JPH0829085B2 - 酵素誘導体の製造において使用するアシル化剤用化合物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血栓症の治療に用いられる酵素誘導体に関す
るものである。

〔従来の技術〕

ヨーロツパ特許第0,009,879号は静脈血栓症を治療す
る有用な治療薬である生体内のワイブリン溶解酵素の誘
導体を開示している。誘導体は加水分解の擬似第一次速
度定数が10^-6／秒〜10^-3／秒の範囲にある加水分解によ
り除去しうる基によりブロツクされている酵素の活性接
触反応部位により特徴付けられている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

或る人間の蛋白質は化学的に変性されてそれらは上述
のヨーロツパ特許で用いられている意味において除去可
能なブロツク剤として働くこと及びこれらの基は酵素に
結合するとき遅い生理学的クリアランス速度で酵素誘導
体を製造しうることが見い出された。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば式（II） 〔式中 Ｘは式 （式中Ｒは脂肪族又は芳香族の残基である）のアシル
基であり； Ａは酸素、硫黄及び窒素から選ばれる少なくとも１個
のヘテロ原子よりなる橋かけ基であって該窒素はC_1-6ア
ルキルにより置換されていてもよく；そして Ｂはアミノ酸側鎖特異性試薬の処理により修飾されて
蛋白質結合基を含むヒト蛋白質の蛋白質結合基に結合し
た親水性結合基であり；そして Ｗは蛋白質または蛋白質結合基のアミノ酸側鎖と直接
反応しうる基を表し、Ｚは対陰イオンでありそしてR¹〜
R⁴はそれぞれ独立して水素または電子引き抜き部分であ
る〕 の化合物が提供される。フイブリン溶解活性を担う酵
素の触媒部位が可逆結合基として酵素に結合するヒト蛋
白質によってブロックされているフイブリン溶解酵素誘
導体の製造は、後述の如く、例えば、ヒト蛋白質を本発
明の式（II）の化合物によりアシル化して処理し、そし
て得られたアシル化蛋白質とフイブリン溶解酵素とを反
応させて行う。

本明細書に用いられている「可逆的な結合基（revers
ible lirkinggroup）」という表現は加水分解の擬似第
一次速度定数が37℃pH7.4で等張性水性媒体中で10^-6／
秒〜10^-3／秒の範囲内にある速度で加水分解により除去
しうる基を含む。

好ましい速度定数は１×10^-5／秒〜８×10^-4／秒の範
囲内にある。

適当には酵素の接触反応の部位は構造（Ｉ） Ｐ−Ｂ−Ａ−Ｘ− （Ｉ） 〔式中Ｐはアミノ酸側鎖特異剤による処理により修飾
されて蛋白質付着基を含む人間の蛋白質であり； Ｘは式 （式中Ｒは芳香族又は脂肪族の残基である）のアシル
基であり； Ａは酵素、硫黄及び窒素から選ばれる少くとも１個の
ヘテロ原子よりなる橋かけ基であつて該窒素は任意にC
_1〜6アルキルにより置換されていてもよく； ＢはＰの蛋白質付着基に結合した直鎖親水性結合基で
ある〕 の基によりブロツクされている。

用語「フイブリン溶解酵素（fibrinolytic enzym
e）」は本明細書において上述のヨーロツパ特許におい
て規定されているように生体内でフイブリン溶解活性を
示す任意の酵素を意味するのに用いられそして哺乳動物
の尿、血液又は組織から又はこのような哺乳動物の酵素
を詳細に示す遺伝子を表わす細菌から得られそしてプラ
スミノーゲンを活性化しうる酵素を含む。組織型プラス
ミノーゲン活性剤（ｔ−PA）の例は黒色腫プラスミノー
ゲン活性剤でありその抽出は公開されたヨーロツパ特許
出願第41766号に記載されている。ｔ−PAは人間の外因
性のプラスミノーゲン活性剤として知られている活性剤
の一つの型である。内因性のプラスミノーゲン活性剤例
えばウロキナーゼ及びプラスミンも又本発明に用いられ
るのに適したフイブリン溶解酵素である。

適当な人間の蛋白質の例は遅い生理学上のクリアラン
ス速度を有することが知られている人間の血漿の蛋白質
例えば人間血清アルブミン（及びそのオリゴマー）、免
疫グロブリン、人間フイブリノーゲン及び人間プラスミ
ノーゲンである。好ましくは蛋白質は30,000〜800,000
ダルトンの範囲内の分子量を有する。好ましい蛋白質は
血栓例えば人間プラスミノーゲンの成分に顕著な親和性
を有することが知られているものである。任意には蛋白
質はそれ自体前記のフイブリン溶解酵素例えばウロキナ
ーゼ又は組織プラスミノーゲン活性剤又はその前酵素例
えばプロウロキナーゼであろう。蛋白質はフイブリン溶
解酵素のときその活性接触反応の部位は任意にはヨーロ
ツパ特許第0009879号に記載されたようにブロツクされ
ていてもよい。このブロツクされたフイブリン溶解酵素
の例はｐ−アミノベンゾイルウロキナーゼである。

前述の誘導体の例は 人間血清アルブミン→人間組織プラスミノーゲン活性
剤 人間血清アルブミン→ウロキナーゼ ウロキナーゼ又はアシル化ウロキナーゼ→人間プラス
ミン 人間組織プラスミノーゲン活性剤→人間プラスミン 人間免疫グロブリンＧ→人間組織プラスミノーゲン活
性剤 人間プラスミノーゲン→人間組織プラスミノーゲン活
性剤 （式中→は酵素の活性中心への可逆的な結合を表わ
す） を含む。

適当な基Ｘの例はヨーロツパ特許第0,009,879号に記
載されたブロツキング基から誘導された基を含む。好ま
しい基はさらに基Ａにより２又は４位において置換され
ている上述のヨーロツパ特許に記載されたような任意に
置換されていてもよいベンゾイル基及び又上述のヨーロ
ツパ特許に記載されておりしかもその２又は３位でＡに
結合している任意に置換されていてもよいアクリロイル
基である。

適当な基Ａは上述の範囲そして好ましくは１×10⁵〜
８×10⁴／秒の範囲に加水分解の擬似第一次速度定数を
もたらすのに充分な得られたベンゾイル又はアクリロイ
ル−酵素の安定化をもたらすものである。

Ａの例は次の通りである。

−Ｏ− −Ｓ− −NH− −NH−NH （式中ＲはＣ_１〜６アルキル基である）。

蛋白質付着基は１種以上のアミノ酸側鎖に特異的であ
りそして基Ｂと反応しうる基を含む試薬による蛋白質の
修飾により誘導された官能基である。

基Ｂの例は置換されたC₂〜C₁₀アルカン例えば６−ア
ミノヘキシル、又は直鎖重合体例えばポリエチレングリ
コールジン、ポリアラニン又はポリサルコシンである。
直鎖基Ｂは任意に誘導体の分析を助けるか又は蛋白質付
着例えばω−アミノアルカン又は重合体基の３−チオプ
ロピオニル又は２−チオアセチル誘導基から誘導された
ものと反応する開裂しうる部分を含んでもよい。開裂し
うる部分の例はジスルフイド結合である。好ましくはジ
スルフイド結合はＰと直鎖基Ｂとの反応から誘導されそ
して従つてＰによるＢの結合で発生する。又開裂部分は
α、βジヒドロキシ基よりなつてもよい。

適当にはＢは基−Ｓ（CH₂）₂CONH−、−Ｓ−（CH₂）₂
CONH（CH₂）₆−又は−Ｓ−（CH₂）₂CONH（CH₂）₂−であ
る。

例として蛋白質と２−イミノチオラン又はN−アセチ
ルホモシステインチオラクトンとの反応による遊離のチ
オール基の発生はチオール反応性Ｂ構造による蛋白質付
着基のカツプリングを行わしめよう。又蛋白質付着基は
Ｂ中の遊離のチオールと反応しうるチオール反応性部分
例えば６−マレイミドヘキシル基又は２−ピリジル−ジ
チオ基を含むことが出来る。好ましくは蛋白質付着基は
蛋白質修飾剤例えば２−イミノチオラン（蛋白質中のリ
ジンε−アミノ基と反応する）から誘導される。

前述のの誘導体は任意に修飾されて蛋白質付着基を含
む人間の蛋白質、フイブリン溶解酵素及び結合剤（酵素
の接触反応の部位と反応しうる部分及び蛋白質のアミノ
基又は蛋白質付着基と反応して前述の可逆的な結合基を
形成しうる部分を有する）を一緒に反応させることによ
り製造されよう。

特に、前述の誘導体は人間の蛋白質（それはアミノ酸
側鎖特異剤による処理によつて任意に修飾されて蛋白質
付着基を含む）を本発明の化合物である式（II） （式中B,A及びＸは式（Ｉ）に関して規定した通りであ
り、 Ｗは蛋白質のアミノ酸側鎖と直接反応しうる基である
か又は蛋白質が蛋白質付着基を含むときＷは該付着基と
反応しうる基を表わし、 Ｚは対陰イオン好ましくはハロゲン又はｐ−トルエン
スルホネートを表わし、そして R¹〜R⁴のそれぞれは水素又はアミジノフエニルエステル
の反応性を増大させる電子引き抜き部分を表わす）のア
シル化剤により処理し、そしてそれにより得られたアシ
ル化蛋白質とフイブリン溶解酵素とを反応させることに
より製造されよう。

式（II）のアシル化剤は新規でありそして本発明を形
成する。

Ｗが蛋白質のアミノ酸側鎖と直接反応しうる基を表わ
すときそれは好ましくはＮ−サクシンイミジル基であ
る。Ｗが蛋白質付着基と反応しうる基を表わすときそれ
は好ましくはピリジルチオ基である。任意にはＷは光活
性化基例えば２−ニトロ−４−アジドフエニルであろ
う。

好ましくはR¹〜R⁴のそれぞれは水素又はハロゲンを表
わす。

前述の誘導体は又人間の蛋白質（それはアミノ酸側鎖
特異剤による処理によつて修飾されて蛋白質付着基を含
む）をフイブリン溶解酵素（それ自体Ｗが蛋白質の蛋白
質付着基と反応しうる基である本発明の式（II）のアシ
ル化剤による処理によつて修飾された）により処理する
ことにより製造されよう。

好ましくはＷはピリジチオ基である。

上述の方法において蛋白質付着基を導入する蛋白質の
修飾は好ましくは用いられる試薬に応じて3.0〜9.0の間
のpHで水性の緩衝された媒体中で行われる。好ましい試
薬２−イミノチオランではpHは好ましくは6.5〜8.5であ
る。蛋白質の濃度は好ましくは高く（＞10mg/ml）そし
て修飾剤は試薬の反応性に応じてやや（1.1〜５倍）モ
ル過剰で用いられる。反応の温度及び時間は好ましくは
０°〜40℃及び10分〜７日の範囲である。蛋白質の修飾
の程度は導入される蛋白質付着基を定量にすることによ
り求められよう。

この定量は標準的な蛋白質化学的技術例えば5,5′−
ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）による滴定であろ
う。好ましくは0.5〜2.0モルの蛋白質付着基が蛋白質１
モル当り平均に導入されよう。修飾された蛋白質は標準
的な技術例えば透析、限外過、ゲル過及び溶媒又は
塩沈でんにより過剰の修飾剤から分離されよう。修飾さ
れた蛋白質とアシル化剤又はアシル化フイブリン溶解酵
素と出来る限り反応させるのが一般に望ましいが、或る
場合には中間体物質は凍結された溶液に貯えられるが又
は凍結乾燥されよう。

上述の如く製造された修飾された蛋白質は蛋白質付着
基の最初の導入に用いられるのと同様な条件下で本発明
の式（II）のアシル化剤と反応させられるがそれは次の
条件下で行われる。

（ａ）アミジノフエニルエステルの加水分解を避けるた
めに好ましいpH範囲は7.0〜8.0でありそして非求核緩衝
剤を用いなければならない。

（ｂ）好ましい温度範囲は０℃〜30℃でありそして反応
時間は６時間以内である。

（ｃ）アシル化剤対蛋白質付着基のモル比は好ましくは
１〜10の範囲内にある。

（ｄ）反応は任意には基Ｗ（例えばピリジン２−チオ
ン）の誘導基の離脱を観察することによりモニターされ
よう。

（ｅ）生成物（蛋白質様アシル化剤）の反応性のために
出来る限り早く生成物を過剰の式（II）のアシル化剤か
ら分離するのが望ましい。この目的のために高性能型除
外クロマトグラフイ又は透析過が用いられよう。

（ｆ）生成物は好ましくは直ちにフイブリン溶解酵素と
反応すべきであるが短時間−40℃以下で凍結された溶液
（凍結乾燥されない）中で貯えられよう。

本発明の式（II）のアシル化剤による未修飾の蛋白質
の処理は一般に蛋白質付着基の導入に用いられるものに
類似の条件下で行なわれる。しかしこの型の試薬の反応
性は上述の（ａ）〜（ｆ）項に記載されたのと似た注意
を働かすべきであることを必要とする。

修飾された蛋白質はそれ自体その活性接触反応の部位
がブロツクされているフイブリン溶解酵素よりなるとき
ブロツキングは前述の修飾の前又は後又はフイブリン溶
解酵素との反応の後の何れかでヨーロツパ特許第000987
9号に記載されたように行われよう。

修飾された蛋白質とアシル化フイブリン溶解酵素との
反応を用いる方法の態様において酵素は先ずヨーロツパ
公開特許出願第0,009,879号においてブロツキング基の
導入について記載された条件下で本発明の式（II）のア
シル化剤と反応せしめられよう。上述の技術により過剰
の試薬を除いた後にアシル化酵素を次に上述の（ａ）〜
（ｄ）項に用いられたものと同様な条件下で蛋白質付着
基を含む蛋白質と反応させられよう。しかしアシル化酵
素の加水分解を最小にするために10℃以下（好ましくは
０°〜４℃）でカツプリングを行うのが好ましい。さら
に修飾された蛋白質は大過剰のモル（10⁴倍以内）でア
シル化酵素について用いられよう。後者の条件は又蛋白
質様アシル化剤とフイブリン溶解酵素との間のカツプリ
ングに適用される。

前述の誘導体は種々の分離技術により過剰の修飾され
た蛋白質／蛋白質アシル化剤及び未カツプル酵素から精
製されよう。誘導体の分子量は通常その成分のそれより
も顕著に大きいために急速型分留法例えば蛋白質高性能
ゲルクロマトグラフイが特に有利である。さらにフイブ
リン溶解酵素成分について親和性を有する不溶性のマト
リツクスを用いるアフイニテイ・クロマトグラフイがゲ
ル過法と関連して用いられよう。

本発明の式（II）のアシル化剤が種々の標準的なやり
方により製造されよう。好ましい一般的な合成の経路は
次の通りである。

（ａ）マスクされた反応性官能基を含むアシル化剤（例
えばＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオナート−SPDP）と置換基に求核基を含む２
−又は４−置換安息香酸誘導体（例えば４−ヒドラジノ
安息香酸、Ｎ−２（６−アミノヘキシル）アミノ安息香
酸又はＮ−４（２−アミノエチル）アミノ安息香酸）と
の反応。好ましい反応条件は１〜24時間常温で乾燥ピリ
ジン（又は他の塩基性溶媒）を必要とする。

（ｂ）（ａ）からの中間体酸はヨーロツパ公開特許第0,
009,879号中に簡単なブロツキング剤として記載されて
いるような弱塩基性溶媒中のジシクロヘキシルカルボジ
イミドを用いて４−アミジノフエノール（又はその環置
換誘導体）の塩によりエステル化される。有効なエステ
ル化を確実にするためにややモル過剰（1.5〜４倍）の
アミジノフエノールを用いるのが好ましい。任意にはエ
ステル化は酸性触媒として無水のｐ−トルエンスルホン
酸の存在下で行われよう。

前述の誘導体は好ましくは製薬組成物として投与され
る。

従つて本発明の式（II）の化合物から、製薬上許容し
うる担体と組合さつた前述の誘導体よりなる製薬組成物
が製造される。

この組成物は人間への静脈内投与に適した製薬組成物
として通常のやり方に従つて処方されよう。

代表的な静脈内投与用の組成物は滅菌された等張性の
水性緩衝液中の滅菌誘導体の溶液である。必要ならば組
成物は又誘導体を溶液に保つ溶解剤及び注射の部位の痛
みを和らげる局所麻酔剤例えばリグノカインを含んでも
よい。一般に、誘導体は遊離且未修飾の蛋白質が遊離さ
れる時間の指示と同様活性単位で酵素結合物の量を示す
気密的に密封されたコンテイナー例えばアンプル又はパ
ツク中の単位投与型例えば乾燥粉末又は水のない濃縮物
で供給されよう。誘導体が灌流により投与されるとき誘
導体は滅菌した製薬上の「注射用水」を含む灌流瓶によ
り処方されよう。誘導体が注射により投与されるとき誘
導体が注射用の滅菌水のアンプルにより処方される。注
射しうる又は灌流しうる組成物は投与前に成分を混合す
ることにより作られよう。

投与される物質の量は要求されるフイブリン溶液の量
及びそれが要求される速度、血栓症条件の程度及び塊の
位置及び大きさに依存しよう。用いられる正確な投与量
及び投与の態様は医師の監督する治療による条件に応じ
て病気の性質からみて強制的に決定されなければならな
い。しかし一般に慢性血栓症を治療される患者は一般に
５回以内の投与の注射により又は灌流により体重の0.10
〜2.0mg/kgの１日当りの投与を受けるだろう。冠状動脈
血栓症の治療には同様な投与が単一の静脈内注射により
与えられよう。

毒性は上述の投与量の範囲内では前述の化合物につい
て観察されなかつた。

従つて前述の他の態様において患者に有効且非毒性の
量の前述の誘導体を投与することよりなる血栓症を治療
する方法が提供される。

下記の方法及び実施例が本発明を説明する。方法 （ａ）色素産生基質定量 ウロキナーゼ及びｔ−PAを25℃でpH8.0の0.1Mトリエ
タノールアミン・HCl中の1mMの基質濃度で色素産生基質
（KabiVitrum,スウエーデン）Ｓ−2444及びＳ−2288に
対しそれぞれ定量した。SUは1cmの行路長のセル中の1ml
の基質に0.001/分のO.D.増大を与える活性の量として規
定される。

（ｂ）速度定数の決定 擬似第一次速度定数はアシル酵素を生理学的条件下即
ち37℃pH7.4で等張性の水性媒体中で加水分解すること
により求められる。一定の期間で一部を取り出しそして
色素産生基質とインキユベートしそして基質の転換速度
を上述の如く測定した。

加水分解を基質の転換速度が最大に達するまで続け
る。速度定数Ｋは ｔに対するloge（１−A^t/Amax） （式中Amaxは前記の一部が基質を転換する最大速度であ
りそしてAtは一部が時間ｔで基質を転換する速度であ
る） をプロツトすることにより計算される。

（ｃ）ラツトの血流中のフイブリン溶解活性の定量オス
のSprague−Dawleyラツト（300〜400g）をペントバルビ
トンナトリウムにより麻酔した（60mg/kg・ｉ・ｐ）。
１本の頸動脈を血液サンプルを集めるためにカニユレー
トした。１本の大腿静脈をヘパリン（50U/kg）及びテス
ト中の化合物の注射のためにカニユレートした。ヘパリ
ン投与後約５分で投与前の血液サンプル（0.8ml）を採
りそして0.1容量の129mMのくえん酸三ナトリウムと混合
した。テストする化合物を次に10秒間で注射した（1ml/
kg）。さらに血液サンプルを正確に1,2,4,8,16,30及び6
0分後に採つた。ヘパリン処理（50U/kg）をカニユーレ
の開存性を保つために30分のサンプリング後に繰返し
た。すべてのくえん酸塩処理した血液サンプルを各実験
の終りまで氷中に保ち次に血漿を得るために４°で15分
間1700gで遠心分離した。ユーグロブリン画分を水中の
氷冷0.011％（v/v）酢酸1.82mlへ各血漿0.1mlを加える
ことにより沈でんさせた。氷中に30分間放置した後すべ
ての管を４°で15分間1700gで遠心分離した。上澄み液
を捨て、各管の内壁を注意して拭きそして各沈でん物を
0.05％（w/v）ナトリウムアジドを含むpH8.0の0.1Mトリ
エタノールアミン・HCl緩衝液に再溶解した。サンプル
の一部（20μｌ）を次に４倍でフイブリン板に適用し
た。フイブリン板は人間フイブリノーゲン（Nabi,グレ
ード1,Flow Laboratories,スコツトランド）0.4％（w/
v）をpH7.4のNaCl125mM中のバルビトン0.029Mに溶解
し、9mlを10×10cmの正方形のプラスチック血（Sterili
n）に移し次にボバイントロンビン（50NIH単位/ml,Park
e−Davis,英国）0.3mlと急速に混合することにより固ま
らせることにより製造された。板を通常18〜24時間37°
でインキユベートするがもし必要ならばそれより長くし
そして水性ブロムフエノールブルーにより染色した。各
溶解帯について互に直角な二つの直径をVernierカリパ
スを用いて測つた。各サンプルのすべての直径を平均し
そしてこの平均を補正曲線を用いてフイブリン溶解活性
に転換した。補正曲線はテストされる化合物の公知の量
を少くとも10匹のラツトから血漿に加えることにより得
られた。これらの標準物は実験サンプルと同一の方法及
び同一の時間を用いて得られた。補正曲線を作るために
直径（mm）は化合物のlog₁₀濃度に対してプロツトされ
た。各実験サンプル中の化合物の血漿濃度は投与量に基
づいて予想されるそれと各ラツトの35ml血漿/kg体重の
予想との％として表示された。

（ｄ）ラツトの血流中の〔¹²⁵I〕ラベル物の定量くえん
酸処理された血液の一部（100μｌ）を１％NaI20μｌ及
び20％トリクロロ酢酸（TCA）400μｌと混合して蛋白質
結合¹²⁵Iを沈でんさせた。氷中で30分後血液を遠心分離
しそして上澄液及び沈でん物の両方を¹²⁵I含量について
カウントした。沈でん物中の全カウントの％を計算して
TCAで沈でんしうるカウントを求めた。各物質について
放射分析クリアランスパターンを時間に対して血液中の
TCAで沈でんしうるカウント（理論量の％として）をプ
ロツトすることにより得た。

（ｅ）モルモツトの血流中のフイブリン溶解活性の定量 オスのDunkin Hartleyモルモツト（350〜450g）をウ
レタンにより麻酔した（25％w/v溶液;6ml/kg,i.p.）。
１本の頸動脈を血液サンプルの採集のためカニユレート
した。１本の大腿静脈をヘパリン（50U/kg,i.v.）及び
テストする化合物の注射のためにカニユレートした。ヘ
パリン投与後約５分で投与前の血液サンプル（2ml）を
採りそして0.1容量の129mMくえん酸三ナトリウムと混合
した。テストされる化合物を次に10秒かけて注射した
（1ml/kg）さらに血液サンプルを正確に2,4,8,16,30,60
及び90分後に採つた。カニユーレの開存性を保つためヘ
パリン処理（50U/kg,i.v.）を30分のサンプリング後に
繰返した。全てのくえん酸塩処理された血液サンプルを
各実験の終りまで氷中に保ち、次に４°で15分間1700g
で遠心分離して血漿を得た。各血漿サンプルを0.01％
（v/v）のTween80を含むpH7.4の燐酸塩で緩衝された塩
水中で200倍に稀釈した。サンプルの一部（30μｌ）を
次に４倍でフイブリン板に適用した。フイブリン板は0.
4％（w/v）の人間フイブリノーゲン（Kabi,グレードL,F
low Laboratories,スコツトランド）をpH7.4で125mM Na
Cl中の0.029Mバルビトンに溶解し、10mlを10×10cmの正
方形のプラスチツク血（Sterilin）にとり0.3mlのボバ
イン・トロンビン（50NIH単位/ml,Parke−Davis,英国）
と急速に混合することにより塊まらせた。板は通常18〜
24時間37°でインキユベートしたがもし必要ならばそれ
より長くしそして水性ブロモフエノールブルーにより染
色した。各溶解帯について互に直角な二つの直径をVern
ierカリパスを用いて測つた。各サンプルについてすべ
ての直径を平均しそしてこの平均を補正曲線についてフ
イブリン溶解活性に転換した。補正曲線はテスト中の化
合物の知られた量を各動物の投与前の血漿に加えること
により得られた。これらの標準物は実験サンプルと同一
の方法及び同一の時間を用いて得られた。補正曲線を得
るために直径（mm）を化合物のlog₁₀濃度に対してプロ
ツトした。各実験サンプル中の化合物の血漿濃度は投与
に基づいて予想されるそれと各モルモツトについて50ml
の血漿/kg体重の予想との％として表示された。

〔実施例〕

実施例１ （ａ）４−〔Ｎ−２−（３−〔２−ピリジル〕ジチオプ
ロピオニル）ヒドラジノ〕安息香酸 SPDP（100mg,0.32mモル）を乾燥ピリジン（1.0ml）に
溶解しそして４−ヒドラジノ安息香酸（55mg,0.32mモ
ル）を加えた。混合物を４時間56℃に加温しそして１晩
常温で放置した。生成物を蒸発乾固させ得られた黄色の
油を水（6.0ml）及びEtOH（0.5ml）により再結晶した。
ガム状の固体を冷却して沈着させそしてこれをエタノー
ル（1.0ml）に溶解し蒸発しそして真空乾燥してガラス
状の固体を得た。

収量:72.6mg（65％）。

NMR（MeOH−D⁴），δ;8.05,irr d,1H，ピリジンH6。7.5
0,オーバーラツピングdd,4H，ピリジンH3＋4,＋ベンゾ
イルA₂B₂qt。6.9,クインテツト，1H，ピリジン5.6.45d,
2H，ベンゾイルA₂B₂。2.6M,4H．−CH₂CH₂− 分析：C₁₃H₂₀N₂O₂（236.37）として： C:66.07,H;8.53,N;11.85. 実測値:C;66.04,H;8.16,N;10.62 （ｂ）４−〔Ｎ−２−（３−〔２−ピリジル〕ジチオプ
ロピオニル）ヒドラジノ〕４′−アミジノフエニルエス
テル・HCl 上述の酸（0.21mモル）を４−アミジノフエノールHCl
（144mg,0.83mモル）及びN,N−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（48mg,0.21mモル）を含む加温（30℃）乾燥ピ
リジン（1.0ml）に溶解した。混合物を48時間常温で放
置し次に過し乾燥ピリジンにより洗つた。液を蒸発
乾固させ固体をH₂O（10ml）及び飽和塩水（1.0ml）中で
砕いた。固体をさらにエーテルを加えつつEtOH;Et₂O,1:
1v/v（5.0ml）により再結晶した。得られたガムを真空
乾燥し次に液に塩水（0.5ml）を加えてEtOH;H₂O， 1:9v/v（4ml）により再結晶した。黄色の固体をP₂O₅上
で真空乾燥した。

収量:52.4mg（52％）。融点140〜142℃NMR（DMSO−
d⁶）。δ;10.15,5,1H，アミドH,9.35/9.55 d,4H，アミ
ジンH,8.5irrm.ピリジンH,7.9/7.5,7.3/6.8irr d.芳香
族H,3.15d,2H。CH₂、2.75d,2H,CH₂． 物質をpH7.4で1mMのジチオスレイトールにより還元し
343nmでピリジン２−チオン離脱をモニターすると約70
％の純度を示した。

実施例２ （ａ）Ｎ−６−（アミノヘキシル）アントラニル酸２−
クロロ安息香酸（31.4g,0.2モル）、1,6−ジアミノヘキ
サン（55.7g,0.5モル）無水炭酸カリウム（25.6g）,n−
ペンタノール（68ml）及び銅粉末（0.3g）を５時間還流
した。ｎ−ペンタノール及び1,6−ジアミノヘキサンを
留去し、残渣を冷水（1.5l）に注いだ。混合物を濃HCl
によりpH7.0に酸性にし４℃に冷却した。得られたガム
を加熱H₂O:ElOH:濃HCl8:8:1v/v（850ml）に採り冷却し
過しそして5NNaOHによりpH7.0にした。沈でん物をH
₂O：濃度HCl,1:1v/v（80ml）に溶解しH₂O及び5NNaOHに
より300mlに希釈した。黄色の油を４℃で沈でんさせ
過し真空乾燥して5mlとした。

収量:24.4g（52％）。融点192℃（分解）NMR（DCl/D
₂O）．δ:8.20,M,1H，アントラニロイルH6,7.65M,アン
トラニロイル,H3＋４＋5.3.50t,2H，アミノメチレン.3.
00,t,3Hアミノメチレン.1.4−2.0,広いエンベロープ,8
H,バツクボーン，CH₂ （ｂ）Ｎ−（６−〔３−（２−ピリジル）ジチオプロピ
オニル〕アミノヘキシル）アントラニル酸４′−アミジ
ノフエニルエステル・HCl SPDP（200mg,0.64mモル）を乾燥ピリジン（1.0ml）に
溶解させ上述のアミノヘキシルアントラニル酸（151mg,
0.64mモル）に加えると急速に溶解した。溶液を４時間
常温で放置し次に減圧下蒸発させた。得られた油を加熱
1 M HCl（5ml）に溶解しそして溶液を5M NaOH（0.5ml）
により中和し次に４℃で１晩冷却した。淡黄色の固体が
沈でんし上澄み液のデカンテーシヨンにより単離しそし
て残基を真空中P₂O₅で乾燥した。生成物を乾燥ピリジン
（1.0ml）及びｐ−アミジノフエノールHCl（221mg,1.28
mモル）中に溶解しそして無水のｐ−トルエンスルホン
酸（100mg）次にN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（158mg,0.77mモル）を加えた。混合物を１晩常温で攪
拌しそして過し乾燥ピリジン（3.0ml）により洗つ
た。合せた液を減圧下蒸発させて油を得、それを20％
v/vエタノール／水により２回再結晶した。

収量:154mg（30％）。融点約70℃（ガラス転移）。

NMR（DMSO−d⁶,270MHz）．δ:9.165/9.436d,4H,Exch.D₂
OアミジンH.8.056/8.021,dd,1H,ピリジンH₆.7.95/7.92
及び7.52/7.51,Qt,4H,アミジノフエノールH.7.6−7.85,
M,2H,ピリジンH₄＋H₅。7.48−7.55,M,2H,ピリジンH₃＋
アミドNH,7.21−7.25,M,1H,アントラニロイルH₄.7.11−
7.14,1H,アントラニロイルH₂。6.82−6.86,d,1H,アント
ラニロイル₀H₅。6.67−6.70,d,1H,アントラニロイルH₃
・3.37,M,2H,₀ CH₂−Ｃ−NH。3.20−3.22,d,2H,−CH₂ −Ｓ−.3.00−3.
04,M,2H,C−NHCH₂。2.48−2.51,M,2H,−CH₂ NH−.1.32−
1.61,2マルチプレツト8H,−（CH₂ ）₄− NMRのスペクトルは又生成物１モル当り約0.5モルの溶
媒エタノール及び0.7モルのｐ−トルエンスルホネート
イオンの存在を示した。

pH7.4でジチオスレイトールにより物質を還元しそし
て343nmでピリジン２−チオンの離脱をモニターすると
約64％の純度を示した。

実施例３ Ｎ−４−｛Ｎ−２−〔３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオニル〕アミノエチル｝アミノ安息香酸の置換された
アミジノフエニルエステルの製造 （ａ）ｔ−ブチル４−アミノベンゾエート ４−アミノ安息香酸（5.0g）を塩化チオニル（50ml）
に懸濁させそして緩やかに還流するように加熱した。２
時間後溶液は完全に透明になり次に反応物を放冷し塩化
チオニルを減圧下除去し最後の痕跡はジクロロメタン
（３×50ml）との共沸により除去した。得られた酸塩化
物を他のジクロロメタン（50ml）に溶解しジクロロメタ
ン（15ml）中のｔ−ブタノール（15ml）の溶液を攪拌し
た溶液に加え次に氷浴中で冷却した。固体の白色沈でん
物即ち表題化合物の塩酸塩が形成された。これをジクロ
ロメタンの蒸発、酢酸エチル（100ml）中の固体の懸濁
そして過により単離した。物質を10％水性炭酸水素ナ
トリウム溶液（100ml）に懸濁させそしてジクロロメタ
ン（３×100ml）中に抽出した。有機層を乾燥し過し
そして蒸発させると淡いクリーム色の固体（4.67g,66
％）融点106〜109℃（文献融点109.5℃）（R,Adamsら
（1926）Ｊ。Amer,Chem,Soc.,48,1758）即ち表題化合物
が残つた。

¹Hnmr（CDCl₃，d⁶DMSO）δ:7.70（2H,d,J＝9Hz,アリ
ール−H）,6.55（2H,d,J＝9Hz,アリール−H）,4.25（2
H,brs,−NH₂ ）。及び1.55（9H,S,CH₃）． 赤外スペクトル（ヌジヨール．ムル）3420,3350,3240,1
690,1640,1605,1515,1295,1160,1120,850,770,700及び6
15cm^-1． （ｂ）ｔ−ブチルＮ−４−（Ｎ−２−フタールイミドエ
チル）アミノベンゾエート ｔ−ブチル４−アミノベンゾエート（1.93g10mモ
ル）,N−（２−ブロモエチル）フタールイミド（2.54g,
10mモル）を3 3/4時間100℃で窒素下一緒に加熱した。
冷却して物質をジクロロメタン（125ml）に溶解し過
しそして蒸発させて黄色の油（3.35g）を得た。これを
クロマトグラフイ（30gシリカ／ジクロロメタン）にか
けそして表題化合物（163mg,5％）を白色の固体として
単離した。クロロホルム／石油エーテル（40〜60℃）に
より再結晶して固定融点139〜141℃を得た。

実測値:C69.70,H6.14,N7.71％C₂H₂N₂O₄としてC68.84,H
6.05及びN7.65％ ¹H nmr（CDCl₃）δ:7.6（5H,m,アリール−H）6.45（2
H,d,J＝9Hz,アリール−H）,4.5（1H,br S,N−H）,3.9
（2H,t,J＝6Hz,CH ₂＝Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）,3.4（2H,m,CH₂NH）
及び1.5（9H,SCCH ₃）． 赤外スペクトル（ヌジヨール）3370,1775,1705,1685,16
10,1525,775,及び720cm^-1 （ｃ）ｔ−ブチルＮ−４−（２−アミノエチル）アミノ
ベンゾエート 上述で生成したフタールイミド（240mg）をエタノー
ル（10ml）に溶解しそしてヒドラジン水和物（40μｌ）
を加えた。溶液を１晩窒素下で還流加熱しその間白色の
沈でん物が形成された。濃塩酸（150μｌ）を加え溶液
を冷却し過した。エタノールを蒸発により除去して水
溶液を残しそれを再過した。溶液を15％水酸化ナトリ
ウム溶液により塩基性にしそして酢酸エチル（２×25m
l）により抽出した。有機溶液を乾燥（硫酸ナトリウ
ム）し過しそして蒸発すると白色の結晶性化合物（13
1mg,85％）即ち所望のジアミノエステル融点117〜119℃
が残つた。

¹H nmr（CDCl₃）δ:7.75（2H,dJ＝9Hz,アリール−
H）,6.5（2H,d,J＝9Hz,アリール−H）,4.55（1H,brS,ア
リール−NH）,3.25（4H,brs,CH ₂）,1.55（9H,S,CCH ₃）
及び1.4（2H,brs,NH ₂） 赤外スペクトル（ヌジヨール）3370,1680,1610,1540,13
00,1160,930,835,及び775cm^-1． 実測値:C65.94,H8.55及びN11.51％。

C₁₃H₂₀N₂O₂としてC66.07,H8.53及びN11.85％． （ｄ）ｔ−ブチルＮ−４−｛Ｎ−２−〔３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオニル〕アミノエチル｝アミノベン
ゾエート ｔ−ブチルＮ−４−（２−アミノエチル）−アミノベン
ゾエート（74mg）及びＮ−サクシンイミジル−３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオナート（100mg）を乾燥ピ
リジン（0.5ml）に溶解し１晩攪拌した。溶媒を減圧下
除去しそして残つたゲルを酢酸エチル（10ml）にとり10
％炭酸水素ナトリウム溶液（10ml）により洗つた。有機
層を乾燥（硫酸ナトリウム）し過しそして蒸発すると
油（131mg,96％）即ち表題化合物を得た。

¹H nmr（CDCl₃）δ:8.25（1H,m,アリール−H）,7.4
（6H,m,アリールH＋ＮH CO）,6.5（2H,d,J＝9Hz,アリー
ル−H）,4.65（1H,brs,N−H）,3.4（4H,m,CH ₂NH）3.05
（2H,t,J＝6Hz,CH₂CO）,2.60（2H,t,J＝6Hz,CH₂−Ｓ−
Ｓ），及び1.55（9H,S,CCH ₃）． 赤外スペクトル（ニート）3350,3070,1660,1610,153
0,1420,1300,1160,1120,910,840,770,735cm^-1． （ｅ）Ｎ−４−｛Ｎ−２−〔３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオニル〕アミノエチル｝アミノ安息香酸，ビ
ストリフルオロ酢酸塩 ｔ−ブチルエステル（66mg）をトリフルオロ酢酸（2m
l）に溶解し90分間室温で放置した。トリフルオロ酢酸
を減圧下除去し酸（90mg）を定量的な収量でオレンジ色
の油として単離した。

¹H nmr（d⁶アセトン／CDCl₃）δ:8.6（1H,m,アリール
−H）,7.75（5H,m,アリール−H）,6.65（2H,d,J＝9Hz,
アリール−H）,3.5（4H,brs,NHCH ₂）,3.05（2H,t,J＝6H
z,COCH ₂），及び2.65（2H,t,J＝6Hz,CH ₂S）． （ｆ）４−アミジノフエニルＮ−４−｛Ｎ−２−〔３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオニル〕アミノエチル｝
アミノベンゾエート 酸ビストリフルオロアセテート（180mg）をピリジン
（1ml）に溶解した。４−アミジノフエノール（54mg,1
当量）次にジシクロヘキシルカルボジイミド（64mg,1当
量）加えた。溶液は濃いオレンジ色になつたがこれは直
ちに消失しジシクロヘキシル尿素が急速に形成された。
５時間後溶液をガラスウールを通して過しそしてピリ
ジンを蒸発により除去して茶色の油（365mg）が残つ
た。完全にエステル化したとしてこの物質は所望の物質
の〜45重量％でありそしてピリジニウムトリフルオロア
セテートが混在していた。

赤外スペクトル（ニート）2400−3300,1680,1610,149
0,1170,840,750及び710cm^-1． （ｇ）２−クロロ−４−アミジノフエニルＮ−４−｛Ｎ
−２−〔３−（２−ピリジルチオ）プロピオニル〕アミ
ノエチル｝アミノベンゾエート酸ビストリフルオロアセ
テート（228mg）をピリジン（1ml）中の２−クロロ−４
−アミジノフエノール（46mg）の溶液に加えた。ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（46mg）を導入した。物質を
20時間攪拌しその間固体が沈でんした。物質をガラスウ
ールを通して過し溶媒を蒸発により除去して淡いクリ
ーム色のガム（288mg）が残つた。完全にエステル化が
なされたとして生成物は約45重量％の純度を有した。

実施例４ 人間血清アルブミンにより人間組織プラスミノーゲン
活性剤の活性中心に結合した複合物（リンカー実施例
１） （ａ）Ｎ−ε−（４−チオブチルイミノ）−〔リジン〕
人間血清アルブミン 人間血清アルブミン（Kabi,200mg/ml）を固体のイミ
ノチオラン（Sigma,10.3mg）と混合し１時間37℃でpH7.
4でインキユベートした。混合物を４℃で小さいSephade
x G−25Mカラムを用いてpH7.4で3.5mlの20％グリセロー
ル,0.1MトリスHCl,0.9％w/v NaCl緩衝液（TGS）にゲル
過した。Ellmannの試薬（1.0mM,20％TGS,pH7.4）を用
いる活性部位の滴定は平均1.09チオール／モルHSAに対
応する2.33mM（２点測定）のチオール含量を示した。溶
液を−40℃で貯蔵した。

（ｂ）Ｎ−ε−（｛２−〔３−（４−ブチルイミノジチ
オ）プロピオニル〕ヒドラジノ｝安息香酸４′−アミジ
ノフエニルエステル・HCl）−〔リジン〕人間血清アル
ブミン チオール化アルブミン（VI,1.5ml）を実施例Ｉ（ｂ）
のアシル化剤（DMSO中の10mM,0.5ml,1.43モル過剰）と
混合し60分間０℃でインキユベートしその間約1.1モル
当量のピリジン２−チオンが離脱した。この物質の一部
をpH7.4の１％w/vD−マンニトール,20mM重炭酸アンモニ
ウム,1.0mM6−アミノヘキサン酸（MAE）緩衝液へ４℃で
２回の続いたゲル過（Sephadex G−25M）に付した。
最終の容量:3.5ml,1.05mMエステル。溶液を−40℃で貯
蔵した。

（ｃ）人間組織プラスミノーゲン活性剤（ｔ−PA）への
カツプリング 精製したｔ−PAを0.1MトリエンHCl,pH7.0（0.5ml）と
混合して20.900SU/mlの最終活性を得そして上述のアル
ブミンエステル（0.5ml）を加えた。０℃でインキユベ
ーシヨンすると第１図に示されるようにＳ−2288に対す
るアミド分解活性が急激に減少した。アシル化法は二相
を有するものと思われた。一つは比較的早く（t_1/2〜13
分）そして他は遅い（t_1/2〜98分）。さらに不活性化が
−40℃への凍結及び融解で生じた。生成物は同一の条件
だが¹²⁵I−MPAを用いて製造されたバツチと混合され
た。

（ｄ）複合物の精製 Sephacryl S−300のカラム（２×55cm）を流速22ml/
時で４℃でMAE緩衝液中の未修飾アルブミン及び¹²⁵I−M
PA（バイアル５）の混合物のクロマトグラフイにより補
正した。アルブミン及び¹²⁵Iは62〜88mlでともに溶離し
た。同一の条件下でクロマトグラフイにかけた粗複合物
はアルブミンより大きい見掛け上の分子量を有ししかも
放射能を含む二種のピークを与えた。42〜64mlで溶離す
る画分を集めそして凍結乾燥して白色の粉末（244mg）
を得た。この方法は二三の他のバツチについて繰返され
た。

（ｅ）複合物の脱アシル化 複合物の凍結乾燥したバツチを0.0％w/v Tween 80洗
滌剤を含む上述のTGS緩衝液中で37℃pH7.4で脱アシル化
した。４個のバツチに関する平均の第一次脱アシル化速
度定数は約４×10^-4／秒であつた。長く貯蔵すると約５
×10^-5／秒の速度定数により特徴付けられる脱アシル化
の遅い成分が明確になりそしてこれは製品の平均分子量
の増大と相関した（下記参照）。

（ｆ）複合物の分子量 カツプルされた生成物の大きさは２種の技術により調
べられた。第一にナトリウムドデシルサルフエートの存
在下のポリアクリルアミドゲル電気透析（Laemmli,英国
（1970）,Nature,277680）を用いて複合物の成分を分離
しそれは¹²⁵I−ｔ−PAのオートラジオグラフイによるか
又はフイブリン・オーバーレイ，ザイモグラフイ（Gran
elli−Piperno,A,及びReich,E.（1978）,J.Exp.Med。，
148223）（それはフイブリン溶解酵素を調べる）により
調べられた。第二に補正された修飾シリカカラムを用い
る型除外高性能液体クロマトグラフイを用いて脱アシル
化前後の複合物混合物を分離した。すべてのこれらの方
法は同様な結果を与えそれは下記の如く要約されよう。

（１）ｔ−PAに伴う放射能及び酵素活性は分子量が130
〜900キロダルトンの範囲内の二三の物と結合してい
る。個々の成分は1,2,3など（少くとも10以内）のアル
ブミン単位とのｔ−PAの結合物に対応している。

（２）すべての分断された複合物の蛋白質は脱アシル化
後フイブリン溶解活性を有しているように思えた。数時
間後37℃のpH8.0のTGS緩衝液又は0.5Mヒドラジンによる
複合物の処理は未修飾ｔ−PA（65〜70キロダルトン）に
相当する等モル量で活性成分（HPLC又はSDS−PAGEによ
り分離可能）の遊離をもたらした。

（ｇ）ラツトの血流からの複合物のクリアランス（方法
も同様に参照） ラツトの循環からの未修飾ｔ−PA及びアルブミン−ｔ
−PA複合物の除去の速度は放射分析及びフイブリン溶解
法の両方により測定された。結果を第２図に示す。未修
飾ｔ−PAの活性は極めて早く除去された（t_1/2約1.5
分）。恐らく代謝された¹²⁵Iラベルが血流に循環するた
めに放射分析の測定は約８分後で活性測定とは相違し
た。アルブミン複合物の酵素活性及び放射活性はともに
未修飾酵素よりも明らかに遅く消失した。投与物の一部
は約36分の見掛けの半減期で消失した。２種の剤に関す
る濃度／時間のプロツトの拡大は複合物が未修飾ｔ−PA
よりも少くとも10倍大きなバイオアベイラビリテイを有
することを暗示している。複合物が加水分解により未修
飾のｔ−PAとなるのでそれ故生体内でそれはフイブリン
溶解剤の徐放形として働きうる。

実施例５ 人間血清アルブミンにより人間組織プラスミノーゲン活
性剤の活性中心と結合した複合物（リンカー実施例２） 人間血清アルブミン（Kabi,200mg/ml,10ml）を２−イ
ミノチオラン（4.1mg,1モル当量）と混合し75分間25℃
でインキユベートした。Ellmannの試薬中で砕くとこの
時点後282mMチオールの濃度を示した。本溶液の一部
（0.5ml）を実施例２（ｂ）のアシル化剤（DMSO中の20m
M,70μl,1モル当量）と混合し１時間氷中に保つた。ｔ
−PA（50,000SU）及びトレーサー¹²⁵I−ｔ−PA（960,00
0c。ｐ。ｍ。）を加えた。混合物は０℃で72時間かけて
活性を徐々に低下させるが減少は短時間25℃でインキユ
ベーシヨンすることにより加速されよう。最終のアミド
分解活性は初めのレベルの37％であつた。生成物をTSK
−Ｇ−3000SW修飾シリカゲルのカラム（300×22.5mM）
へ適用しそして高性能ゲル浸透クロマトグラフイにかけ
た。用いた緩衝液は22℃で1.0ml/分の流速で0.08M燐酸
ナトリウム、0.32M塩化ナトリウム,20％v/vエタノールp
H7.0（Buffer H,Hefti,F。（1982）Anal。Biochem。，1
21,378〜381）であつた。蛋白質結合放射能の４個のピ
ークが観察され、カラムの空いた容量（40ml）に近い第
一のは極めて高分子量の物質であり約58mlにおける第二
のはMW＞200キロダルトンの物質のものであつた。第三
のピークは約64mlで溶離されそして約130キロダルトン
のMWに相当した。未修飾ｔ−PAは約74mlで溶離した。52
〜66mlからの溶離液の集りを集めMAE緩衝液（水で1:5v/
vに希釈されそして1mg/mlの人間血清アルブミンを含
む）にゲル過されそして凍結乾燥した。これは81mgの
白色固体を生じた。放射化学的収率:16.5％。37℃で0.0
1％w/v Tween80を含むTGS緩衝液中のこの物質の脱アシ
ル化はそれが初め約14％のカツプリングしていないｔ−
PAを含みそして脱アシル化に関するこの速度定数は約6.
4×10^-5／秒であつたことを示した。

この物質は2000SU/kgの投与量でラツトに注射されそ
して血流中のフイブリン溶解活性は方法（ｃ）に記載さ
れたように求められた。第３図はラツト（ｎ＝５）の血
流から複合物（2000SU/kg）のクリアランスを示す。約3
6分の半減期によるクリアランスの遅い相は確認され
た。第２図との比較はこのクリアランスを未修飾ｔ−PA
のそれよりもかなり低いことを示す。

実施例６ 人間免疫グロブリンＧにより人間組織プラスミノーゲン
活性剤の活性中心に結合した複合物（リンカー実施例
１） （ａ）Ｎ−ε−４−チオブチルイミノ〔リジン〕人間免
疫グロブリンＧ 人間免疫グロブリンＧ（Sigma,100mg）を脱気した50m
Mの燐酸ナトリウム0.1Mの塩化ナトリウムpH7.4緩衝液
（PBS緩衝液,1.0ml）に溶解しそして２−イミノチオラ
ン（PBS中の新しい50mM溶液50μｌ）を加えた。混合物
を１時間37℃でインキユベートし次に４℃でPBSの3.4ml
へ小さなSephadex G−25カラムでゲル過した。生成物
を直ちに用いた。

（ｂ）Ｎ−ε−（｛２−〔３−（４−ブチルイミノジチ
オ）プロピオニル〕ヒドラジノ｝安息香酸４′−アミジ
ノフエニル・HCl）−〔リジン〕−人間免疫グロブリン
Ｇ 上述のチオール化IgGを実施例１（ｂ）のアシル化剤
（DMSO中の20mM85μｌ）と混合しそして10分間常温（22
〜24℃）でインキユベートした。冷い（−20℃）エタノ
ール（10ml）を30秒にわたつて混合しつつ加えた。混合
物を４℃で30分間18,000gで遠心分離しそしてペレツト
をPBS緩衝液（3.4ml）に再溶解した。飽和した硫酸アン
モニウム溶液（10ml）を１分間攪拌しつつ加えそして遠
心分離を繰返した。ペレツトを2.2mlのPBSに溶解しそし
て４℃で同一の緩衝液3.4mlヘゲル過した。生成物を
直ちに用いた。

（ｃ）人間組織プラスミノーゲン活性剤（ｔ−PA）への
カツプリング 精製したｔ−PA（約26nモル）を段階（ｂ）の生成物
と混合して51,000SU/mlを含む溶液を得た。混合物を24
時間氷中に保つと残存の活性は11,600SU/ml（22.7％）
であつた。生成物を遠心分離して少量の不溶性の物質を
除きそしてサンプルの一部（50μｌ）を0.01％w/vTween
80を含むTGS緩衝液に希釈した。このサンプルの脱アシ
ル化を37℃で測定しそして約5.7×10^-4／秒の第一次定
数を得た。残つた生成物を−70℃で溶液として貯えそし
てフイブリン・オーバーレイ・サイモグラフイにより分
析するとき高分子量（Ｃ−200キロダルトン）フイブリ
ン溶解成分を示した。

実施例７ 人間血清アルブミンにより人間組織プラスミノーゲン活
性剤の活性中心に結合した複合物（リンカー実施例３） （ａ）４−｛Ｎ−２−（３−〔２−ピリジルジチオ〕プ
ロピオニル）アミノエチルアミノ｝ベンゾイル人間組織
プラスミノーゲン活性剤 組織プラスミノーゲン活性剤（3.0mlの0.1Mナトリウ
ム４−グアニジノブチラート中の46nモル）pH7.4を４℃
で16時間次に25℃で５時間実施例３のアシル化剤（DMSO
中の50mM30μｌ）により処理した。次に4.6％の最初の
アミド分解活性が残つた。この溶液2.5mlを0.01％w/vTw
een80を含むTGS緩衝液3.5mlへゲル過した。この溶液
の一部1:20v/vのTGS/Tween80への希釈及び37℃における
脱アシル化は第一次脱アシル化速度定数が約6.6×10^-4
／秒であることを示した。残りの溶液を直ちに用いた。

（ｂ）チオール化人間血清アルブミンへのカツプリング 人間血清アルブミン（Sigma,200mg）をPBS（1.0ml）
に溶解しそして50mMの新しい水性２−イミノチオラン60
μｌとともに25℃で１時間インキユベートした。生成物
をPBS（3.5ml）へゲル過しそして液を直ちに上述の
アシル−ｔ−PA溶液と混合した。30分間０℃に保つた後
生成物を−40℃で凍結して貯えた。生成物のSDS−PAGE/
フイブリン・オーバーレイ・ザイモグラフイは加水分解
され易い高分子量フイブリン溶解成分の存在を示した。

実施例８ 人間プラスミンの活性中心に結合したウロキナーゼの複
合物（リンカー実施例１） （ａ）チオール化ウロキナーゼの製造 高分子量ウロキナーゼ（Serono,500,000IU,32.8nモ
ル）をPBS緩衝液（1.0ml）中のトレーサー¹²⁵I−UK（1.
13×10⁶c.p.m.）と混合し２−イミノチオラン（冷
（℃）水中の50mM溶液25μｌ）により処理した。混合物
を75分間25℃でインキユベートしそして水（3.5ml）に
より1:1v/vで希釈されたMAE緩衝液へゲル過（Sephade
x^R G−25）した。この溶液を凍結乾燥した。

（ｂ）４−（３−｛２−ピリジルジチオ｝プロピオニ
ル）ヒドラジノベンゾイル（Ser−740）人間プラスミン Lys−プラスミノーゲン（100mg）をTGS緩衝液（1.0m
l）に溶解し２時間０℃でウロキナーゼ（5000IU）によ
り活性化した。得られたプラスミンは3.7×10⁶SU/mlの
活性を有しそして０℃で１時間実施例１のアシル化剤
（DMSO中の20mM溶液50μｌ）により処理した。次にアミ
ド分解活性を最初のレベルの0.6％へ減少させそして混
合物をMAE緩衝液（3.4ml）へゲル過しそして0.2mlの
部分で凍結乾燥した。サンプルの一部をPBS緩衝液（3.0
ml）に溶解しそしてジチオスレイトール（5mM）により
還元した。343nmにおける光学密度の増大はピリジン−
２−チオンの離脱によるものでありそれは各部分が約27
nモルのアシル酵素を含むことを示した。生成物の第一
次脱アシル化速度定数は約1.96×10^-4／秒であつた。

（ｃ）成分のカツプリング 上記のウロキナーゼをPBS緩衝液（1.0ml）中の５アリ
クオートのアシル酵素と混合しそして２時間０℃に保つ
た。分光光度計で測定して約61nモルのピリジン２−チ
オンが離脱した。生成物を実施例５に記載したように標
品高性能ゲル浸透クロマトグラフイにより精製された。
結合物は約60〜68mlで溶離しそしてこの部分をMAE緩衝
液（水により1:1v/vに希釈されそして1mg/mlの人間血清
アルブミンを含む）にゲル過され６アリクオートで凍
結乾燥された。未修飾ウロキナーゼは約78mlでカラムか
ら溶離された。結合物の最終の収率は8.3％（放射化
学）又は9.6％（アミド溶解）であつた。TGS緩衝液中の
45分間37℃の結合物の加水分解はプラスミン基質Ｓ−22
51に対するアミド分解活性において４倍増大したことを
測定したのでプラスミンの離脱を示した。SDSPAGE及び
フイブリン・オーバーレイ・ザイモグラフイは各UK分子
に共役したアシルプラスミン１及び２分子に相当する成
分を開示した。高MWバンドは３時間37℃のTGS緩衝液中
の加水分解に対して反応し易すかつた。

実施例９ 人間プラスミンの活性中心に結合したｐ−アミノベン
ゾイルウロキナーゼの複合物（リンカー実施例２） ウロキナーゼ（Serono,500,000IU,32.8nモル）をトレ
ーサー¹²⁵I−UK（1.70×10⁶c.p.m）と混合しそして75分
間25℃でPBS緩衝液（0.5ml）中の２−イミノチオラン
（冷水中10mM13.3μｌ）により処理した。この生成物を
さらに加工することなく用いた。２−（Ｎ−６−〔３−
｛２−ピリジルジチオ｝プロピオニル〕アミノヘキシル
アミノベンゾイル（Ser−740）人間プラスミンを25℃で
２時間プラスミン（実施例８（ｂ）において製造、0.9m
l）と実施例２（ｂ）のアシル化剤（DMSO中の20nM 80μ
ｌ）とを反応させることにより製造した。プラスミンの
アミド分解活性はこれらの条件下で最初の活性の8.8％
に低下した。生成物を水（3.2ml）中で1:5v/vに希釈さ
れたMAE緩衝液にゲル過しそして４−アリクオートで
凍結乾燥した。ジチオスレイトールによるこれらのアリ
クオートの一つの還元は約140nモルのアシル酵素含量を
示した。上述のチオール化ウロキナーゼは４−アミノ安
息香酸４′−アミジノフエニルエステルHCl（DMSO中50m
M溶液20μｌ）と混合しそしてアシル−プラスミン１バ
イアルに加えた。混合物を40分間25℃でインキユベート
し次に実施例４で記載されたHPLC条件を用いてクロマト
グラフイにかけた。溶離液の放射能をモニターすると結
合物は59〜66mlの間で溶離するが未修飾ウロキナーゼは
約75〜79mlに現れることが分つた。前者の部分を水（1
0.2ml）中1:5v/vに希釈されたMAE緩衝液にゲル過され
そしてアリクオートで凍結乾燥された。37℃のTGS緩衝
液中のこれらのアリクオートの一つの脱アシル化はウロ
キナーゼ活性部位のｐ−アミノベンゾイル基の除去の第
一次脱アシル化速度定数が約2.7×10^-4／秒であること
を示した。ウロキナーゼをプラスミンに結合するアシル
基は遥かに安定（Ｋ＜２×10^-5／秒）であつた。SDS−P
AGE及びフイブリン・オーバーレイ・サイモグラフイは
実施例８で示したのと同様なパターンを示した。

化合物を４匹のラツトに8000SU/kg,i.v.で注射しそし
て血流からのフイブリン溶解活性のクリアランスを方法
（ｃ）で記載された技術を用いて測りそして40000SU/kg
で未修飾ウロキナーゼのクリアランスと比較した。第４
図はユーグロブリン沈でんを用いて得た結果を示す。未
修飾UKと比べて33〜47分の延長された血漿半減期が観察
された。この剤のクリアランスは又5000SU/kgi.v。の投
与でモルモツト（方法（ｅ））で研究された。第５図は
未修飾UK及び結合物のクリアランスを比較しそしてUKそ
れ自体のより早いクリアランスと顕著に対照的に40〜50
分の半減期が少くとも50％の注射された結合物の投与に
適用されることを示している。

実施例10 人間プラスミンの活性部位に結合したウロキナーゼの複
合物（リンカー実施例３） （ａ）４−｛Ｎ−２−（３−〔２−ピリジルジチオ〕プ
ロピオニル）アミノエチルアミノ｝ベンゾイル人間プラ
スミン（方法１） 人間プラスミン溶液を実施例８（ｂ）の方法により製
造されそして3.05×10⁶SU/mlのアミド分解活性を有し
た。この溶液の1.5mlを実施例３（ｆ）のアシル化剤（D
MSO中50mM溶液75μｌ）と混合した。混合物を４℃で16
時間25℃で２時間インキユベートしそしてさらにアシル
化剤75μｌを加えた後37℃で30分間インキユベートし
た。アミド分解活性は次に最初のレベルの1.16％に減少
した。生成物を0.22μフイルターにより過し実施例５
に記載された条件を用いてHPLCにより精製した。アシル
プラスミンは62〜68mlの間で溶離しそして過剰のアシル
化剤から充分に分離された。アシルプラスミンの部分は
MAE緩衝液（9.6ml）中にゲル過されそして６アリクオ
ートで凍結乾燥された。ジチオスレイトールによる一つ
のアクリオートの還元は5.62nモル／アリクオートのア
シル酵素含量を示した。37℃におけるTGS/Tween80緩衝
液中のアシル酵素の脱アシル化は約6.4×10^-5／秒の第
一次脱アシル化速度定数を与えた。

（ｂ）チオール化ウロキナーゼへのカツプリング 高分子量ウロキナーゼ（Serono,500,000IU,32.8nモ
ル）を0.01％w.v Tween80（1.0ml）を含むPBS緩衝液中
のトレーサー¹²⁵I−UK（1.33×10⁶c.p。ｍ）と混合し２
−イミノチオラン（冷水中50mMの新しい溶液50μｌ）と
混合し１時間25℃でインキユベートした。生成物をPBS/
Tween80（3.5ml）にゲル過しそして直ちに上述のアシ
ル−プラスミン（28.1nモル）５バイアル及びボバイン
肺トリプシン抑制剤（アプロチニン）の44μＭ溶液0.2m
lへ加えた。混合物をCentricon（商標）遠心分離超過
バイアルに入れそして5000gで２時間４℃で遠心分離し
た。この方法は容量を1.1mlへ減少した。生成物を実施
例４に記載した条件を用いてHPLCにより精製した。放射
能の三つのピークが観察された。約56mlにおける第一は
MW〜200キロダルトンの結合物に相当し約64mlの第二は1
00〜140キロダルトンの物質に相当しそして80〜82mlの
第三は未修飾ウロキナーゼに相当した。初めの二つのピ
ーク（部分:52〜58ml,60〜68ml）をMAE緩衝液ヘゲル
過しそして凍結乾燥した。高MW画分の放射化学的収率
（２プラスミン分子にカツプリングしたウロキナーゼに
相当）は6.3％であり第二の画分（1:1結合物）のそれは
9.8％であつた。二つの画分のアミド分解活性の回収は
それぞれ3.9及び11％であつた。SDS−PAGE/フイブリン
・オーバーレイ・ザイモグラフイは二つの画分に高MW結
合物バンドが存在することを確証した。

実施例11 人間プラスミンの活性中心へ結合した人間組織プラスミ
ノーゲン活性剤の複合物（リンカー実施例１） 0.01％w/v Tween80（2.5ml）を含むPBS緩衝液中のト
レーサー¹²⁵I t−PA（２×10⁶c.p.m）と混合した組織プ
ラスミノーゲン活性剤（18000SU）を２−イミノチオラ
ン（冷PBS/Tween中50mM25μｌ）により処理しそして混
合物を30分間25℃でインキユベートした。生成物をPBS/
Tween緩衝液（3.0ml）ヘゲル過しそして実施例８
（ｂ）のアシル−プラスミンの一つのアクリオートとア
プロチニン溶液（44μM20μｌ）と混合した。混合物を
氷中で１時間インキユベートした。この物質のSDS−PAG
E/フイブリン・オーバーレイ・サイモグラフイは加水分
解に反応しやすい高MW結合物バンドを開示した。

実施例12 人間プラスミノーゲンにより組織プラスミノーゲン活性
剤の活性中心に結合した複合物（リンカー実施例１） 実施例１） 人間lys−ウラスミノーゲン（33％v/vグリセロールを
含むPBS緩衝液中の9.4mg/ml溶液1.2ml）を２−イミノチ
オラン（水中の新しい50mM溶液24μｌ）と混合し４分間
37℃でインキユベートした。実施例１（ｂ）のアシル化
剤（DMSO中の10mM溶液150μｌ）を加えそして混合物を
１時間氷中に保つた。生成物を1.0mM6−アミノヘキサン
酸（3.2ml）を含むPBS緩衝液へゲル過〔Sephadex（商
標）Ｇ−25〕した。得られたチオール化プラスミノーゲ
ン溶液の一部（1.0ml）をｔ−PA（20,000）及びトレー
サー¹²⁵I−ｔ−PA（１×10⁶c/p/m）と混合し０℃でイン
キユベートした。2 1/2時間後ｔ−PAのアミド分解活性
は最初のレベルの7.7％へ減少した。生成物の一部を0.5
ml/分及び22℃で緩衝液Ｈ（実施例５参照）中の修飾シ
リカゲルカラム（TSK G−3000,600×7.5mM）のHPLC分離
にかけた。放射能の高分子量ピークは約17mlで溶離しそ
して未修飾ｔ−PAは約20mlで溶離した。SDS−PAGE/フイ
ブリン・ザイモグラフイは又加水分解されやすい高MWフ
イブリン溶解成分の存在を開示した。

実施例13 人間プラスミンの活性中心に結合した人間組織プラスミ
ノーゲン活性剤の複合物（リンカー実施例３） 組織プラスミノーゲン活性剤（0.1Mナトリウム４−グ
アニジノブチラート,0.3M塩化ナトリウム,20mM燐酸ナト
リウム,0.01％w/v Tween80の3.4mlpH7.4中の78nモル）
を70分間25℃で50mM2−イミノチオラン（冷水中新しく
調製）50μｌにより処理した。この溶液1.7mlをSephade
x（商標）Ｇ−25で上述の緩衝液3.4mlへゲル過した。
Ellmannの試薬中でｔ−PAのチオール基を滴定すると蛋
白質１モル当り平均約0.6〜0.7モルのチオールを示し
た。チオール化ｔ−PAをアプロチニン（132nモル）、上
述の緩衝液（0.4ml）及び実施例８（ｂ）のアシルプラ
スミン（53nモル）と混合した。混合物をCentricon（商
標）バイアル中で濃縮して最終容量1.0ml（２時間5000g
/4℃）とした。生成物はアミド分解分析により測定して
約23nモルのｔ−PAを含んだ。SDS−PAGE/フイブリン・
オーバーレイ・ザイモグラフイによる生成物の分析は見
掛け分子量約150キロダルトンのフイブリン溶解活性成
分が未修飾のｔ−PAとともに存在することが分つた。こ
の物質のジチオスレイトールによる還元（30分間０℃で
C,20mM）は殆んどの高分子量成分を除去し従つて複合物
の成分はジスルフイド橋により結合されていることを確
証した。

実施例14 人間プラスミンの活性中心に結合したウロキナーゼの複
合物（リンカー実施例2,ウロキナーゼの活性中心のアシ
ル化なし） 0.01％w/v tween80（1.0ml）を含むPBS緩衝液中に高M
Wウロキナーゼ（Serono,500000IU,32.8nモル）を溶解し
１時間25℃で50mM2−イミノチオラン25μｌにより処理
した。生成物をMAE緩衝液にゲル過しそして凍結乾燥
した。Fllmannの滴定は修飾UKの平均のチオール含量が
0.8モル／モルであることを示した。生成物（64nモル）
をPBS/Tween緩衝液（1.0ml）中の実施例９で製造された
Ｎ−２−〔Ｎ−６−｛３−（２−ピリジルチオ）プロピ
オニル｝アミノヘキシル〕アミノベンゾイル（SER740）
人間プラスミン（330nモル）と混合し４時間０℃に保つ
た。生成物を25℃で流速1.0ml/分で緩衝液Ｈ中で修飾さ
れたシリカゲルカラム（TSK G−4000SW,7.5×600mM）の
HPLCにより一部精製された。20〜24mlの間で溶離する生
成物が1mg/mlの人間血清アルブミンを含むMAE緩衝液へ
ゲル過されそして凍結乾燥された。151gの白色の固体
が生成しこの一部（81mg）を４℃で流速10ml/時で4mM重
炭酸アンモニウム,0.1％w/vD−マンニトール中でSephac
ryl（商標）Ｓ−300のカラム（16×200mm）で再精製し
た。二つの画分を集めそして凍結乾燥した。第一は高分
子量物質（42〜52ml）に相当し第二はMW約90キロダルト
ンの物質（54〜62ml）に相当した。SDS−PAGE/フイブリ
ン・オーバーレイ・ザイモグラフイは高MW画分が約220
キロダルトンのフイブリン溶解活性成分（２プラスミン
分子に結合したUK）及び１プラスミンとのUK複合物（13
4キロダルトン）を含みそしてUKがないことを示した。
実施例９の複合物と同じく生成物は容易には加水分解さ
れなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４（ｃ）におけるＳ−2288のアミド分解
活性の低下（0.℃におけるインキユベーシヨン）を示
し、第２図は実施例４（ｇ）におけるラツトの循環から
のｔ−PA及びアルブミン−ｔ−PAの除去の速度の放射分
析及びフイブリン溶解の結果を示し、第３図は実施例５
におけるラツト（ｎ＝５）の血流からの複合物（2000SU
/kg）のクリアランスを示し、第４及び第５図は実施例
９におけるユーグロブリン沈でんを用いて得られた未修
飾ウロキナーゼ及び実施例２（ｂ）のアシル化剤を用い
て製造した化合物のクリアランスを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式（II） 〔式中 Ｘは式 （式中Ｒは脂肪族又は芳香族の残基である）のアシル基
   であり； Ａは酸素、硫黄及び窒素から選ばれる少なくとも１個の
   ヘテロ原子よりなる橋かけ基であって該窒素はC_1-6アル
   キルにより置換されていてもよく；そして Ｂはアミノ酸側鎖特異性試薬の処理により修飾されて蛋
   白質結合基を含むヒト蛋白質の蛋白質結合基に結合した
   親水性結合基であり；そして Ｗは蛋白質又は蛋白質結合基のアミノ酸側鎖と直接反応
   しうる基を表し、Ｚは対陰イオンでありそしてR¹〜R⁴は
   それぞれ独立して水素又は電子引き抜き部分である〕 の化合物。