JP2001033439A - 乾式蛍光測定による標的核酸の検出／定量方法 - Google Patents
乾式蛍光測定による標的核酸の検出／定量方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 特定の塩基配列を有する標的核酸を蛍光色
素を用いて検出または定量する際の測定容器・照射方向
・試料溶液量の下限の制限を緩和する方法を提供する。 【解決手段】 観察用の清浄な固相基板上に、検出また
は定量対象である一定量の試料溶液由来の標的核酸と、
該標的核酸の塩基配列の特定の部位に相補的な塩基配列
を有するプローブ核酸とが相互に作用して両者のハイブ
リッド体が形成されており、かつ、該ハイブリッド体に
作用し、作用した結果、蛍光を発するか、または、蛍光
が増大し、かつ、該ハイブリッド体に作用した状態で、
乾燥状態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素が
該ハイブリッド体に対して作用可能な状態で存在する状
態を実現する工程と、該基板上でハイブリッド体および
蛍光色素を乾燥させる工程と、乾燥後に観測手段である
蛍光色素からの蛍光を測定する工程と、を有することを
特徴とする標的核酸の乾式検出または定量方法。
素を用いて検出または定量する際の測定容器・照射方向
・試料溶液量の下限の制限を緩和する方法を提供する。 【解決手段】 観察用の清浄な固相基板上に、検出また
は定量対象である一定量の試料溶液由来の標的核酸と、
該標的核酸の塩基配列の特定の部位に相補的な塩基配列
を有するプローブ核酸とが相互に作用して両者のハイブ
リッド体が形成されており、かつ、該ハイブリッド体に
作用し、作用した結果、蛍光を発するか、または、蛍光
が増大し、かつ、該ハイブリッド体に作用した状態で、
乾燥状態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素が
該ハイブリッド体に対して作用可能な状態で存在する状
態を実現する工程と、該基板上でハイブリッド体および
蛍光色素を乾燥させる工程と、乾燥後に観測手段である
蛍光色素からの蛍光を測定する工程と、を有することを
特徴とする標的核酸の乾式検出または定量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は特定の塩基配列を有
する標的核酸の検出または定量方法に関する。
する標的核酸の検出または定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より生物の特定遺伝子の検出のため
に特定塩基配列を有する標的核酸と該標的核酸に対する
核酸プローブの二本鎖核酸ハイブリッド体の検出の際に
エチジウムブロマイド(以下ＥＢと呼ぶ)等の二本鎖核酸
に作用して蛍光を増大する蛍光色素を用いて二本鎖核酸
をゲル中、もしくは、溶液中で検出/定量する技術は広
く用いられてきている。
に特定塩基配列を有する標的核酸と該標的核酸に対する
核酸プローブの二本鎖核酸ハイブリッド体の検出の際に
エチジウムブロマイド(以下ＥＢと呼ぶ)等の二本鎖核酸
に作用して蛍光を増大する蛍光色素を用いて二本鎖核酸
をゲル中、もしくは、溶液中で検出/定量する技術は広
く用いられてきている。
【０００３】また、近年ではごく微量の核酸を検出する
ために核酸を酵素的に増幅するポリメレースチェインリ
アクション(ＰＣＲ)が一般的となってきているが、この
ＰＣＲの増副産物を検出するため溶液中で二本鎖核酸に
作用してはじめて蛍光を発する蛍光色素２-メチル-４,
６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム
塩を用いる手法も用いられるようになってきている(Ｎu
cleic Ａcid Ｒesearch,1995,Ｖol.２３,Ｎo.８ 144
5-1446)。
ために核酸を酵素的に増幅するポリメレースチェインリ
アクション(ＰＣＲ)が一般的となってきているが、この
ＰＣＲの増副産物を検出するため溶液中で二本鎖核酸に
作用してはじめて蛍光を発する蛍光色素２-メチル-４,
６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム
塩を用いる手法も用いられるようになってきている(Ｎu
cleic Ａcid Ｒesearch,1995,Ｖol.２３,Ｎo.８ 144
5-1446)。
【０００４】最近、これらの色素の他に溶液中で二本鎖
核酸に作用して蛍光を発する蛍光色素として、Ｍolecul
ar Ｐrobe社からＹＯＹＯ１をはじめとするいくつかの
色素が販売されている。
核酸に作用して蛍光を発する蛍光色素として、Ｍolecul
ar Ｐrobe社からＹＯＹＯ１をはじめとするいくつかの
色素が販売されている。
【０００５】これらの色素のうち、ＥＢは一般的に二本
鎖核酸の塩基対間に入り込むインターカレーターである
とされ、また、文献(Ｎucleic Ａcid Ｓyｍposiuｍ
Ｓeries Ｎo.２９ 1993 83-84)には２-メチル-４,６
-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム塩
もインターカレーターとの記載がある。一方、ＹＯＹＯ
１は一般的に二本鎖核酸のグルーブ内に入り込むグルー
ブパインデイングタイプの蛍光色素とされている。
鎖核酸の塩基対間に入り込むインターカレーターである
とされ、また、文献(Ｎucleic Ａcid Ｓyｍposiuｍ
Ｓeries Ｎo.２９ 1993 83-84)には２-メチル-４,６
-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム塩
もインターカレーターとの記載がある。一方、ＹＯＹＯ
１は一般的に二本鎖核酸のグルーブ内に入り込むグルー
ブパインデイングタイプの蛍光色素とされている。
【０００６】また、特定遺伝子検出のための特定塩基配
列を有する標的核酸、もしくは、標的核酸の塩基配列の
特定の部位に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を
固相に固定し、それぞれに対応するプローブ核酸、もし
くは、標的核酸とのハイブリッド体を形成させ、該ハイ
ブリッド体を検出する、いわゆる固相ハイブリダイゼー
ション法は広く知られている。また、検出方法に関して
もさまざまな手法が開発されてきている。
列を有する標的核酸、もしくは、標的核酸の塩基配列の
特定の部位に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を
固相に固定し、それぞれに対応するプローブ核酸、もし
くは、標的核酸とのハイブリッド体を形成させ、該ハイ
ブリッド体を検出する、いわゆる固相ハイブリダイゼー
ション法は広く知られている。また、検出方法に関して
もさまざまな手法が開発されてきている。
【０００７】最も代表的な手法はサザーンハイブリダイ
ゼーション法で、これは、ゲル電気泳動で鎖長に応じて
展開した核酸をナイロンフィルター等に移し取り、一本
鎖にディネーチャーした後、例えば、ラジオアイソトー
プ標識したプローブ核酸を作用させ、形成したハイブリ
ッド体をオートラジオグラフィーで検出するというもの
である。
ゼーション法で、これは、ゲル電気泳動で鎖長に応じて
展開した核酸をナイロンフィルター等に移し取り、一本
鎖にディネーチャーした後、例えば、ラジオアイソトー
プ標識したプローブ核酸を作用させ、形成したハイブリ
ッド体をオートラジオグラフィーで検出するというもの
である。
【０００８】上記方法の、ラジオアイソトープを使用す
る問題点を解決するために、化学的な発色を検出手段と
する改良法も実用化されている。
る問題点を解決するために、化学的な発色を検出手段と
する改良法も実用化されている。
【０００９】近年では、さらに簡便に特定の遺伝子を検
出する手段として、マイクロプレート表面にプローブ核
酸を固定し、ここに例えば、ｍＲＮＡの標的核酸を作用
させ、形成したハイブリッド体を、二本鎖核酸に特異的
に作用し蛍光が増大する色素、例えば、エチジウムブロ
マイド(以下ＥＢと呼ぶ)によって検出するという手法も
開発されている(特表平７−５０６４８２号公報)。
出する手段として、マイクロプレート表面にプローブ核
酸を固定し、ここに例えば、ｍＲＮＡの標的核酸を作用
させ、形成したハイブリッド体を、二本鎖核酸に特異的
に作用し蛍光が増大する色素、例えば、エチジウムブロ
マイド(以下ＥＢと呼ぶ)によって検出するという手法も
開発されている(特表平７−５０６４８２号公報)。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】これまで述べてきたよ
うに二本鎖核酸に溶液中で作用して、蛍光を増大する色
素、もしくは、はじめて蛍光を発する色素は知れている
が、いずれも溶液中での蛍光挙動が知られているのみで
あった。
うに二本鎖核酸に溶液中で作用して、蛍光を増大する色
素、もしくは、はじめて蛍光を発する色素は知れている
が、いずれも溶液中での蛍光挙動が知られているのみで
あった。
【００１１】通常、蛍光色素の蛍光特性(強度、励起/蛍
光スペクトル等)は色素が溶解した試料溶液約１〜４ｍL
を測定用のガラスセルを用いて、一般的には蛍光光度計
で測定する。また、２００μL程度の微小セルも市販さ
れている。また、最近では最多９６穴のプラスチック製
のマイクロプレート中の各々約１００〜２５０μLの試
料溶液を自動的に連続して測定する装置も数社から市販
されている(例:Ｃyto Ｆluor、日本パーセプティブリ
ミテッド)。
光スペクトル等)は色素が溶解した試料溶液約１〜４ｍL
を測定用のガラスセルを用いて、一般的には蛍光光度計
で測定する。また、２００μL程度の微小セルも市販さ
れている。また、最近では最多９６穴のプラスチック製
のマイクロプレート中の各々約１００〜２５０μLの試
料溶液を自動的に連続して測定する装置も数社から市販
されている(例:Ｃyto Ｆluor、日本パーセプティブリ
ミテッド)。
【００１２】これらの測定は上述のようにいずれも溶液
中の試料溶液を測定するために測定容器に制限があり、
また、マイクロプレートで測定する際には励起光を液面
方向から照射すると表面で乱反射、散乱が起こるなどの
問題があり通常はプレート裏面から照射せざるを得ない
等の問題点もあった。
中の試料溶液を測定するために測定容器に制限があり、
また、マイクロプレートで測定する際には励起光を液面
方向から照射すると表面で乱反射、散乱が起こるなどの
問題があり通常はプレート裏面から照射せざるを得ない
等の問題点もあった。
【００１３】また、試料溶液量が０.５〜５μL程度のご
く微量となると測定容器に制限があるばかりではなく、
これを顕微鏡を用いて測光しようとすると上述の励起方
向の問題点のほかに、試料が乾燥してしまい代表的な蛍
光色素ＦIＴＣ(fluoresceinisothiocyanate)であっても
蛍光が消光する等の問題点もあった。
く微量となると測定容器に制限があるばかりではなく、
これを顕微鏡を用いて測光しようとすると上述の励起方
向の問題点のほかに、試料が乾燥してしまい代表的な蛍
光色素ＦIＴＣ(fluoresceinisothiocyanate)であっても
蛍光が消光する等の問題点もあった。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの問
題点に鑑み、特に二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核酸
を検出/定量するに当たり、鋭意検討した結果本発明を
為すに至った。本発明の標的核酸の検出方法は以下の工
程から構成される。
題点に鑑み、特に二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核酸
を検出/定量するに当たり、鋭意検討した結果本発明を
為すに至った。本発明の標的核酸の検出方法は以下の工
程から構成される。
【００１５】(１)観察用の清浄な固相基板上に、検出ま
たは定量対象である一定量の試料溶液由来の標的核酸
(Ａ)と、該標的核酸の塩基配列の特定の部位に相補的な
塩基配列を有するプローブ核酸(Ｂ)とが相互に作用して
標的核酸(Ａ)とプローブ核酸(Ｂ)のハイブリッド体(Ｃ)
が形成されており、かつ、該ハイブリッド体(Ｃ)に作用
し、作用した結果、蛍光を発するか、または、蛍光が増
大し、かつ、該ハイブリッド体に作用した状態で、乾燥
状態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素(Ｄ)が
該ハイブリッド体(Ｃ)に対して作用可能な状態で存在す
る状態を実現する工程 (２)該基板上でハイブリッド体(Ｃ)および蛍光色素(Ｄ)
を乾燥させる工程 (３)乾燥後に観測手段である蛍光色素(Ｄ)からの蛍光を
測定する工程
たは定量対象である一定量の試料溶液由来の標的核酸
(Ａ)と、該標的核酸の塩基配列の特定の部位に相補的な
塩基配列を有するプローブ核酸(Ｂ)とが相互に作用して
標的核酸(Ａ)とプローブ核酸(Ｂ)のハイブリッド体(Ｃ)
が形成されており、かつ、該ハイブリッド体(Ｃ)に作用
し、作用した結果、蛍光を発するか、または、蛍光が増
大し、かつ、該ハイブリッド体に作用した状態で、乾燥
状態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素(Ｄ)が
該ハイブリッド体(Ｃ)に対して作用可能な状態で存在す
る状態を実現する工程 (２)該基板上でハイブリッド体(Ｃ)および蛍光色素(Ｄ)
を乾燥させる工程 (３)乾燥後に観測手段である蛍光色素(Ｄ)からの蛍光を
測定する工程
【００１６】
【発明の実施の形態】前記工程(１)において、ハイブリ
ッド体(Ｃ)の形成(１-１)と、蛍光色素(Ｄ)のハイブリ
ッド体(Ｃ)への作用(１-２)は、(a)前記試料溶液中に溶
存した状態で行なっても、また、(b)前記基板上に固定
された状態で行なってもよい。
ッド体(Ｃ)の形成(１-１)と、蛍光色素(Ｄ)のハイブリ
ッド体(Ｃ)への作用(１-２)は、(a)前記試料溶液中に溶
存した状態で行なっても、また、(b)前記基板上に固定
された状態で行なってもよい。
【００１７】後者(b)の場合には、標的核酸(Ｂ)、プロ
ーブ核酸(Ａ)のいずれか一方をあらかじめ前記観察用の
清浄な固相基板の表面に固定化する工程(１-０)、(１-
０')を有しており、その後もう一方の溶液を作用させる
ことでハイブリッド体(Ｃ)の形成(１-１)を行ない、続
けて蛍光色素(Ｄ)のハイブリッド体(Ｃ)への作用(１-
２)を行なう。
ーブ核酸(Ａ)のいずれか一方をあらかじめ前記観察用の
清浄な固相基板の表面に固定化する工程(１-０)、(１-
０')を有しており、その後もう一方の溶液を作用させる
ことでハイブリッド体(Ｃ)の形成(１-１)を行ない、続
けて蛍光色素(Ｄ)のハイブリッド体(Ｃ)への作用(１-
２)を行なう。
【００１８】この時、必要に応じ以下の洗浄工程を加え
てもよい、 (１-１'):ハイブリッド体(Ｃ)形成(１-１)の後、蛍光色
素(Ｄ)のハイブリッド体(Ｃ)への作用(１-２)の前に、
ハイブリッド体(Ｃ)以外の溶液中の核酸を洗いの操作に
よって除去する工程 (１-３):蛍光色素(Ｄ)のハイブリッド体(Ｃ)への作用
(１-２)の後に、ハイブリッド体(Ｃ)に作用しなかった
蛍光色素(Ｄ)を洗いの操作によって除去する工程 (１-４):前記工程(１)と(２)の間において、ハイブリッ
ド体(Ｃ)と、ハイブリッド体(Ｃ)に作用した蛍光色素
(Ｄ)を包括する溶媒をガス流により除去する工程 (b)ではプローブ核酸(Ｂ)を固相に固定化するか、ある
いは、標的核酸(Ａ)を固相に固定化するかの違いはあっ
ても、最終的に固相の表面に形成された標的核酸とプロ
ーブ核酸のハイブリッド体(Ｃ)を検出する手段には基本
的に差はない。本発明の方法によれば最終的に標的核酸
とプローブ核酸のハイブリッド体(Ｃ)と該ハイブリッド
体に作用した蛍光色素(Ｄ)が基板表面に一定の面積をも
って薄膜状に乾燥した状態で存在するので、試料の取り
扱いが容易であるばかりでなく、液体が存在しないので
励起の方向に制限がない。また、乾燥した状態で蛍光を
計測するので試料容器の制限が大幅に緩和される。
てもよい、 (１-１'):ハイブリッド体(Ｃ)形成(１-１)の後、蛍光色
素(Ｄ)のハイブリッド体(Ｃ)への作用(１-２)の前に、
ハイブリッド体(Ｃ)以外の溶液中の核酸を洗いの操作に
よって除去する工程 (１-３):蛍光色素(Ｄ)のハイブリッド体(Ｃ)への作用
(１-２)の後に、ハイブリッド体(Ｃ)に作用しなかった
蛍光色素(Ｄ)を洗いの操作によって除去する工程 (１-４):前記工程(１)と(２)の間において、ハイブリッ
ド体(Ｃ)と、ハイブリッド体(Ｃ)に作用した蛍光色素
(Ｄ)を包括する溶媒をガス流により除去する工程 (b)ではプローブ核酸(Ｂ)を固相に固定化するか、ある
いは、標的核酸(Ａ)を固相に固定化するかの違いはあっ
ても、最終的に固相の表面に形成された標的核酸とプロ
ーブ核酸のハイブリッド体(Ｃ)を検出する手段には基本
的に差はない。本発明の方法によれば最終的に標的核酸
とプローブ核酸のハイブリッド体(Ｃ)と該ハイブリッド
体に作用した蛍光色素(Ｄ)が基板表面に一定の面積をも
って薄膜状に乾燥した状態で存在するので、試料の取り
扱いが容易であるばかりでなく、液体が存在しないので
励起の方向に制限がない。また、乾燥した状態で蛍光を
計測するので試料容器の制限が大幅に緩和される。
【００１９】もちろん、工程(２)に入る前までに用いる
各種溶液の量が比較的多ければ、それに対応した凹部を
有する容器が必要であるが、使用する各種溶液の量が十
分に少量であれば平面状の基板でも差し支えない。
各種溶液の量が比較的多ければ、それに対応した凹部を
有する容器が必要であるが、使用する各種溶液の量が十
分に少量であれば平面状の基板でも差し支えない。
【００２０】ただし、(a)の場合、定量的な評価が必要
な場合には滴下した液の面積を特定できる微小な凹部は
必要となる。
な場合には滴下した液の面積を特定できる微小な凹部は
必要となる。
【００２１】さらに、本発明によれば溶液中の標的核酸
にプローブ核酸とのハイブリッド体(Ｃ)に作用した結
果、蛍光を発する、または、蛍光が増大する色素(Ｄ)を
該標的核酸に作用させるので原理的にはハイブリッド体
に作用しなかった蛍光色素(Ｄ)を洗いの操作によって除
く必要がない。
にプローブ核酸とのハイブリッド体(Ｃ)に作用した結
果、蛍光を発する、または、蛍光が増大する色素(Ｄ)を
該標的核酸に作用させるので原理的にはハイブリッド体
に作用しなかった蛍光色素(Ｄ)を洗いの操作によって除
く必要がない。
【００２２】ただし、(b)の方法では最終的に検出すべ
きハイブリッド体(Ｃ)が固相表面に固定化されるので、
特に、ハイブリッド体に作用して蛍光が増大するタイプ
の蛍光色素を用いる場合には、バックグラウンドを低減
するために、必要により洗いの操作によってハイブリッ
ド体に作用しなかった色素を除去することも容易とな
り、さらに、同様にバックグラウンドの低減のために、
固相上に形成されたハイブリッド以外の核酸を洗いの操
作によって除去することも容易となる。
きハイブリッド体(Ｃ)が固相表面に固定化されるので、
特に、ハイブリッド体に作用して蛍光が増大するタイプ
の蛍光色素を用いる場合には、バックグラウンドを低減
するために、必要により洗いの操作によってハイブリッ
ド体に作用しなかった色素を除去することも容易とな
り、さらに、同様にバックグラウンドの低減のために、
固相上に形成されたハイブリッド以外の核酸を洗いの操
作によって除去することも容易となる。
【００２３】また、本発明の方法によれば、二本鎖核酸
やハイブリッド体に作用した状態で、乾燥状態において
も蛍光の発光が維持可能な蛍光色素(Ｄ)を用いるので上
述したような乾燥による蛍光の消光の問題点も原理的に
回避可能である。
やハイブリッド体に作用した状態で、乾燥状態において
も蛍光の発光が維持可能な蛍光色素(Ｄ)を用いるので上
述したような乾燥による蛍光の消光の問題点も原理的に
回避可能である。
【００２４】本発明に用いる蛍光色素は溶液中のハイブ
リッド体に作用した結果、蛍光を発する、または、蛍光
が増大し、かつ、ハイブリッド体に作用した状態で、乾
燥状態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素であ
ればいかようなものでもかまわない。
リッド体に作用した結果、蛍光を発する、または、蛍光
が増大し、かつ、ハイブリッド体に作用した状態で、乾
燥状態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素であ
ればいかようなものでもかまわない。
【００２５】本発明に用いる蛍光色素が核酸ハイブリッ
ド体と作用し、その乾燥状態においても蛍光の発光を維
持する機構は定かではないが、蛍光強度が強く(別の見
方をすれば蛍光の量子収率が高い)、かつ、溶液中では
比較的安定なＦIＴＣやローダミンのそれぞれ単独の溶
液が乾燥状態に置くと速やかに消光すること考えると、
本発明の蛍光色素が核酸ハイブリッド体に作用した結
果、色素の周囲の微小環境が変化し、蛍光の発光の維持
に適したものとなったのではないかと推察される。その
ような観点からすると本発明の蛍光色素の核酸ハイブリ
ッド体に作用するモードとしては色素分子が核酸ハイブ
リッド体に包括されるタイプが望ましい。そのような作
用モードとしては色素が二本鎖核酸である核酸ハイブリ
ッド体の塩基対間に入り込むインターカレーション、あ
るいは、二本鎖核酸のグルーブに入り込むグルーブバイ
ンディングがある。
ド体と作用し、その乾燥状態においても蛍光の発光を維
持する機構は定かではないが、蛍光強度が強く(別の見
方をすれば蛍光の量子収率が高い)、かつ、溶液中では
比較的安定なＦIＴＣやローダミンのそれぞれ単独の溶
液が乾燥状態に置くと速やかに消光すること考えると、
本発明の蛍光色素が核酸ハイブリッド体に作用した結
果、色素の周囲の微小環境が変化し、蛍光の発光の維持
に適したものとなったのではないかと推察される。その
ような観点からすると本発明の蛍光色素の核酸ハイブリ
ッド体に作用するモードとしては色素分子が核酸ハイブ
リッド体に包括されるタイプが望ましい。そのような作
用モードとしては色素が二本鎖核酸である核酸ハイブリ
ッド体の塩基対間に入り込むインターカレーション、あ
るいは、二本鎖核酸のグルーブに入り込むグルーブバイ
ンディングがある。
【００２６】本発明者らはこれらのモードで核酸ハイブ
リッド体に作用する色素として、蛍光強度、安定性等を
種々検討した結果、インターカレーターとしてはＥＢ、
２-メチル-４,６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニ
ル)ピリリウム塩、グルーブバインデイングタイプの色
素としてはＹＯＹＯ１が望ましいことを見出した。もっ
とも本発明はこれらの色素に限定されるものではない。
リッド体に作用する色素として、蛍光強度、安定性等を
種々検討した結果、インターカレーターとしてはＥＢ、
２-メチル-４,６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニ
ル)ピリリウム塩、グルーブバインデイングタイプの色
素としてはＹＯＹＯ１が望ましいことを見出した。もっ
とも本発明はこれらの色素に限定されるものではない。
【００２７】本発明によって検出/定量可能となる標的
核酸としてはプローブ核酸とハイブリッドを形成するも
のであればどのようなものでも構わない。ＤＮＡ、ＲＮ
Ａともに本発明の標的核酸となりうる。
核酸としてはプローブ核酸とハイブリッドを形成するも
のであればどのようなものでも構わない。ＤＮＡ、ＲＮ
Ａともに本発明の標的核酸となりうる。
【００２８】ただし、(a)の場合は、溶液中に標的核酸
とプローブ核酸のハイブリッド体以外の二本鎖核酸が存
在すると、原理的に該二本鎖核酸も検出してしまうの
で、該二本鎖核酸を弁別、除去する必要がある。こうし
た操作を排除するためにはあらかじめ一本鎖に分離した
標的核酸を用いるか、あるいは、はじめから一本鎖であ
るＲＮＡを標的核酸とするのが望ましい。
とプローブ核酸のハイブリッド体以外の二本鎖核酸が存
在すると、原理的に該二本鎖核酸も検出してしまうの
で、該二本鎖核酸を弁別、除去する必要がある。こうし
た操作を排除するためにはあらかじめ一本鎖に分離した
標的核酸を用いるか、あるいは、はじめから一本鎖であ
るＲＮＡを標的核酸とするのが望ましい。
【００２９】さらに、ＲＮＡのなかではtＲＮＡ、rＲＮ
Ａに比較して部分的な二本鎖部分が少ないｍＲＮＡを標
的核酸とするのがさらに望ましい。
Ａに比較して部分的な二本鎖部分が少ないｍＲＮＡを標
的核酸とするのがさらに望ましい。
【００３０】一方、(b)の方法によれば、先述のよう
に、ハイブリッド体以外の核酸の洗浄による除去が容易
であるので、ハイブリダイゼーションの条件をコントロ
ールすることにより、一本鎖核酸、二本鎖核酸、双方と
もそのまま検出対象となりうる。より簡便な検出を可能
とする意味では一本鎖核酸のほうが望ましいといえる
が、基本的には差はない。一本鎖核酸の場合には(a)の
場合と同様に部分的な二本鎖部分が少なく、アミノ酸配
列を直接コードするｍＲＮＡがなかでも望ましい。本発
明の(b)の方法において用いる最終的に標的核酸とプロ
ーブ核酸のハイブリッド体が固定化される基板は該ハイ
ブリッド体が結合可能なものであればいかようなもので
も構わないが、例えば、合成石英、溶融石英等のガラス
基板、アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレン等の
樹脂基板を用いることが可能である。
に、ハイブリッド体以外の核酸の洗浄による除去が容易
であるので、ハイブリダイゼーションの条件をコントロ
ールすることにより、一本鎖核酸、二本鎖核酸、双方と
もそのまま検出対象となりうる。より簡便な検出を可能
とする意味では一本鎖核酸のほうが望ましいといえる
が、基本的には差はない。一本鎖核酸の場合には(a)の
場合と同様に部分的な二本鎖部分が少なく、アミノ酸配
列を直接コードするｍＲＮＡがなかでも望ましい。本発
明の(b)の方法において用いる最終的に標的核酸とプロ
ーブ核酸のハイブリッド体が固定化される基板は該ハイ
ブリッド体が結合可能なものであればいかようなもので
も構わないが、例えば、合成石英、溶融石英等のガラス
基板、アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレン等の
樹脂基板を用いることが可能である。
【００３１】その際、本発明の方法によれば蛍光検出時
の励起光の照射方向に関する制限が緩和されるが、仮
に、検出すべき物質の基板に対して裏面から照射する蛍
光顕微鏡等を用いる場合には励起光と、放出され蛍光の
波長に対して光学的に透明であることが要求される。
の励起光の照射方向に関する制限が緩和されるが、仮
に、検出すべき物質の基板に対して裏面から照射する蛍
光顕微鏡等を用いる場合には励起光と、放出され蛍光の
波長に対して光学的に透明であることが要求される。
【００３２】一方、検出すべき物質側から励起光を照射
する場合においても励起光の散乱を考慮すれば、上記の
ように光学的に透明であるか、あるいは、黒色鏡面体、
黒色艶消面体のように反射をある程度制御可能な基板が
望ましい。半透明な基板は特に励起光の散乱を考慮する
と望ましい基板とはいえない。
する場合においても励起光の散乱を考慮すれば、上記の
ように光学的に透明であるか、あるいは、黒色鏡面体、
黒色艶消面体のように反射をある程度制御可能な基板が
望ましい。半透明な基板は特に励起光の散乱を考慮する
と望ましい基板とはいえない。
【００３３】また、本発明に用いる標的核酸、あるい
は、プローブ核酸の基板への結合方法は、標的核酸、あ
るいは、プローブ核酸が基板に結合可能で、その状態で
それぞれプローブ核酸、あるいは、標的核酸とハイブリ
ッドの形成が可能で、かつ、本発明の方法に基づいて該
ハイブリッド体が検出/定量可能な方法であればいかよ
うなものであっても構わない。
は、プローブ核酸の基板への結合方法は、標的核酸、あ
るいは、プローブ核酸が基板に結合可能で、その状態で
それぞれプローブ核酸、あるいは、標的核酸とハイブリ
ッドの形成が可能で、かつ、本発明の方法に基づいて該
ハイブリッド体が検出/定量可能な方法であればいかよ
うなものであっても構わない。
【００３４】その際、前記サザーンハイブリダイゼーシ
ョンに用いられているナイロンフィルター等も原理的に
は使用可能ではあるがハイブリダイゼーションの効率、
あるいは、先述の蛍光検出方法を考慮すれば光学的検出
に有利な基板上に標的核酸、あるいは、プローブ核酸を
共有結合させる方法が望ましい。
ョンに用いられているナイロンフィルター等も原理的に
は使用可能ではあるがハイブリダイゼーションの効率、
あるいは、先述の蛍光検出方法を考慮すれば光学的検出
に有利な基板上に標的核酸、あるいは、プローブ核酸を
共有結合させる方法が望ましい。
【００３５】そのような方法のために近年、住友ベーク
ライト株式会社から表面にアミノ基を結合したポリスチ
レン製のマイクロプレート(商品名:スミロンＮ)、ある
いは、カルボキシル基を結合した同じくポリスチレン製
のマイクロプレート(商品名:スミロンＣ)が市販されて
いる。
ライト株式会社から表面にアミノ基を結合したポリスチ
レン製のマイクロプレート(商品名:スミロンＮ)、ある
いは、カルボキシル基を結合した同じくポリスチレン製
のマイクロプレート(商品名:スミロンＣ)が市販されて
いる。
【００３６】上記アミノ基と核酸の５'末端の水酸基を
カルボニルジイミダゾールで活性化してペプチド結合さ
せる方法、あるいは、上記カルボキシル基を前記特表平
７−５０６４８２号公報に記載の方法により１級アミノ
基を結合した核酸と結合する方法により核酸を結合する
ことができる。あるいは、上記カルボキシル基をマレイ
ミド化した後、スルフィドリル基を結合した核酸を結合
する方法も用いることができる。
カルボニルジイミダゾールで活性化してペプチド結合さ
せる方法、あるいは、上記カルボキシル基を前記特表平
７−５０６４８２号公報に記載の方法により１級アミノ
基を結合した核酸と結合する方法により核酸を結合する
ことができる。あるいは、上記カルボキシル基をマレイ
ミド化した後、スルフィドリル基を結合した核酸を結合
する方法も用いることができる。
【００３７】また、ガラス基板上にアミノシランカップ
リング剤を塗布した後、上記方法と同様にアミノ基と核
酸を結合する方法、あるいは、グリシジルシランカップ
リング剤を塗布した後、エポキシ基と核酸に結合したア
ミノ基、あるいは、核酸塩基のアミノ基と、ハイブリダ
イゼーションに支障のない形態で結合する方法も使用可
能である。
リング剤を塗布した後、上記方法と同様にアミノ基と核
酸を結合する方法、あるいは、グリシジルシランカップ
リング剤を塗布した後、エポキシ基と核酸に結合したア
ミノ基、あるいは、核酸塩基のアミノ基と、ハイブリダ
イゼーションに支障のない形態で結合する方法も使用可
能である。
【００３８】基板の状態は、流動性を有している水の存
在による蛍光測定への障害、あるいは水分を含むことに
よる蛍光測定への障害を排除する乾燥状態であればよ
い。例えば実際の測定に用いるサンプルと同じものを作
成し、実際と同じ乾燥方法で予備乾燥実験を行ない、該
乾燥したサンプルについてＮＭＲを測定し、その結果に
基づいて水が測定に障害とならない程度に十分除去され
る乾燥条件を決定すればよい。
在による蛍光測定への障害、あるいは水分を含むことに
よる蛍光測定への障害を排除する乾燥状態であればよ
い。例えば実際の測定に用いるサンプルと同じものを作
成し、実際と同じ乾燥方法で予備乾燥実験を行ない、該
乾燥したサンプルについてＮＭＲを測定し、その結果に
基づいて水が測定に障害とならない程度に十分除去され
る乾燥条件を決定すればよい。
【００３９】具体的乾燥方法としては下記実施例で用い
られる真空ポンプでのドライアップが挙げられるが、同
様の効果を奏するものなら特に制限はない。
られる真空ポンプでのドライアップが挙げられるが、同
様の効果を奏するものなら特に制限はない。
【００４０】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明
する。
する。
【００４１】[実施例１] ＥＢ、２-メチル-４,６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノ
フェニル)ピリリウムアイオダイド(以下Ｐ２と呼ぶ)、
ＹＯＹＯ１によるオリゴデオキシヌクレオチドの検出 (１)モデル標的核酸として一本鎖ＤＮＡであるＭ１３ｍ
p１８の塩基配列の特定の一部分と全く同一の塩基配列
を有する２０量体のオリゴデオキシヌクレオチドを入手
した(関東化学株式会社)。塩基配列を以下に示す。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) このオリゴヌクレオチドの水溶液と水とを適宜混合する
ことにより塩基として１００μＭのモデル標的核酸のス
トック溶液とした。
フェニル)ピリリウムアイオダイド(以下Ｐ２と呼ぶ)、
ＹＯＹＯ１によるオリゴデオキシヌクレオチドの検出 (１)モデル標的核酸として一本鎖ＤＮＡであるＭ１３ｍ
p１８の塩基配列の特定の一部分と全く同一の塩基配列
を有する２０量体のオリゴデオキシヌクレオチドを入手
した(関東化学株式会社)。塩基配列を以下に示す。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) このオリゴヌクレオチドの水溶液と水とを適宜混合する
ことにより塩基として１００μＭのモデル標的核酸のス
トック溶液とした。
【００４２】(２)プローブ核酸として上記モデル標的核
酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する２０量体のオ
リゴデオキシヌクレオチドを同じく入手し、(１)と同様
に塩基として１００μＭのプローブ核酸のストック溶液
とした。塩基配列を以下に示す。 ３'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ５'(配
列番号２) (３)ＥＢ(シグマアルドリッチジャパン)４ｍgをＤＭＳ
Ｏ １ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加えた。この溶液
をさらに水で１００倍に希釈し、１０μＭのストック溶
液とした。
酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する２０量体のオ
リゴデオキシヌクレオチドを同じく入手し、(１)と同様
に塩基として１００μＭのプローブ核酸のストック溶液
とした。塩基配列を以下に示す。 ３'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ５'(配
列番号２) (３)ＥＢ(シグマアルドリッチジャパン)４ｍgをＤＭＳ
Ｏ １ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加えた。この溶液
をさらに水で１００倍に希釈し、１０μＭのストック溶
液とした。
【００４３】(４)Ｐ２(本発明者らが合成)５ｍgをアセ
トニトリル１ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加えた。こ
の溶液をさらに水で１００倍に希釈することにより１０
μＭストック溶液とした。
トニトリル１ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加えた。こ
の溶液をさらに水で１００倍に希釈することにより１０
μＭストック溶液とした。
【００４４】(５)ＹＯＹＯ１(Ｍolecular Ｐrobe社
１ｍＭ/ＤＭＳＯ)を水で１００倍希釈して１０μＭのス
トック溶液とした。
１ｍＭ/ＤＭＳＯ)を水で１００倍希釈して１０μＭのス
トック溶液とした。
【００４５】(６)モデル標的核酸溶液０、２、５、１０
μL(色素溶液を加えた段階での最終濃度０、２.０、５.
０、１０.０μＭ)、プローブ核酸溶液１５μL(最終濃度
１５μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液(p
Ｈ７.５)を混合し、水を加えて９０μLとした後アニー
ルし最終４℃まで冷却した。
μL(色素溶液を加えた段階での最終濃度０、２.０、５.
０、１０.０μＭ)、プローブ核酸溶液１５μL(最終濃度
１５μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液(p
Ｈ７.５)を混合し、水を加えて９０μLとした後アニー
ルし最終４℃まで冷却した。
【００４６】(７)上記ＤＮＡ溶液に各色素溶液１０μL
(最終濃度１μＭ)を加えた。
(最終濃度１μＭ)を加えた。
【００４７】(８)適宜洗浄、乾燥した厚さ１ｍｍの透明
アクリル基板(旭化成 デラグラスＡ)に(５)の溶液を
０.５μL載せた。この状態のものと、別に、同様の操作
をし真空ポンプでドライアップしたものとの蛍光を観
察、蛍光強度を測定した。
アクリル基板(旭化成 デラグラスＡ)に(５)の溶液を
０.５μL載せた。この状態のものと、別に、同様の操作
をし真空ポンプでドライアップしたものとの蛍光を観
察、蛍光強度を測定した。
【００４８】蛍光の観察にはオリンパス倒立型蛍光顕微
鏡IＭＴ２(対物レンズ１０倍)を使用した。蛍光観察用
のフィルターキューブはＥＢの場合にはＧ励起フィルタ
ーを、ＹＯＹＯ１の場合にはＢ励起フィルターを、ま
た、Ｐ２の場合には特別に製作(朝日分光株式会社 励
起:５８０nｍ、蛍光５４０nｍ、ダイクロイックミラー
６１０nｍ)したものを使用した。
鏡IＭＴ２(対物レンズ１０倍)を使用した。蛍光観察用
のフィルターキューブはＥＢの場合にはＧ励起フィルタ
ーを、ＹＯＹＯ１の場合にはＢ励起フィルターを、ま
た、Ｐ２の場合には特別に製作(朝日分光株式会社 励
起:５８０nｍ、蛍光５４０nｍ、ダイクロイックミラー
６１０nｍ)したものを使用した。
【００４９】蛍光強度の測定には上記蛍光顕微鏡と中継
レンズ(ＮＦＫ ２.５×ＬＤ)を介して、イメージイン
テンシファイヤー付きＣＣＤ(浜松ホトニクス IＣＣＤ
Ｃ２４００-８７)と画像処理装置(浜松ホトニクス
Ａrgus５０)を使用した。
レンズ(ＮＦＫ ２.５×ＬＤ)を介して、イメージイン
テンシファイヤー付きＣＣＤ(浜松ホトニクス IＣＣＤ
Ｃ２４００-８７)と画像処理装置(浜松ホトニクス
Ａrgus５０)を使用した。
【００５０】蛍光強度の測定領域は平均的な明るさで、
ある程度均一と判断される２００×２００μｍの領域
で、値は領域中の画素(２×２μｍ)の平均値を採用し
た。
ある程度均一と判断される２００×２００μｍの領域
で、値は領域中の画素(２×２μｍ)の平均値を採用し
た。
【００５１】また、イメージインテンシファイヤーの増
幅度は表示値０.２である。なお、各々の色素の蛍光強
度値はフィルターの分光特性がそれぞれ異なり、また、
励起光源(高圧水銀ランプ)が輝線から構成されること、
さらにはIＣＣＤカメラの感度に波長依存性があるので
直接比較することはできない。
幅度は表示値０.２である。なお、各々の色素の蛍光強
度値はフィルターの分光特性がそれぞれ異なり、また、
励起光源(高圧水銀ランプ)が輝線から構成されること、
さらにはIＣＣＤカメラの感度に波長依存性があるので
直接比較することはできない。
【００５２】得られた蛍光強度値を図１(溶液)、図２
(乾式)に示す。図１、図２よりＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１
を用いて、蛍光強度の差、直線性に差が見られるものの
ドライアップ状態でのモデル標的核酸の検出/定量が可
能であることがわかる。また、使用した三種の色素を比
較するとＥＢ、ＹＯＹＯ１ではドライアップした際の消
光の度合いが強く、特に、ＥＢではその傾向が強い。そ
れに比べるとＰ２では相対的に乾燥時のクエンチングの
度合いが弱く、本発明の測定方式に適合しているといえ
る。
(乾式)に示す。図１、図２よりＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１
を用いて、蛍光強度の差、直線性に差が見られるものの
ドライアップ状態でのモデル標的核酸の検出/定量が可
能であることがわかる。また、使用した三種の色素を比
較するとＥＢ、ＹＯＹＯ１ではドライアップした際の消
光の度合いが強く、特に、ＥＢではその傾向が強い。そ
れに比べるとＰ２では相対的に乾燥時のクエンチングの
度合いが弱く、本発明の測定方式に適合しているといえ
る。
【００５３】[実施例２] ＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１による標的ＤＮＡの検出 (１)標的核酸として一本鎖ＤＮＡであるＭ１３ｍp１８
を入手した(宝酒造株式会社)。標的とする塩基配列は以
下に示したように実施例１と同一である。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) このＤＮＡの水溶液と水とを適宜混合することにより標
的部分の塩基として１０μＭの標的核酸のストック溶液
とした。なお、実施例１と比較して標的部分の塩基とし
ての濃度を希薄なものとしたのはＭ１３ｍp１８が７２
４９塩基からなっているため、核酸としての濃度を適当
に保つためである。
を入手した(宝酒造株式会社)。標的とする塩基配列は以
下に示したように実施例１と同一である。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) このＤＮＡの水溶液と水とを適宜混合することにより標
的部分の塩基として１０μＭの標的核酸のストック溶液
とした。なお、実施例１と比較して標的部分の塩基とし
ての濃度を希薄なものとしたのはＭ１３ｍp１８が７２
４９塩基からなっているため、核酸としての濃度を適当
に保つためである。
【００５４】(２)プローブ核酸のストック溶液として実
施例１と同様に以下の塩基配列を有するオリゴデオキシ
ヌクレオチドの１０μＭの水溶液を調製した。 ３'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ５'(配
列番号２) (３)実施例１と同様に、ＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１の１０
μＭのストック溶液を調製した。
施例１と同様に以下の塩基配列を有するオリゴデオキシ
ヌクレオチドの１０μＭの水溶液を調製した。 ３'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ５'(配
列番号２) (３)実施例１と同様に、ＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１の１０
μＭのストック溶液を調製した。
【００５５】(４)標的核酸溶液０、２、５、１０μL(色
素溶液を加えた段階での最終濃度０、０.２、０.５、
１.０μＭ)、プローブ核酸溶液１５μL(最終濃度１.５
μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液(pＨ７.
５)を混合し、水を加えて９９μLとした後アニールし最
終４℃まで冷却した。
素溶液を加えた段階での最終濃度０、０.２、０.５、
１.０μＭ)、プローブ核酸溶液１５μL(最終濃度１.５
μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液(pＨ７.
５)を混合し、水を加えて９９μLとした後アニールし最
終４℃まで冷却した。
【００５６】(５)上記ＤＮＡ溶液に各色素溶液１.０μL
(最終濃度０.１μＭ)を加えた。
(最終濃度０.１μＭ)を加えた。
【００５７】(６)実施例１と同様に試料をドライアップ
した状態での蛍光強度を測定した。ただし、標的ＤＮＡ
濃度が低いのでイメージインテンシファイヤーの増幅度
を表示値で１.０とした。
した状態での蛍光強度を測定した。ただし、標的ＤＮＡ
濃度が低いのでイメージインテンシファイヤーの増幅度
を表示値で１.０とした。
【００５８】測定結果を図３に示す。図３から本発明の
方法により標的一本鎖ＤＮＡの検出/定量が可能である
ことがわかる。
方法により標的一本鎖ＤＮＡの検出/定量が可能である
ことがわかる。
【００５９】[実施例３] Ｐ２による標的ｍＲＮＡの検出 (１)常法によりヒトβ2アドレナリン作用受容体cＤＮＡ
からＴ7ＲＮＡポリメレースを用いてヒトβ2アドレナリ
ン作用受容体ｍＲＮＡを合成し、ＤＮase処理後精製し
た。ｍＲＮＡの水溶液と水とを適宜混合することにより
標的部分の塩基として１０μＭの標的核酸のストック溶
液とした。
からＴ7ＲＮＡポリメレースを用いてヒトβ2アドレナリ
ン作用受容体ｍＲＮＡを合成し、ＤＮase処理後精製し
た。ｍＲＮＡの水溶液と水とを適宜混合することにより
標的部分の塩基として１０μＭの標的核酸のストック溶
液とした。
【００６０】該ｍＲＮＡの標的塩基配列部分を以下に示
した。 ５'ＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴ３'
(配列番号３) (２)プローブ核酸のストック溶液として以下の塩基配列
を有するオリゴデオキシヌクレオチド(関東化学株式会
社から入手)の１０μＭの水溶液を調製した。 ３'ＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＧＣＣＧＧＴＣＧＴＡ５'
(配列番号４) (３)実施例１と同様にＰ２の１０μＭのストック溶液を
調製した。
した。 ５'ＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴ３'
(配列番号３) (２)プローブ核酸のストック溶液として以下の塩基配列
を有するオリゴデオキシヌクレオチド(関東化学株式会
社から入手)の１０μＭの水溶液を調製した。 ３'ＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＧＣＣＧＧＴＣＧＴＡ５'
(配列番号４) (３)実施例１と同様にＰ２の１０μＭのストック溶液を
調製した。
【００６１】(４)標的核酸溶液０、２、５、１０μL(色
素溶液を加えた段階での最終濃度０、０.２、０.５、
１.０μＭ)、プローブ核酸溶液１５μL(最終濃度１.５
μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液(pＨ７.
５)を混合し、水を加えて９０μLとした後アニールし最
終４℃まで冷却した。
素溶液を加えた段階での最終濃度０、０.２、０.５、
１.０μＭ)、プローブ核酸溶液１５μL(最終濃度１.５
μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液(pＨ７.
５)を混合し、水を加えて９０μLとした後アニールし最
終４℃まで冷却した。
【００６２】(５)上記ＤＮＡ溶液にＰ２溶液１.０μL
(最終濃度０.１μＭ)を加えた。
(最終濃度０.１μＭ)を加えた。
【００６３】(６)実施例２と同様に試料をドライアップ
した状態での蛍光強度を測定した。測定結果を図４に示
す。図４から本発明の方法により標的ｍＲＮＡの検出/
定量が可能であることがわかる。
した状態での蛍光強度を測定した。測定結果を図４に示
す。図４から本発明の方法により標的ｍＲＮＡの検出/
定量が可能であることがわかる。
【００６４】[実施例４] ＥＢ、２-メチル-４,６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノ
フェニル)ピリリウムアイオダイド(以下Ｐ２と呼ぶ)、
ＹＯＹＯ１によるオリゴデオキシヌクレオチドの検出
(プローブ核酸固定) (１)モデル標的核酸として実施例１で用いたものと同じ
２０量体のオリゴデオキシヌクレオチドを用いた(関東
化学株式会社)。塩基配列を以下に示す。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) このオリゴヌクレオチドの水溶液と水とを適宜混合する
ことにより塩基として１００μＭのモデル標的核酸のス
トック溶液とした。
フェニル)ピリリウムアイオダイド(以下Ｐ２と呼ぶ)、
ＹＯＹＯ１によるオリゴデオキシヌクレオチドの検出
(プローブ核酸固定) (１)モデル標的核酸として実施例１で用いたものと同じ
２０量体のオリゴデオキシヌクレオチドを用いた(関東
化学株式会社)。塩基配列を以下に示す。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) このオリゴヌクレオチドの水溶液と水とを適宜混合する
ことにより塩基として１００μＭのモデル標的核酸のス
トック溶液とした。
【００６５】(２)プローブ核酸として上記モデル標的核
酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する２０量体のオ
リゴデオキシヌクレオチドを同じく入手し、(１)と同様
に塩基として１００μＭのプローブ核酸のストック溶液
とした。なお、固相に共有結合で固定化するために５’
末端にヘキサメチレンをリンカーとするアミノ基を結合
したものを入手し使用した。塩基配列を以下に示す。 3'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ-NH25'
(配列番号２) (３)実施例１と同様に、ＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１の１０
μＭのストック溶液を調製した。
酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する２０量体のオ
リゴデオキシヌクレオチドを同じく入手し、(１)と同様
に塩基として１００μＭのプローブ核酸のストック溶液
とした。なお、固相に共有結合で固定化するために５’
末端にヘキサメチレンをリンカーとするアミノ基を結合
したものを入手し使用した。塩基配列を以下に示す。 3'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ-NH25'
(配列番号２) (３)実施例１と同様に、ＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１の１０
μＭのストック溶液を調製した。
【００６６】(４)公表特許公報の方法に準じ、カルボキ
シ基を表面に結合した９６ウェルマイクロプレート(住
友ベークライト、スミロンＣ)に１-hydroxy-２,５-diox
o-３-pyrrolidinesulfonic acid,ｍonosodiuｍ salt
(シグマアルドリッチジャパン、以下、スルホＮＨＳと
呼ぶ)と１-ethyl-３-(３diｍethylaｍinopropyl)carbod
iiｍide,hydrochloride(シグマアルドリッチジャパン、
以下、ＥＤＣと呼ぶ)を用いて(２)のプローブ核酸を固
定した。
シ基を表面に結合した９６ウェルマイクロプレート(住
友ベークライト、スミロンＣ)に１-hydroxy-２,５-diox
o-３-pyrrolidinesulfonic acid,ｍonosodiuｍ salt
(シグマアルドリッチジャパン、以下、スルホＮＨＳと
呼ぶ)と１-ethyl-３-(３diｍethylaｍinopropyl)carbod
iiｍide,hydrochloride(シグマアルドリッチジャパン、
以下、ＥＤＣと呼ぶ)を用いて(２)のプローブ核酸を固
定した。
【００６７】(５)上記マイクロプレートのウェル中にモ
デル標的核酸溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、
２.０、５.０、１０.０μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔr
is-ＨＣl緩衝液(pＨ７.５)を混合し、水を加えて１００
μLとした後アニールし最終４℃まで冷却した。蛍光を
観察する前までの以下の各工程は４℃で行った。
デル標的核酸溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、
２.０、５.０、１０.０μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔr
is-ＨＣl緩衝液(pＨ７.５)を混合し、水を加えて１００
μLとした後アニールし最終４℃まで冷却した。蛍光を
観察する前までの以下の各工程は４℃で行った。
【００６８】(６)マイクロプレートのウェル表面に結合
しているプローブ核酸量に対して標的核酸量が過剰と考
えられるので、ウェル中の溶液をすて、上記緩衝液１０
０μLで３回洗浄し、ついで、該緩衝溶液を９０μL加え
た。
しているプローブ核酸量に対して標的核酸量が過剰と考
えられるので、ウェル中の溶液をすて、上記緩衝液１０
０μLで３回洗浄し、ついで、該緩衝溶液を９０μL加え
た。
【００６９】(７)上記ＤＮＡ溶液に各色素溶液１０μL
(最終濃度１μＭ)を加えたのち約１０分放置し、色素溶
液を吸引により除去した。
(最終濃度１μＭ)を加えたのち約１０分放置し、色素溶
液を吸引により除去した。
【００７０】(８)上記緩衝溶液１００μLで１回ウェル
内を洗浄し、この溶液を吸引により除去した。
内を洗浄し、この溶液を吸引により除去した。
【００７１】(９)真空ポンプでマイクロプレートをドラ
イアップし実施例１と同様の方法で蛍光を観察、蛍光強
度を測定した。これとは別に、(１０)の工程の後、１０
ｍＭＴris-ＨＣl緩衝液(pＨ７.５)１００μLを加えた溶
液系での蛍光も測定した。ただし、イメージインテンシ
ファイヤーの増幅度は表示値４.０である。
イアップし実施例１と同様の方法で蛍光を観察、蛍光強
度を測定した。これとは別に、(１０)の工程の後、１０
ｍＭＴris-ＨＣl緩衝液(pＨ７.５)１００μLを加えた溶
液系での蛍光も測定した。ただし、イメージインテンシ
ファイヤーの増幅度は表示値４.０である。
【００７２】得られた蛍光強度値を図５(溶液)、図６
(乾式)に示す。図５、図６よりＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１
を用いて、蛍光強度の差、直線性に差が見られるものの
ドライアップ状態でのモデル標的核酸の検出/定量が可
能であることがわかる。また、使用した三種の色素を比
較するとＥＢ、ＹＯＹＯ１ではドライアップした際の消
光の度合いが強く、特に、ＥＢではその傾向が強い。そ
れに比べるとＰ２では相対的に乾燥時のクエンチングの
度合いが弱く、本発明の測定方式に適合しているといえ
る。
(乾式)に示す。図５、図６よりＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１
を用いて、蛍光強度の差、直線性に差が見られるものの
ドライアップ状態でのモデル標的核酸の検出/定量が可
能であることがわかる。また、使用した三種の色素を比
較するとＥＢ、ＹＯＹＯ１ではドライアップした際の消
光の度合いが強く、特に、ＥＢではその傾向が強い。そ
れに比べるとＰ２では相対的に乾燥時のクエンチングの
度合いが弱く、本発明の測定方式に適合しているといえ
る。
【００７３】[実施例５] Ｐ２による標的ＤＮＡの検出(プローブ核酸固定) (１)標的核酸として実施例２で用いたものと同じ一本鎖
ＤＮＡであるＭ１３ｍp１８を用いた(宝酒造株式会
社)。標的とする塩基配列は以下に示したように実施例
１及び４と同一である。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) 実施例２と同様に、このＤＮＡの水溶液と水とを適宜混
合することにより標的部分の塩基として１０μＭの標的
核酸のストック溶液とした。なお、実施例５と比較して
標的部分の塩基としての濃度を希薄なものとしたのはＭ
１３ｍp１８が７２４９塩基からなっているため、核酸
としての濃度を適当に保つためである。 (２)実施例４と同様にプローブ核酸として上記モデル標
的核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する２０量体
のオリゴデオキシヌクレオチドを同じく入手し、(１)と
同様に塩基として１００μＭのプローブ核酸のストック
溶液とした。塩基配列を以下に示した。 3'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ-NH25'
(配列番号２) (３)実施例４と同様にマイクロプレートに(２)のプロー
ブ核酸を固定した。
ＤＮＡであるＭ１３ｍp１８を用いた(宝酒造株式会
社)。標的とする塩基配列は以下に示したように実施例
１及び４と同一である。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) 実施例２と同様に、このＤＮＡの水溶液と水とを適宜混
合することにより標的部分の塩基として１０μＭの標的
核酸のストック溶液とした。なお、実施例５と比較して
標的部分の塩基としての濃度を希薄なものとしたのはＭ
１３ｍp１８が７２４９塩基からなっているため、核酸
としての濃度を適当に保つためである。 (２)実施例４と同様にプローブ核酸として上記モデル標
的核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する２０量体
のオリゴデオキシヌクレオチドを同じく入手し、(１)と
同様に塩基として１００μＭのプローブ核酸のストック
溶液とした。塩基配列を以下に示した。 3'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧ-NH25'
(配列番号２) (３)実施例４と同様にマイクロプレートに(２)のプロー
ブ核酸を固定した。
【００７４】(４)上記マイクロプレートのウェル中に
(１)の標的核酸溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、
０.２、０.５、１.０μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris
-ＨＣl緩衝液(pＨ７.５)を混合し、水を加えて１００μ
Lとした後アニールし最終４℃まで冷却した。蛍光を観
察する前までの以下の各工程は４℃で行った。
(１)の標的核酸溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、
０.２、０.５、１.０μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris
-ＨＣl緩衝液(pＨ７.５)を混合し、水を加えて１００μ
Lとした後アニールし最終４℃まで冷却した。蛍光を観
察する前までの以下の各工程は４℃で行った。
【００７５】(５)ウェル中の溶液をすて、上記緩衝液１
００μLで３回洗浄し、ついで、該緩衝溶液を９０μL加
えた。
００μLで３回洗浄し、ついで、該緩衝溶液を９０μL加
えた。
【００７６】(６)上記溶液に実施例４と同様に調製した
Ｐ２溶液１０μL(最終濃度１μＭ)を加えたのち約１０
分放置し、色素溶液を吸引により除去した。
Ｐ２溶液１０μL(最終濃度１μＭ)を加えたのち約１０
分放置し、色素溶液を吸引により除去した。
【００７７】(７)上記緩衝溶液１００μLで１回ウェル
内を洗浄し、この溶液を吸引により除去した。
内を洗浄し、この溶液を吸引により除去した。
【００７８】(８)実施例４と同様に試料をドライアップ
した状態での蛍光強度を測定した。測定結果を図７に示
す。図７から本発明の方法により標的一本鎖ＤＮＡの検
出/定量が可能であることがわかる。
した状態での蛍光強度を測定した。測定結果を図７に示
す。図７から本発明の方法により標的一本鎖ＤＮＡの検
出/定量が可能であることがわかる。
【００７９】[実施例６] Ｐ２による標的ｍＲＮＡの検出(プローブ核酸固定) (１)常法によりヒトβ2アドレナリン作用受容体cＤＮＡ
からＴ7ＲＮＡポリメレースを用いてヒトβ2アドレナリ
ン作用受容体ｍＲＮＡを合成し、ＤＮase処理後精製し
た。ｍＲＮＡの水溶液と水とを適宜混合することにより
標的部分の塩基として１０μＭの標的核酸のストック溶
液とした。該ｍＲＮＡの標的塩基配列部分を以下に示し
た。 5'ＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴ3'
(配列番号３) (２)プローブ核酸のストック溶液として以下の塩基配列
を有するオリゴデオキシヌクレオチド(関東化学株式会
社から入手)の１０μＭの水溶液を調製した。このオリ
ゴヌクレオチドの５'末端には実施例４、５と同様にア
ミノ基が結合されている。 3'ＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＧＣＣＧＧＴＣＧＴＡ-NH2
5'(配列番号４) (３)実施例４と同様にマイクロプレートに(２)のプロー
ブ核酸を固定した。 (４)上記マイクロプレートのウェル中に(１)の標的ｍＲ
ＮＡ溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、０.２、０.
５、１.０μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝
液(pＨ７.５)を混合し、水を加えて１００μLとした後
アニールし最終４℃まで冷却した。蛍光を観察する前ま
での以下の各工程は４℃で行った。 (５)ウェル中の溶液をすて、上記緩衝液１００μLで３
回洗浄し、ついで、該緩衝溶液を９０μL加えた。 (６)上記溶液に実施例４と同様に調製したＰ２溶液１０
μL(最終濃度１μＭ)を加えたのち約１０分放置し、色
素溶液を吸引により除去した。 (７)上記緩衝溶液１００μLで１回ウェル内を洗浄し、
この溶液を吸引により除去した。 (８)実施例４と同様に試料をドライアップした状態での
蛍光強度を測定した。
からＴ7ＲＮＡポリメレースを用いてヒトβ2アドレナリ
ン作用受容体ｍＲＮＡを合成し、ＤＮase処理後精製し
た。ｍＲＮＡの水溶液と水とを適宜混合することにより
標的部分の塩基として１０μＭの標的核酸のストック溶
液とした。該ｍＲＮＡの標的塩基配列部分を以下に示し
た。 5'ＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴ3'
(配列番号３) (２)プローブ核酸のストック溶液として以下の塩基配列
を有するオリゴデオキシヌクレオチド(関東化学株式会
社から入手)の１０μＭの水溶液を調製した。このオリ
ゴヌクレオチドの５'末端には実施例４、５と同様にア
ミノ基が結合されている。 3'ＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＧＣＣＧＧＴＣＧＴＡ-NH2
5'(配列番号４) (３)実施例４と同様にマイクロプレートに(２)のプロー
ブ核酸を固定した。 (４)上記マイクロプレートのウェル中に(１)の標的ｍＲ
ＮＡ溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、０.２、０.
５、１.０μＭ)、５μLの１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝
液(pＨ７.５)を混合し、水を加えて１００μLとした後
アニールし最終４℃まで冷却した。蛍光を観察する前ま
での以下の各工程は４℃で行った。 (５)ウェル中の溶液をすて、上記緩衝液１００μLで３
回洗浄し、ついで、該緩衝溶液を９０μL加えた。 (６)上記溶液に実施例４と同様に調製したＰ２溶液１０
μL(最終濃度１μＭ)を加えたのち約１０分放置し、色
素溶液を吸引により除去した。 (７)上記緩衝溶液１００μLで１回ウェル内を洗浄し、
この溶液を吸引により除去した。 (８)実施例４と同様に試料をドライアップした状態での
蛍光強度を測定した。
【００８０】測定結果を図８に示す。図８から本発明の
方法により標的ｍＲＮＡの検出/定量が可能であること
がわかる。
方法により標的ｍＲＮＡの検出/定量が可能であること
がわかる。
【００８１】[実施例７] Ｐ２による標的ＤＮＡの検出(標的核酸固定) (１)標的核酸として二本鎖ＤＮＡであるpＵＣ１８を入
手した(宝酒造株式会社)。標的とする塩基配列はマルチ
プルクローニングサイトの制限酵素(Ｈind III)切断部
位の外側の実施例５、６と同一のものである。塩基配列
を以下に示した。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) (２)上記ＤＮＡを所定の方法により制限酵素ＥcoＲ I
(宝酒造株式会社)で完全消化しエタノール沈殿により回
収した。
手した(宝酒造株式会社)。標的とする塩基配列はマルチ
プルクローニングサイトの制限酵素(Ｈind III)切断部
位の外側の実施例５、６と同一のものである。塩基配列
を以下に示した。 ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ３'(配
列番号１) (２)上記ＤＮＡを所定の方法により制限酵素ＥcoＲ I
(宝酒造株式会社)で完全消化しエタノール沈殿により回
収した。
【００８２】(３)回収したＤＮＡをさらに制限酵素Ｐvu
II(宝酒造株式会社)により完全消化しエタノール沈殿
により回収した。回収された制限酵素消化後のＤＮＡに
は以下の３種のＤＮＡが含まれることになる。
II(宝酒造株式会社)により完全消化しエタノール沈殿
により回収した。回収された制限酵素消化後のＤＮＡに
は以下の３種のＤＮＡが含まれることになる。
【００８３】約２０００塩基対の両端に平滑末端を有
する二本鎖ＤＮＡ 約１００塩基対の一方の末端に平滑末端を有し、他方
の末端に対合末端３'ＴＴＡＡ(ＡＡが末端側)を有する
二本鎖ＤＮＡ 約２００塩基対の一方の末端に平滑末端を有し、他方
の末端に対合末端３'ＴＴＡＡ(ＡＡが末端側)を有する
二本鎖ＤＮＡ なお、(１)の標的塩基配列はの対合末端を有するセン
ス鎖側に存在する。
する二本鎖ＤＮＡ 約１００塩基対の一方の末端に平滑末端を有し、他方
の末端に対合末端３'ＴＴＡＡ(ＡＡが末端側)を有する
二本鎖ＤＮＡ 約２００塩基対の一方の末端に平滑末端を有し、他方
の末端に対合末端３'ＴＴＡＡ(ＡＡが末端側)を有する
二本鎖ＤＮＡ なお、(１)の標的塩基配列はの対合末端を有するセン
ス鎖側に存在する。
【００８４】(４)適宜洗浄した石英ガラス基板(飯山特
殊ガラス ２５.４×２５.４ｍｍ厚さ０.５ｍｍ)にエポ
キシ基を有するシランカップリング剤(信越化学工業株
式会社 ＫＢＭ４０３ γ-グリシドキシプロピルトリ
メトキシシラン)の２％溶液(水:エタノール＝１:１)を
スピンコートし１００℃で一時間乾燥した。これにより
基板上にエポキシ基が結合する。
殊ガラス ２５.４×２５.４ｍｍ厚さ０.５ｍｍ)にエポ
キシ基を有するシランカップリング剤(信越化学工業株
式会社 ＫＢＭ４０３ γ-グリシドキシプロピルトリ
メトキシシラン)の２％溶液(水:エタノール＝１:１)を
スピンコートし１００℃で一時間乾燥した。これにより
基板上にエポキシ基が結合する。
【００８５】(５)(４)のガラス基板を標的塩基配列の塩
基対として１μＭの(３)のＤＮＡ溶液(１０ｍＭリン酸
緩衝溶液pＨ７.０ ２ｍL)に室温下２４時間反応させ
た。これにより(３)の、の二本鎖ＤＮＡが対合末端
のアデニンのアミノ基と基板上のエポキシ基が反応して
結合する。
基対として１μＭの(３)のＤＮＡ溶液(１０ｍＭリン酸
緩衝溶液pＨ７.０ ２ｍL)に室温下２４時間反応させ
た。これにより(３)の、の二本鎖ＤＮＡが対合末端
のアデニンのアミノ基と基板上のエポキシ基が反応して
結合する。
【００８６】(６)上記ガラス基板を水で洗浄後、２ｍL
の水中で９５℃で１０分間加熱し、９５℃の熱水で洗浄
した。これにより(３)の、の二本鎖ＤＮＡは対合末
端で基板に結合した一方の鎖のみとなる。
の水中で９５℃で１０分間加熱し、９５℃の熱水で洗浄
した。これにより(３)の、の二本鎖ＤＮＡは対合末
端で基板に結合した一方の鎖のみとなる。
【００８７】(７)実施例４、５と同様の塩基配列のプロ
ーブ核酸(関東化学株式会社から入手。アミノ基は結合
していない。)の塩基として１μＭ溶液(１００ｍＭ Ｔ
ris-ＨＣl pＨ７.５)２ｍL中に上記基板を浸漬しハイ
ブリダイゼーション条件に置き最終４℃まで冷却した。
これによりプローブ核酸は基板に結合したのＤＮＡと
ハイブリッドを形成する。以下、検出までの操作は４℃
で行った。
ーブ核酸(関東化学株式会社から入手。アミノ基は結合
していない。)の塩基として１μＭ溶液(１００ｍＭ Ｔ
ris-ＨＣl pＨ７.５)２ｍL中に上記基板を浸漬しハイ
ブリダイゼーション条件に置き最終４℃まで冷却した。
これによりプローブ核酸は基板に結合したのＤＮＡと
ハイブリッドを形成する。以下、検出までの操作は４℃
で行った。
【００８８】(８)上記ガラス基板を(７)の緩衝溶液２ｍ
Lで３回洗浄した後、実施例４と同様に調製したＰ２溶
液(１μＭ)２ｍLに１０分間浸漬した。
Lで３回洗浄した後、実施例４と同様に調製したＰ２溶
液(１μＭ)２ｍLに１０分間浸漬した。
【００８９】(９)上記緩衝溶液２ｍLで基板を洗浄し、
アルゴン気流で基板上の液を除去した。
アルゴン気流で基板上の液を除去した。
【００９０】(１０)実施例４と同様に試料をドライアッ
プした状態での蛍光強度を測定した。対照として(６)の
結合の操作を行わなかったガラス基板を測定した。測定
結果を表１に示す。
プした状態での蛍光強度を測定した。対照として(６)の
結合の操作を行わなかったガラス基板を測定した。測定
結果を表１に示す。
【００９１】
【表１】 表１より本発明の方法により基板上に結合した標的核酸
の検出が可能であることがわかる。
の検出が可能であることがわかる。
【００９２】[比較例１]ＦIＴＣの乾式蛍光観察。
【００９３】水への溶解性を考慮してアミノ化されたＦ
IＴＣ(Ｍolecular Ｐrobe社)を用い、これを１μＭの
水溶液とし、適量をスライドガラスとカバーガラスの間
に浸透させた。上記実施例の蛍光顕微鏡(Ｇ励起フィル
ター)＋IＣＣＤ＋Ａrgus５０のシステムで蛍光を観察し
た。
IＴＣ(Ｍolecular Ｐrobe社)を用い、これを１μＭの
水溶液とし、適量をスライドガラスとカバーガラスの間
に浸透させた。上記実施例の蛍光顕微鏡(Ｇ励起フィル
ター)＋IＣＣＤ＋Ａrgus５０のシステムで蛍光を観察し
た。
【００９４】その結果、ガラス間に水が存在している間
は比較的強い蛍光が観察されたが、水が蒸発した領域か
らは全く蛍光は観察されなかった。
は比較的強い蛍光が観察されたが、水が蒸発した領域か
らは全く蛍光は観察されなかった。
【００９５】
【発明の効果】本発明の方法により標的核酸をドライな
条件で蛍光観察することが可能となった。これにより検
出/定量に使用する容器の制限が緩和される、少量の試
料も乾燥を気にすることなく使用できる、ドライな条件
なので操作が相対的に簡便となる、蛍光の励起光照射の
方向に制限がなくなる等の効果をみることができた。
条件で蛍光観察することが可能となった。これにより検
出/定量に使用する容器の制限が緩和される、少量の試
料も乾燥を気にすることなく使用できる、ドライな条件
なので操作が相対的に簡便となる、蛍光の励起光照射の
方向に制限がなくなる等の効果をみることができた。
【００９６】また、最終的に標的核酸とプローブ核酸の
ハイブリッド体が基板に固定される態様においては、必
要に応じて、該ハイブリッド体以外の核酸、あるいは、
蛍光色素を洗いの操作によって除去することも可能とな
った。これによりバックグラウンドが低減し、結果とし
て検出/定量の感度が期待できる。
ハイブリッド体が基板に固定される態様においては、必
要に応じて、該ハイブリッド体以外の核酸、あるいは、
蛍光色素を洗いの操作によって除去することも可能とな
った。これによりバックグラウンドが低減し、結果とし
て検出/定量の感度が期待できる。
【００９７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Canon Inc. <120> Detection/Quantification of Targeted nucleotide chains by fluorescence. <130> 3495015 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 1 actggccgtc gtttatcaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 2 gttgtaaaac gacggccagt 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 3 tgctgtgcgt cacggccagc at 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 4 atgctggccg tgacgcacag ca 22
【図１】ハイブリッド核酸溶液法におけるＥＢ、Ｐ２、
ＹＯＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(溶液系)
ＹＯＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(溶液系)
【図２】ハイブリッド核酸溶液法におけるＥＢ、Ｐ２、
ＹＯＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(乾式)
ＹＯＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(乾式)
【図３】ハイブリッド核酸溶液法におけるＥＢ、Ｐ２、
ＹＯＹＯ１によるＭ１３ｍp１８の検出/定量
ＹＯＹＯ１によるＭ１３ｍp１８の検出/定量
【図４】ハイブリッド核酸溶液法におけるＰ２によるｍ
ＲＮＡの検出/定量
ＲＮＡの検出/定量
【図５】プローブ核酸固定法におけるＥＢ、Ｐ２、ＹＯ
ＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(溶液系)
ＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(溶液系)
【図６】プローブ核酸固定法におけるＥＢ、Ｐ２、ＹＯ
ＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(乾式)
ＹＯ１によるモデル標的核酸の検出/定量(乾式)
【図７】プローブ核酸固定法におけるＥＢ、Ｐ２、ＹＯ
ＹＯ１によるＭ１３ｍp１８の検出/定量
ＹＯ１によるＭ１３ｍp１８の検出/定量
【図８】プローブ核酸固定法におけるＰ２によるｍＲＮ
Ａの検出/定量
Ａの検出/定量
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 伸子 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB14 BB48 DA12 DA13 DA14 FB02 FB12 FB15 GC15 HA09 2G054 CA22 CE02 EA03 EA06 FB01 GA04 GB02 GB04 GE01 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 CA12 HA11 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QQ53 QR38 QR55 QR63 QR66 QR82 QR84 QS34 QS39 QX02
Claims (19)
- 【請求項１】 観察用の清浄な固相基板上に、検出また
は定量対象である一定量の試料溶液由来の標的核酸(Ａ)
と、該標的核酸の塩基配列の特定の部位に相補的な塩基
配列を有するプローブ核酸(Ｂ)とが相互に作用して標的
核酸(Ａ)とプローブ核酸(Ｂ)のハイブリッド体(Ｃ)が形
成されており、 かつ、該ハイブリッド体(Ｃ)に作用し、作用した結果、
蛍光を発するか、または、蛍光が増大し、かつ、該ハイ
ブリッド体に作用した状態で、乾燥状態においても蛍光
の発光が維持可能な蛍光色素(Ｄ)が該ハイブリッド体
(Ｃ)に対して作用可能な状態で存在する状態を実現する
工程(１)と、 該基板上でハイブリッド体(Ｃ)および蛍光色素(Ｄ)を乾
燥させる工程(２)と、 乾燥後に観測手段である蛍光色素(Ｄ)からの蛍光を測定
する工程(３)と、を有することを特徴とする標的核酸の
乾式検出または定量方法。 - 【請求項２】 前記工程(１)において、ハイブリッド体
(Ｃ)の形成(１-１)と、蛍光色素(Ｄ)のハイブリッド体
(Ｃ)への作用(１-２)のいずれもが前記試料溶液中に溶
存した状態で行なわれる請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記工程(１)において、ハイブリッド体
(Ｃ)の形成(１-１)と、蛍光色素(Ｄ)のハイブリッド体
(Ｃ)への作用(１-２)のいずれもが前記基板上に固定さ
れた状態で行なわれる請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記プローブ核酸(Ｂ)を、前記標的核酸
(Ａ)に作用させる前にあらかじめ前記基板の表面に固定
化する工程(１-０)を有する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記標的核酸(Ａ)を、前記プローブ核酸
(Ｂ)に作用させる前にあらかじめ前記基板の表面に固定
化する工程(１-０')を有する請求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 前記工程(１)において、ハイブリッド体
(Ｃ)形成(１-１)の後、蛍光色素(Ｄ)のハイブリッド体
(Ｃ)への作用(１-２)の前に、 ハイブリッド体(Ｃ)以外の溶液中の核酸を洗いの操作に
よって除去する工程(１-１')を有する請求項３〜５のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 前記工程(１)において、蛍光色素(Ｄ)の
ハイブリッド体(Ｃ)への作用(１-２)の後に、 ハイブリッド体(Ｃ)に作用しなかった蛍光色素(Ｄ)を洗
いの操作によって除去する工程(１-３)を有する請求項
３〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 前記工程(１)と(２)の間において、 ハイブリッド体(Ｃ)と、ハイブリッド体(Ｃ)に作用した
蛍光色素(Ｄ)を包括する溶媒をガス流により除去する工
程(１-４)を有する請求項３〜７のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項９】 前記固相基板がガラス基板である請求項
１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 前記固相基板が樹脂基板である請求項
１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 前記標的核酸(Ａ)が一本鎖の核酸であ
る請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 前記標的核酸(Ａ)がＤＮＡである請求
項１〜１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 前記標的核酸(Ａ)がＲＮＡである請求
項１〜１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 標的核酸(Ａ)がｍＲＮＡである請求項
１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記蛍光色素(Ｄ)が二本鎖核酸の塩基
対間に入り込むインターカレーターである請求項１〜１
４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１６】 前記蛍光色素(Ｄ)が二本鎖核酸のグル
ーブ内に入り込むグルーブバインディンクタイプの色素
である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１７】 前記蛍光色素(Ｄ)が２-メチル-４,６-
ビス(４-Ｎ,Ｎ,-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム塩
である請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記蛍光色素(Ｄ)がエチジウムブロマ
イドである請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記蛍光色素(Ｄ)がＹＯＹＯ１である
請求項１６に記載の方法。
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