JPH08154674A

JPH08154674A - 新規リパーゼ、その製造法及びその用途

Info

Publication number: JPH08154674A
Application number: JP7070589A
Authority: JP
Inventors: Yuzo Kojima; 裕三小嶋; Akira Shimizu; 昌清水
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1994-03-03
Filing date: 1995-03-02
Publication date: 1996-06-18
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: JP3676841B2

Abstract

(57)【要約】【目的】PUFA高含有油脂により高い活性を示す新規リパ
ーゼ、その製造法及びその用途に関する。【構成】PUFA含有油脂においてPUFAによく作用し、且
つ、不飽和脂肪酸含有トリグリセライドに対し、不飽和
度が高い程、良く作用する基質特異性を有する新規リパ
ーゼ、該リパーゼ生産能を有するシュードモナス属の菌
株を栄養培地で培養し、培養物中に該リパーゼを生成せ
しめ、これを採取する新規リパーゼの製造法及び該新規
リパーゼの用途。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規リパーゼ、その製
造法及びその用途に関する。更には、シュードモナス属
の生産する高度不飽和脂肪酸含有油脂に顕著に作用する
新規リパーゼ、その製造法及びその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来発見されているリパーゼは、エイコ
サペンタエン酸（以下、EPAという）、ドコサヘキサエ
ン酸（以下、DHAという）、アラキドン酸等の高度不飽
和脂肪酸（以下、PUFAという）含有トリグリセリドに
は、作用し難いと言われており、例えば、 Bottino等
は、鯨油に含まれるEPAやDHAのエステルが膵臓リパーゼ
による加水分解を受けがたい事を示し〔Lipids、第２
巻、489-493頁（1967年）〕、そして、Jensen等も、二
重結合位置の異なる15種のcis-オクタデセン酸を含む合
成グリセリドに対する膵リパーゼの特異性を検討し、７
−位以下に二重結合位置を持つcis-オクタデセン酸に難
分解性を示すこと〔Lipids、第８巻、45-47頁（1973
年）〕、且つ又、Geotrichum candidum 由来のリパーゼ
においても９−位の二重結合に難分解性を示すことを明
らかにしている〔Lipids、第７巻、738-741頁（1972
年）〕。

【０００３】このため、従来、微生物リパーゼのPUFA含
有トリグリセリドに対する難分解性を利用して、魚油中
のPUFAをグリセリン残基に残し、油脂中のPUFAを濃縮す
る方法が盛んになされている（特開昭61-15692号、特開
昭61-15693号、特公平4-10519号、特公平5-33988号）。

【０００４】しかしながら、一方、従来の微生物リパー
ゼのPUFA含有油脂に対する作用が極めて低いにも係わら
ず、その微弱な作用を利用してPUFA含有油脂を直接的に
改質しようとする試みもなされている。例えば、長田等
は、４種類の微生物固定化リパーゼを用いてアシドリシ
スを行い、イワシ油の改質を検討し、Chromobacterium
visucosumおよびMucor mieheiのリパーゼがPUFA含有油
脂に対し、僅かではあるが活性を示すことを明らかに
し、これらリパーゼを用いてPUFAを高濃度に含む遊離脂
肪酸から、直接PUFAを高濃度に含むトリグリセリドを合
成している〔油化学、第39巻、467-471頁（1990年）、
日本水産学会誌、第57巻、119-125頁（1991年）〕。

【０００５】そして又、ドコサヘキサエン酸とグリセリ
ンを基質とし、固定化リパーゼを用いてDHAトリグリセ
リドを合成する試みもなされている（特開平5-33110
5）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、既存のリパー
ゼのPUFA含有油脂に対する作用は、極めて微弱であり、
そのため、魚油などのPUFA含有油脂の加水分解や改質、
又長鎖或いは、高度不飽和脂肪酸を調製するに際して、
そのエステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシ
ス、およびアルコリシス等を、既存のリパーゼを用いて
効率的に行う事は極めて困難であり、PUFA含有油脂によ
り高い活性を示す新たなリパーゼが求められていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】このような現状を鑑み、
本発明者等は、PUFA含有油脂に対し高い活性を示す新規
なリパーゼを生産する菌の探索を行い、目的とするリパ
ーゼを生産する微生物を見いだすことに成功した。

【０００８】そして、得られたリパーゼは、PUFA含有油
脂によく作用する基質特異性を有する新規リパーゼであ
ることを知り、本発明を完成した。

【０００９】本発明の酵素生産菌は、新たに土壌から発
見、分離されたものであり、その菌学的性質は、下記の
通りである。

【００１０】(1) 形態大きさ：0.5〜0.7×1.0〜3.0μｍ桿菌グラム染色性：陰性運動性：多極鞭毛運動胞子の有無：無

【００１１】(2) 各培地における生育状態肉汁寒天平板培養：円形、光沢有り、凸状、柔らか、淡
黄色〜淡褐色肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化する。リトマス・ミルク培養：ペプトン化する。

【００１２】(3) 生理学的性質酸素要求性：好気性 OF 型：酸化カタラーゼ：陽性オキシダーゼ：陽性ＶＰ反応：陰性インドールの生成：陰性硝酸塩の還元性：陰性脱窒反応：陰性硫化水素の生成：陰性ウレアーゼ：陽性クエン酸分解：陽性カゼイン分解：陽性チロシン分解：陽性デンプンの加水分解：陰性 DNA分解：陰性アルギニン分解：陽性エスクリン分解：陰性糖類からの酸生成：Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンニット
から酸を生成するが、乳糖、麦芽糖、白糖、サリシンか
らは酸を生成しない。色素産生：ピオシアニン陰性ピオベルジン陽性生育温度の範囲：４〜37℃で生育（最適25〜33℃）生育pHの範囲：pH4.6〜9.6（最適 pH６〜8.5）生育食塩濃度：０〜５％

【００１３】以上の菌学的性質について、Bergey's Man
nual of Determinative Bacteriology、第８巻（1974
年）及びBergey's Mannual of Systematic Bacteriolog
y、第１巻（1984年）を参照し、本菌をシュードモナス
・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescns）に属す
る菌と同定し、シュードモナス・フルオレッセンス（Ps
eudomonas fluorescens）3−80と命名した。尚、本菌
は、FERM P-14166として、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。

【００１４】本菌を培養して、本発明の酵素を生産する
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカーなど、通常、微生物の培養
に使用される有機窒素源、或いは塩化アンモニウム、硫
酸アモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素
源が使用される。炭素源としては、ラード、バター、魚
油、鯨油などの動物性油脂、オリーブ油、大豆油、米糠
油、綿実油、ゴマ油などの植物性油脂、オレイン酸、パ
ルミチン酸、リノレイン酸などの脂肪酸類及びフラクト
ース、グルコース、マンノース、ガラクトース、異性化
糖、蔗糖、マルトース、キシロース、ソルビトール、マ
ンニトール、グリセロール、澱粉など、種々の糖、糖ア
ルコール及び澱粉やデキストリンなども使用することが
できる。

【００１５】以上の窒素源と炭素源のほか、補足する培
地成分として、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン
塩、バリウム塩などが添加される。培養はpH５〜９、温
度25〜40℃で１〜４日間程度、通気攪拌等の好気的培養
で行い、リパーゼを主に菌体外に生成蓄積せしめる。菌
体外に蓄積したリパーゼは、培養後、遠心、濾過等によ
り除菌し、除菌液を硫酸アンモニウム塩析、或いはアセ
トン、アルコール等を用いる有機溶媒沈澱などの種々の
方法で処理することにより、培養液から取得することが
できる。

【００１６】更に高度に精製された酵素標品は、疎水性
担体或いはイオン交換体によるクロマトグラフィーやゲ
ルろ過による分子篩クロマトグラフィーを行うことによ
り得ることができる。

【００１７】一方、菌体内酵素は、菌体破砕後、遠心分
離等で無細胞抽出液を調製し、同様の精製法で取得する
ことができる。

【００１８】以下、こうして得られた本発明の酵素の理
化学的性質について記載する。

【００１９】(a) 作用本発明の酵素は、PUFA含有油脂によく作用し、PUFAを効
率的に生成せしめる。

【００２０】(b)基質特異性本発明の酵素を炭素数18の飽和及び不飽和脂肪酸含有油
脂に作用させたとき、炭素鎖18-0の飽和脂肪酸よりも炭
素鎖18-1,18-2及び18-3の各種不飽和脂肪酸含有トリグ
リセリドによく作用し（図１に示される。）、又、炭素
数20及び炭素数22の各種不飽和脂肪酸含有トリグリセリ
ドに対しても良く作用する。

【００２１】試験例１トリオレイン 200mg、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）
２ml、100 mM CaCl₂ 0.1ml、本発明のリパーゼ 25単位
を平底ガラス容器（３×６cm）に入れ、２cmの攪拌子で
500rpmで攪拌し、37℃、20分間反応させ反応後油分をジ
エチルエーテルで抽出し分解物をイアトロスキャンTH10
（ヤトロン社製）にて分析した。その結果、加水分解率
16.8％で１，３−ジオレインは僅かであり（0.4 mol
％）、１，２−ジオレインが多く（28.6 mol％）生成し
ていた。

【００２２】(c) 至適pH 至適pHは、約７〜９付近に認められた〔基質オリーブ油
を0.1Ｍの各緩衝液の下で、37℃、20分反応（図２に示
される。）〕。尚、図中で黒丸は、Macllvaine緩衝液、
黒四角は、Glycine-NaOH緩衝液、白三角は、Tris-HCl緩
衝液をそれぞれ示す。

【００２３】(d) 至適温度至適温度は、約50℃付近に認められた［基質オリーブ油
を0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）の下で、20分反応（図３
に示される。）］。

【００２４】 (e) 温度安定性60分間の処理で約40℃付近まで安定であ
る。［0.1％トリトンX-100を含むPIPES-NaOH緩衝液（pH
7.0）（図４に示される。）］

【００２５】(f) pH安定性約pH６〜７付近で安定である。［0.1％トリトンX-100を
含むブリットンロビンソンの広域緩衝液で30℃、24時間
処理（図５に示される。）］

【００２６】(g) 分子量約64,000（SDS電気泳動法）

【００２７】(h) 活性化カルシウムにより活性化される。

【００２８】

【表１】

【００２９】(i) 金属塩（EDTAを含む）の影響

【００３０】

【表２】

【００３１】(j)等電点アンホライン焦点電気泳動法で測定した結果、本酵素の
等電点は、約4.7付近である。

【００３２】(k) 精製法限外濾過濃縮、エタノール分画、硫安塩析、アセトン分
画、DEAE-トヨパール65M （東ソー社製）等によるイオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、ブチル−スーパロー
ス、フェニル−スーパロース（ファルマシア製）等によ
る疎水性カラムクロマトグラフィー、トヨパール HW-55
（東ソー社製）等によるゲルろ過及びクロマトフォーカ
シング（ファルマシア社製）などを組み合わせることに
より高度に精製することができる。

【００３３】(l) 活性測定法 JIS規格 K601-88に記載の工業用リパーゼの活性度測定
方法、乳化剤添加法による測定方法（Ｂ法）に準じて行
った。そして、オリーブ油基質（リン酸緩衝液、pH7.
0）に酵素を37℃、20分間反応させた後、１分間に１μm
olの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。

【００３４】更に、本発明の酵素と既存の各種リパーゼ
との基質特異性について、以下に述べるガスクロマトグ
ラフィーを用いる基質特異性分析法に基づき、比較試験
を行った。

【００３５】基質特異性分析法:リパーゼの脂肪酸に対
する特異性は、基質油脂にリパーゼを添加し、反応させ
た後、n-ヘキサン：エタノール：３Ｎ硫酸混合液を加え
反応を停止させ、反応液中の油分をn-ヘキサンにて抽出
し、遊離した脂肪酸を分離してメチルエステル化し、そ
の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにて分析する方
法で行った。

【００３６】加水分解率は、アセトン：エタノール混合
液を加え反応を停止させ、アルカリ溶液にて滴定する方
法で求めた。

【００３７】即ち、酵素反応は、２連で行い、いずれも
内径３cm、容量50mlのガラス製ふた付き容器に0.1M PIP
ER-NaOH緩衝液１mlと基質油200 mg、100 mM CaCl₂ 10μ
l、直径２mmのガラスビーズ30個をいれ、ふたをし、37
℃で５分間振盪（振幅３cmで１分間に150回）した後、
酵素液100μlを加えて、更に１時間振盪した。

【００３８】一方は、アセトン：エタノール混合液
（１：１、V/V）５mlを添加し、反応を停止し、フェノ
ールフタレイン溶液２滴を加え、0.1N 水酸化カリウム
−エタノール標準液にて滴定し、紅色になる点より分解
率を求めた。

【００３９】また、他の一方は、遊離した脂肪酸組成の
分析の為に用いた。反応液に５mlのn-ヘキサン：エタノ
ール：３Ｎ硫酸混合液（400:200:1,V/V）を加え反応を
停止した。そして油分の存在するヘキサン層を分取後、
水１mlと１Ｎ水酸化カリウム溶液400μlを加え、アルカ
リ性にし、水層を分取した。次に、水層に対し、１Ｎ塩
酸を800μlを加え、酸性にし、n-ヘキサン４mlを加え、
酵素反応で遊離した脂肪酸をn-ヘキサン層に抽出した。
この遊離脂肪酸画分に三フッ化ほう素メタノール溶液メ
タノール錯体を加えてメチルエステル化した後、ガスク
ロマトグラフィーにて脂肪酸の分析を行った。

【００４０】各種基質油脂より酵素反応により遊離され
た脂肪酸量は、下記の計算式により求めた。

【００４１】ガスクロマトグラフィーの条件は、次の通
りである。装置：島津GC-9Aガスクロマトグラフィー；カラム：Ada
vanceDS 60-80 mesh Chromosorb W,2m×3mmガラスカラ
ム；カラム温度：190−220℃；注入温度：240℃；検出
器：FID；キャリヤーガス：N₂ 50 ml/min

【００４２】

【数１】

【００４３】尚、数式１中の記号及び数値は、次のこと
を意味する。 H：総加水分解率（％） a：試料溶液の滴定に要したN/10水酸化カリウム−エタ
ノール標準液量(ml) b：空試験に要したN/10水酸化カリウム−エタノール標
準液量（ml） f：0.1N水酸化カリウム−エタノール標準液のファクタ
ー 0.1：0.1N水酸化カリウム−エタノール標準液濃度 0.2：基質油の量（g） S：ケン化価 56.11：水酸化カリウムの分子量

【００４４】任意の一脂肪酸の加水分解のされ易さを示
す値Ｆ及び任意の一脂肪酸の加水分解率Hiは、それぞれ
次の数式２及び数式３で求められる。

【００４５】

【数２】

【００４６】

【数３】

【００４７】尚、数式２又は数式３中の記号は、次のこ
とを意味する fi：リパーゼの加水分解後遊離した任意の一脂肪酸のモ
ル分率 f₀i：任意の一脂肪酸の未分解油脂中のモル分率 H：総加水分解率（％）

【００４８】試験例２イカ油〔DHA(22-6) 17.7％, EPA(20-5) 15.8％含有、理
研ビタミン社製〕、タラ肝油（EPA 12.12％,アラキドン
酸(20-4) 8.96％含有、理研ビタミン社製）、アラキド
ン酸含有油脂（アラキドン酸 25.41％,EPA 4.05％含
有、サントリー社製）、ジホモ−γ−リノレン酸含有油
脂（ジホモ−γ−リノレン酸(20-3,n-6系PUFA) 23.2％,
γ−リノレン酸(18-3,n-6系PUFA) 9.86％含有、サント
リー社製）、及びミード酸含有油脂（ミード酸(20-3,n-
9系PUFA)12.24％、サントリー社製）のそれぞれに、本
発明の酵素、クロモバクテリウム由来のリパーゼ（Chro
mobacterium viscosum, 旭化成社製）、リゾプス由来の
リパーゼ（Rhizopus delemar, 生化学工業社製）、カン
ジダ由来のリパーゼ（Candida cylindracea, シグマ社
製）、アスペルギルス由来のリパーゼ（Aspergillus ni
ger, 商品名：リパーゼ−AP，天野製薬社製）及びシュ
ードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：
リパーゼ−AK，天野製薬社製）の各種市販リパーゼを加
水分解率が５から10％になるように添加し、基質特異性
分析法に述べた条件と同一の条件で反応後、遊離する脂
肪酸の組成を上記基質特異性分析法にて分析し、得られ
た各脂肪酸の遊離率を、添加したリパーゼ１単位当たり
の分解率（Hi/U）として図６〜図１０に示した。

【００４９】尚、図６は、基質がイカ油の場合であり、
図７は、基質がタラ肝油の場合であり、図８は、基質が
アラキドン酸含有油脂の場合であり、図９は、基質がジ
ホモ−γ−リノレン酸含有油脂の場合であり、図１０
は、基質がミード酸含有油脂の場合である。

【００５０】図６〜図１０で明らかなように、イカ油、
タラ肝油、アラキドン酸含有油脂、ジホモ−γ−リノレ
ン酸含有油脂、ミード酸含有油脂の場合の何れの基質に
おいても、本発明の酵素は、既存のリパーゼと比較し
て、EPA、DHA、アラキドン酸等のPUFAにおけるHi/U値が
著しく大きく、不飽和脂肪酸を含有する油脂の不飽和脂
肪酸部分に極めて速やかに作用することが明らかとなっ
た。

【００５１】試験例３大豆油〔パルミチン酸(18-0) 4.1％, オレイン酸(18-1)
23.8％,リノール酸(18-2) 53.9％, α−リノレン酸(18
-3,n-3系PUFA) 7.4％含有、和光純薬工業社製〕に、本
発明の酵素、クロモバクテリウム由来のリパーゼ（Chro
mobacterium viscosum,旭化成社製）、リゾプス由来の
リパーゼ（Rhizopus delemar,生化学工業社製）、カン
ジダ由来のリパーゼ（Candida cylindracea,シグマ社
製）、アスペルギルス由来のリパーゼ（Aspergillus ni
ger,商品名：リパーゼ−AP，天野製薬社製）及びシュー
ドモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リ
パーゼ−AK，天野製薬社製）の各種市販リパーゼを加水
分解率が５から10％になるように添加し、基質特異性分
析法に述べた条件と同一の条件で反応後、遊離する脂肪
酸の組成を上記基質特異性分析法にて分析し、パルミチ
ン酸（18-0）のF値を100とする相対値で示した。その結
果は図１１に示される。

【００５２】図１１から明らかなように、大豆油を基質
とし、生成する脂肪酸の各成分のF値において、本発明
の酵素で処理した場合は、α−リノレン酸、リノール酸
等の不飽和脂肪酸の値が飽和脂肪酸のパルミチン酸の値
よりはるかに大きく、一方、既存のリパーゼで処理した
場合には、飽和脂肪酸のパルミチン酸の値が、α−リノ
レン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸の値と同等若しく
はより大きいことが分かる。

【００５３】即ち、上記試験例２及び３の結果から明ら
かなように、本発明の酵素は、既存の他のリパーゼと
は、作用及び基質特異性において明らかに異なっている
事が分かる。

【００５４】それ故、本発明者が自然界からのスクリー
ニングにより得たシュードモナス・フルオッレセンス
（Pseudomonas fluorescens）3-80 FERM P-14166の生産
するリパーゼは、新規リパーゼといえるものである。

【００５５】試験例４更に、本発明者等は、PUFA含有油脂のイカ油を基質と
し、本発明の酵素と同様にPUFAに強く作用するところの
基質特異性を有するリパーゼを、シュードモナスに属す
るタイプカルチャーからスクリーニングした。

【００５６】

【表３】

【００５７】その結果、表３に示すシュードモナス・オ
バリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・アウ
レオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens）、シュ
ードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaph
is）等のシュードモナスに属する広範囲の菌株がシュー
ドモナス・フルオッレセンス（Pseudomonas fluorescen
s）3-80（FERM P-14166）と同様にPUFAに強く作用する
特徴を有する酵素を産生することを明かにした。

【００５８】本発明の酵素をPUFA含有油脂に作用させる
場合の作用条件は、本発明の酵素が、その活性を維持で
きる条件で有れば特に限定されないが、本発明の酵素
は、低加水分解条件下においてもよくPUFAを遊離するこ
とを特徴としている。従って、本発明においては、本発
明の酵素をPUFA含有油脂に作用させることによって、夾
雑物の少ないPUFAを高純度に取得することができる。
尚、試験例５で明らかなように、本発明の酵素は、高加
水分解率においても、市販の酵素〔例えば、シュードモ
ナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リパー
ゼ−AK，天野製薬社製）〕と同等、又はそれ以上にPUFA
を遊離することができる。

【００５９】試験例５ミード酸含有油脂（ミード酸(20-3,n-9系PUFA)12.24
％、サントリー社製）及びイカ油〔DHA(22-6) 17.7％,
EPA(20-5) 15.8％含有、理研ビタミン社製〕を本発明の
酵素及び市販のリパーゼの一例としてシュードモナス由
来のリパーゼ（Pseudomonas sp., 商品名：リパーゼ−A
K，天野製薬社製）でそれぞれ加水分解し、反応液を経
時的にサンプリングし、油脂組成と遊離した脂肪酸画分
中のミード酸、EPA及びDHAの含量を分析した。即ち、ミ
ード酸含有油脂及びイカ油３g、0.1MPIPES-NaOH緩衝液
（pH7.0）３ml、100 mM塩化カルシウム0.5 ml、リパーゼ
3000U、ガラスビーズ30個（直径５mm）を100 ml容三角
フラスコに入れ、窒素ガスで置換後密栓して、30℃で振
盪し（150ストローク/min、ピッチ３cm）反応させ、各
時間の反応液の油分をクロロホルム−メタノール（２：
１，V/V）にて抽出し、油脂成分をイヤトロスキャンTH-
10にて定量し、一方、抽出した油分をシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィー（20cm×20cm、展開溶媒n-ヘキサン：
ジエチルエーテル：ギ酸＝70:30:１,V/V）にて展開し、
遊離脂肪酸画分をかきとり、10％塩酸メタノールにてメ
チルエステル化してミード酸、EPA及びDHAの含量をガス
クロマトグラフィーにより定量した。遊離されたPUFA量
は、加水分解前油脂中に含有された各PUFA量に対する割
合で示した。その結果、図１２〜図１４より明らかなよ
うに、本発明の酵素は、低加水分解率において、ミード
酸、EPA及びDHA等のPUFAを良く遊離し、高加水分解率に
おいても市販のリパーゼと同等、又は、それ以上にPUFA
を遊離できる。

【００６０】それ故、本発明は、本発明の酵素をPUFA含
有油脂に作用させることにより、PUFA含有油脂からアラ
キドン酸、ミード酸、EPA及びDHA等のPUFAを夾雑物を少
なく、高純度に取得する方法、或いは、本発明の酵素及
び市販のリパーゼをPUFA含有油脂に作用させることによ
って、PUFAを取得する方法を提供するものである。更に
又、本発明は、本発明の酵素と市販のリパーゼとを組み
合わせて使用することによって、PUFA含有油脂から複数
のPUFAをより効率良く分別取得する方法をも提供するも
のである。

【００６１】試験例６次に、本発明者等は、本発明の酵素及び市販の３種リパ
ーゼ〔クロモバクテリウム由来のリパーゼ（C. viscosu
m.,商品名：リパーゼ−TOYO，旭化成社製）、カンジダ
由来のリパーゼ（Candida cylindracea,シグマ社製）〕
及び〔シュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas s
p.,商品名：リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用い、グ
リセリンとオレイン酸、EPA、DHAの各遊離脂肪酸とでグ
リセリド合成を行ない、各種リパーゼのグリセリド合成
能を比較した。尚、用いた遊離脂肪酸のうちEPAとDHA
（何れもNIPPON CHEMICAL FEED Co.,Ltd.社製）は、各
エチルエステルから定法（脂質分析法入門、157頁、藤
野安彦著、学会出版センター社出版）に従い調製したも
のを用いて行った。即ち、グリセロール４g、各脂肪酸
0.3g、100 mM 塩化カルシウム0.1 ml、0.1M PIPES-NaOH
緩衝液（pH7.0）に溶解した各酵素１ml（500 u）、直径
２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶（内径2.5c
m、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密栓
し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を行ない、反
応後アセトン−エタノール混液（１：１）を10ml加え反
応を停止し、フェノールフタレン溶液を加え、0.1Nエタ
ノール性水酸化カリウム溶液にて滴定した。そして、オ
レイン酸に対する合成率を100％とした相対活性で、各
酵素のそれぞれの遊離脂肪酸に対する合成率を求めた。
その結果は、表４に示される。

【００６２】

【表４】

【００６３】表４より明らかなように、本発明の酵素
は、市販の各リパーゼに比較し、EPA、DHA、アラキドン
酸、ミード酸等の高度不飽和遊離脂肪酸の合成能が高い
ことが分かる。

【００６４】試験例７なお更に、本発明者等は、本発明の酵素を用い、トリオ
レインと各遊離脂肪酸とでアシドリシス反応を行い、ト
リオレインへの各遊離脂肪酸の取り込み量の検討をも試
みた。即ち、トリオレイン100μmole、遊離脂肪酸100μ
mole、固定化リパーゼ（精製した本発明の酵素を2,000
U/mlになるように10mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて希釈
し、この酵素液２mlにセライト545 ２gを用いてスラリ
ー状にし、室温にて20時間真空乾燥して調製した）100m
g、n-ヘキサン３ml、水５μlを30ml容サプル瓶（内径2.
5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密
栓し、20℃にて振盪して（振幅３cm、150ストローク）
反応を行った。用いた遊離脂肪酸は、DHA、EPA（何れも
NIPPON CHEMICAL FEED Co.,Ltd.社製）、アラキドン
酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸（何れもサント
リ−社製）の各エチルエステルから定法（脂質分析法入
門、157頁、藤野安彦著、学会出版センター社出版）に
従い調製したものを用いて行った。反応後、反応液の30
0μlを取りシリカゲル薄層クロマトグラフィー（20cm×
20cm、展開溶媒n-ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝
70：30：１V/V）にて展開し、トリグリセリド画分をか
きとり10％塩酸−メタノールにてメチルエステル化して
トリグリセリド画分中の各脂肪酸の含量をガスクロマト
グラフィーにより定量し、トリオレインへの各脂肪酸の
取り込み量（mol％）を検討した。その結果は、図１５
に示される。図１５から明らかなように、本発明の酵素
は、何れの高度不飽和脂肪酸をも効率よく取り込むこと
が分かる。

【００６５】以下、実施例により本発明の内容を更に具
体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により何
等限定されるものではない。

【００６６】

【実施例】

実施例１ポリペプトン1.0％、酵母エキス0.3％、デキストリン1.
0％、グリセロール0.2％、K₂HPO₄ 0.2％、MgSO₄・7H₂O
0.05％、アデカノールLG126 0.05％からなる前培養培地
（pH7.0）80mlにシュードモナス・フルオッレセンス（P
seudomonas fluorescens）3-80（FERM P-14166）を接種
し、28℃で17時間シェカー培養して種培養を調製した。
次に、あらかじめ常法により殺菌した、肉エキス2.0
％、酵母エキス0.3％、グリセロール0.2％、K₂HPO₄ 0.2
％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、タラ肝油1.0％、アデカノール
LG126 0.05％からなる本培養培地（pH7.0）３Ｌに上記
種培養 80mlを接種し、28℃で２日間通気攪拌（0.75VV
m,500rpm）培養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活
性として、10.0u/mlの除菌液2.8Ｌを得た。

【００６７】次に、この除菌液を限外濾過（分画分子量
6000）により濃縮し、アルコールを加えて有機溶媒沈澱
させ、この沈澱を10mM Tris-HCl 緩衝液（pH7.5）に溶
解し、同緩衝液で透析後、同緩衝液で平衡化したDEAE-
トヨパールカラムに供した。吸着した酵素は、食塩濃度
を上昇させる直線的濃度勾配法にて溶出し、活性画分を
限外濾過により濃縮した。この濃縮液を0.2M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したトヨパールHW-
50カラムに供し、ゲル濾過を行った。

【００６８】次に、この酵素液に0.5Mまで硫酸アンモニ
ウムを添加し、0.5M 硫酸アンモニウムを含む50 mM リ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したフェニル−スパーロ
ースカラム（FPLC）に供し、硫酸アンモニウムの濃度を
直線的に下降させる濃度勾配法にて溶出させた。さらに
得られた酵素活性画分を５mMリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析し、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカ
ラムに供した。リン酸濃度を0.5M まで直線濃度勾配法
で上昇させ、目的酵素を溶出し、脱塩濃縮した。そして
濃縮した酵素をクロマトフォーカシングにて分画し、精
製酵素標品を得た。

【００６９】実施例２肉エキス２％、酵母エキス0.5％、グリセロール1.2％、
K₂HPO₄ 0.2％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、アデカノールLG126
0.05％からなる液体培地（pH7.0）３Ｌを５Ｌジャーフ
ァーメンターに入れ、121℃、30分間加圧滅菌した後、
予め同培地で18時間振盪培養したシュードモナス・フル
オッレセンス（Pseudomonas fluorescens）3-80（FERM
P-14166）の前培養液を接種し、28℃、16時間（0.75VV
m,500rpm）通気培養した。培養液を遠心分離した上清の
リパーゼ活性は40u/mlであった。

【００７０】得られた培養液液の遠心上清を限外ろ過
（分画分子量6000）により濃縮し、0.5Ｍになるように
硫酸アンモニウムを加え0.5Ｍ硫酸アンモニウムを含む2
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて平衡化したブチル−トヨ
パールゲル200mlを加え、未吸着画分を除去し、同緩
衝液でゲルを洗浄後、10％ショ糖、0.1％トリトンX-100
を含む10mMリン酸緩衝液にてリパーゼを溶出した。得ら
れたリパーゼ画分を限外濃縮後、10％ショ糖、0.1％ト
リトンX-100を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に
対し、透析し、同緩衝液で平衡化したDEAE−トヨパール
（２×17cm）に注入した。カラムを同緩衝液で洗浄後、
0.5Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液の直線的濃度勾配
法にて溶出し、リパーゼ画分を限外ろ過により濃縮し
た。

【００７１】この濃縮液を0.2Ｍ食塩、10％ショ糖を含
む50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したSuperdex200
HR10/30カラム（ファルマシア製FPLC使用）によりゲル
ろ過を行い、活性画分を限外ろ過により濃縮して精製リ
パーゼを得た。こうして得られた精製リパーゼの比活性
は9844単位/mg、SDS電気泳動法において単一バンドを示
し、その分子量は約64,000であった。

【００７２】実施例３実施例１と同じ前培養培地80 ml にシュードモナス・オ
バリス（Pseudomonasovalis ）No.111 AKU 820 を接種
し、28℃で18 時間シェカー培養して種培養を調製し
た。次に、あらかじめ常法により殺菌した、ポリペプト
ン 0.5％、酵母エキス0.5％、グリセロール1.0％、K₂HP
O₄ 0.2％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、アデカノールLG126 0.0
5％からなる本培養培地（pH7.0）３Lに上記種培養 80ml
を接種し、28℃で24時間通気攪拌（0.75VVm,500rpm）培
養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性として4.5u
/mlの除菌液2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実施例１
と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得た。

【００７３】実施例４実施例１と同じ前培養培地80 mlにシュードモナス・オ
ウレオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens ）IFO
3521 を接種し、28℃で18時間シェカー培養して種培養
を調製し、その種培養液80mlを実施例２記載の本培養培
地３Ｌに接種し、28℃で24時間通気攪拌（0.75VVm,500r
pm）培養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性とし
て9.8u/mlの除菌液2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実
施例１と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得
た。

【００７４】実施例５実施例１と同じ前培養培地80mlにシュードモナス・クロ
ロラフィス（Pseudomonas chlororaphis ）IFO 3904 を
接種し、28℃で18時間シェカー培養して種培養を調製
し、この種培養液80mlを実施例１記載の本培養培地３Ｌ
に接種し、28℃で２日間通気攪拌（0.75VVm,500rpm）培
養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性として6.2u
/mlの除菌液 2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実施例
１と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得た。

【００７５】実施例６精製イカ油〔DHA(22-6) 17.7％, EPA(20-5) 15.8％含
有、理研ビタミン社製〕、30 g、0.1M PIPES-NaOH緩衝液
（pH7.0）30 ml、100 mM 塩化カルシウム５ ml、実施例
２に準じて得られた本発明の酵素30,000 Uを200 ml容メ
ジューム瓶に入れ窒素ガスで置換後密栓して、30℃で１
時間攪拌し（500rpm）反応させ（加水分解率は24.4
％）、反応後、森岡等の方法〔油化学、36巻816−820
（1987）〕により反応液からリパーゼ反応で遊離した脂
肪酸を抽出し、溶媒を除去後、常法に従い尿素付加法及
びそれに続く低温分別法〔何れの方法も、W.W.Christi
e,"Lipid Analysis",Pergamon Press,146-147頁（197
3）に記載されている。〕を行うことにより濃縮 EPA
（液中含量56.6％）1.1 gを得た。

【００７６】そして、未分解グリセリドを含むヘキサン
層にエタノールを等量加え、ヘキサン層を取る操作を数
回繰り返すことによって、未分解のジグリセリド及びモ
ノグリセリドを除去した。こうして得られたトリグリセ
リド10.6 gに0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）30 ml、1
00 mM 塩化カルシウム５ ml、市販のシュードモナス由
来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リパーゼ−A
K，天野製薬社製）10,000 Uを200 ml容メジューム瓶に
入れ窒素ガスで置換後密栓して、30℃で５時間攪拌し
（500rpm）反応させ（加水分解率は57.8％）、反応後、
森岡等の方法〔油化学、36巻816−820（1987）〕により
反応液からリパーゼ反応で遊離した脂肪酸を抽出し、溶
媒を除去後、常法に従い尿素付加法及びそれに続く低温
分別法〔何れの方法も、W.W.Christie,"Lipid Analysi
s",Pergamon Press,146-147頁（1973）に記載されてい
る。〕を行うことにより濃縮 DHA（液中含量61.5％）0.
96 gを得た。

【００７７】実施例７グリセロール４g、EPA 0.3g、100 mM 塩化カルシウム0.
1 ml、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）に溶解した実施
例２に準じて得られた本発明の酵素１ml（500u）、直径
２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶（内径2.5c
m、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密栓
し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を行った。反
応後アセトン−エタノール混液（１：１）を10ml加え反
応を停止し、フェノールフタレン溶液を加え、0.1Nエタ
ノール性水酸化カリウム溶液にて滴定し、本発明の酵素
のオレイン酸に対する合成率を100％とし、EPAに対する
合成率を求めたところ104.2％であった。

【００７８】実施例８グリセロール４g、DHA 0.3g、100 mM 塩化カルシウム0.
1 ml、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）30 ml、に溶解
した実施例１に準じて得られた本発明の酵素１ml（500
u）、直径２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶
（内径2.5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を
置換後密栓し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を
行った。反応後アセトン−エタノール混液（１：１）を
10ml加え反応を停止し、フェノールフタレン溶液を加
え、0.1Nエタノール性水酸化カリウム溶液にて滴定し、
本発明の酵素のオレイン酸に対する合成率を100％と
し、DHAに対する合成率を求めたところ57.4％であっ
た。

【００７９】実施例９まず、精製した本酵素及び市販の３種リパーゼ〔クロモ
バクテリウム由来のリパーゼ（C. viscosum.,商品名：
リパーゼ−TOYO，旭化成社製）、カンジダ由来のリパー
ゼ（Candida cylindracea,シグマ社製）〕及び〔シュー
ドモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リ
パーゼ−AK，天野製薬社製）を5,000 U／mlになるよう
に10 mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて希釈又は溶解し、こ
の酵素液２mlにセライト545 ２gを加え乳鉢を用いてス
ラリー状にし、室温にて20時間真空乾燥し各固定化リパ
ーゼを調製した。次いで、トリオレイン271.2μmole、
遊離脂肪酸271.2μmole、固定化リパーゼ100mg、n-ヘキ
サン4.56ml、あらかじめ求めた各酵素の最適水分量であ
る水、それぞれ５μl，10μl，５μl，10μlを30ml容サ
ンプル瓶（内径2.5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスに
て空気を置換後密栓し、10℃,30℃にて24時間振盪して
（振幅３cm、150ストローク）反応を行った。用いた遊
離脂肪酸は、DHA、EPA（何れもNIPPON CHEMICAL FEED C
o.,Ltd.社製）エチルエステルから定法（脂質分析法入
門、157頁、藤野安彦著、学会出版センター社出版）に
従い調製したものを用いて行った。反応後、反応液の30
0μlを取りシリカゲル薄層クロマトグラフィー（20cm×
20cm、展開溶媒n-ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝
70：30：１V/V）にて展開し、トリグリセリド画分をか
きとり10％塩酸−メタノールにてメチルエステル化して
トリグリセリド画分中の各脂肪酸の含量をガスクロマト
グラフィーにより定量し、トリオレインへの各脂肪酸の
取り込み量（mol％）を検討した。その結果、10℃及び3
0℃反応でのEPAの取り込みは図１６に、そして10℃反応
でのDHAの取り込みは図１７にそれぞれ示される。

【００８０】図１６及び図１７から明らかなように、本
発明の酵素の場合、市販の酵素がほとんど作用しない
か、或いは僅かにしか作用しない低温度においても非常
に速やかにEPAやDHA等のPUFAとアシドリシス反応を行う
ことができる。従って、本発明の酵素は高温度下で酸化
されやすい特徴を有するPUFAを含有するトリグリセリド
をアシドリシス反応で合成する場合極めて有利である。

【００８１】

【発明の効果】本発明の酵素は、既存のリパーゼに比し
て PUFAに高い活性を示す。それ故、魚油などのPUFA含
有トリグリセリドの油脂の加水分解や改質、又長鎖或い
は、高度不飽和脂肪酸を調製するに際して、そのエステ
ル合成反応、エステル交換反応、アシドリシス、および
アルコリシス等をより効率的に行うために有利に使用さ
れうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素の基質特異性を示す。

【図２】本発明の酵素の至適pHを示す。

【図３】本発明の酵素の至適温度を示す。

【図４】本発明の酵素の温度安定性を示す。

【図５】本発明の酵素のpH安定性を示す。

【図６】本発明の酵素と既存のリパーゼとをイカ油に作
用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸エステルの分
解率を示す。

【図７】本発明の酵素と既存のリパーゼとをタラ肝油に
作用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸エステルの
分解率を示す。

【図８】本発明の酵素と既存のリパーゼとを高アラキド
ン酸含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当たりの脂
肪酸エステルの分解率を示す。

【図９】本発明の酵素と既存のリパーゼとをジホモ−γ
−リノレン酸含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当
たりの脂肪酸エステルの分解率を示す。

【図１０】本発明の酵素と既存のリパーゼとをミード酸
含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸
エステルの分解率を示す。

【図１１】本発明の酵素と既存のリパーゼとを大豆油に
作用させた場合の脂肪酸に対する特異性を示す。

【図１２】本発明の酵素と既存のリパーゼとをミード酸
含有油脂に作用させた場合の加水分解率と遊離ミード酸
量との関係を示す。

【符号の説明】

図中の黒丸は、本発明の酵素を用いた場合であり、白四
角は市販のシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomona
s sp.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた
場合である。

【図１３】本発明の酵素と既存のリパーゼとをイカ油に
作用させた場合の加水分解率と遊離EPA量との関係を示
す。

【符号の説明】

【図１４】本発明の酵素と既存のリパーゼとをイカ油に
作用させた場合の加水分解率と遊離DHA量との関係を示
す。

【符号の説明】

図中の黒丸は、本発明の酵素を用いた場合であり、白四
角はシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas s
p.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた場合
である。

【図１５】本発明の酵素を用いたアシドリシス反応によ
る、トリオレインへの各脂肪酸の取り込み量を示すもの
である。

【図１６】本発明の酵素と市販の酵素を比較して用いた
場合のアシドリシス反応による、トリオレインへのEPA
の取り込みを示すものである。

【図１７】本発明の酵素及び市販の酵素を比較して用い
た場合のアシドリシス反応による、トリオレインへのDH
Aの取り込みを示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有する新規リパー
ゼ。 (a) 作用：高度不飽和脂肪酸含有油脂によく作用し、高
度不飽和脂肪酸を効率的に生成する。 (b)基質特異性：炭素数18の飽和及び不飽和脂肪酸含有
油脂に作用させたとき、炭素鎖18-0の飽和脂肪酸よりも
炭素鎖18-1,18-2及び18-3の各種不飽和脂肪酸含有トリ
グリセリドに良く作用し、又、炭素数20及び炭素数22の
各種不飽和脂肪酸含有トリグリセリドに対しても良く作
用する。 (c) 至適pH：約７〜９付近 (d) 至適温度：約50℃付近 (e) 等電点：約4.7付近
【請求項２】請求項１記載の新規リパーゼ生産能を有す
るシュードモナス属菌を培養して、該リパーゼを生産
し、これを採取することを特徴とする新規リパーゼの製
造法。
【請求項３】高度不飽和脂肪酸含有油脂に請求項１記載
の新規リパーゼを作用させて高度不飽和脂肪酸を遊離さ
せ、これを抽出、回収せしめることを特徴とする高不飽
和脂肪酸高度含有油脂からの高度不飽和脂肪酸の取得方
法。
【請求項４】高度不飽和脂肪酸含有油脂に請求項１記載
の新規リパーゼと市販のリパーゼとを組み合わせること
により、種々の高度不飽和脂肪酸を分別し、抽出し、回
収せしめることを特徴とする高不飽和脂肪酸高度含有油
脂からの高度不飽和脂肪酸の分別取得方法。
【請求項５】グリセロールと高度不飽和脂肪酸とを請求
項１記載の新規リパーゼ存在下で反応させて高度不飽和
脂肪酸のグリセロールエステルを生成せしめることを特
徴とする高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの合成法。
【請求項６】トリグリセリドと遊離の高度不飽和脂肪酸
とにおいて、請求項１記載の新規リパーゼを用いるアシ
ドリス反応によって、トリグリセリド中に高度不飽和脂
肪酸を取り込ましめること特徴とする高度不飽和脂肪酸
含有グリセリドの生成法。
【請求項７】トリグリセリドと遊離の高度不飽和脂肪酸
とにおいて、請求項１記載の新規リパーゼを用いるアシ
ドリス反応を20℃以下で行うことによって、トリグリセ
リド中に高度不飽和脂肪酸を取り込ましめること特徴と
する高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの生成法。