JPH08313529A - オリゴヌクレオチド分解活性能の測定方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチド分解活性能の測定方法Info
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- JPH08313529A JPH08313529A JP5319896A JP5319896A JPH08313529A JP H08313529 A JPH08313529 A JP H08313529A JP 5319896 A JP5319896 A JP 5319896A JP 5319896 A JP5319896 A JP 5319896A JP H08313529 A JPH08313529 A JP H08313529A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 オリゴヌクレオチド分解活性能を測定する手
段を提供する。 【構成】本発明に係るオリゴヌクレオチド分解活性能の
測定方法は、適当な数の核酸塩基からなる１本鎖オリゴ
ヌクレオチドの５’末端及び３’末端に、それぞれエネ
ルギー供与体およびエネルギー受容体とを有するオリゴ
ヌクレオチドを用い、該オリゴヌクレイチドが非分解時
の該エネルギー供与体と該エネルギー受容体の蛍光と、
該オリゴヌクレオチドを分解反応に供した後の該エネル
ギー供与体と該エネルギー受容体の蛍光とを比較し、オ
リゴヌクレオチド分解活性能を測定するものである。
段を提供する。 【構成】本発明に係るオリゴヌクレオチド分解活性能の
測定方法は、適当な数の核酸塩基からなる１本鎖オリゴ
ヌクレオチドの５’末端及び３’末端に、それぞれエネ
ルギー供与体およびエネルギー受容体とを有するオリゴ
ヌクレオチドを用い、該オリゴヌクレイチドが非分解時
の該エネルギー供与体と該エネルギー受容体の蛍光と、
該オリゴヌクレオチドを分解反応に供した後の該エネル
ギー供与体と該エネルギー受容体の蛍光とを比較し、オ
リゴヌクレオチド分解活性能を測定するものである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ドの分解活性能を測定する方法に関する。
ドの分解活性能を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】目的遺伝子の発現の制御等の研究におい
て、機能性オリゴヌクレオチドを生体細胞内に注入し、
そのオリゴヌクレオチドが生体細胞内でどのような挙動
をするのかを知ることは、１つの効果的な手段であるこ
とが知られている（Erickson,R,P.,and Izant,J.G. e
d.,1992, Gene Regulation:Biology of Antisense RNA
and DNA, Raven Press, NEw York; Murray,J.A.H. ed.,
1992,Antisense RNA and DNA, Wiley-Liss, New Yor
k）。
て、機能性オリゴヌクレオチドを生体細胞内に注入し、
そのオリゴヌクレオチドが生体細胞内でどのような挙動
をするのかを知ることは、１つの効果的な手段であるこ
とが知られている（Erickson,R,P.,and Izant,J.G. e
d.,1992, Gene Regulation:Biology of Antisense RNA
and DNA, Raven Press, NEw York; Murray,J.A.H. ed.,
1992,Antisense RNA and DNA, Wiley-Liss, New Yor
k）。
【０００３】例えば、短いＤＮＡ分子は細胞に注入され
ると、相補的塩基配列を含む対応するｍＲＮＡに結合す
ることにより特定のタンパクの合成を阻害することが知
られている（Wagner,R.W.,1994,Nature 372,333-33
5）。さらに、ＡＩＤＳの治療研究においては特別にデ
ザインされたリボザイムがＡＩＤＳウイルスのｍＲＮＡ
を切断することが知られており（Sarver,N.,et al.,Sci
ence 247,1222-1225,1990)、リボザイムまたはその人工
的に修飾した類縁体が将来薬物として有用な候補である
と考えられている。
ると、相補的塩基配列を含む対応するｍＲＮＡに結合す
ることにより特定のタンパクの合成を阻害することが知
られている（Wagner,R.W.,1994,Nature 372,333-33
5）。さらに、ＡＩＤＳの治療研究においては特別にデ
ザインされたリボザイムがＡＩＤＳウイルスのｍＲＮＡ
を切断することが知られており（Sarver,N.,et al.,Sci
ence 247,1222-1225,1990)、リボザイムまたはその人工
的に修飾した類縁体が将来薬物として有用な候補である
と考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
所定の機能性オリゴヌクレオチドの生体内における安定
性または信頼性は、該オリゴヌクレオチドの塩基配列ま
たはその塩基数、さらに生体内に存在する種々の生体物
質例えば、ヌクレアーゼ等に大きく依存する。
所定の機能性オリゴヌクレオチドの生体内における安定
性または信頼性は、該オリゴヌクレオチドの塩基配列ま
たはその塩基数、さらに生体内に存在する種々の生体物
質例えば、ヌクレアーゼ等に大きく依存する。
【０００５】従って、生体内に注入された機能性オリゴ
ヌクレオチドが細胞内でヌクレアーゼ等により切断等さ
れるという可能性が大きい。この場合、ターゲットオリ
ゴヌクレオチドが分解されたことを検出することは従来
の方法では極めて困難であった。
ヌクレオチドが細胞内でヌクレアーゼ等により切断等さ
れるという可能性が大きい。この場合、ターゲットオリ
ゴヌクレオチドが分解されたことを検出することは従来
の方法では極めて困難であった。
【０００６】従来、生体内においてオリゴヌクレオチド
をモニターするのに、オリゴヌクレオチド鎖の一端に蛍
光色素でラベルしたものがプローブとして使用されてい
る。しかしながら、この方法においては該プローブが分
解反応により分解し、もはやオリゴヌクレオチドとして
の目的の機能を有しなくなったにもかかわらず、分解断
片の蛍光色素の蛍光は依然として検出可能であるという
問題が生じる可能性がある。
をモニターするのに、オリゴヌクレオチド鎖の一端に蛍
光色素でラベルしたものがプローブとして使用されてい
る。しかしながら、この方法においては該プローブが分
解反応により分解し、もはやオリゴヌクレオチドとして
の目的の機能を有しなくなったにもかかわらず、分解断
片の蛍光色素の蛍光は依然として検出可能であるという
問題が生じる可能性がある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、以
上の問題を解決するために鋭意研究し、被検体オリゴヌ
クレオチドの細胞内での分子構造上の変化、例えばヌク
レアーゼ等による分解等を高感度に検出することが可能
となる方法の開発に成功した。従って、この方法に基づ
いて、該被検体オリゴヌクレオチドの細胞内での安定性
や信頼性をインビトロ、またはインビボで評価すること
を可能とする方法を提供することに成功した。
上の問題を解決するために鋭意研究し、被検体オリゴヌ
クレオチドの細胞内での分子構造上の変化、例えばヌク
レアーゼ等による分解等を高感度に検出することが可能
となる方法の開発に成功した。従って、この方法に基づ
いて、該被検体オリゴヌクレオチドの細胞内での安定性
や信頼性をインビトロ、またはインビボで評価すること
を可能とする方法を提供することに成功した。
【０００８】すなわち、本発明に係る被検体オリゴヌク
レオチドの分解活性能の測定方法は、該オリゴヌクレオ
チドを２種類の異なった蛍光色素でラベルし、これらの
２種類の発蛍光団による分子内共鳴エネルギー移動（Ｒ
ＥＴ）(Stryer,L.(1978),Annu.Rev.Biochem.,47,819-84
6.;Herman,B.(1989) In Taylor,D.L. and Wang,Y.(ed
s.), Fluorscence Microscopy of Living Cells in Cul
ture-Part B. AcademicPress, New York, pp220-245.)
に基づく蛍光特性を調べることによるものである。
レオチドの分解活性能の測定方法は、該オリゴヌクレオ
チドを２種類の異なった蛍光色素でラベルし、これらの
２種類の発蛍光団による分子内共鳴エネルギー移動（Ｒ
ＥＴ）(Stryer,L.(1978),Annu.Rev.Biochem.,47,819-84
6.;Herman,B.(1989) In Taylor,D.L. and Wang,Y.(ed
s.), Fluorscence Microscopy of Living Cells in Cul
ture-Part B. AcademicPress, New York, pp220-245.)
に基づく蛍光特性を調べることによるものである。
【０００９】より詳しくは、本発明は、被検体オリゴヌ
クレオチドに結合した、１組のエネルギー供与体基およ
びエネルギー受容体基による共鳴エネルギー移動と、前
記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受容体基
間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応に基づく前記共鳴
エネルギー移動の変化とを検出し被検体オリゴヌクレオ
チドの分解活性能を測定する方法に関するものである。
クレオチドに結合した、１組のエネルギー供与体基およ
びエネルギー受容体基による共鳴エネルギー移動と、前
記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受容体基
間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応に基づく前記共鳴
エネルギー移動の変化とを検出し被検体オリゴヌクレオ
チドの分解活性能を測定する方法に関するものである。
【００１０】また、本発明は、被検体１本鎖オリゴヌク
レオチドの５’および３’末端に結合した、１組のエネ
ルギー供与体基およびエネルギー受容体基による共鳴エ
ネルギー移動と、前記オリゴヌクレオチドの分解反応に
基づく前記共鳴エネルギー移動の変化とを検出し被検体
オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定する方法に関す
るものである。
レオチドの５’および３’末端に結合した、１組のエネ
ルギー供与体基およびエネルギー受容体基による共鳴エ
ネルギー移動と、前記オリゴヌクレオチドの分解反応に
基づく前記共鳴エネルギー移動の変化とを検出し被検体
オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定する方法に関す
るものである。
【００１１】また、本発明は、被検体オリゴヌクレオチ
ドに結合した、１組の、フルオレセイン系発蛍光団を含
むエネルギー供与体基およびローダミン系発蛍光団を含
むエネルギー受容体基、による共鳴エネルギー移動（Ｒ
ＥＴ）と、前記１組のエネルギー供与体基およびエネル
ギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応に基
づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出
し被検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定する方
法に関するものである。
ドに結合した、１組の、フルオレセイン系発蛍光団を含
むエネルギー供与体基およびローダミン系発蛍光団を含
むエネルギー受容体基、による共鳴エネルギー移動（Ｒ
ＥＴ）と、前記１組のエネルギー供与体基およびエネル
ギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応に基
づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出
し被検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定する方
法に関するものである。
【００１２】また本発明は、被検体１本鎖オリゴヌクレ
オチドの５’及び３’末端に結合した、１組の、フルオ
レセイン系発蛍光団を含むエネルギー供与体基およびロ
ーダミン系発蛍光団を含むエネルギー受容体基による共
鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、前記オリゴヌクレオチ
ドの分解反応に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥ
Ｔ）の変化とを検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解
活性能を測定する方法に関するものである。
オチドの５’及び３’末端に結合した、１組の、フルオ
レセイン系発蛍光団を含むエネルギー供与体基およびロ
ーダミン系発蛍光団を含むエネルギー受容体基による共
鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、前記オリゴヌクレオチ
ドの分解反応に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥ
Ｔ）の変化とを検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解
活性能を測定する方法に関するものである。
【００１３】また、本発明は、被検体オリゴヌクレオチ
ドに結合した、１組のエネルギー供与体基およびエネル
ギー受容体基であり、前記１組のエネルギー供与体基お
よびエネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が３
個以上３０個以下の核酸塩基からなるものによる共鳴エ
ネルギー移動（ＲＥＴ）と、前記１組のエネルギー供与
体基およびエネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド
鎖の分解反応に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥ
Ｔ）の変化とを検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解
活性能を測定する方法に関するものである。
ドに結合した、１組のエネルギー供与体基およびエネル
ギー受容体基であり、前記１組のエネルギー供与体基お
よびエネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が３
個以上３０個以下の核酸塩基からなるものによる共鳴エ
ネルギー移動（ＲＥＴ）と、前記１組のエネルギー供与
体基およびエネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド
鎖の分解反応に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥ
Ｔ）の変化とを検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解
活性能を測定する方法に関するものである。
【００１４】さらに、本発明は、被検体１本鎖オリゴヌ
クレオチドの５’及び３’末端に結合した、１組の、フ
ルオレセイン系発蛍光団を含むエネルギー供与体基およ
びローダミン系発蛍光団を含むエネルギー受容体基であ
り、前記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受
容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が３個以上３０個以下
の核酸塩基からなるものによる共鳴エネルギー移動（Ｒ
ＥＴ）と、前記オリゴヌクレオチドの分解反応に基づく
前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出し被
検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定する方法に
関するものである。
クレオチドの５’及び３’末端に結合した、１組の、フ
ルオレセイン系発蛍光団を含むエネルギー供与体基およ
びローダミン系発蛍光団を含むエネルギー受容体基であ
り、前記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受
容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が３個以上３０個以下
の核酸塩基からなるものによる共鳴エネルギー移動（Ｒ
ＥＴ）と、前記オリゴヌクレオチドの分解反応に基づく
前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出し被
検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定する方法に
関するものである。
【００１５】また、本発明は、被検体オリゴヌクレオチ
ドに結合した、１組のエネルギー供与体基およびエネル
ギー受容体基であり、前記１組のエネルギー供与体基お
よびエネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が１
０個の核酸塩基からなるものによる共鳴エネルギー移動
（ＲＥＴ）と、前記１組のエネルギー供与体基およびエ
ネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応
に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを
検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定す
る方法に関するものである。
ドに結合した、１組のエネルギー供与体基およびエネル
ギー受容体基であり、前記１組のエネルギー供与体基お
よびエネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が１
０個の核酸塩基からなるものによる共鳴エネルギー移動
（ＲＥＴ）と、前記１組のエネルギー供与体基およびエ
ネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応
に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを
検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定す
る方法に関するものである。
【００１６】また、本発明は、被検体１本鎖オリゴヌク
レオチドの５’及び３’末端に結合した、１組の、フル
オレセイン系発蛍光団を含むエネルギー供与体基および
ローダミン系発蛍光団を含むエネルギー受容体基であ
り、前記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受
容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が１０個の核酸塩基か
らなるものによる共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、前
記オリゴヌクレオチドの分解反応に基づく前記共鳴エネ
ルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出し被検体オリゴヌ
クレオチドの分解活性能を測定する方法に関するもので
ある。
レオチドの５’及び３’末端に結合した、１組の、フル
オレセイン系発蛍光団を含むエネルギー供与体基および
ローダミン系発蛍光団を含むエネルギー受容体基であ
り、前記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受
容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が１０個の核酸塩基か
らなるものによる共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、前
記オリゴヌクレオチドの分解反応に基づく前記共鳴エネ
ルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出し被検体オリゴヌ
クレオチドの分解活性能を測定する方法に関するもので
ある。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下本発明をさらに詳しく説明す
る。
る。
【００１８】（被検体一本鎖オリゴヌクレオチドの分解
活性能）本発明において、被検体一本鎖オリゴヌクレオ
チドの分解活性能とは、被検体一本鎖オリゴヌクレオチ
ドが、インビボまたはインビトロで、種々の条件下で分
解反応を受けて分解し、もはや本来の生理学的作用を示
さなくなるものである。例えば、被検体一本鎖オリゴヌ
クレオチドが一回の加水分解反応を受けて、２本に分解
すること等である。本発明に係る被検体一本鎖オリゴヌ
クレオチドは、特に該分解部分があらかじめ知られてい
る場合と、知られていない場合との制限はなく使用可能
であり、もし、あらかじめ知られている場合においては
さらに、その部分が切断等の反応をうけたかどうかを確
認することも可能である。一般的に、生理活性が認めら
れるオリゴヌクレオチドはその一部でも欠落すると該作
用を示さないか、または極めて弱くなり、この変化を知
ることは重要であり、特にリアルタイムでモニタするこ
とは重要である。
活性能）本発明において、被検体一本鎖オリゴヌクレオ
チドの分解活性能とは、被検体一本鎖オリゴヌクレオチ
ドが、インビボまたはインビトロで、種々の条件下で分
解反応を受けて分解し、もはや本来の生理学的作用を示
さなくなるものである。例えば、被検体一本鎖オリゴヌ
クレオチドが一回の加水分解反応を受けて、２本に分解
すること等である。本発明に係る被検体一本鎖オリゴヌ
クレオチドは、特に該分解部分があらかじめ知られてい
る場合と、知られていない場合との制限はなく使用可能
であり、もし、あらかじめ知られている場合においては
さらに、その部分が切断等の反応をうけたかどうかを確
認することも可能である。一般的に、生理活性が認めら
れるオリゴヌクレオチドはその一部でも欠落すると該作
用を示さないか、または極めて弱くなり、この変化を知
ることは重要であり、特にリアルタイムでモニタするこ
とは重要である。
【００１９】（共鳴エネルギー移動、ＲＥＴ）本発明に
おけるＲＥＴとは、蛍光現象であって（Stryer,L.Ann.R
ev.Biochem、47、1978、819ー846;In Taylor,D.L. and Wan
g,Y. eds., Fluorescence Microscopyof Living Cells
in Culture-Part B. Academic Press, New York,220-24
5,1989）等に記載され、簡単には、(1)１つの発蛍光団
（エネルギー供与体、ドナー）の蛍光スペクトルが他の
発蛍光団（エネルギー受容体、アクセプター）の励起ス
ペクトルと重なる場合で、かつ(2)ドナーとアクセプタ
ーとが接近する位置にある場合においては、ドナーの励
起がアクセプターからの蛍光を誘導し、さらにドナー自
身からの蛍光強度は減少するという現象を意味する。
おけるＲＥＴとは、蛍光現象であって（Stryer,L.Ann.R
ev.Biochem、47、1978、819ー846;In Taylor,D.L. and Wan
g,Y. eds., Fluorescence Microscopyof Living Cells
in Culture-Part B. Academic Press, New York,220-24
5,1989）等に記載され、簡単には、(1)１つの発蛍光団
（エネルギー供与体、ドナー）の蛍光スペクトルが他の
発蛍光団（エネルギー受容体、アクセプター）の励起ス
ペクトルと重なる場合で、かつ(2)ドナーとアクセプタ
ーとが接近する位置にある場合においては、ドナーの励
起がアクセプターからの蛍光を誘導し、さらにドナー自
身からの蛍光強度は減少するという現象を意味する。
【００２０】さらに上記ＲＥＴはドナーとアクセプター
との距離に極めて敏感であることが知られており、一般
的には両者の距離の１０ー6乗に比例する。
との距離に極めて敏感であることが知られており、一般
的には両者の距離の１０ー6乗に比例する。
【００２１】従って、被検体中に１組のＲＥＴを与える
ドナーとアクセプターとを設け、この間で生じるＲＥＴ
の消失をモニターすることで、上記ドナーとアクセプタ
ー間が大きく変化したこと、すなわち、上記ドナー基と
アクセプター基を含む部分が切断等されてもはや一分子
中にはないことを確認することが可能となる。
ドナーとアクセプターとを設け、この間で生じるＲＥＴ
の消失をモニターすることで、上記ドナーとアクセプタ
ー間が大きく変化したこと、すなわち、上記ドナー基と
アクセプター基を含む部分が切断等されてもはや一分子
中にはないことを確認することが可能となる。
【００２２】（エネルギー供与体（ドナー）、エネルギ
ー受容体（アクセプター））本発明において使用可能な
エネルギー供与体（ドナー）およびエネルギー受容体
（アクセプター）は、上記のＲＥＴを利用することが可
能な組合わせならば特に制限されない。
ー受容体（アクセプター））本発明において使用可能な
エネルギー供与体（ドナー）およびエネルギー受容体
（アクセプター）は、上記のＲＥＴを利用することが可
能な組合わせならば特に制限されない。
【００２３】種々の発蛍光団を有する色素が使用可能で
あるが、例えばフルオレセイン系、ローダミン系の色素
等が好適に使用可能である。
あるが、例えばフルオレセイン系、ローダミン系の色素
等が好適に使用可能である。
【００２４】本発明においては特に、ドナーとしてフル
オレセイン発蛍光団を有する色素、およびアクセプター
としてローダミンＸ発蛍光団を有する色素を用いること
が好ましい。フルオレセインおよびローダミンＸの吸収
スペクトルは吸収ピークとして４９７、５８６ｎｍを有
する。一方フルオレセインは４９４ｎｍで励起した場合
にそれぞれ５２３ｎｍに蛍光のピークを示す。またロー
ダミンＸは５８５ｎｍで励起した場合に６１０ｎｍに蛍
光ピークを示す。
オレセイン発蛍光団を有する色素、およびアクセプター
としてローダミンＸ発蛍光団を有する色素を用いること
が好ましい。フルオレセインおよびローダミンＸの吸収
スペクトルは吸収ピークとして４９７、５８６ｎｍを有
する。一方フルオレセインは４９４ｎｍで励起した場合
にそれぞれ５２３ｎｍに蛍光のピークを示す。またロー
ダミンＸは５８５ｎｍで励起した場合に６１０ｎｍに蛍
光ピークを示す。
【００２５】ここでこの２種類の発蛍光団がＲＥＴを生
じるに適当な距離にある場合には、ドナーとしてのフル
オレセインからアクセプターとしてのローダミンＸへの
蛍光エネルギー移動に伴いフルオレセインに基づく蛍光
強度は減少し、ローダミンＸに基づく蛍光強度が増加す
ることになる。
じるに適当な距離にある場合には、ドナーとしてのフル
オレセインからアクセプターとしてのローダミンＸへの
蛍光エネルギー移動に伴いフルオレセインに基づく蛍光
強度は減少し、ローダミンＸに基づく蛍光強度が増加す
ることになる。
【００２６】（被検体、１重鎖オリゴヌクレオチドの調
製）本発明においては、被検体としての１本鎖のオリゴ
ヌクレオチドの塩基配列の種類は、使用の目的に応じて
選択可能であり、特に制限されない。
製）本発明においては、被検体としての１本鎖のオリゴ
ヌクレオチドの塩基配列の種類は、使用の目的に応じて
選択可能であり、特に制限されない。
【００２７】本発明においてこれはＲＥＴを利用するた
めには、両発蛍光団の距離がある好ましい範囲にあるこ
とが必要であり、該２種類の蛍光団基間のオリゴヌクレ
オチドの塩基配列数は、ＲＥＴが利用可能な発蛍光団の
選択に依存することとなる。従って、被検体オリゴヌク
レオチドの適当な部分（分解反応を受ける際切断されう
る部分を挟む）に上記２種類の発蛍光団を有するように
調製することが好ましい。例えば上記２種類の発蛍光団
がフルオレセインとローダミンＸを使用する場合におい
てはそれらの間のオリゴヌクレオチドの塩基配列数は約
１０個が最も好ましい範囲となる。より一般的には、３
個以上３０個以下の核酸塩基からなることが好ましい。
これは、あまり短い場合は、該被検体が分解する位置が
極めて制限されること、またこれ以上長い場合は、充分
なＲＥＴが観測されないこととなるからである。従って
これらの事情から、より好ましい範囲は、５個以上１８
個以下（さらに、８個以上１５個以下）の核酸塩基から
なる。
めには、両発蛍光団の距離がある好ましい範囲にあるこ
とが必要であり、該２種類の蛍光団基間のオリゴヌクレ
オチドの塩基配列数は、ＲＥＴが利用可能な発蛍光団の
選択に依存することとなる。従って、被検体オリゴヌク
レオチドの適当な部分（分解反応を受ける際切断されう
る部分を挟む）に上記２種類の発蛍光団を有するように
調製することが好ましい。例えば上記２種類の発蛍光団
がフルオレセインとローダミンＸを使用する場合におい
てはそれらの間のオリゴヌクレオチドの塩基配列数は約
１０個が最も好ましい範囲となる。より一般的には、３
個以上３０個以下の核酸塩基からなることが好ましい。
これは、あまり短い場合は、該被検体が分解する位置が
極めて制限されること、またこれ以上長い場合は、充分
なＲＥＴが観測されないこととなるからである。従って
これらの事情から、より好ましい範囲は、５個以上１８
個以下（さらに、８個以上１５個以下）の核酸塩基から
なる。
【００２８】従って、あらかじめ、これらの塩基配列数
を有するオリゴヌクレオチドを被検体の分解されるべき
位置を含むように合成し、さらに適当な発蛍光団を選択
し、これらを該オリゴヌクレオチド部分に結合させた被
検体オリゴヌクレオチドを調製することは当業者にとっ
て容易である。
を有するオリゴヌクレオチドを被検体の分解されるべき
位置を含むように合成し、さらに適当な発蛍光団を選択
し、これらを該オリゴヌクレオチド部分に結合させた被
検体オリゴヌクレオチドを調製することは当業者にとっ
て容易である。
【００２９】さらに、本発明においては、分解反応に供
されるオリゴヌクレオチド部以外については、該反応に
影響されない限り特に制限されるものではない。
されるオリゴヌクレオチド部以外については、該反応に
影響されない限り特に制限されるものではない。
【００３０】したがって、分解に供される部の５’末端
または３’末端にさらにオリゴヌクレオチド、オリゴペ
プチド等の基は結合していても使用可能である。すなわ
ち、本発明の実施の一態様として、１つの被検体機能性
ポリヌクレオチドの分解点と推定される位置を含む上記
の適当な数のオリゴヌクレオチドを選び、その両端に上
記のＲＥＴが利用可能となる発蛍光団を結合させること
で、該部分が分解される反応を追跡可能となる。この場
合、上記ポリヌクレオチド部分以外は実質的に制限はな
い。
または３’末端にさらにオリゴヌクレオチド、オリゴペ
プチド等の基は結合していても使用可能である。すなわ
ち、本発明の実施の一態様として、１つの被検体機能性
ポリヌクレオチドの分解点と推定される位置を含む上記
の適当な数のオリゴヌクレオチドを選び、その両端に上
記のＲＥＴが利用可能となる発蛍光団を結合させること
で、該部分が分解される反応を追跡可能となる。この場
合、上記ポリヌクレオチド部分以外は実質的に制限はな
い。
【００３１】さらに、本発明においては、分解される際
に、該被検体が１本鎖であることは必ずしも必要ではな
い。他のＤＮＡ等と相補的に２重鎖を形成し、分解反応
に供され、上記のＲＥＴの変化を観測し得る。
に、該被検体が１本鎖であることは必ずしも必要ではな
い。他のＤＮＡ等と相補的に２重鎖を形成し、分解反応
に供され、上記のＲＥＴの変化を観測し得る。
【００３２】本発明においては、被検体となるオリゴヌ
クレオチドの合成方法は特に制限されず、公知のヌクレ
オチド合成方法が好適に使用可能である。例えば、化学
合成法、自動合成法等が使用可能である。さらに、必要
ならば、酵素を用いる合成方法も好適に使用可能であ
る。
クレオチドの合成方法は特に制限されず、公知のヌクレ
オチド合成方法が好適に使用可能である。例えば、化学
合成法、自動合成法等が使用可能である。さらに、必要
ならば、酵素を用いる合成方法も好適に使用可能であ
る。
【００３３】（発蛍光団色素を有する被検体オリゴヌク
レオチドの調製）本発明においては、エネルギー供与体
基およびエネルギー受容体基を被検体オリゴヌクレオチ
ド部分の５’または３’末端に結合する方法は特に制限
されず、一般の有機合成法、または適当な誘導体を用い
た酵素反応により、種々の態様で調製可能である。以下
にその一例を説明する。
レオチドの調製）本発明においては、エネルギー供与体
基およびエネルギー受容体基を被検体オリゴヌクレオチ
ド部分の５’または３’末端に結合する方法は特に制限
されず、一般の有機合成法、または適当な誘導体を用い
た酵素反応により、種々の態様で調製可能である。以下
にその一例を説明する。
【００３４】(1)ターゲットたるオリゴヌクレオチド
に、望ましい上記エネルギー供与体基およびエネルギー
受容体基を結合する方法においては、あらかじめターゲ
ットたるオリゴヌクレオチドを合成しておき、さらに
５’または３’末端の活性基（例えば、それぞれのＯＨ
基）と、公知の化学反応に基づきエネルギー供与体基お
よびエネルギー受容体基を結合させ導入することが可能
である。導入されるべきエネルギー供与体基およびエネ
ルギー受容体基と、該末端基との間に適当な長さに調製
するためのリンカー部を追加することも可能である。
に、望ましい上記エネルギー供与体基およびエネルギー
受容体基を結合する方法においては、あらかじめターゲ
ットたるオリゴヌクレオチドを合成しておき、さらに
５’または３’末端の活性基（例えば、それぞれのＯＨ
基）と、公知の化学反応に基づきエネルギー供与体基お
よびエネルギー受容体基を結合させ導入することが可能
である。導入されるべきエネルギー供与体基およびエネ
ルギー受容体基と、該末端基との間に適当な長さに調製
するためのリンカー部を追加することも可能である。
【００３５】(2)ターゲットたるオリゴヌクレオチドの
一部をあらかじめ組込み、かつ導入されるべきエネルギ
ー供与体基およびエネルギー受容体基をそれぞれ有する
基を、ターゲットヌクレオチドの一部を形成するオリゴ
ヌクレオチドと結合し、調製することが可能である。
一部をあらかじめ組込み、かつ導入されるべきエネルギ
ー供与体基およびエネルギー受容体基をそれぞれ有する
基を、ターゲットヌクレオチドの一部を形成するオリゴ
ヌクレオチドと結合し、調製することが可能である。
【００３６】本発明の実施例においては、５’末端にフ
ルオレセイン発蛍光団を有するオリゴヌクレオチド（９
−ｍｅｒ）に、ローダミンＸ発蛍光団を有するヌクレオ
チドを化学合成法で、または酵素化学法で結合した。
ルオレセイン発蛍光団を有するオリゴヌクレオチド（９
−ｍｅｒ）に、ローダミンＸ発蛍光団を有するヌクレオ
チドを化学合成法で、または酵素化学法で結合した。
【００３７】同様に本発明においては、３’末端にロー
ダミンＸ発蛍光団を有するオリゴヌクレオチド（９−ｍ
ｅｒ）に、フルオロセイン発蛍光団を有するヌクレオチ
ドを化学合成法で、または酵素化学法で結合した。
ダミンＸ発蛍光団を有するオリゴヌクレオチド（９−ｍ
ｅｒ）に、フルオロセイン発蛍光団を有するヌクレオチ
ドを化学合成法で、または酵素化学法で結合した。
【００３８】（ＲＥＴ測定による分解活性能測定）本発
明においては、ＲＥＴにより、２種類の発蛍光団からの
蛍光スペクトルを測定し、比較する方法については特に
制限はない。
明においては、ＲＥＴにより、２種類の発蛍光団からの
蛍光スペクトルを測定し、比較する方法については特に
制限はない。
【００３９】例えば、ＲＥＴが可能な条件においての２
種類の発蛍光団からのそれぞれの蛍光強度の比と、ＲＥ
Ｔが生じない条件下での２種類の発蛍光団からの蛍光強
度の比を比較する方法は好適に使用可能である。
種類の発蛍光団からのそれぞれの蛍光強度の比と、ＲＥ
Ｔが生じない条件下での２種類の発蛍光団からの蛍光強
度の比を比較する方法は好適に使用可能である。
【００４０】この場合、さらに高感度の測定とするため
に、励起波長の選択、蛍光の選択的測定のためのフィル
ター、さらに２種類の蛍光を同時に測定する手段等が好
適に使用可能となる。
に、励起波長の選択、蛍光の選択的測定のためのフィル
ター、さらに２種類の蛍光を同時に測定する手段等が好
適に使用可能となる。
【００４１】さらに、ＲＥＴに基づく現象が、他の現象
例えば、蛍光寿命の変化に影響を及ぼすものであれば、
その寿命の変化も本発明による分解活性能測定に利用す
ることが可能である。
例えば、蛍光寿命の変化に影響を及ぼすものであれば、
その寿命の変化も本発明による分解活性能測定に利用す
ることが可能である。
【００４２】さらに、本発明においては、分解酵素が１
本鎖で分解するのか、２本鎖で分解するのかの制限なく
使用可能である。
本鎖で分解するのか、２本鎖で分解するのかの制限なく
使用可能である。
【００４３】（インビボでのＲＥＴ測定による分解活性
能測定）本発明に係るオリゴヌクレオチドの分解活性測
定方法においては、インビボでの測定方法については特
に制限なく使用可能である。
能測定）本発明に係るオリゴヌクレオチドの分解活性測
定方法においては、インビボでの測定方法については特
に制限なく使用可能である。
【００４４】インビボで、２種類の発蛍光団からの蛍光
を測定可能とする手段であればよく、例えば、試料を蛍
光顕微鏡により視覚化して観測しつつ、２種類のフィル
ターを使用することにより２種類の発蛍光団からの蛍光
を同時測定し、その時間変化をモニターすることが可能
となる（図１０）。
を測定可能とする手段であればよく、例えば、試料を蛍
光顕微鏡により視覚化して観測しつつ、２種類のフィル
ターを使用することにより２種類の発蛍光団からの蛍光
を同時測定し、その時間変化をモニターすることが可能
となる（図１０）。
【００４５】本発明においては、例えば、ウニ卵に２種
類の発蛍光団でラベルしたオリゴヌクレオチド（Ｒ−Ｏ
ＤＮ−Ｆ）を注入することにより、インビボでそのＲＥ
Ｔを観測可能である。
類の発蛍光団でラベルしたオリゴヌクレオチド（Ｒ−Ｏ
ＤＮ−Ｆ）を注入することにより、インビボでそのＲＥ
Ｔを観測可能である。
【００４６】ＲＥＴの観測により、細胞中で、該オリゴ
ヌクレオチドが分解していないことがインビボで確認可
能である。
ヌクレオチドが分解していないことがインビボで確認可
能である。
【００４７】さらにＲＥＴが時間的に、またはその他の
生化学的処理により変化する場合においては、該オリゴ
ヌクレオチドの分解活性がリアルタイムで観測可能とな
る。
生化学的処理により変化する場合においては、該オリゴ
ヌクレオチドの分解活性がリアルタイムで観測可能とな
る。
【００４８】以上の手法は、被検体オリゴヌクレオチド
の、インビトロまたはインビボで各種のヌクレアーゼに
よる分解活性を測定するための手段を提供するものであ
る。
の、インビトロまたはインビボで各種のヌクレアーゼに
よる分解活性を測定するための手段を提供するものであ
る。
【００４９】さらに、細胞内での、該被検体オリゴヌク
レオチドの安定性、その寿命等をリアルタイムでモニタ
ー可能とする。
レオチドの安定性、その寿命等をリアルタイムでモニタ
ー可能とする。
【００５０】実施例 以下、本発明を実施例に従って詳細に説明する。ただ
し、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
し、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００５１】（実施例１）５’−ローダミンＸ−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＵ−３’−フ
ルオレセイン（Ｒ−ＯＤＮ−Ｆ）の合成（図７）。
ルオレセイン（Ｒ−ＯＤＮ−Ｆ）の合成（図７）。
【００５２】３’−フルオレセイン−１，２−ジデオキ
シウリジン−５’−トリフォスフェイト（ｄｄＵＴＰ−
Ｆ）（Boehringer Mannheim社製）と、５’−ローダミ
ンＸ−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴ−３’（Ｒ−ＯＤＮ）（宝酒
造社製）とから次の酵素反応を用いて合成した。
シウリジン−５’−トリフォスフェイト（ｄｄＵＴＰ−
Ｆ）（Boehringer Mannheim社製）と、５’−ローダミ
ンＸ−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴ−３’（Ｒ−ＯＤＮ）（宝酒
造社製）とから次の酵素反応を用いて合成した。
【００５３】0.1mM ddUTP-Fと0.05mM R-ODNを２０単位
のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ(GIBCO-BRL社製）と３７℃で２時間、100mMカコジル
酸カリウム緩衝液（pH7.2）、2mMCoCl2、および1mMジチ
オスレイトール（２３）中でインキュベートした。
のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ(GIBCO-BRL社製）と３７℃で２時間、100mMカコジル
酸カリウム緩衝液（pH7.2）、2mMCoCl2、および1mMジチ
オスレイトール（２３）中でインキュベートした。
【００５４】生成物のＲ−ＯＤＮ−Ｆは、高速液体クロ
マトグラフィ（HPLC、東ソー製、モデル８１００）で、
イオン交換カラム（ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ、東ソ
ー）を用いて、次の条件で精製分離した。
マトグラフィ（HPLC、東ソー製、モデル８１００）で、
イオン交換カラム（ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ、東ソ
ー）を用いて、次の条件で精製分離した。
【００５５】流速：1.0 ml/分、 温度：室温２５℃。
【００５６】溶媒：20mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0）でNaC
l 0.1Mから1Mを用いた直線濃度勾配分離精製した。
l 0.1Mから1Mを用いた直線濃度勾配分離精製した。
【００５７】（実施例２）５’ーフルオレセイン−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ−３’−
ローダミンＸ（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の合成（図８）。 化学
合成法により合成し、ＨＰＬＣにおいて単一ピークを確
認した（図１）。
ローダミンＸ（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の合成（図８）。 化学
合成法により合成し、ＨＰＬＣにおいて単一ピークを確
認した（図１）。
【００５８】（吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル）
Ｆ−ＯＤＮ−Ｒは溶媒Ａ（50mMTris-HCl緩衝液、pH8.0,
0.1MNaCl,1mM CaCl2および1mMMgCl2）で適当な濃度へ希
釈した。
Ｆ−ＯＤＮ−Ｒは溶媒Ａ（50mMTris-HCl緩衝液、pH8.0,
0.1MNaCl,1mM CaCl2および1mMMgCl2）で適当な濃度へ希
釈した。
【００５９】吸収スペクトルは、日立モデル５５７で、
また蛍光スペクトルは日立モデル８５０を使用した。
また蛍光スペクトルは日立モデル８５０を使用した。
【００６０】Ｆ−ＯＤＮ−Ｒの吸収スペクトルは図２に
示されるように、フルオレセインおよびローダミンＸそ
れぞれの吸収スペクトルの重ねあわせたものと一致し
た。
示されるように、フルオレセインおよびローダミンＸそ
れぞれの吸収スペクトルの重ねあわせたものと一致し
た。
【００６１】Ｆ−ＯＤＮ−Ｒの蛍光スペクトルを図３に
示した。
示した。
【００６２】４９４ｎｍで励起した場合、５２３および
６１０ｎｍに蛍光ピークを示すが、これはフルオレセイ
ンおよびローダミンＸ由来のそれぞれの蛍光スペクトル
の重ねあわせたものである。
６１０ｎｍに蛍光ピークを示すが、これはフルオレセイ
ンおよびローダミンＸ由来のそれぞれの蛍光スペクトル
の重ねあわせたものである。
【００６３】同様に、６０６ｎｍでモニターした場合、
５００および５９４ｎｍに蛍光ピークを与える。
５００および５９４ｎｍに蛍光ピークを与える。
【００６４】ここでそれぞれの蛍光強度を比較すると、
４９４ｎｍで励起した場合には、６１０ｎｍのローダミ
ンＸ由来の蛍光スペクトルの強度がフルオレセイン由来
の蛍光スペクトルと比較して数倍大きくなっている。
４９４ｎｍで励起した場合には、６１０ｎｍのローダミ
ンＸ由来の蛍光スペクトルの強度がフルオレセイン由来
の蛍光スペクトルと比較して数倍大きくなっている。
【００６５】この結果は、フルオロセイン発蛍光団から
の蛍光エネルギーがローダミン発蛍光団に移動すること
により、これらの蛍光強度が変化したことを意味する。
の蛍光エネルギーがローダミン発蛍光団に移動すること
により、これらの蛍光強度が変化したことを意味する。
【００６６】（酵素によるオリゴヌクレオチドの消化）
上記得られたオリゴヌクレオチド（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）
を、基質として１重鎖のＤＮＡにとってエンドヌクレア
ーゼとしての機能を有する（Sambrook,J.,Fritsch,E.
F., and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring,1989）ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（宝酒造社製）
で消化させた。
上記得られたオリゴヌクレオチド（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）
を、基質として１重鎖のＤＮＡにとってエンドヌクレア
ーゼとしての機能を有する（Sambrook,J.,Fritsch,E.
F., and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring,1989）ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（宝酒造社製）
で消化させた。
【００６７】例えばインビトロでの測定は、Ｆ−ＯＤＮ
−Ｒ(17 nM）を、2mlの溶媒Ａ中、３０℃で６０分間、
５単位のＢＡＬ３１とインキュベートした後行った。
−Ｒ(17 nM）を、2mlの溶媒Ａ中、３０℃で６０分間、
５単位のＢＡＬ３１とインキュベートした後行った。
【００６８】またはインビボでの測定は、Ｆ−ＯＤＮ−
Ｒ(50 μM）を、4μlの溶媒Ａ中、３０℃で３０分間、
0.1単位のＢＡＬ３１とインキュベートした後行った。
Ｒ(50 μM）を、4μlの溶媒Ａ中、３０℃で３０分間、
0.1単位のＢＡＬ３１とインキュベートした後行った。
【００６９】この酵素による消化は、２μlの0.1M EGTA
を４μlの反応液に加えることで止めた。
を４μlの反応液に加えることで止めた。
【００７０】（ウニ卵およびマイクロインジェクショ
ン）ウニ卵（Hemicentrotus pulcherrimus）を0.55M KC
lの体腔内注入により集め、海水で２回洗う。ウニ卵を
ポリー−Ｌ−リジンコートガラスカバースリップの上に
おく（約3ml容積のチャンバを作るようにルーサイトで
枠が作られている）。
ン）ウニ卵（Hemicentrotus pulcherrimus）を0.55M KC
lの体腔内注入により集め、海水で２回洗う。ウニ卵を
ポリー−Ｌ−リジンコートガラスカバースリップの上に
おく（約3ml容積のチャンバを作るようにルーサイトで
枠が作られている）。
【００７１】オリゴヌクレイオチドは100μMの濃度で10
0mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、pH7.2中に懸濁させ、該オリゴ
ヌクレオチド溶液（約1-2%卵の体積）を卵中にマイクロ
インジェクションした（Hirano,K.Develop.Growth and
Differ.24,1982,273-281）。
0mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、pH7.2中に懸濁させ、該オリゴ
ヌクレオチド溶液（約1-2%卵の体積）を卵中にマイクロ
インジェクションした（Hirano,K.Develop.Growth and
Differ.24,1982,273-281）。
【００７２】（ＲＥＴの顕微鏡下可視化）得られたウニ
卵からのＲＥＴを同時に観測するため、注入されたオリ
ゴヌクレオチド由来の蛍光の成分を、蛍光顕微鏡（ダイ
アフォト−ＴＭＤ；ニコン）に設置した２つフィルター
を用いて別々に観測した。
卵からのＲＥＴを同時に観測するため、注入されたオリ
ゴヌクレオチド由来の蛍光の成分を、蛍光顕微鏡（ダイ
アフォト−ＴＭＤ；ニコン）に設置した２つフィルター
を用いて別々に観測した。
【００７３】緑のイメージは、５２０−５６０ｎｍのバ
ンドパスフィルタを通して観察し、赤のイメージは、５
８０ｎｍ以上のシャープカットオフフィルタを通して観
察した。
ンドパスフィルタを通して観察し、赤のイメージは、５
８０ｎｍ以上のシャープカットオフフィルタを通して観
察した。
【００７４】これらの両タイプのイメージにおいては、
熱吸収フィルタを用いて赤外線を除いた。
熱吸収フィルタを用いて赤外線を除いた。
【００７５】バンドパスフィルタ４７０−４９０ｎｍに
より得られる励起光は、観測蛍光シグナルから取り除い
た（５１０ｎｍカットオフ波長、ダイクロイックミラ
ー）。
より得られる励起光は、観測蛍光シグナルから取り除い
た（５１０ｎｍカットオフ波長、ダイクロイックミラ
ー）。
【００７６】得られた緑、赤のイメージは、２秒ごとに
高感度ＩＣＣＤカメラ（ｃ２４００−８０、浜松ホトニ
クス）で取り込まれ、さらに蛍光強度はイメージプロセ
ッサ（ＡＲＧＵＳ−５０、浜松ホトニクス）により処理
解析した。
高感度ＩＣＣＤカメラ（ｃ２４００−８０、浜松ホトニ
クス）で取り込まれ、さらに蛍光強度はイメージプロセ
ッサ（ＡＲＧＵＳ−５０、浜松ホトニクス）により処理
解析した。
【００７７】オリゴヌクレオチドをマイクロインジェク
トされたウニ卵は、フロオレセインからの緑の蛍光のほ
かに明るい赤い蛍光をだしていた。
トされたウニ卵は、フロオレセインからの緑の蛍光のほ
かに明るい赤い蛍光をだしていた。
【００７８】一方ＢＡＬ３１消化したものをインジェク
トしたものは赤い蛍光は観測されず、ただ緑の蛍光のみ
であった。
トしたものは赤い蛍光は観測されず、ただ緑の蛍光のみ
であった。
【００７９】蛍光強度は卵の部分で異なり、卵の中心で
は強度は強いが周辺では緑も赤も弱かった。これは、光
路長の違いによる問題であり、細胞体積を補正すること
で修正可能であった。
は強度は強いが周辺では緑も赤も弱かった。これは、光
路長の違いによる問題であり、細胞体積を補正すること
で修正可能であった。
【図１】本発明の原理を説明する模式図である。被検体
オリゴヌクレオチドに結合したエネルギー供与体（Ｄ）
とエネルギー受容体（Ａ）により観測されるＲＥＴが、
分解反応により観測されなくなるなる様子を示す。
オリゴヌクレオチドに結合したエネルギー供与体（Ｄ）
とエネルギー受容体（Ａ）により観測されるＲＥＴが、
分解反応により観測されなくなるなる様子を示す。
【図２】５’−フルオレセイン−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ
−３’−ローダミンＸ（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の精製分離後
の高速液体クロマトグラムを示す図である。
−３’−ローダミンＸ（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の精製分離後
の高速液体クロマトグラムを示す図である。
【図３】５’−フルオレセイン−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ
−３’−ローダミンＸ（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の吸収スペク
トルを示す図である。
−３’−ローダミンＸ（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の吸収スペク
トルを示す図である。
【図４】４９４ｎｍで励起された５’−フルオレセイン
−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ−３’−ローダミンＸ（Ｆ−Ｏ
ＤＮ−Ｒ）の発光スペクトルを示す図である。
−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ−３’−ローダミンＸ（Ｆ−Ｏ
ＤＮ−Ｒ）の発光スペクトルを示す図である。
【図５】６０６ｎｍでモニタされた５’−フルオレセイ
ン−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ−３’−ローダミンＸ（Ｆ−
ＯＤＮ−Ｒ）の励起スペクトルを示す図である。
ン−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ−３’−ローダミンＸ（Ｆ−
ＯＤＮ−Ｒ）の励起スペクトルを示す図である。
【図６】ＢＡＬ３１で酵素消化された後の５’−フルオ
レセイン−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ−３’−ローダミンＸ
（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の発光スペクトル（実線）を示す図
である。
レセイン−ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ−３’−ローダミンＸ
（Ｆ−ＯＤＮ−Ｒ）の発光スペクトル（実線）を示す図
である。
【図７】５’ーローダミンーＴＧＡＡＡＴＴＧＴＵー
３’ーフルオレセインの分子構造を示す図である。
３’ーフルオレセインの分子構造を示す図である。
【図８】５’ーフルオレセインーＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴ
ー３’ーローダミンＸの分子構造を示す図である。
ー３’ーローダミンＸの分子構造を示す図である。
【図９】細胞内で、本発明にかかる作用を説明する図で
ある。ＲＥＴを観測可能とする被検体オリゴヌクレオチ
ドを細胞内に注入し、細胞内でのヌクレアーゼによる分
解反応を細胞内からのＲＥＴの変化をモニターすること
で追跡することができる。
ある。ＲＥＴを観測可能とする被検体オリゴヌクレオチ
ドを細胞内に注入し、細胞内でのヌクレアーゼによる分
解反応を細胞内からのＲＥＴの変化をモニターすること
で追跡することができる。
【図１０】蛍光顕微鏡下ウニ卵からの２成分の蛍光比Re
d成分／Green成分の時間変化を示す図である。図中Ａ
は、Ｒ−ＯＤＮ−Ｆ（天然のphosphodiester linkageを
有するもの）を注入したウニ卵の上記比の変化を示す。
図中Ｂは、Ｒ−Ｓ−ＯＤＮ−Ｆ（nuclease-resistant p
hosphorothioate linkageを有する)を注入したウニ卵の
上記比の変化を示す。
d成分／Green成分の時間変化を示す図である。図中Ａ
は、Ｒ−ＯＤＮ−Ｆ（天然のphosphodiester linkageを
有するもの）を注入したウニ卵の上記比の変化を示す。
図中Ｂは、Ｒ−Ｓ−ＯＤＮ−Ｆ（nuclease-resistant p
hosphorothioate linkageを有する)を注入したウニ卵の
上記比の変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東２−４−29
Claims (8)
- 【請求項１】 被検体オリゴヌクレオチドに結合した、
１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受容体基に
よる共鳴エネルギー移動と、前記１組のエネルギー供与
体基およびエネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド
鎖の分解反応に基づく前記共鳴エネルギー移動の変化と
を検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定
する方法。 - 【請求項２】 被検体１本鎖オリゴヌクレオチドの５’
および３’末端に結合した、１組のエネルギー供与体基
およびエネルギー受容体基による共鳴エネルギー移動
と、前記オリゴヌクレオチドの分解反応に基づく前記共
鳴エネルギー移動の変化とを検出し被検体オリゴヌクレ
オチドの分解活性能を測定する方法。 - 【請求項３】 被検体オリゴヌクレオチドに結合した、
１組の、フルオレセイン系発蛍光団を含むエネルギー供
与体基およびローダミン系発蛍光団を含むエネルギー受
容体基、による共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、前記
１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受容体基間
のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応に基づく前記共鳴エ
ネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出し被検体オリゴ
ヌクレオチドの分解活性能を測定する方法。 - 【請求項４】 被検体１本鎖オリゴヌクレオチドの５’
及び３’末端に結合した、１組の、フルオレセイン系発
蛍光団を含むエネルギー供与体基およびローダミン系発
蛍光団を含むエネルギー受容体基による共鳴エネルギー
移動（ＲＥＴ）と、前記オリゴヌクレオチドの分解反応
に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを
検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定す
る方法。 - 【請求項５】 被検体オリゴヌクレオチドに結合した、
１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受容体基で
あり、前記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー
受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が３個以上３０個以
下の核酸塩基からなるものによる共鳴エネルギー移動
（ＲＥＴ）と、前記１組のエネルギー供与体基およびエ
ネルギー受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応
に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを
検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解活性能を測定す
る方法。 - 【請求項６】 被検体１本鎖オリゴヌクレオチドの５’
及び３’末端に結合した、１組の、フルオレセイン系発
蛍光団を含むエネルギー供与体基およびローダミン系発
蛍光団を含むエネルギー受容体基であり、前記１組のエ
ネルギー供与体基およびエネルギー受容体基間のオリゴ
ヌクレオチド鎖が３個以上３０個以下の核酸塩基からな
るものによる共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、前記オ
リゴヌクレオチドの分解反応に基づく前記共鳴エネルギ
ー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出し被検体オリゴヌクレ
オチドの分解活性能を測定する方法。 - 【請求項７】 被検体オリゴヌクレオチドに結合した、
１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受容体基で
あり、前記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー
受容体基間のオリゴヌクレオチド鎖が１０個の核酸塩基
からなるものによる共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、
前記１組のエネルギー供与体基およびエネルギー受容体
基間のオリゴヌクレオチド鎖の分解反応に基づく前記共
鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の変化とを検出し被検体オ
リゴヌクレオチドの分解活性能を測定する方法。 - 【請求項８】 被検体１本鎖オリゴヌクレオチドの５’
及び３’末端に結合した、１組の、フルオレセイン系発
蛍光団を含むエネルギー供与体基およびローダミン系発
蛍光団を含むエネルギー受容体基であり、前記１組のエ
ネルギー供与体基およびエネルギー受容体基間のオリゴ
ヌクレオチド鎖が１０個の核酸塩基からなるものによる
共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）と、前記オリゴヌクレオ
チドの分解反応に基づく前記共鳴エネルギー移動（ＲＥ
Ｔ）の変化とを検出し被検体オリゴヌクレオチドの分解
活性能を測定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5319896A JPH08313529A (ja) | 1995-03-10 | 1996-03-11 | オリゴヌクレオチド分解活性能の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-50926 | 1995-03-10 | ||
| JP5092695 | 1995-03-10 | ||
| JP5319896A JPH08313529A (ja) | 1995-03-10 | 1996-03-11 | オリゴヌクレオチド分解活性能の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08313529A true JPH08313529A (ja) | 1996-11-29 |
Family
ID=26391414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5319896A Pending JPH08313529A (ja) | 1995-03-10 | 1996-03-11 | オリゴヌクレオチド分解活性能の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08313529A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005059548A1 (ja) | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Kankyo Engineering Co., Ltd. | 核酸測定用新規混合物、及びそれを用いる核酸の新規測定方法並びにそれらに用いる核酸プローブ |
-
1996
- 1996-03-11 JP JP5319896A patent/JPH08313529A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005059548A1 (ja) | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Kankyo Engineering Co., Ltd. | 核酸測定用新規混合物、及びそれを用いる核酸の新規測定方法並びにそれらに用いる核酸プローブ |
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