JPH08140695A - 培養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法 - Google Patents
培養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 培養菌体からのアスタキサンチンの工業的に
有利な分離・精製方法を開発する。 【構成】 エタノールを助溶媒とする超臨界二酸化炭素
抽出および硝酸銀水溶液抽出を併用することを特徴とす
るファフィア・ロドジーマ（Phaffia rhodozyma）の培
養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法。 【効果】 培養菌体からのアスタキサンチンの工業的に
有利な分離・精製方法が提供できる。
有利な分離・精製方法を開発する。 【構成】 エタノールを助溶媒とする超臨界二酸化炭素
抽出および硝酸銀水溶液抽出を併用することを特徴とす
るファフィア・ロドジーマ（Phaffia rhodozyma）の培
養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法。 【効果】 培養菌体からのアスタキサンチンの工業的に
有利な分離・精製方法が提供できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ファフィア・ロドジー
マ（Phaffia rhodozyma)の培養菌体からの、生理活性物
質として有用なアスタキサンチンの分離・精製方法に関
する。
マ（Phaffia rhodozyma)の培養菌体からの、生理活性物
質として有用なアスタキサンチンの分離・精製方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】近年、海産物中に多く含まれているカロ
テノイドや高度不飽和脂肪酸などの生理活性物質が注目
されている。これらの生理活性物質は物理的性質がきわ
めて類似しており、その分離・精製は容易ではなく、工
業的規模での分離・精製方法の開発が望まれている。従
来、脂肪酸などの生理活性物質の分離には真空蒸留法が
用いられているが、カロテノイドや高度不飽和脂肪酸な
どでは操作温度が高すぎ、熱的な安定性から使用が困難
である。一方、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）による分取法も実験室規模で検討されているが、溶
離液からの溶質の回収や充填物の交換等を要するため、
必ずしも低濃度の原料からの濃縮には経済的な方法とは
いえない。これに対し、超臨界流体抽出の適用が有望視
されており、特に、二酸化炭素は無毒で臨界温度が３
１.５℃で操作温度が３５℃程度であり、かつ安価であ
ることから、高度不飽和脂肪酸の分離溶媒として多くの
研究がなされており、例えば、魚油中からエイコサペン
タエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等
の高度不飽和脂肪酸の分離法として硝酸銀水溶液抽出を
併用した超臨界二酸化炭素抽出による鈴木らの研究（T.
Suzuki et al., Bioseparation, ３，１９７（１９９
３））や、温度勾配法を用いる鈴木らの研究がある。し
かし、これらは対象が不純物の比較的少ない抽魚油から
のＥＰＡおよびＤＨＡなどの不飽和脂肪酸に限定されて
おり、トリグリセライドなどの不純物を多く含む培養菌
体からのカロテノイドであるアスタキサンチンを分離・
精製方法は提案されておらず、魚油中からのＤＨＡおよ
びＥＰＡを抽出する方法では、培養菌体そのものからの
アスタキサンチンの分離はできないようである。
テノイドや高度不飽和脂肪酸などの生理活性物質が注目
されている。これらの生理活性物質は物理的性質がきわ
めて類似しており、その分離・精製は容易ではなく、工
業的規模での分離・精製方法の開発が望まれている。従
来、脂肪酸などの生理活性物質の分離には真空蒸留法が
用いられているが、カロテノイドや高度不飽和脂肪酸な
どでは操作温度が高すぎ、熱的な安定性から使用が困難
である。一方、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）による分取法も実験室規模で検討されているが、溶
離液からの溶質の回収や充填物の交換等を要するため、
必ずしも低濃度の原料からの濃縮には経済的な方法とは
いえない。これに対し、超臨界流体抽出の適用が有望視
されており、特に、二酸化炭素は無毒で臨界温度が３
１.５℃で操作温度が３５℃程度であり、かつ安価であ
ることから、高度不飽和脂肪酸の分離溶媒として多くの
研究がなされており、例えば、魚油中からエイコサペン
タエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等
の高度不飽和脂肪酸の分離法として硝酸銀水溶液抽出を
併用した超臨界二酸化炭素抽出による鈴木らの研究（T.
Suzuki et al., Bioseparation, ３，１９７（１９９
３））や、温度勾配法を用いる鈴木らの研究がある。し
かし、これらは対象が不純物の比較的少ない抽魚油から
のＥＰＡおよびＤＨＡなどの不飽和脂肪酸に限定されて
おり、トリグリセライドなどの不純物を多く含む培養菌
体からのカロテノイドであるアスタキサンチンを分離・
精製方法は提案されておらず、魚油中からのＤＨＡおよ
びＥＰＡを抽出する方法では、培養菌体そのものからの
アスタキサンチンの分離はできないようである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、工業的
規模で、ファフィア・ロドジーマの培養菌体からアスタ
キサンチンを効率よく分離・精製する方法を開発すべ
く、鋭意研究を重ねた結果、エタノールを助溶媒とする
超臨界二酸化炭素抽出および硝酸銀溶液を併用すること
により、その目的が達成できることを見いだし、本発明
を完成するに至った。
規模で、ファフィア・ロドジーマの培養菌体からアスタ
キサンチンを効率よく分離・精製する方法を開発すべ
く、鋭意研究を重ねた結果、エタノールを助溶媒とする
超臨界二酸化炭素抽出および硝酸銀溶液を併用すること
により、その目的が達成できることを見いだし、本発明
を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、エタノールを
助溶媒とする超臨界二酸化炭素抽出および硝酸銀溶液を
併用することを特徴とするファフィア・ロドジーマの培
養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法、特
に、培養菌体を分解または破砕し、有機溶媒抽出し、硝
酸銀抽出した後、エタノールを助溶媒として超臨界二酸
化炭素抽出を行う方法を提供するものである。以下、本
発明を詳細に説明する。
助溶媒とする超臨界二酸化炭素抽出および硝酸銀溶液を
併用することを特徴とするファフィア・ロドジーマの培
養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法、特
に、培養菌体を分解または破砕し、有機溶媒抽出し、硝
酸銀抽出した後、エタノールを助溶媒として超臨界二酸
化炭素抽出を行う方法を提供するものである。以下、本
発明を詳細に説明する。
【０００５】培養菌体からの抽出油の精製 本発明の方法で使用するアスタキサンチン生産菌として
は、ファフィア・ロドジーマに属する酵母、具体的には
ファフィア・ロドジーマＡＴＣＣ ２４２０２株および
該株を自体公知の変異処理して得られた株などが挙げら
れる。アスタキサンチン生産菌は、ブドウ糖、蔗糖、糖
密などの炭素源、酵母エキス、ペプトン、硫安などの窒
素源、その他微量の栄養源を含有する培地を用いて、１
５〜２５℃、好ましくは１８〜２２℃の好気的条件下で
５〜７日間培養する。培養した菌体は、遠心分離法によ
り集菌し、培地成分の除去のため水にて洗浄を行う。つ
いで、菌体の分解または破砕のために、物理的処理
（例、超音波処理、フレンチプレス処理、ホモジナイザ
ー処理など）あるいは化学的処理（例、酸加水分解処理
および酵素処理など）を行った後、例えば、メタノー
ル、エタノールあるいはアセトンなどの有機溶媒を用い
て菌体内のアスタキサンチンを抽出する。抽出物を、４
０℃以下で減圧濃縮して溶媒を除去すると、アスタキサ
ンチンを含有する抽出油が得られる。本明細書では、こ
れを培養菌体の抽出油と称する。
は、ファフィア・ロドジーマに属する酵母、具体的には
ファフィア・ロドジーマＡＴＣＣ ２４２０２株および
該株を自体公知の変異処理して得られた株などが挙げら
れる。アスタキサンチン生産菌は、ブドウ糖、蔗糖、糖
密などの炭素源、酵母エキス、ペプトン、硫安などの窒
素源、その他微量の栄養源を含有する培地を用いて、１
５〜２５℃、好ましくは１８〜２２℃の好気的条件下で
５〜７日間培養する。培養した菌体は、遠心分離法によ
り集菌し、培地成分の除去のため水にて洗浄を行う。つ
いで、菌体の分解または破砕のために、物理的処理
（例、超音波処理、フレンチプレス処理、ホモジナイザ
ー処理など）あるいは化学的処理（例、酸加水分解処理
および酵素処理など）を行った後、例えば、メタノー
ル、エタノールあるいはアセトンなどの有機溶媒を用い
て菌体内のアスタキサンチンを抽出する。抽出物を、４
０℃以下で減圧濃縮して溶媒を除去すると、アスタキサ
ンチンを含有する抽出油が得られる。本明細書では、こ
れを培養菌体の抽出油と称する。
【０００６】培養菌体抽出油の前処理 アセトンを用いた再結晶法により、培養菌体の抽出油を
精製する。培養菌体抽出油に１〜１０倍量、好ましくは
５倍量程度のアセトンを加え、−３０〜１００℃、好ま
しくは−５０℃にて冷却を行う。このとき、冷却によっ
て生じた下相の沈澱物を吸引濾過にて濾液と分離する。
さらに、濾液を減圧乾燥し、１〜５倍量、好ましくは３
倍量程度のアセトンを加え、同様の操作を５回程繰り返
す。ただし、添加アセトン量は、徐々に量を減らして、
冷却時にアスタキサンチンの結晶が生じるように調整す
る。この操作により、アスタキサンチンを８０％程度に
濃縮する。濃縮アスタキサンチン試料を、硝酸銀を含む
エタノール溶液に溶解させる。硝酸銀を含むエタノール
溶液としては、０.１〜１Ｎ、好ましくは０.５Ｎ程度の
濃度のものを使用する。また、濃縮アスタキサンチン試
料０.１ｇに対して１０〜５０ｇ、好ましくは２０ｇの
硝酸銀を含むエタノール溶液を加える。このときアスタ
キサンチンは銀イオンと反応する。接触後、４〜４０
℃、好ましくは２５℃にて、１２〜４８時間、好ましく
は１２時間静置した後、遠心分離によりアスタキサンチ
ンと不純物を分離した。得られたアスタキサンチンのエ
タノール溶液を超臨界抽出の仕込液とする。
精製する。培養菌体抽出油に１〜１０倍量、好ましくは
５倍量程度のアセトンを加え、−３０〜１００℃、好ま
しくは−５０℃にて冷却を行う。このとき、冷却によっ
て生じた下相の沈澱物を吸引濾過にて濾液と分離する。
さらに、濾液を減圧乾燥し、１〜５倍量、好ましくは３
倍量程度のアセトンを加え、同様の操作を５回程繰り返
す。ただし、添加アセトン量は、徐々に量を減らして、
冷却時にアスタキサンチンの結晶が生じるように調整す
る。この操作により、アスタキサンチンを８０％程度に
濃縮する。濃縮アスタキサンチン試料を、硝酸銀を含む
エタノール溶液に溶解させる。硝酸銀を含むエタノール
溶液としては、０.１〜１Ｎ、好ましくは０.５Ｎ程度の
濃度のものを使用する。また、濃縮アスタキサンチン試
料０.１ｇに対して１０〜５０ｇ、好ましくは２０ｇの
硝酸銀を含むエタノール溶液を加える。このときアスタ
キサンチンは銀イオンと反応する。接触後、４〜４０
℃、好ましくは２５℃にて、１２〜４８時間、好ましく
は１２時間静置した後、遠心分離によりアスタキサンチ
ンと不純物を分離した。得られたアスタキサンチンのエ
タノール溶液を超臨界抽出の仕込液とする。
【０００７】超臨界二酸化炭素抽出 本発明における超臨界二酸化炭素抽出は、自体公知の方
法で行うことができ、例えば、図１に例示するような超
臨界抽出装置を用い、高圧セル部の温度３３〜４０℃、
好ましくは３５℃、圧力７５〜３００atm、好ましくは
１５０atmとし、二酸化炭素の流量０.５〜５.０dm3／
分、好ましくは４.０dm3／分の条件下で行うことがで
き、これにより、純度の極めて高い（約９３％程度）ア
スタキサンチンが効率よく、回収できる。
法で行うことができ、例えば、図１に例示するような超
臨界抽出装置を用い、高圧セル部の温度３３〜４０℃、
好ましくは３５℃、圧力７５〜３００atm、好ましくは
１５０atmとし、二酸化炭素の流量０.５〜５.０dm3／
分、好ましくは４.０dm3／分の条件下で行うことがで
き、これにより、純度の極めて高い（約９３％程度）ア
スタキサンチンが効率よく、回収できる。
【０００８】図１示す超臨界抽出装置は、ボンベ１から
ストップバルブＶ−２までの昇圧部およびその下流の抽
出部よりなる。昇圧部 ボンベ１は、液体二酸化炭素を昇圧用ポンプ５へ送るた
め、サイフォン式の二酸化炭素ボンベを用いた。ボンベ
から送られる液体二酸化炭素中の水分を除去するため
に、ボンベとポンプの間に乾燥管２を置いた。乾燥管の
仕様は、材質ＳＵＳ３１６、最高使用圧力２０ＭＰa、
内径３５.５mm、長さ３１０mmとした。また、乾燥剤に
は、ＧＬサイエンス(株)製のモレキュラーシーブ５Ａ
（１／１６インチ・ペレット）を使用した。乾燥管によ
り水分を除去された液体二酸化炭素は、冷却ユニット４
（ヤマト科学製ＢＬ−２２）によって約−１２℃に保た
れたエチレングリコールにより冷却され、昇圧用ポンプ
５（ガス供給ポンプ）に送られる。ガス供給ポンプは、
ＧＬサイエンス(株)製の高圧用シングルプランジャーポ
ンプＡＰＳ−５Ｌ（最大圧力５８.８ＭＰa、常用圧力４
９.０ＭＰa、流量０.５〜５.２ml／分）を使用した。ポ
ンプヘッド部分には、液体二酸化炭素の気化を防ぐため
に冷却ユニットを装着した。また、ガス供給ポンプ内に
ゴミなどの不純物が混入することを防ぐためにフィルタ
３として、ＧＬサイエンス(株)製ＦＴ４−１０型を使用
した。フィルタの細孔平均径は約１０μmとした。系内
の圧力は、圧力調節弁Ｖ−１（Back pressure regulato
r）により任意の圧力に設定した。圧力調節弁はＴＥＳ
ＣＯＭ製の２６−１７２２−２４を使用した。このバル
ブは±０.１ＭＰa で系内の圧力を制御でき、最大使用
圧力は４１.５ＭＰa（４１５バール）であった。系内の
圧力は、ブルドン式圧力計６（ＧＬサイエンス(株)製Ｌ
ＣＧ−３５０；最大使用圧力３４.３ＭＰa）で測定し
た。この圧力計には、上限接点出力端子が付いており、
指定圧力でガス供給ポンプの電源を切るように設定し
た。また、これらの圧力計の検定に司測研(株)製エコノ
ミー圧力計ＰＥ−３３−Ａ（歪ゲージ式、精度±０.３
％）を使用した。昇圧部の圧力を制御するために、昇圧
部と抽出部の間にストップバルブＶ−２を設置した。ス
トップバルブには、ＧＬサイエンス(株)製の２ウエイ・
バルブ ０２−０１２０（最大使用圧力９８.０ＭＰa）
を用いた。また、安全のために、安全弁７をストップバ
ルブＶ−２の下流側に設置した。安全弁は、ＡＫＩＣＯ
(株)製のスプリング式のもので、系内の圧力が３４.３
ＭＰa で作動するように調整・検定した。なお、昇圧部
のボンベからフィルタまでの区間以外の配管には、１／
１６インチのステンレス管（材質ＳＵＳ３１６、外径
１.５８８mm、内径０.８mm）を用い、他の部分はすべて
１／８インチのステンレス管（材質ＳＵＳ３１６、外径
３.１７５mm、内径２.１７mm）を用いた。
ストップバルブＶ−２までの昇圧部およびその下流の抽
出部よりなる。昇圧部 ボンベ１は、液体二酸化炭素を昇圧用ポンプ５へ送るた
め、サイフォン式の二酸化炭素ボンベを用いた。ボンベ
から送られる液体二酸化炭素中の水分を除去するため
に、ボンベとポンプの間に乾燥管２を置いた。乾燥管の
仕様は、材質ＳＵＳ３１６、最高使用圧力２０ＭＰa、
内径３５.５mm、長さ３１０mmとした。また、乾燥剤に
は、ＧＬサイエンス(株)製のモレキュラーシーブ５Ａ
（１／１６インチ・ペレット）を使用した。乾燥管によ
り水分を除去された液体二酸化炭素は、冷却ユニット４
（ヤマト科学製ＢＬ−２２）によって約−１２℃に保た
れたエチレングリコールにより冷却され、昇圧用ポンプ
５（ガス供給ポンプ）に送られる。ガス供給ポンプは、
ＧＬサイエンス(株)製の高圧用シングルプランジャーポ
ンプＡＰＳ−５Ｌ（最大圧力５８.８ＭＰa、常用圧力４
９.０ＭＰa、流量０.５〜５.２ml／分）を使用した。ポ
ンプヘッド部分には、液体二酸化炭素の気化を防ぐため
に冷却ユニットを装着した。また、ガス供給ポンプ内に
ゴミなどの不純物が混入することを防ぐためにフィルタ
３として、ＧＬサイエンス(株)製ＦＴ４−１０型を使用
した。フィルタの細孔平均径は約１０μmとした。系内
の圧力は、圧力調節弁Ｖ−１（Back pressure regulato
r）により任意の圧力に設定した。圧力調節弁はＴＥＳ
ＣＯＭ製の２６−１７２２−２４を使用した。このバル
ブは±０.１ＭＰa で系内の圧力を制御でき、最大使用
圧力は４１.５ＭＰa（４１５バール）であった。系内の
圧力は、ブルドン式圧力計６（ＧＬサイエンス(株)製Ｌ
ＣＧ−３５０；最大使用圧力３４.３ＭＰa）で測定し
た。この圧力計には、上限接点出力端子が付いており、
指定圧力でガス供給ポンプの電源を切るように設定し
た。また、これらの圧力計の検定に司測研(株)製エコノ
ミー圧力計ＰＥ−３３−Ａ（歪ゲージ式、精度±０.３
％）を使用した。昇圧部の圧力を制御するために、昇圧
部と抽出部の間にストップバルブＶ−２を設置した。ス
トップバルブには、ＧＬサイエンス(株)製の２ウエイ・
バルブ ０２−０１２０（最大使用圧力９８.０ＭＰa）
を用いた。また、安全のために、安全弁７をストップバ
ルブＶ−２の下流側に設置した。安全弁は、ＡＫＩＣＯ
(株)製のスプリング式のもので、系内の圧力が３４.３
ＭＰa で作動するように調整・検定した。なお、昇圧部
のボンベからフィルタまでの区間以外の配管には、１／
１６インチのステンレス管（材質ＳＵＳ３１６、外径
１.５８８mm、内径０.８mm）を用い、他の部分はすべて
１／８インチのステンレス管（材質ＳＵＳ３１６、外径
３.１７５mm、内径２.１７mm）を用いた。
【０００９】抽出部 抽出部は、槽全体の高さ調節が可能な水恒温槽１１内に
設置した。水恒温槽の内容積は、８０dm3であり、チノ
ー(株)製温度制御器ＤＢ１０００により、水温を測定温
度±０.１℃で制御できる。昇圧部から供給される液体
二酸化炭素は、予熱器８へ送られる。予熱器は、溶媒
（二酸化炭素）を平衡温度まで加熱し超臨界流体にする
ためのものであり、１／８インチのステンレス管（材質
ＳＵＳ３１６、外径３.１７５mm、内径２.１７mm、長さ
約４ｍ）を直径５５mm、長さ１４０mmのスパイラル状に
変形して、水恒温槽内に設置した。予熱器により超臨界
流体とした二酸化炭素は、流体の逆流を防止する逆止弁
９（ＡＫＩＣＯ(株)製ＳＳ−５３Ｆ４：最大使用圧力３
４.３ＭＰa）を通過し、ストップバルブＶ−３、４を調
節することにより被抽出試料を含む平衡セル１０に導入
した。ストップバルブＶ−４は、抽出操作前後にストッ
プバルブＶ−５より下流の管内の残留物質を除去する目
的で設置した。平衡セルとしてＡＫＩＣＯ(株)製の高圧
用抽出セル（材質ＳＵＳ３１６、設計圧力３４.３ＭＰ
a、設計温度３７３.１５Ｋ、内径４５mm、高さ１６１.
５mm、内容積２５０ml）を用いた。飛沫同伴を防止し、
超臨界流体と試料の接触面積を大きくするための直径１
０mmのガラスビーズと共に試料を平衡セルに仕込んだ。
また、平衡セルから液体試料の飛沫同伴を防ぐためにセ
ルの入口にガラスウールを、出口に金属フィルタ（ステ
ンレス製焼結板、平均細孔径１２０μm）を設置した。
試料が溶解した超臨界流体（二酸化炭素）を、ストップ
バルブＶ−５および流量調節弁Ｖ−６（Expansion valv
e）を用いて系外へ排出した。流量調節弁は、ＡＫＩＣ
Ｏ(株)製の高圧用流量調節弁ＰＦ３／８−３−４００Ｋ
−ＮＶを使用した。このバルブを使って超臨界流体の流
量を調節し、減圧操作を行った。また、試料の凝縮によ
る管内の閉塞を防止するために、高圧用フィルタ１２を
流量調節弁の上流側に設置した。フィルタには、ＮＵＰ
ＲＯ製２ＴＦ−７（細孔平均径約７μm）を用いた。減
圧に伴う試料の凝縮および超臨界流体（二酸化炭素）に
よるドライアイスの発生を防ぐために、恒温槽出口から
トラップ１４までの流路および流量調節弁の外側に加熱
ユニット１３（リボンヒータおよび流量調節弁保温用鋳
込みヒータ；電圧約３０Ｖで約１２０℃保温可能）を設
置し、流路を保温した。最高使用温度は１５０℃で、こ
の部分の温度調節には、チノー(株)製温度制御器ＤＢ１
０００を用いた。流量調節弁Ｖ−６で減圧後、析出した
試料を、水浴１５中に設けたトラップ１４で回収した。
超臨界流体の流量を、流量計１７により測定した。流量
計には、品川精器製の積算式湿式ガスメータＷ−ＮＫ−
０.５Ｂ（測定精度０.１dm3）を使用した。対象ガスが
二酸化炭素であるため、測定前に流量計内の水を二酸化
炭素で飽和させた。さらに、測定対象流体（二酸化炭
素）を水蒸気で飽和するために、流量計の上流に飽和器
１６を設置した。
設置した。水恒温槽の内容積は、８０dm3であり、チノ
ー(株)製温度制御器ＤＢ１０００により、水温を測定温
度±０.１℃で制御できる。昇圧部から供給される液体
二酸化炭素は、予熱器８へ送られる。予熱器は、溶媒
（二酸化炭素）を平衡温度まで加熱し超臨界流体にする
ためのものであり、１／８インチのステンレス管（材質
ＳＵＳ３１６、外径３.１７５mm、内径２.１７mm、長さ
約４ｍ）を直径５５mm、長さ１４０mmのスパイラル状に
変形して、水恒温槽内に設置した。予熱器により超臨界
流体とした二酸化炭素は、流体の逆流を防止する逆止弁
９（ＡＫＩＣＯ(株)製ＳＳ−５３Ｆ４：最大使用圧力３
４.３ＭＰa）を通過し、ストップバルブＶ−３、４を調
節することにより被抽出試料を含む平衡セル１０に導入
した。ストップバルブＶ−４は、抽出操作前後にストッ
プバルブＶ−５より下流の管内の残留物質を除去する目
的で設置した。平衡セルとしてＡＫＩＣＯ(株)製の高圧
用抽出セル（材質ＳＵＳ３１６、設計圧力３４.３ＭＰ
a、設計温度３７３.１５Ｋ、内径４５mm、高さ１６１.
５mm、内容積２５０ml）を用いた。飛沫同伴を防止し、
超臨界流体と試料の接触面積を大きくするための直径１
０mmのガラスビーズと共に試料を平衡セルに仕込んだ。
また、平衡セルから液体試料の飛沫同伴を防ぐためにセ
ルの入口にガラスウールを、出口に金属フィルタ（ステ
ンレス製焼結板、平均細孔径１２０μm）を設置した。
試料が溶解した超臨界流体（二酸化炭素）を、ストップ
バルブＶ−５および流量調節弁Ｖ−６（Expansion valv
e）を用いて系外へ排出した。流量調節弁は、ＡＫＩＣ
Ｏ(株)製の高圧用流量調節弁ＰＦ３／８−３−４００Ｋ
−ＮＶを使用した。このバルブを使って超臨界流体の流
量を調節し、減圧操作を行った。また、試料の凝縮によ
る管内の閉塞を防止するために、高圧用フィルタ１２を
流量調節弁の上流側に設置した。フィルタには、ＮＵＰ
ＲＯ製２ＴＦ−７（細孔平均径約７μm）を用いた。減
圧に伴う試料の凝縮および超臨界流体（二酸化炭素）に
よるドライアイスの発生を防ぐために、恒温槽出口から
トラップ１４までの流路および流量調節弁の外側に加熱
ユニット１３（リボンヒータおよび流量調節弁保温用鋳
込みヒータ；電圧約３０Ｖで約１２０℃保温可能）を設
置し、流路を保温した。最高使用温度は１５０℃で、こ
の部分の温度調節には、チノー(株)製温度制御器ＤＢ１
０００を用いた。流量調節弁Ｖ−６で減圧後、析出した
試料を、水浴１５中に設けたトラップ１４で回収した。
超臨界流体の流量を、流量計１７により測定した。流量
計には、品川精器製の積算式湿式ガスメータＷ−ＮＫ−
０.５Ｂ（測定精度０.１dm3）を使用した。対象ガスが
二酸化炭素であるため、測定前に流量計内の水を二酸化
炭素で飽和させた。さらに、測定対象流体（二酸化炭
素）を水蒸気で飽和するために、流量計の上流に飽和器
１６を設置した。
【００１０】かくして、本発明の方法により、ファフィ
ア・ロドジーマの培養菌体から分離・精製されたアスタ
キサンチンは、そのままカロテイノイド系生理活性物質
として食品、医薬等の分野で、従来のカロテイノイド系
物質と同様に使用することができる。
ア・ロドジーマの培養菌体から分離・精製されたアスタ
キサンチンは、そのままカロテイノイド系生理活性物質
として食品、医薬等の分野で、従来のカロテイノイド系
物質と同様に使用することができる。
【００１１】
【実施例】つぎに、実施例を挙げてさらに本発明を詳し
く説明する。なお、培地組成の％は、いずれもｗ／ｖ％
を意味する。 実施例１ 以下に記載するごとく、ファフィア・ロドジーマを培養
し、図２のフローチャートに従って、その培養菌体から
アスタキサンチンを分離、精製した。酵母エキス０.３
％、ポリペプトン０.５％およびブドウ糖１.０％からな
る液体培地を２００mlバッフル付三角フラスコに５０ml
加え、１２１℃にて１５分間オートクレーブで加熱殺菌
した。これをファフィア・ロドジーマＡＴＣＣ ２４２
０２株の変異処理により得られた株の純粋培養物を接種
し、２０℃にて９６時間回転式振盪機で培養した。つい
で、酵母エキス０.２％、硫安０.６％、リン酸二水素カ
リウム０.３％、硫酸マグネシウム七水和物０.１％、塩
化カルシウム二水和物０.０１％およびブドウ糖１０％
からなる液体培地６リットルを１０リットルのジャーフ
ァメンターに入れ、１２１℃にて１５分間オートクレー
ブにて加熱殺菌した。これに上記の前培養液１２０mlを
接種し、２０℃、通気量６リットル／分、撹拌速度４０
０rpmの条件にて培養した。９６時間培養後、培養液か
ら遠心分離機により、湿重量で約５００ｇの菌体を得る
ことができた。
く説明する。なお、培地組成の％は、いずれもｗ／ｖ％
を意味する。 実施例１ 以下に記載するごとく、ファフィア・ロドジーマを培養
し、図２のフローチャートに従って、その培養菌体から
アスタキサンチンを分離、精製した。酵母エキス０.３
％、ポリペプトン０.５％およびブドウ糖１.０％からな
る液体培地を２００mlバッフル付三角フラスコに５０ml
加え、１２１℃にて１５分間オートクレーブで加熱殺菌
した。これをファフィア・ロドジーマＡＴＣＣ ２４２
０２株の変異処理により得られた株の純粋培養物を接種
し、２０℃にて９６時間回転式振盪機で培養した。つい
で、酵母エキス０.２％、硫安０.６％、リン酸二水素カ
リウム０.３％、硫酸マグネシウム七水和物０.１％、塩
化カルシウム二水和物０.０１％およびブドウ糖１０％
からなる液体培地６リットルを１０リットルのジャーフ
ァメンターに入れ、１２１℃にて１５分間オートクレー
ブにて加熱殺菌した。これに上記の前培養液１２０mlを
接種し、２０℃、通気量６リットル／分、撹拌速度４０
０rpmの条件にて培養した。９６時間培養後、培養液か
ら遠心分離機により、湿重量で約５００ｇの菌体を得る
ことができた。
【００１２】このようにして得られた菌体を凍結乾燥し
た後、アセトンを加え、乳鉢で機械的に菌体を破砕しな
がら抽出を行った。遠心分離法により、上相のアセトン
抽出液と残渣を分離し、その残渣にさらにアセトンを加
え抽出を行った。得られたアセトン抽出液を４０℃にて
減圧濃縮することにより、培養菌体の抽出油を約２５ｇ
得た。得られた培養菌体の抽出油約１００ｇを５００ml
のアセトンと接触させた後、−５０℃にて冷却を行っ
た。このとき、冷却によって生じた沈澱物を吸引濾過に
て分離し、濾液約２００ｇを得た。濾液を減圧乾燥し、
得られた乾燥試料５.３ｇに２０mlのアセトンを加え、
再び冷却した後、同様の操作を４回繰り返した。このと
きのアセトン添加量は、それぞれ１５、１０、５、１ml
とし、アスタキサンチンの結晶が得られるように調整し
た。以上の操作により純度８３％のアスタキサンチン試
料０.２７ｇを得た。さらに、得られた濃縮アスタキサ
ンチン試料０.２１ｇに硝酸銀濃度０.５Ｎのエタノール
溶液２０mlを加え、２５℃にて１２時間静置した。その
後、遠心分離によりアスタキサンチンと不純物を分離し
た。得られたアスタキサンチン試料０.１２ｇに１０ml
のエタノールを加え、超臨界抽出の仕込液とした。
た後、アセトンを加え、乳鉢で機械的に菌体を破砕しな
がら抽出を行った。遠心分離法により、上相のアセトン
抽出液と残渣を分離し、その残渣にさらにアセトンを加
え抽出を行った。得られたアセトン抽出液を４０℃にて
減圧濃縮することにより、培養菌体の抽出油を約２５ｇ
得た。得られた培養菌体の抽出油約１００ｇを５００ml
のアセトンと接触させた後、−５０℃にて冷却を行っ
た。このとき、冷却によって生じた沈澱物を吸引濾過に
て分離し、濾液約２００ｇを得た。濾液を減圧乾燥し、
得られた乾燥試料５.３ｇに２０mlのアセトンを加え、
再び冷却した後、同様の操作を４回繰り返した。このと
きのアセトン添加量は、それぞれ１５、１０、５、１ml
とし、アスタキサンチンの結晶が得られるように調整し
た。以上の操作により純度８３％のアスタキサンチン試
料０.２７ｇを得た。さらに、得られた濃縮アスタキサ
ンチン試料０.２１ｇに硝酸銀濃度０.５Ｎのエタノール
溶液２０mlを加え、２５℃にて１２時間静置した。その
後、遠心分離によりアスタキサンチンと不純物を分離し
た。得られたアスタキサンチン試料０.１２ｇに１０ml
のエタノールを加え、超臨界抽出の仕込液とした。
【００１３】仕込液を入れた平衡セル１０を図１に示す
超臨界抽出装置に設置した。つぎに、バルブＶ−２,４,
６を開き、バルブＶ−３,５を閉じ、ボンベ１より二酸
化炭素を供給し、系内のすべての空気を二酸化炭素で完
全に置換するために、二酸化炭素を１０分程度流した。
つぎに、バルブＶ−２、３、５を閉じた状態で、昇圧用
ポンプ５により系内（昇圧部）の圧力を上昇させた。そ
の後、平衡セルを測定圧力にするため、バルブＶ−５を
開けた。圧力上昇後、バルブＶ−５を閉じ、バルブＶ−
３を開き、バルブＶ−５より上流側が操作圧力になるよ
うに昇圧し、その後３０分程度放置した。また、恒温槽
出口からトラップまでの流路および流量調節弁Ｖ−６の
保温も開始した。系内の圧力および温度が一定になった
後、バルブＶ−５を開けて試料のサンプリングを開始し
た。このとき、流量調節弁Ｖ−６により流量を調節し
た。測定流速は、０.０７〜４dm3／分とした。流量調節
弁で減圧し、溶解力を失った二酸化炭素から析出した試
料を氷浴中のトラップで回収した。バルブＶ−３および
５を閉めサンプリングを終了した。その後、バルブＶ−
４を開け、配管中に残っている試料を二酸化炭素ですべ
て流し出した。試料の回収が完全に終わった後、トラッ
プを系内から外した。得られたトラップ内の抽出物を４
０℃にて減圧濃縮し、溶媒を除去することにより、高純
度（約９３％）のアスタキサンチンを得ることができ
た。
超臨界抽出装置に設置した。つぎに、バルブＶ−２,４,
６を開き、バルブＶ−３,５を閉じ、ボンベ１より二酸
化炭素を供給し、系内のすべての空気を二酸化炭素で完
全に置換するために、二酸化炭素を１０分程度流した。
つぎに、バルブＶ−２、３、５を閉じた状態で、昇圧用
ポンプ５により系内（昇圧部）の圧力を上昇させた。そ
の後、平衡セルを測定圧力にするため、バルブＶ−５を
開けた。圧力上昇後、バルブＶ−５を閉じ、バルブＶ−
３を開き、バルブＶ−５より上流側が操作圧力になるよ
うに昇圧し、その後３０分程度放置した。また、恒温槽
出口からトラップまでの流路および流量調節弁Ｖ−６の
保温も開始した。系内の圧力および温度が一定になった
後、バルブＶ−５を開けて試料のサンプリングを開始し
た。このとき、流量調節弁Ｖ−６により流量を調節し
た。測定流速は、０.０７〜４dm3／分とした。流量調節
弁で減圧し、溶解力を失った二酸化炭素から析出した試
料を氷浴中のトラップで回収した。バルブＶ−３および
５を閉めサンプリングを終了した。その後、バルブＶ−
４を開け、配管中に残っている試料を二酸化炭素ですべ
て流し出した。試料の回収が完全に終わった後、トラッ
プを系内から外した。得られたトラップ内の抽出物を４
０℃にて減圧濃縮し、溶媒を除去することにより、高純
度（約９３％）のアスタキサンチンを得ることができ
た。
【００１４】
【発明の効果】本発明によれば、ファフィア・ロドジー
マの培養菌体から、アスタキサンチンが効率よく分離・
精製でき、工業的に有用な培養菌体からのアスタキサン
チンの分離・精製方法が提供できる。
マの培養菌体から、アスタキサンチンが効率よく分離・
精製でき、工業的に有用な培養菌体からのアスタキサン
チンの分離・精製方法が提供できる。
【図１】 本発明方法で使用する超臨界抽出装置の具体
例の説明図。
例の説明図。
【図２】 本発明のアスタキサンチンの分離・精製方法
の具体例を示すフローチャート。
の具体例を示すフローチャート。
１：ボンベ、２：乾燥管、３：フィルタ、４：冷却ユニ
ット、５：昇圧用ポンプ、６：圧力計、７：安全弁、
８：予熱器、９：逆止弁、１０：平衡セル、１１：水恒
温槽、１２：高圧用フィルタ、１３：加熱ユニット、１
４：トラップ、１５：水浴、１６：飽和器、１７：流量
計
ット、５：昇圧用ポンプ、６：圧力計、７：安全弁、
８：予熱器、９：逆止弁、１０：平衡セル、１１：水恒
温槽、１２：高圧用フィルタ、１３：加熱ユニット、１
４：トラップ、１５：水浴、１６：飽和器、１７：流量
計
Claims (2)
- 【請求項１】 エタノールを助溶媒とする超臨界二酸化
炭素抽出および硝酸銀溶液を併用することを特徴とする
ファフィア・ロドジーマ（Phaffia rhodozyma）の培養
菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法。 - 【請求項２】 培養菌体を分解または破砕し、有機溶媒
抽出し、硝酸銀を添加した後、エタノールを助溶媒とし
て超臨界二酸化炭素抽出を行う請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6290977A JPH08140695A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 培養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6290977A JPH08140695A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 培養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08140695A true JPH08140695A (ja) | 1996-06-04 |
Family
ID=17762877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6290977A Pending JPH08140695A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 培養菌体からのアスタキサンチンの分離・精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08140695A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000112534A (ja) * | 1998-09-25 | 2000-04-21 | E & E Elektron Gmbh | 一定の相対湿度を発生する装置 |
| EP1278725A1 (en) * | 2000-05-04 | 2003-01-29 | Haita Food Products Co., Ltd. | Process for extracting astaxanthin pigment from yeast and extracted pigment thereof |
| WO2011113225A1 (en) * | 2010-03-15 | 2011-09-22 | Peking University | Extraction of a component from a composition using supercritical fluid |
| CN111430547A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-07-17 | 电子科技大学 | 一种基于虾青素阴极缓冲层的有机太阳能电池及其制备方法 |
-
1994
- 1994-11-25 JP JP6290977A patent/JPH08140695A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000112534A (ja) * | 1998-09-25 | 2000-04-21 | E & E Elektron Gmbh | 一定の相対湿度を発生する装置 |
| EP1278725A1 (en) * | 2000-05-04 | 2003-01-29 | Haita Food Products Co., Ltd. | Process for extracting astaxanthin pigment from yeast and extracted pigment thereof |
| WO2011113225A1 (en) * | 2010-03-15 | 2011-09-22 | Peking University | Extraction of a component from a composition using supercritical fluid |
| CN111430547A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-07-17 | 电子科技大学 | 一种基于虾青素阴极缓冲层的有机太阳能电池及其制备方法 |
| CN111430547B (zh) * | 2020-03-19 | 2023-10-17 | 电子科技大学 | 一种基于虾青素阴极缓冲层的有机太阳能电池及其制备方法 |
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