは、アミノ酸487個からなるヒトのβサブユニットタンパク質（配列番号7）をコードし、またラットの推定配列よりもアミノ酸5 0個短い（図27）。全体では、ヒトのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットは、タンパク質としてラットのファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットと、96%同一である（図27）。コード領域では、ヒトのcDNAのヌクレオチド配列（配列番号8）は、ラットの配列（配列番号4）と87%同一である。3．考察 CAAXファルネシルトランスフェラーゼ、および関連するプレニルトランスフェラーゼ、CAAXゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの機能が重要であると考えられる疾患あるいは障害において、発病したり病状が悪化する原因が、CAAXファルネシルトランスフェラーゼ、あるいはCAAXゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットのいずれかの異常による場合がある。ファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニット、あるいはβサブユニットのいずれかに突然変異が起こると、プレニル化が多数の異なるタンパク質や組織に作用して、多面にわたって影響を与える。特に突然変異がファルネシルトランスフェラーゼαサブユニットを冒す場合、このタンパク質はCAAXファルネシルトランスフェラーゼとCAAXゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの両方に存在しているので、多面的な影響を避けることはできない。ファルネシルトランスフェラーゼのαまたはβサブユニットの重要領域の突然変異が異なれば、各GTP結合タンパク質に対する影響も異なってくる。p21^rasタンパク質を例にとれば、ファルネシル化すると、p21^rasが形質膜の内表面に付着しやすくなる。したがって、ファルネシル化により、発癌rasタンパク質はより能率的に細胞増殖を刺激すると信ぜられている。p21^rasタンパク質の付着能力を高めることは、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素のαまたはβサブユニットいずれかを増幅したり、あるいは突然変異を活性化して、間接的に腫瘍細胞の増殖や発展に影響する可能性がある。実施例Ｖ NH₂末端の正の負荷による純粋阻害剤の創造本実施例では、配列Cys-A₁-A₂-Xに一致し、式中A₁およびA₂は脂肪族アミノ酸であり、Xはメチオニンまたはセリンである、テトラペプチド内で、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼがファルネシル残基をシステイン残基に移行させることを証明する。A₂残基が芳香族（例えば、Cys-Val-Phe-Metの場合のようにフェニルアラニン）であると、このテトラペプチドは酵素との結合を続けるが、もはやファルネシル基を受け付けることはない、したがってこのテトラペプチドが純粋阻害剤となる。本実施例の実験では、このファルネシル化耐性には、システインNH₂-基に正の負荷をすることが必要であることを示している。また、この基をアセチル、オクタノイル、またはコール酸残基で誘導体を形成したり、あるいはアミノ酸もう一つ付けてペプチドを拡張したりすると、フェニルアラニン含有ペプチドがファルネシル残基を受け入れる性能を回復する。システインNH₂ 基を除いても同様の結果となる（メルカプトプロピオン酸-Val-Phe-Met）。これらのデータは、システインアミノ基に付与された正の負荷は、位置A₂の芳香族残基と強調して作用し、ペプチドにファルネシル化耐性を与えることを示唆している。したがって、これらの実験から、このタイプの非ファルネシル化テトラペプチド阻害剤は、位置A₂には芳香族残基を含有し、NH₂末端は遊離していなければならないと、結論することができる。1．方法ａ．ペプチド類ペプチド類は、t-ブチルオキシカルボニル（Boc）、または9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（9-fluorenylmethyloxycarbonyl）（Fmoc）を用いて、手動固相法（manual solid pahse methodoloty）（Barrary & Merrifield, 1980）により調製し、精製は逆相高速液体クロマトグラフィ（Amicon C18、TFA／H₂O／ MeCN 0.1%またはTEAA／H₂O／MeCN 10mM）および分析は高速原子衝撃質量分析によって行った。コール酸（Aldrich）は、N、N-ジメチルアセトアミド中にベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘクサフルオロホスフェートを溶解したものを用いて活性化した。塩化オクタノイル（Oc tanoyl chloride）はオクタノイルペプチドを調製するために使用した。使用直前、各ペプチドは、ジメチルスルホキシド／ジチオトレイトール10mM中に溶解して、濃度1mMとした。希釈はすべてジチオトレイトール10mMを含む水によって行った。ｂ．タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼは、上記で説明した連続硫酸アンモニウム分画法、Mono Qイオン交換クロマトグラフィ、およびペプチドアフィニテイクロマトグラフィによって、ラット脳のホモジネートから見かけ均質性を得るまで精製した（Reiss et al., 1990a, 1990b）。ｃ．［³H］ファルネシルピロリン酸からペプチドへの［³H］ファルネシルの移行反応混合液は、各25μl当り次の濃度の成分を含有していた。すなわち、トリス-塩酸50mM（pH7.5）、ZnCl 50μM、MgCl₂ 3mM、KCl 30mM、ジチオトレイトール1mM、オクチルβ-D-グルコシド0.2%（v／v）、全trans［³H］ファルネシルピロリン酸（8、000〜16、000dpm／pmol、Dupont-New England Nuclear）0.6または2 .4μM、表示濃度のペプチド、およびアフィニテイ精製タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ〜5ng。37℃で15または30分間インキュベートした後、250mM EDTA 2μlを加えて反応を終結させ、上記で説明した方法により、反応混合液全部の薄層クロマトグラフィ（Nagasawa et al., 1984））を行った。原液（origi n）（2cm片）および薄層シート毎に連続1cm分画12個を切取り、3a70Bシンチレーション混合液10ml中でシンチレーション計数を行った（Research Products Inte rnational）。ペプチドに付着した［³H］ファルネシル量は、ピーク（peak frac tion）の放射能を加算して（通常は、ペプチドによっては10〜12または9〜11）計算した。また、ペプチドを含まないインキュベートまたはファルネシル化の基質とはならないテトラペプチド（SVIM）を含むインキュベートを平行して行ってブランク値を測定した（Nagasawa et al., 1984）。ｄ．タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ活性の検定［³H］ファルネシルピロリン酸から組替えp21^H-rasへ移行した［³H］ファルネシル量を、上記で説明したフィルター検定により測定した（Reiss et al.,1990 ）。2．成績上記の実施例で述べたように、ペプチドに付着している［³H］ファルネシルは薄層クロマトグラフィにより測定して、どの阻害剤が酵素の良き基質となり得るかの点も判定することが好ましい。図23は二つのペプチド、すなわちCVFMとN−A cCVFMの、［³H］ファルネシルがE.Coliから産生されたp21^H-rasへ移行するのを阻害する性能（パネルA）を比較したものである。この図はさらに、直接移行検定により、ラット脳から単離したタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼを精製したものと共にインキュベートするとき［³H］ファルネシルの受容体として作用する性能も比較している（パネルB）。［³H］ファルネシルのp21^H-rasへの取り込みは、トリクロロ酢酸で沈澱させた後で測定した。ペプチドは両方とも比較的高い親和力でp21^H-rasのファルネシル化を阻害した。CVFMとN-AcCVMの50%阻止濃度はそれぞれ0.07および0.27μMであった。図23Bに示す薄層クロマトグラフィ検定では、［³H］ファルネシル化したペプチドは溶媒の前端を移動するが、取り込まれていない［³H］FPPはほどんともとのままの位置に留まっている（Goldste in et al., 1991）。CVIMの存在下では、ほどんとすべての³H-放射能がペプチドと共に移動する。前の例と同様に、位置A₂を芳香族で置換（例えば、CVFM）すると、ファルネシルの移行が阻止される。しかしながら、NH²末端をアセチル化すると（例えば、N-AcCVFM）、この強力な阻害剤からファルネシル化を回復してしまう（図23B）。図24は、図23のペプチドとは異なる、位置A₁のバリンをイソロイシンで置換したCIFMとN-AcCIFMにおいても、阻害活性と受容機能とに同じ様な食い違いがあることを示したものである。ここでも、二つのペプチドはp21^H-rasのファルネシル化を阻害したが、（ファルネシル化の阻害力が弱い）アセチル化されているペプチドのみがファルネシル化された。興味があることは、NH₂末端とA₂芳香族側鎖の二つは、ペプチド内の互いに離れた領域にあるにも拘らす、共同してファルネシルの移行を阻害する。しかしながら、おのおの単独では完全な機能を持つ基質として作用する。さらに、表IV（下記）は、阻害力と基質活性との間にはほどんと相関関係がなく、明かにペプチド-タンパク質の相互作用が、ペプチドの結合とファルネシルトランスフェラーゼ活性の輪郭を決めていることを示している。表IVはまた、一連のN-修飾ペプチドが高いペプチド濃度（3.6μM）で示す、ファルネシル受容活性とファルネシルトランスフェラーゼ阻害活性とを比較している。これらの検定は、精製ファルネシルトランスフェラーゼ濃度を数回にわたって変えて行ったものである。結果を標準化するため、実験の度に、標準品ペプチドCVIM（p21^K-rasBのCOOH末端と一致する）のファルネシル化を測定し、結果はサンプルペプチドと標準ペプチドの［³H］ファルネシル取り込み量の比で表している。このデータによると、N-アセチル化によってファルネシル化を回復できるのは、フェニルアラニン含有ペプチドのみに限らなかった。トリプトファン（CV WMおよびN-AcCVWM）でも同様の結果が得られた。さらに、N-置換基はアセチル基に限らなかった。 CVFMの置換基がオクタノイルまたはコール酸残基であっても、同様の結果が得られた。また、N-置換基がアミノ酸である場合もファルネシル化が起こり、この場合KCVFMまたはCCVFMのようなペンタペプチドが形成された。これらのN-アセチル化誘導体、およびCVFMを含む他のペンタペプチドもファルネシル化された。各ペプチドは濃度3.6μMで、精製ファルネシルトランスフェラーゼと共にインキュベートし、取り込み放射能は上記で説明した方法で測定した。［³H］ファルネシルピロリン酸から各テトラペプチドへの［³H］ファルネシル取り込み量を、実験の度に測定したCVIMへの取り込み量で割った比を出して、結果を標準化した。p21^H-rasのファルネシル化の50%阻害濃度は、各ペプチドを0.03〜10μM範囲の 6濃度で試験して得たものである。 *3個月にわたって連続実施した9回の実験の平均。この時の50%阻害濃度は0.032 〜0.09μMの範囲内であった。図25は遊離NH₂基（CVFM）を持つフェニルアラニン含有テトラペプチドが、N- 置換ペプチド（N-オクタノイルCVFM）のファルネシル化を阻害したことを示している。さらに、ファルネシル化反応に対するN-修飾の効果を確認している。また、CVFMとそのN-修飾誘導体が酵素の同一の結合部位と相互作用をすることを示している。 3．考察これまでに説明した実施例は、CA₁A₂X配列のA₂位置に芳香族残基を含有するペプチドが、自ら酵素によってファルネシル化されることなく、p21^H-rasのファルネシル化を阻害することを証明している。本実施例では、これらペプチドが持つファルネシル化に対する耐性もまた、システインの遊離NH₂末端に依存していることが証明されている。このNH₂をアシル（アセチルまたはオクタノイル）またはアミノ酸残基で置換すると、このペプチドはファルネシル化の基質となる。ファルネシルトランスフェラーゼ酵素は、二つの注目に値する特異性を持っている。まず、試験した限りの配列に広い、多様性の阻害活性があることは、正確なペプチド認識領域を持っていることを窺わせる。第二に、A2芳香族基とNH₂末端とは協調してファルネシルの移行を妨害している。これとは別に、これらの部分の片方を持つペプチドは、基質として良く受け入れらている。ペプチドのこれら二つの部位をさらに修飾して、酵素の結合とファルネシルの移行に必要な構造を個々に探索することができるかも知れない。芳香族含有ペプチドがファルネシル化に対する耐性を持つためには、NH₂末端に正の負荷を必要とすることは、当然であると思われる。修飾によってファルネシル化を回復する場合、そのすべての修飾においてこの窒素から正の負荷を取り除いてしまう。この解釈は、始めからNH₂基がない（lacks a primary NH₂-group ）（メルカプトプロピオン酸-VFM）フェニルアラニン含有ペプチドがファルネシル化された過去の実験結果とも一致する。フェニルアラニン含有ペプチドに正の負荷を与えると、ファルネシル化に耐性を示すメカニズムはまだ分かっていない。一つの可能性としては、位置A₂に芳香族残基を持つペプチドが結合すると、酵素内で配座が変更されて、負荷されたNH₂ 末端をファルネシル残基の移行を妨害する位置に置くことが考えられる。反対に、ペプチドがファルネシル化されて、酵素からゆっくりと解離して行き、ファルシル化周期を絶つ可能性もある。精製ファルネシルトランスフェラーゼにより、慎重に速度論的研究（kinetic studies）を行えば、これらの可能性が明らかになるであろう。本発明の実用化について、無傷の細胞でファルネシルトランスフェラーゼを抑制するために、CVFMなどの芳香族含有ペプチドを使用する適用がある。この場合、細胞にデリバリーするためには非基質のペプチド阻害剤が好ましいが、負荷されたNH₂末端が付いているのでペプチドの細胞膜の通過が遅くなるかも知れない。また、この負荷を置換基でマスクし、後にこのマスクが細胞内で分解させるようにすることも必要になるかも知れない。エステラーゼや、アミダーゼが至る所に存在しているので、この目標は達成できる筈である。 **************** 本発明の最良の実施態様に関連して組成や方法を説明したが、本発明の概念、精神および範囲を離れることなしに、これらの組成、方法、方法の工程、または工程の順序に変更を加えることができることは、当業者にとり明白である。より詳しくは、化学的、生理的に関連がある薬剤をもって、本発明において説明した薬剤を置き換えて同一または類似する結果を挙げることができることは明白である。当業者にとり明白なこのような類似する置換物、および変更はすべて、添付の請求範囲に定める本発明の精神、範囲および概念に属するものとする。文献以下に列記する文献は、本発明で使用している方法、技術および／または組成を補足、説明、背景の記述または教示する範囲内で、引用することにより本発明の一部とする。配列表（1）一般的情報：（i）出願人：（A）名称：ボード・オヴ・リージェンツ，ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム（B）街：ウェスト・セヴンス・ストリート 201 （C）市：オースティン（D）州：テキサス（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号： 78701 および（A）名称：ジェネンテック，インコーポレイテッド（B）街：ポイント・サン・ブルーノ・ブールヴァード 460 （C）市：サン・フランシスコ（D）州：カリフォルニア（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号： 94080 （ii）発明者ブラウン，マイケル・エスゴールドスタイン，ジョゼフ・エルライス，ユーヴァルマースターズ，ジェイムズ・シー，ジュニア（iii）発明の名称：ファルネシルトランスフェラーゼの同定、特性評価および阻害方法、ならびにその組成（iv）配列の数：７１（v）連絡先：（A）あて先： ARNOLD, WHITE & DURKEE （B）街： P.O. Box 4433 （C）市：ヒューストン（D）州：テキサス（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号： 77210 （vi）コンピュータ読取可能な形式（A）媒体：フロッピーディスク（B）コンピュータ： IBM PC 互換器（C）オペレーティングシステム： PC-DOS/MS-DOS/ASCII （D）ソフトウェア： WORDPERFECT 5.1 （vii）本出願データ：（A）出願番号： PCT/US93/08062 （B）出願日： 1993年８月24日（C）分類：不明（viii）先の出願データ：（A）出籟番号：第07/935,087号（B）出願日： 1992年8月24日（C）分類：不明（ix）代理人の情報：（A）氏名：パーカー，デイヴィッド・エル（B）登録番号： 32,165 （C）参照番号： UTFD377PCT （x）電子通信の情報：（A）電話番号： 512-320-7200 （B）ファックス番号： 512-474-7577 （C）テレックス：なし（2）配列番号：1 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 377アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号1 （3）配列番号：2 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 1701塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号2 （4）配列番号：3 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 437アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号3 （5）配列番号：4 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 2464塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号4 （6）配列番号：5 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 379アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号5 （7）配列番号：6 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 1664塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号6 （8）配列番号：7 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 387アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号7 （9）配列番号：8 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 1248核酸（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号8 （10）配列番号：9 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 6アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号9 （11）配列番号：10 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号10 （12）配列番号：11 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 10アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号11 （13）配列番号：12 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号12 （14）配列番号：13 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号13 （15）配列番号：14 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号14 （16）配列番号：15 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 10アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号15 （17）配列番号：16 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 10アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号16 （18）配列番号：17 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号17 （19）配列番号：18 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号18 （20）配列番号：19 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号19 （21）配列番号：20 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号20 （22）配列番号：21 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号21 （23）配列番号：22 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号22 （24）配列番号：23 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号23 （25）配列番号：24 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号24 （26）配列番号：25 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号25 （27）配列番号：26 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号26 （28）配列番号：27 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号27 （29）配列番号：28 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号28 （30）配列番号：29 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号29 （31）配列番号：30 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号30 （32）配列番号：31 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号31 （33）配列番号：32 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号32 （34）配列番号：33 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号33 （35）配列番号：34 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号34 （36）配列番号：35 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号35 （37）配列番号：36 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号36 （38）配列番号：37 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号37 （39）配列番号：38 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号38 （40）配列番号：39 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号39 （41）配列番号：40 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号40 （42）配列番号：41 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号41 （43）配列番号：42 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号42 （44）配列番号：43 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号43 （45）配列番号：44 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号44 （46）配列番号：45 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号45 （47）配列番号：46 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号46 （48）配列番号：47 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号47 （49）配列番号：48 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 12アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号48 （50）配列番号：49 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 6アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号49 （51）配列番号：50 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 10アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号50 （52）配列番号：51 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号51 （53）配列番号：52 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号52 （54）配列番号：53 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 7アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号53 （55）配列番号：54 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号54 （56）配列番号：55 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号55 （57）配列番号：56 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号56 （58）配列番号：57 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 14塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号57 （59）配列番号：58 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 14塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号58 （60）配列番号：59 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 16アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号59 （61）配列番号：60 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 14塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号60 （62）配列番号：61 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 14塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号61 （63）配列番号：62 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 44塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号62 （64）配列番号：63 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 16アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号63 （65）配列番号：64 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 44塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号64 （66）配列番号：65 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号65 （67）配列番号：66 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号66 （68）配列番号：67 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 15アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号67 （69）配列番号：68 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 17アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号68 （70）配列番号：69 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 19塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号69 （71）配列番号：70 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 7アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号70 （72）配列番号：71 （i）配列の特徴（A）配列の長さ： 4アミノ酸残基（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号７１

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 7/02 7/06 7/08 Ｃ１２Ｎ 9/99 9152−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 9/10 9359−4Ｂ 15/09 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ゴールドスタイン，ジョゼフ・エルアメリカ合衆国、75219 テキサス、ダラス、タートル・クリーク・ブールヴァード 3831 (72)発明者ライス，ユーヴァルアメリカ合衆国、75248 テキサス、ダラス、エル‐エスタド 15730、＃249 (72)発明者マースターズ，ジェイムズ・シー，ジュニアアメリカ合衆国、94610 カリフォルニア、オークランド、マッキンリー・アヴェニュー 809

Claims

【特許請求の範囲】 1. 構造内にファルネシルトランスフェラーゼ阻害ペプチド配列を持ち、それ自体がタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼによってファルネシル化する基質となることなく、該酵素によるp21^rasのファルネシル化を阻害することができ、このファルネシルトランスフェラーゼ阻害ペプチド配列にアミノ酸CA₁A₂Xを含み、式中Ｃ＝システイン A₁＝脂肪族、芳香族またはヒドロキシアミノ酸 A₂＝芳香族アミノ酸または一以上の芳香族部分をを取り込むことができる修飾アミノ酸 X＝メチオニン、セリン、グルタミンまたはシステインである化合物からなる純粋ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であって、この化合物は標的細胞の細胞内に取り込まれるものであり、CA₁A₂XのC残基が正に負荷されたアミノ末端であるという形態を備えた純粋ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤。 2. 請求項1に記載の阻害剤において、上記化合物がシステイン残基上に負荷されていないα窒素を有するN-末端の修飾を行った修飾CA₁A₂Xであり、この修飾が標的細胞内で標的細胞により除去されて、正に負荷されたα窒素を持つN-末端システインを暴露することができる阻害剤。 3. 請求項2に記載の阻害剤において、さらに加水分解または脱アシル化により修飾を受け、正に負荷されたα窒素を持つN-末端システインを暴露することができる阻害剤。 4. 加水分解に感受性を持つN-マンニッヒまたはシッフ塩基構造を含む、請求項3に記載の阻害剤。 5. 請求項4に記載の阻害剤において、さらに次の構造を持つ阻害剤。 6. 請求項4に記載の阻害剤において、さらに次の構造を持つ阻害剤。 7. 加水分解に感受性を持つ2-置換チアゾリジン-4-カルボン酸構造を含む、請求項3に記載の阻害剤。 8. 請求項7に記載の阻害剤において、さらに次の構造を持つ阻害剤。 9. 脱アシル化により除去できるN-末端アシル基を含む、請求項3に記載の阻害剤。 10．請求項2に記載の阻害剤において、さらに細胞内酵素作用より修飾を行って、正に負荷されたα窒素を持つN-末端システインを暴露することができる阻害剤。 11．請求項10に記載の阻害剤において、さらにオキソプロリナーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、またはトランスペプチダーゼにより修飾を行って、正に負荷されたα窒素を持つN-末端システインを暴露することができる阻害剤。 12．請求項11に記載の阻害剤において、さらにオキソプロリナーゼにより修飾することができ、且つ次の構造を持つ阻害剤。 13．請求項11に記載の阻害剤において、さらにエステラーゼにより修飾することができ、且つ次の構造を持つ阻害剤。 14．請求項11に記載の阻害剤において、さらにピログルタミルアミノペプチダーゼにより修飾することができ、且つ次の構造を持つ阻害剤。 15．請求項11に記載の阻害剤において、さらにトリプシンにより修飾することができ、且つ次の構造 R'= L-アルギニン、L-リシンまたはC-末端L-アルギニンまたはL-リシンを持つペプチドを持つ阻害剤。 16．請求項11に記載の阻害剤において、さらにキモトリプシンにより修飾することができ、且つ次の構造 R'= L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、またはC-末端にこれらのアミノ酸を持つペプチドを持つ阻害剤。 17．請求項11に記載の阻害剤において、さらにγ-グルタミルトランスペプチダーゼにより修飾することができ、且つ次の構造を持つ阻害剤。 18．請求項1に記載の阻害剤において、さらに次の構造 N= システインのα窒素 R1,R2またはR3= H,アルキル、置換アルキル、フェニル、ベンジル、置換フェニル、置換ベンジルを持つ阻害剤。 19．請求項1に記載の阻害剤において、さらに次の構造を持つ阻害剤。 20．請求項1に記載の阻害剤において、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害ペプチド配列がテトラペプチドCVFMである阻害剤。 21．請求項1に記載の阻害剤において、A₂アミノ酸の芳香族部分が修飾されて、フルオロ、クロロまたはニトロ基を含んでいる阻害剤。 22．請求項1に記載の阻害剤において、A₂アミノ酸がパラクロロフェニルアラニンからなる阻害剤。 23．請求項1に記載の阻害剤において、A₂アミノ酸がナフチルリングを含んでいる阻害剤。 24．ファルネシルトランスフェラーゼ酵素を、請求項1のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の有効濃度で処理することにより、この酵素を阻害する方法。 25．悪性腫瘍細胞を、請求項1のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の有効濃度で処理することにより、ファルネシル部分がこの悪性腫瘍細胞のp21rasタンパク質に付着するのを阻害する方法。