JPH08217773A - １，５−アンヒドログルシトールの酸化物およびそれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの測定方法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの酸化物およびそれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの測定方法Info
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- JPH08217773A JPH08217773A JP5367395A JP5367395A JPH08217773A JP H08217773 A JPH08217773 A JP H08217773A JP 5367395 A JP5367395 A JP 5367395A JP 5367395 A JP5367395 A JP 5367395A JP H08217773 A JPH08217773 A JP H08217773A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は酸化酵素による１，５−アンヒドログ
ルシトールの新規な酸化生成物および１，５−アンヒド
ログルシトールの精度よい測定方法を提供する。 【構成】酸素の存在下、１，５−アンヒドログルシトー
ルに酸化酵素であるピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソ
ルボースオキシダーゼとアルドース−２−ウロースデヒ
ドラターゼを作用させて得られる２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）オキサン−４，５−ジオン、その水付加体ま
たはそのオキシム誘導体。これらを定量することよりな
る１，５−アンヒドログルシトールの精度よい測定方
法。
ルシトールの新規な酸化生成物および１，５−アンヒド
ログルシトールの精度よい測定方法を提供する。 【構成】酸素の存在下、１，５−アンヒドログルシトー
ルに酸化酵素であるピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソ
ルボースオキシダーゼとアルドース−２−ウロースデヒ
ドラターゼを作用させて得られる２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）オキサン−４，５−ジオン、その水付加体ま
たはそのオキシム誘導体。これらを定量することよりな
る１，５−アンヒドログルシトールの精度よい測定方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、１，５−アンヒドログ
ルシトール（以下「１，５ＡＧ」という）の新規な構造
を有する酸化物およびそれを用いる１，５ＡＧの測定方
法に関する。
ルシトール（以下「１，５ＡＧ」という）の新規な構造
を有する酸化物およびそれを用いる１，５ＡＧの測定方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１，５ＡＧは、ヒト髄液及び血漿中など
に存在し、ある種の疾患、特に糖尿病においては血漿中
の量が低下することが報告されている化合物である。
１，５ＡＧを測定する方法は知られている（特開昭６３
−１８５３９７号公報）。この方法は、１，５ＡＧをピ
ラノースオキシダーゼ等で酸化して発生する過酸化水素
を測定する方法である。
に存在し、ある種の疾患、特に糖尿病においては血漿中
の量が低下することが報告されている化合物である。
１，５ＡＧを測定する方法は知られている（特開昭６３
−１８５３９７号公報）。この方法は、１，５ＡＧをピ
ラノースオキシダーゼ等で酸化して発生する過酸化水素
を測定する方法である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、１，５
ＡＧについてピラノースオキシダーゼ等の酵素による酸
化を詳細に検討した結果、１，５ＡＧの新規な構造を有
する酸化物が誘導され、この酸化物を定量することによ
り精度よく１，５ＡＧを測定することができることを知
見した。したがって、本発明の目的は、１，５ＡＧの新
規な構造を有する酸化物を提供するにある。また他の目
的は、１，５ＡＧの新規な構造を有する酸化物を用いる
１，５ＡＧの測定方法を提供するにある。
ＡＧについてピラノースオキシダーゼ等の酵素による酸
化を詳細に検討した結果、１，５ＡＧの新規な構造を有
する酸化物が誘導され、この酸化物を定量することによ
り精度よく１，５ＡＧを測定することができることを知
見した。したがって、本発明の目的は、１，５ＡＧの新
規な構造を有する酸化物を提供するにある。また他の目
的は、１，５ＡＧの新規な構造を有する酸化物を用いる
１，５ＡＧの測定方法を提供するにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の第一の要旨は、
下記の化学式［化２］（化１と同じ）で示される化学構
造を有する２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン−
４，５−ジオンと、その水付加体である下記の化学式
［化３］で示される化学構造を有する２（Ｓ）−（ヒド
ロキシメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロキシオ
キサンまたはそのオキシム誘導体に関する。
下記の化学式［化２］（化１と同じ）で示される化学構
造を有する２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン−
４，５−ジオンと、その水付加体である下記の化学式
［化３］で示される化学構造を有する２（Ｓ）−（ヒド
ロキシメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロキシオ
キサンまたはそのオキシム誘導体に関する。
【０００５】
【化２】
【０００６】
【化３】
【０００７】本発明の第二の要旨は、酸素の存在下、試
料中の１，５ＡＧにピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソ
ルボースオキシダーゼとアルドース−２−ウロースデヒ
ドラターゼを作用させ、生成した上記の化学式［化２］
で示される化学構造を有する２（Ｓ）−（ヒドロキシメ
チル）オキサン−４，５−ジオン又はその水付加体を必
要によりその誘導体に変換させて定量することよりなる
１，５ＡＧの測定方法を提供するにある。
料中の１，５ＡＧにピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソ
ルボースオキシダーゼとアルドース−２−ウロースデヒ
ドラターゼを作用させ、生成した上記の化学式［化２］
で示される化学構造を有する２（Ｓ）−（ヒドロキシメ
チル）オキサン−４，５−ジオン又はその水付加体を必
要によりその誘導体に変換させて定量することよりなる
１，５ＡＧの測定方法を提供するにある。
【０００８】本発明につきさらに詳細に説明する。本発
明で使用される試料としては髄液、血漿、血清、尿また
はこれらから糖または蛋白などの測定を妨害する成分を
除去して得られるもの等が挙げられる。
明で使用される試料としては髄液、血漿、血清、尿また
はこれらから糖または蛋白などの測定を妨害する成分を
除去して得られるもの等が挙げられる。
【０００９】本発明で使用される１，５ＡＧの酸化酵素
であるピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキ
シダーゼは、国際生化学連合（ＩＵＢ）酵素委員会の分
類により、それぞれＥＣ１．１．３．１０又はＥＣ１．
１．３．１１に分類されるものであれば何でもよく、こ
れらの酵素の由来は問わない。
であるピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキ
シダーゼは、国際生化学連合（ＩＵＢ）酵素委員会の分
類により、それぞれＥＣ１．１．３．１０又はＥＣ１．
１．３．１１に分類されるものであれば何でもよく、こ
れらの酵素の由来は問わない。
【００１０】本発明で使用されるアルドース−２−ウロ
ースデヒドラターゼ（ａｌｄｏｓ−２−ｕｌｏｓｅ ｄ
ｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）は公知のものが使用でき、たと
えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
２３２，５９−７５（１９９２）に記載されているアル
ドース−２−ウロースデヒドラターゼが使用できる。
ースデヒドラターゼ（ａｌｄｏｓ−２−ｕｌｏｓｅ ｄ
ｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）は公知のものが使用でき、たと
えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
２３２，５９−７５（１９９２）に記載されているアル
ドース−２−ウロースデヒドラターゼが使用できる。
【００１１】なお、ポリポラスオブツサス由来のピラノ
ースオキシダーゼにはアルドース−２−ウロースデヒド
ラターゼを含んでいるものがある。例えば、宝酒造 (株
)製のピラノースオキシダーゼ「タカラ」にはこのアル
ドース−２−ウロースデヒドラターゼが含まれているの
で、このピラノースオキシダーゼを使用する場合には特
にアルドース−２−ウロースデヒドラターゼを別途加え
る必要はない。
ースオキシダーゼにはアルドース−２−ウロースデヒド
ラターゼを含んでいるものがある。例えば、宝酒造 (株
)製のピラノースオキシダーゼ「タカラ」にはこのアル
ドース−２−ウロースデヒドラターゼが含まれているの
で、このピラノースオキシダーゼを使用する場合には特
にアルドース−２−ウロースデヒドラターゼを別途加え
る必要はない。
【００１２】つぎに、本発明の２（Ｓ）−（ヒドロキシ
メチル）オキサン−４，５−ジオン又はその水付加体で
ある２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５
−テトラヒドロキシオキサンを製造する方法について述
べる。これらの化合物は、１，５ＡＧを酸化することに
より得ることができ、１，５ＡＧの酸化は、１，５ＡＧ
を水または緩衝液に溶解した水溶液を、カタラーゼの存
在下、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキ
シダーゼとアルドース−２−ウロースデヒドラターゼと
に接触させることによって行われる。
メチル）オキサン−４，５−ジオン又はその水付加体で
ある２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５
−テトラヒドロキシオキサンを製造する方法について述
べる。これらの化合物は、１，５ＡＧを酸化することに
より得ることができ、１，５ＡＧの酸化は、１，５ＡＧ
を水または緩衝液に溶解した水溶液を、カタラーゼの存
在下、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキ
シダーゼとアルドース−２−ウロースデヒドラターゼと
に接触させることによって行われる。
【００１３】接触の方法は、特に制限されない。例え
ば、酵素溶液としてこれらの酵素溶液を１，５ＡＧ水溶
液に添加するか、酵素自体を架橋し又は高分子坦体に固
定化して不溶化した酵素を、１，５ＡＧ水溶液に添加す
るか、前記の不溶化した酵素をカラムに充填（バイオリ
アクター）し、これに１，５ＡＧ水溶液を通液すること
により行われる。
ば、酵素溶液としてこれらの酵素溶液を１，５ＡＧ水溶
液に添加するか、酵素自体を架橋し又は高分子坦体に固
定化して不溶化した酵素を、１，５ＡＧ水溶液に添加す
るか、前記の不溶化した酵素をカラムに充填（バイオリ
アクター）し、これに１，５ＡＧ水溶液を通液すること
により行われる。
【００１４】１，５ＡＧの酸化反応の条件は、使用する
酵素の性質によって変化するが、酵素が十分に作用しう
るように緩衝液の種類と濃度、ｐＨ、反応温度、１，５
ＡＧの濃度、使用する酵素の量などを吟味し、選択すれ
ばよい。通常、酵素の至適条件の近傍に設定するのがよ
り好ましい。
酵素の性質によって変化するが、酵素が十分に作用しう
るように緩衝液の種類と濃度、ｐＨ、反応温度、１，５
ＡＧの濃度、使用する酵素の量などを吟味し、選択すれ
ばよい。通常、酵素の至適条件の近傍に設定するのがよ
り好ましい。
【００１５】次に、１，５ＡＧに前記の酵素を作用させ
たときに生じる生成物について述べる。
たときに生じる生成物について述べる。
【００１６】〔13Ｃ核磁気共鳴による方法〕化学的性質
と生化学的性質が、１，５ＡＧと同等であり、核磁気共
鳴で構造を解析する上で都合のよい13Ｃ標識１，５ＡＧ
（炭素骨格の全てを13Ｃ置換した１，５ＡＧ）を用い、
酵素による反応の変化を13Ｃ核磁気共鳴スペクトルで追
跡し、１，５ＡＧの酸化反応生成物を推定する。
と生化学的性質が、１，５ＡＧと同等であり、核磁気共
鳴で構造を解析する上で都合のよい13Ｃ標識１，５ＡＧ
（炭素骨格の全てを13Ｃ置換した１，５ＡＧ）を用い、
酵素による反応の変化を13Ｃ核磁気共鳴スペクトルで追
跡し、１，５ＡＧの酸化反応生成物を推定する。
【００１７】すなわち、13Ｃ標識１，５ＡＧ 8.5mg 、
ピラノースオキシダーゼとアルドース−２−ウロースデ
ヒドラターゼの混合物 (宝酒造( 株) 製、ピラノースオ
キシダーゼ「タカラ」）５mg、カタラーゼ (比活性 1,9
20U/mg) 1mg 、重水 0.1mlを50mM リン酸緩衝液 (pH 6.
0) 0.5ml に溶解し、37℃で３時間反応させる。時間の
経過とともに13Ｃ標識１，５ＡＧは消失し、新たに13Ｃ
標識化合物（Ａ）が生成蓄積する。この物質の13Ｃ核磁
気共鳴スペクトルを測定した。スペクトルの解析結果を
表１と表２に示す。
ピラノースオキシダーゼとアルドース−２−ウロースデ
ヒドラターゼの混合物 (宝酒造( 株) 製、ピラノースオ
キシダーゼ「タカラ」）５mg、カタラーゼ (比活性 1,9
20U/mg) 1mg 、重水 0.1mlを50mM リン酸緩衝液 (pH 6.
0) 0.5ml に溶解し、37℃で３時間反応させる。時間の
経過とともに13Ｃ標識１，５ＡＧは消失し、新たに13Ｃ
標識化合物（Ａ）が生成蓄積する。この物質の13Ｃ核磁
気共鳴スペクトルを測定した。スペクトルの解析結果を
表１と表２に示す。
【００１８】この13Ｃ核磁気共鳴スペクトルの値から、
13Ｃ標識化合物（Ａ）の構造は、２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）オキサン−４，５−ジオン［化２］の水付加
体である２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−４，４，
５，５−テトラヒドロキシオキサン［化３］と推定でき
る。
13Ｃ標識化合物（Ａ）の構造は、２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）オキサン−４，５−ジオン［化２］の水付加
体である２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−４，４，
５，５−テトラヒドロキシオキサン［化３］と推定でき
る。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】〔エチルオキシム誘導体による方法〕１，
５ＡＧ 50mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドース−
２−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造 (株 )
製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」）５mg、カタラ
ーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg を 50mMリン酸緩衝液 (p
H 6.0) 2.0mlに溶解し、37℃で１２時間反応する。
５ＡＧ 50mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドース−
２−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造 (株 )
製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」）５mg、カタラ
ーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg を 50mMリン酸緩衝液 (p
H 6.0) 2.0mlに溶解し、37℃で１２時間反応する。
【００２２】この反応液にＯ−エチルヒドロキシルアミ
ン塩酸塩 300mgを添加後、酢酸ナトリウム水溶液を滴下
して反応液の pH を約４とし、室温下でさらに１２時間
反応する。得られた反応液に酢酸エチルを加えて生成物
を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固する。この
乾固した残渣を精製水で溶解後、高速液体クロマトグラ
フィーにて精製し、約 35mg の化合物（Ｂ）の結晶を得
る。この化合物（Ｂ）の結晶の物理化学的性状は、次の
通りである。
ン塩酸塩 300mgを添加後、酢酸ナトリウム水溶液を滴下
して反応液の pH を約４とし、室温下でさらに１２時間
反応する。得られた反応液に酢酸エチルを加えて生成物
を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固する。この
乾固した残渣を精製水で溶解後、高速液体クロマトグラ
フィーにて精製し、約 35mg の化合物（Ｂ）の結晶を得
る。この化合物（Ｂ）の結晶の物理化学的性状は、次の
通りである。
【００２３】
【表３】分子量： 230（理論値： 230.26 ） トリメチルシリル化した化合物（Ｂ）のマススペクトル
による。 分子式：Ｃ10Ｈ18Ｎ2Ｏ4
による。 分子式：Ｃ10Ｈ18Ｎ2Ｏ4
【００２４】化合物（Ｂ）及び13Ｃ標識化合物（Ｂ）を
トリメチルシリル化し、マススペクトル（ＥＩ−ＭＳス
ペクトル）を測定した結果を表４に示す。親ピーク（Ｍ
＋）フラグメントの質量数から、化合物（Ｂ）の分子量
を求め、分子式を推定した。
トリメチルシリル化し、マススペクトル（ＥＩ−ＭＳス
ペクトル）を測定した結果を表４に示す。親ピーク（Ｍ
＋）フラグメントの質量数から、化合物（Ｂ）の分子量
を求め、分子式を推定した。
【００２５】
【表４】
【００２６】
【表５】紫外線吸収スペクトル：紫外線吸収スペクトル
は、精製水に溶解して測定する。 最大吸収波長 259.6nm (Ｅ1% 1cm ＝ 233 ) 赤外線吸収スペクトル：赤外線吸収スペクトルは、試料
をＫＢｒ錠剤法で測定する。 ３４２５（ｃｍ-1）、２９７８、２９３７、２８８５、
１６２４、１４８３、１４４４、１３８５、１３５８、
１２３０、１１５１、１０９０、１０４７、９５１、９
３０、８７９、８３５、７７９、７２３、７１０、６２
１、５５２
は、精製水に溶解して測定する。 最大吸収波長 259.6nm (Ｅ1% 1cm ＝ 233 ) 赤外線吸収スペクトル：赤外線吸収スペクトルは、試料
をＫＢｒ錠剤法で測定する。 ３４２５（ｃｍ-1）、２９７８、２９３７、２８８５、
１６２４、１４８３、１４４４、１３８５、１３５８、
１２３０、１１５１、１０９０、１０４７、９５１、９
３０、８７９、８３５、７７９、７２３、７１０、６２
１、５５２
【００２７】13Ｃ核磁気共鳴スペクトル：スペクトル
は、重ＤＭＳＯに溶解して測定する。化学シフトは、内
部標準のテトラメチルシランを 0ppm とし、これとの比
較値で示す。溶媒の重ＤＭＳＯのシグナルは 39.0 〜 4
0.0ppmに出現する。化合物（Ｂ）のシグナルは、表６の
通りで、マススペクトルのデータと一致し、１０個の炭
素が観測された。
は、重ＤＭＳＯに溶解して測定する。化学シフトは、内
部標準のテトラメチルシランを 0ppm とし、これとの比
較値で示す。溶媒の重ＤＭＳＯのシグナルは 39.0 〜 4
0.0ppmに出現する。化合物（Ｂ）のシグナルは、表６の
通りで、マススペクトルのデータと一致し、１０個の炭
素が観測された。
【００２８】
【表６】
【００２９】1Ｈ核磁気共鳴スペクトル：スペクトル
は、重ＤＭＳＯに溶解して測定する。化学シフトは、内
部標準のテトラメチルシランを 0ppm とし、これとの比
較値で表７に示す。
は、重ＤＭＳＯに溶解して測定する。化学シフトは、内
部標準のテトラメチルシランを 0ppm とし、これとの比
較値で表７に示す。
【００３０】
【表７】
【００３１】これらの測定値から、化合物（Ｂ）は、次
の化学式［化４］の化学構造を有すると認められる。
の化学式［化４］の化学構造を有すると認められる。
【００３２】
【化４】
【００３３】このことから、酸素及び好ましくはカタラ
ーゼの存在下、１，５−アンヒドログルシトールにピラ
ノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼと
アルドース−２−ウロースデヒドラターゼを作用させて
生じる酸化生成物は、２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）
オキサン−４，５−ジオン［化２］であり、さらにこの
［化２］の化合物に２分子の水が付加した２（Ｓ）−
（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロ
キシオキサン［化３］を与えるものと推定された。 こ
こでカタラーゼを存在させた場合に生じる酸化生成物
は、［化２］又は［化３］で示される化合物であり、こ
れ以上酸化の進んだ生成物はほとんど認められない。
ーゼの存在下、１，５−アンヒドログルシトールにピラ
ノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼと
アルドース−２−ウロースデヒドラターゼを作用させて
生じる酸化生成物は、２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）
オキサン−４，５−ジオン［化２］であり、さらにこの
［化２］の化合物に２分子の水が付加した２（Ｓ）−
（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロ
キシオキサン［化３］を与えるものと推定された。 こ
こでカタラーゼを存在させた場合に生じる酸化生成物
は、［化２］又は［化３］で示される化合物であり、こ
れ以上酸化の進んだ生成物はほとんど認められない。
【００３４】次に本発明の測定方法について説明する。
１，５−アンヒドログルシトールを含む試料に酸素の存
在下、前記の酵素を作用させるが、酸素は必ずしも供給
する必要はなく、試料中などに存在する溶存酸素をその
まま利用してもよい。
１，５−アンヒドログルシトールを含む試料に酸素の存
在下、前記の酵素を作用させるが、酸素は必ずしも供給
する必要はなく、試料中などに存在する溶存酸素をその
まま利用してもよい。
【００３５】ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボー
スオキシダーゼは、前記のものが使用でき、通常０．５
〜５００U/ml、好ましくは１〜２００U/ml使用される。
アルドース−２−ウロースデヒドラターゼも、前記のも
のが使用でき、通常０．５〜５００U/ml、好ましくは１
〜２００U/ml使用される。カタラーゼは公知のものが使
用可能であって、通常１〜１００００U/ml、好ましくは
１００〜６０００U/ml使用される。酵素反応は、酵素試
薬を試料に添加し、通常１５〜５０℃で１分〜２４時
間、好ましくは３分〜30分間行われる。
スオキシダーゼは、前記のものが使用でき、通常０．５
〜５００U/ml、好ましくは１〜２００U/ml使用される。
アルドース−２−ウロースデヒドラターゼも、前記のも
のが使用でき、通常０．５〜５００U/ml、好ましくは１
〜２００U/ml使用される。カタラーゼは公知のものが使
用可能であって、通常１〜１００００U/ml、好ましくは
１００〜６０００U/ml使用される。酵素反応は、酵素試
薬を試料に添加し、通常１５〜５０℃で１分〜２４時
間、好ましくは３分〜30分間行われる。
【００３６】次に、酵素反応で生成する２（Ｓ）−（ヒ
ドロキシメチル）オキサン−４，５−ジオン［化２］、
その水付加体である２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−
４，４，５，５−テトラヒドロキシオキサン［化３］を
測定する方法について説明する。
ドロキシメチル）オキサン−４，５−ジオン［化２］、
その水付加体である２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−
４，４，５，５−テトラヒドロキシオキサン［化３］を
測定する方法について説明する。
【００３７】２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン
−４，５−ジオン［化２］は、反応基としてジケトンを
持っている。ジケトンは、化学的な反応性に富み、たと
えば、ヒドロキシルアミンやその誘導体と反応してジケ
トンのオキシム誘導体を、ヒドラジンやその誘導体と反
応してジケトンのヒドラゾン誘導体を、カルバミン酸や
その誘導体と反応してジケトンのカルバゾン誘導体を、
芳香族アミンやその誘導体と反応してジケトンのシッフ
塩基誘導体を、グアニジンやその誘導体と反応して蛍光
誘導体を与えることが知られている。
−４，５−ジオン［化２］は、反応基としてジケトンを
持っている。ジケトンは、化学的な反応性に富み、たと
えば、ヒドロキシルアミンやその誘導体と反応してジケ
トンのオキシム誘導体を、ヒドラジンやその誘導体と反
応してジケトンのヒドラゾン誘導体を、カルバミン酸や
その誘導体と反応してジケトンのカルバゾン誘導体を、
芳香族アミンやその誘導体と反応してジケトンのシッフ
塩基誘導体を、グアニジンやその誘導体と反応して蛍光
誘導体を与えることが知られている。
【００３８】一方、２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オ
キサン−４，５−ジオン［化２］の水付加体である２
（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５−テト
ラヒドロキシオキサン［化３］は、容易に脱水して２
（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン−４，５−ジオ
ン［化２］に戻り、２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オ
キサン−４，５−ジオン［化２］と同様に反応する。
キサン−４，５−ジオン［化２］の水付加体である２
（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５−テト
ラヒドロキシオキサン［化３］は、容易に脱水して２
（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン−４，５−ジオ
ン［化２］に戻り、２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オ
キサン−４，５−ジオン［化２］と同様に反応する。
【００３９】１，５ＡＧの酵素による酸化反応によって
生じる２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン−４，
５−ジオン［化２］と、その水付加体である２（Ｓ）−
（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロ
キシオキサン［化３］は、そのまま測定してもよいが、
好ましくは前記の反応などによって容易に吸光度の大き
い色素や、高感度の蛍光物質等の誘導体に変換すること
ができるので、適当な検出系を利用すればこれらの物質
を精度よく定量することができる。したがって、精度よ
く１，５ＡＧを測定することが可能となる。
生じる２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン−４，
５−ジオン［化２］と、その水付加体である２（Ｓ）−
（ヒドロキシメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロ
キシオキサン［化３］は、そのまま測定してもよいが、
好ましくは前記の反応などによって容易に吸光度の大き
い色素や、高感度の蛍光物質等の誘導体に変換すること
ができるので、適当な検出系を利用すればこれらの物質
を精度よく定量することができる。したがって、精度よ
く１，５ＡＧを測定することが可能となる。
【００４０】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。
するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。
【００４１】実施例１〔13Ｃ標識２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロキシオキサ
ンの製造〕13 Ｃ標識１，５ＡＧ 8.5mg 、ピラノースオキシダーゼ
とアルドース−２−ウロースデヒドラターゼの混合物
(宝酒造(株)製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」）
5mg、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg 、重水 0.1m
lを 50mM リン酸緩衝液 (pH 6.0) 0.5ml に溶解し、37
℃で３時間反応させた。
シメチル）−４，４，５，５−テトラヒドロキシオキサ
ンの製造〕13 Ｃ標識１，５ＡＧ 8.5mg 、ピラノースオキシダーゼ
とアルドース−２−ウロースデヒドラターゼの混合物
(宝酒造(株)製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」）
5mg、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg 、重水 0.1m
lを 50mM リン酸緩衝液 (pH 6.0) 0.5ml に溶解し、37
℃で３時間反応させた。
【００４２】時間の経過とともに13Ｃ標識１，５ＡＧは
消失し、13Ｃ標識２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−
４，４，５，５−テトラヒドロキシオキサン［化３］が
生成した。この反応液の13Ｃ核磁気共鳴スペクトルの測
定結果は、前記の値と一致した。
消失し、13Ｃ標識２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）−
４，４，５，５−テトラヒドロキシオキサン［化３］が
生成した。この反応液の13Ｃ核磁気共鳴スペクトルの測
定結果は、前記の値と一致した。
【００４３】実施例２〔２（Ｓ）−（ヒドロキシメチ
ル）オキサン−４，５−ジオンのジＯ−エチルオキシム
の製造〕 １，５ＡＧ 50mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドー
ス−２−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造(株)
製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」） 5mg、カタラ
ーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg を 50mMリン酸緩衝液 (p
H 6.0) 2.0mlに溶解し、37℃で１２時間反応させた。こ
の反応液にＯ−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩 300mg
を添加後、酢酸ナトリウム水溶液を滴下して反応液の p
H を約４とし、室温下でさらに１２時間反応させた。
ル）オキサン−４，５−ジオンのジＯ−エチルオキシム
の製造〕 １，５ＡＧ 50mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドー
ス−２−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造(株)
製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」） 5mg、カタラ
ーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg を 50mMリン酸緩衝液 (p
H 6.0) 2.0mlに溶解し、37℃で１２時間反応させた。こ
の反応液にＯ−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩 300mg
を添加後、酢酸ナトリウム水溶液を滴下して反応液の p
H を約４とし、室温下でさらに１２時間反応させた。
【００４４】得られた反応液に酢酸エチルを加えて生成
物を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固した。こ
の乾固した残渣を精製水で溶解後、高速液体クロマトグ
ラフィーにて精製し、約 35mg の２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）オキサン−４，５−ジオンのジＯ−エチルオ
キシム〔前記化合物（Ｂ）：［化４］〕の結晶を得た。
生成物についてのマススペクトル、紫外線吸収スペクト
ル、赤外線吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルは、
前記の値と一致した。
物を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固した。こ
の乾固した残渣を精製水で溶解後、高速液体クロマトグ
ラフィーにて精製し、約 35mg の２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）オキサン−４，５−ジオンのジＯ−エチルオ
キシム〔前記化合物（Ｂ）：［化４］〕の結晶を得た。
生成物についてのマススペクトル、紫外線吸収スペクト
ル、赤外線吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルは、
前記の値と一致した。
【００４５】実施例３（１，５ＡＧの測定） 1.0 、10.0、20.0、50.0mg/l濃度の1,５ＡＧ標準液およ
び健常者の血清 100μl に、それぞれ、ピラノースオキ
シダーゼとアルドース−２−ウロースデヒドラターゼの
混合物 (宝酒造(株)製、ピラノースオキシダーゼ「タカ
ラ」）１mg/ml、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 0.1mg
/mlを溶解した 50mMリン酸緩衝液 (pH6.0) 500μl を添
加し、37℃で３時間反応させた。
び健常者の血清 100μl に、それぞれ、ピラノースオキ
シダーゼとアルドース−２−ウロースデヒドラターゼの
混合物 (宝酒造(株)製、ピラノースオキシダーゼ「タカ
ラ」）１mg/ml、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 0.1mg
/mlを溶解した 50mMリン酸緩衝液 (pH6.0) 500μl を添
加し、37℃で３時間反応させた。
【００４６】この反応液に、２(W/V) ％濃度となるよう
にＯ−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を添加後、
室温下でさらに６時間反応させた。得られた反応液に、
２mlの酢酸エチルを加えて２（Ｓ）−（ヒドロキシメチ
ル）オキサン−４，５−ジオンのジＯ−エチルオキシム
を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固した。この
乾固した残渣を精製水に溶解後、下記の高速液体クロマ
トグラフィーの条件下にて分析した。
にＯ−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を添加後、
室温下でさらに６時間反応させた。得られた反応液に、
２mlの酢酸エチルを加えて２（Ｓ）−（ヒドロキシメチ
ル）オキサン−４，５−ジオンのジＯ−エチルオキシム
を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固した。この
乾固した残渣を精製水に溶解後、下記の高速液体クロマ
トグラフィーの条件下にて分析した。
【００４７】
【表８】〔高速液体クロマトグラフィーの条件〕 装置 ：ＬＣ１０ＡＴ（島津(株)製） 分離カラム：センシューパックＣ18、6.0mmm内径×100m
m （センシュー(株）製） 移動相 ：Ａ液：精製水、 Ｂ液：80％アセトニトリル（グラジエント条件：０→30
分でアセトニトリル０→50％） 流速 ：1.5ml 分 検出器 ：ＳＰＤ１０、検出波長 263nm（島津（株）
製） 注入量 ：１００μl
m （センシュー(株）製） 移動相 ：Ａ液：精製水、 Ｂ液：80％アセトニトリル（グラジエント条件：０→30
分でアセトニトリル０→50％） 流速 ：1.5ml 分 検出器 ：ＳＰＤ１０、検出波長 263nm（島津（株）
製） 注入量 ：１００μl
【００４８】この分析条件下で得られた１，５ＡＧの検
量線を、図１に示した。図１の検量線を用いて測定した
健常者血清中の１，５ＡＧ値を表９に示した。また市販
の１，，５ＡＧ測定用キット〔ラナＡＧキット（日本化
薬 (株) 製）〕を使用して上記の健常者の血清中の１，
５ＡＧ値を測定して表９に示した。両者の測定値はよく
一致した。
量線を、図１に示した。図１の検量線を用いて測定した
健常者血清中の１，５ＡＧ値を表９に示した。また市販
の１，，５ＡＧ測定用キット〔ラナＡＧキット（日本化
薬 (株) 製）〕を使用して上記の健常者の血清中の１，
５ＡＧ値を測定して表９に示した。両者の測定値はよく
一致した。
【００４９】
【表９】
【００５０】
【発明の効果】以上説明した本発明によれば、１，５−
アンヒドログルシトールの新規な酸化生成物が提供され
る。さらに当該生成物又はその誘導体を定量することに
より１，５−アンヒドログルシトールを精度よく測定す
る方法が提供される。
アンヒドログルシトールの新規な酸化生成物が提供され
る。さらに当該生成物又はその誘導体を定量することに
より１，５−アンヒドログルシトールを精度よく測定す
る方法が提供される。
【図１】１，５ＡＧの検量線を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の化学式［化１］で示される化学構
造を有する２（Ｓ）−（ヒドロキシメチル）オキサン−
４，５−ジオン、その水付加体またはそのオキシム誘導
体。 【化１】 - 【請求項２】 そのオキシム誘導体がＯ−エチルオキシ
ム誘導体である請求項１に記載の２（Ｓ）−（ヒドロキ
シメチル）オキサン−４，５−ジオンのオキシム誘導
体。 - 【請求項３】 酸素の存在下、試料中の１，５−アンヒ
ドログルシトールに１，５−アンヒドログルシトールの
酸化酵素であるピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボ
ースオキシダーゼとアルドース−２−ウロースデヒドラ
ターゼを作用させ、生成した２（Ｓ）−（ヒドロキシメ
チル）オキサン−４，５−ジオン又はその水付加体を必
要によりその誘導体に変換させて定量することを特徴と
する１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。 - 【請求項４】 誘導体がＯ−エチルオキシム誘導体であ
る請求項３に記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5367395A JPH08217773A (ja) | 1995-02-17 | 1995-02-17 | １，５−アンヒドログルシトールの酸化物およびそれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5367395A JPH08217773A (ja) | 1995-02-17 | 1995-02-17 | １，５−アンヒドログルシトールの酸化物およびそれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08217773A true JPH08217773A (ja) | 1996-08-27 |
Family
ID=12949356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5367395A Pending JPH08217773A (ja) | 1995-02-17 | 1995-02-17 | １，５−アンヒドログルシトールの酸化物およびそれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08217773A (ja) |
-
1995
- 1995-02-17 JP JP5367395A patent/JPH08217773A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041122 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20050317 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |