JPH08103293A - 臨床細菌薬剤感受性の迅速選別方法 - Google Patents

臨床細菌薬剤感受性の迅速選別方法

Info

Publication number
JPH08103293A
JPH08103293A JP26614994A JP26614994A JPH08103293A JP H08103293 A JPH08103293 A JP H08103293A JP 26614994 A JP26614994 A JP 26614994A JP 26614994 A JP26614994 A JP 26614994A JP H08103293 A JPH08103293 A JP H08103293A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
drug
bacterium
clinical
culture
atp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP26614994A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3466735B2 (ja
Inventor
Susumu Seto
進 瀬戸
Yoshio Moji
佳夫 門司
Nobutaka Osawa
伸孝 大沢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nihon Millipore KK
Original Assignee
Nihon Millipore KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nihon Millipore KK filed Critical Nihon Millipore KK
Priority to JP26614994A priority Critical patent/JP3466735B2/ja
Publication of JPH08103293A publication Critical patent/JPH08103293A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3466735B2 publication Critical patent/JP3466735B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 採取した菌への見きわめるべき薬剤の有効性
判定を目的とする。 【構成】 対象薬剤を含んだ培地からなる培養器上に濾
過膜を置き、その上に臨床細菌を滴下して常法により増
殖し、ATPを抽出する抽出工程を経て、ルシフェリン
・ルシフェラーゼ発光試薬を噴霧その他の方法で供給し
て反応せしめ発光させる発光工程を経て、発光の有無、
強弱をイメージアナライザーにより測定し、供試薬剤が
無効な場合は臨床細菌が正常に増殖するのでRMDS法
により生菌由来のATPに基づく顕著な生物発光が輝点
として検出される。一方、供試薬剤が有効な場合は臨床
細菌が正常に増殖しないのでRMDS法により生菌由来
のATPに基づく生物発光を検出し得ない。この2つの
現象への帰属により判定する。 【効果】 培養時間が短くてもATP由来の発光を見る
ことにより判定し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本願発明は臨床細菌に有効な薬剤
を迅速に選別し、病気治療の早期対応に寄与しようとす
るものであり、その目的は臨床医学上極めて重要な意義
を有する。本願発明は主として患者のタン、胃液、尿、
その他より単離した病原菌に効果のある薬剤を選別する
に当たり、臨床細菌由来のアデノシンー三リン酸(以下
ATPと略す)およびルシフェリンとルシフェラーゼを
含む溶液試薬(以下ルシフェリン・ルシフェラーゼ発光
試薬と呼ぶ)を反応させて生成する微弱光をイメージア
ナライザー、例えば商品名RMDS(日本ミリポア株式
会社製)で光増強し、生菌を輝点として捉えることによ
って迅速、高感度に臨床細菌の薬剤感受性を検査する方
法を提供しようとするものである。
【0002】
【従来の技術】臨床細菌の薬剤感受性を知る方法として
は、検体から採取した菌を各種薬剤を含む栄養培地で培
養して、その増殖の有無を観測するか、あるいは各種薬
剤を滲み込ませたディスクを栄養寒天培地上に置いて培
養する時に生成する生育阻止円の有無により感受性を判
定するのが一般的な方法とされている。しかし、これら
の方法は有効性を判定するまでに長時間の培養が必要で
ある欠陥を有し、早期治療の実現には満足のいく方法と
はいい難い。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は臨床細菌の
薬剤感受性の判定に要する時間を短縮し、従来より迅速
に有効な薬剤を選別し、病気の早期治療に寄与するため
に特願平4−505080や特開平5−328995に
提案の高感度の迅速生菌測定機(商品名RMDS:日本
ミリポア(株)製)と臨床細菌の検査に適した培養器と
を組み合わせて利用することを課題とした。
【0004】
【課題を解決するための手段】上述した課題のもとに種
々検討した結果、臨床細菌に有効な薬剤を選別する方法
において、対象薬剤を含んだ培地からなる培養器上に濾
過膜を置きその上に臨床細菌を滴下して常法により増殖
し、ATPを抽出する抽出工程をへて、ルシフェリン・
ルシフェラーゼ発光試薬を噴霧その他の方法で供給し反
応せしめて発光させる発光工程を経て、発光の有無、強
弱をイメージアナライザーにより測定し、発光が無いか
実質的に無いことから薬剤の有効なことを判定し、発光
が観測されることから薬剤の効果の無いことを判定する
ことからなる薬剤の有効性を判定する薬剤の選別法を見
いだし本発明を完成するに至った。
【0005】特に試験すべきサンプルの種類が多い場合
には一度に沢山の判定が望まれるし、さらに互いに並べ
て比較するためには判定対象を隣接して植種、培養、抽
出、反応および発光を行えることが望ましい。このよう
な場合は培地成分が混合しないように区画を設けた培地
の集合体を用いることが望ましい。一定の面積に多数の
区画を設けた場合にはその上の濾過膜上の菌が置かれた
環境が乾燥し易く正確な判定の妨げになるので、長時間
の培養を必要とする場合には水分を適宜供給することは
欠かせない操作である。
【0006】さらに、培地の上部を覆う濾過膜は培地と
接する部分が親水性で培地成分を濾過膜上に円滑に供す
ることが好ましい。一方濾過膜の上部は多くの採取サン
プルを判定するためには膜上の隣接サンプルの抽出や発
光などの処理操作中混合しないように疎水性の隔壁の役
割を果たす格子などが取り付けられていることも好まし
い。
【0007】本願発明をさらに詳述すると、例えば図1
〜2に示したように多数の小さな孔2を有するプラスチ
ックまたはガラス製柱または板3よりなる培養器1に各
種薬剤を各濃度で含有した栄養寒天を注ぎ混合固化した
上に、濾過膜4を置き寒天と接触する該濾過膜の反対側
の部分即ち濾過膜上に検体から採取した臨床細菌を滴下
あるいは付着した後、培養器1をシャーレに入れ培養す
る。所定時間後濾過膜4をとり外し、風乾し生菌からA
TPを抽出するために抽出試薬(RMD試薬:日本ミリ
ポア(株)製)、さらにルシフェリン・ルシフェラーゼ
発光試薬(RMD試薬:日本ミリポア(株)製)を超音
波式吸入器EW622(松下電工製)で噴霧して発光さ
せる。直ちにイメージアナライザー例えばRMDSを用
いて輝点を観測し菌の増殖の有無を判定し、薬剤効果の
判定が可能となる。繰り返すと、本法によれば供試薬剤
が無効な場合は臨床細菌が正常に増殖するのでRMDS
法により生菌由来のATPに基づく顕著な生物発光が輝
点として検出され、供試薬剤が有効な場合は臨床細菌が
正常に増殖しないのでRMDS法により生菌由来のAT
Pに基づく生物発光を検出し得ず、薬剤の採取した菌へ
の有効性判定が出来ることになる。
【0008】尚、本願発明で用いる培養器の具体例を述
べると、直径50〜110mm、高さ10〜30mmの
ガラスあるいはプラスチック製の平たい円柱に直径3〜
6mmの窪みとも言うべき必ずしも円形断面を有する必
要はない孔を選定された間隔をもたせて空けたものであ
り、この様な孔を有する円柱をシャーレに入れて用いる
か、あるいは蓋をつけてそのまま培養器として用いても
よい。又、図3〜4に示すように使用する濾過膜4は培
養器の円柱に設けた例えば孔の径に合わせて3〜6mm
×3〜6mm程度の大きさと前記孔の間隔に等しい間隔
の濾過部5を有するように格子6を設けた孔径0.1〜
0.65μmの多孔質膜であり又、格子6は例えば疎水
性の樹脂を親水性の濾過膜に印刷等で含浸させるなどに
より形成できる。臨床細菌を長時間培養する必要がある
場合は培養中に水分の蒸発により寒天が乾燥し、細菌の
増殖に悪影響を与えるので、乾燥を防ぐためシャーレに
水を加えて湿潤状態を保持する必要がある。斯る方法を
採用することにより従来に比べ多量のサンプルを多種類
の薬剤で極めて迅速に処理し得、すばやく臨床細菌の薬
剤感受性を判定し得るに至った。
【0009】
【作用】対象とする薬剤を含んだ寒天培地を少なくとも
1個有する培養器に仕込みその上に接して置かれた多孔
質膜上に臨床細菌を滴下し、適温で適切な時間培養し抽
出剤でATPを抽出し、ルシフェリンとルシフェラーゼ
を含む発光試薬を噴霧その他の手段で供し発光をイメー
ジアナライザーで検出し、薬剤の採取菌に対する有効性
を判定し得る事となる。
【0010】
【実施例】以下実施例により本発明を説明する。 実施例1 エシェリシア コリ(Escherichia col
i ATCC 2592)、スタフィロコッカス アウ
レウス(Staphylococcus aureus
ATCC 25923)、サルモネラ エンテリテデ
ス(Salmonella enteritidis
116−54)、シュードモナス エールギノーサ(P
seudomonas aeruginosa ATC
C 27853)、クレブシェラ ニューモニア(Kl
ebsiella pneumonia ATCC 8
329)、シゲラ フレゼネリ(Shigella f
lexeneri 1b)のSCD培地(日本製薬製)
一夜培養液を生理食塩水で約105 個/mlになる様に
希釈して供試菌とした。アミノベンジルペニシリン(A
BPC)、ピペラシリン(PIPC)、(セファゾリン
(CEZ)、セフメタゾール(CMZ)、ジェンタマイ
シン(GM)、エリシロマイシン(EM)の各薬剤の3
0μg/mlの溶液と1.0%SCD寒天を培養器の直
径5mm、深さ10mmの孔に各々0.1ml及び0.
1ml加え混合し固化する。その上に特殊格子付濾過膜
(直径47mmφ、細孔径0.45μm、日本ミリポア
製)の親水性部分が寒天と接触する様にして載せる。こ
の接触部分に10μlの各供試菌液を滴下してから37
℃に4〜5時間培養する。培養後、濾過膜を外し風乾し
て、ATP抽出試薬を流速5μl/秒で10〜20秒
間、発光試薬を流速10μl/秒で5〜10秒間この濾
過膜上に噴霧供給して発光させる。反応による発光を直
ちにRMDSで増光し、30〜120秒間フォトンカウ
ンティングを行い、輝点として捉える。比較として同菌
株を同薬剤の同濃度を含むディスクを用いるカービーボ
ウエル法で48時間培養して検査した結果を表1に示し
た。
【0011】
【表1】 A:菌の成育による従来法 - :成育しない、感受性あり; + :成育、耐性あり B:輝度による本願発明法 - :発光無し、感受性あり ; + :発光、耐性あり
【0012】実施例2 ミコバクテリウム チュベルクロシス(Micobac
terium tuberclosis 青山株)の1
%小川培地での2週間培養から生理食塩水で約105
mlになる様に希釈して供試菌とした。リファンピシン
(RFP)、イソニコチン酸ヒドラジド(INH)、エ
タンブタノール(EB)、ペニシリン(PC)を30μ
g/ml含む小川培地(極東製薬製)に菌液を加え1%
(v/v)とし37℃にて6日間培養した。培養液の1
0μlを実施例1と同様濾過膜に滴下する。風乾後、A
TP抽出試薬と発光試薬を噴霧して発光させる。直ちに
RMDSで発光の有無を測定する。比較として上記薬剤
と菌液を含む小川培地を2週間培養して生育の有無を検
査した結果を表2に示した。
【0013】
【表2】 A:菌の成育による従来法 - :成育なし、感受性あり ; + :成育、耐性あり B:輝度による本願発明法 - :発光無し、感受性あり ; + :発光、耐性あり
【0014】
【発明の効果】本願発明によれば臨床細菌に有効な薬剤
の検出が高感度のイメージアナライザーを用いることに
より培養時間が短くても抽出したATPを反応発光させ
ることにより可能となり、従来法に比べ極めて短時間の
判定が可能となるので早期治療への対応が実現し得、そ
の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明で使用できる多孔培養器の一例を示す平
面図である。
【図2】図1のA−A断面図である。
【図3】本発明で使用できる濾過膜の一例を示す平面図
である。
【図4】図2のB−B断面図である。
【符号の説明】
1:多孔培養器 2:孔 3:プラスチックまたはガラス円柱 4:濾過膜 5:濾過部 6:格子

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 臨床細菌に有効な薬剤の選別方法におい
    て、濾過膜上に臨床細菌を採取し、培養器で増殖し、A
    TPを抽出し、次いでルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発
    光試薬と反応せしめ発光の有無、強弱をイメージアナラ
    イザーにより測定し薬剤の有効性を判定する薬剤の選別
    方法。
  2. 【請求項2】 濾過膜に培地成分が互いに混合しないよ
    うに区画を設け、複数の異なった薬剤を異なった区画に
    割り当てる請求項1の薬剤の選別方法。
JP26614994A 1994-10-06 1994-10-06 臨床細菌薬剤感受性の迅速選別方法 Expired - Fee Related JP3466735B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP26614994A JP3466735B2 (ja) 1994-10-06 1994-10-06 臨床細菌薬剤感受性の迅速選別方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP26614994A JP3466735B2 (ja) 1994-10-06 1994-10-06 臨床細菌薬剤感受性の迅速選別方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08103293A true JPH08103293A (ja) 1996-04-23
JP3466735B2 JP3466735B2 (ja) 2003-11-17

Family

ID=17426981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP26614994A Expired - Fee Related JP3466735B2 (ja) 1994-10-06 1994-10-06 臨床細菌薬剤感受性の迅速選別方法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP3466735B2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014519022A (ja) * 2011-05-04 2014-08-07 ディーエックスアップクローズ 微生物を特定し、微生物を計数し、抗微生物感度を判定する装置および方法
US9399788B2 (en) 2011-09-13 2016-07-26 Osaka University Method for inspecting susceptibility of bacteria or fungi to antimicrobial drug and system for use in the same
CN112119153A (zh) * 2018-05-29 2020-12-22 株式会社日立高新技术 细胞检测装置和细胞检测方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014519022A (ja) * 2011-05-04 2014-08-07 ディーエックスアップクローズ 微生物を特定し、微生物を計数し、抗微生物感度を判定する装置および方法
US9399788B2 (en) 2011-09-13 2016-07-26 Osaka University Method for inspecting susceptibility of bacteria or fungi to antimicrobial drug and system for use in the same
CN112119153A (zh) * 2018-05-29 2020-12-22 株式会社日立高新技术 细胞检测装置和细胞检测方法
CN112119153B (zh) * 2018-05-29 2024-03-19 株式会社日立高新技术 细胞检测装置和细胞检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP3466735B2 (ja) 2003-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU718273B2 (en) Method to detect bacteria
JP5554711B2 (ja) 殺生物剤の嫌気性微生物に対する評価のための高処理量の試験方法
EP0863994B1 (en) Multi-zone sterility indicator
CN110023761B (zh) 制备活的微生物样品和微生物用于随后的质谱测量和评估
FI67725C (fi) Foerfarande foer framstaellning av enheter avsedda foer bestaemning av antibiotika- och sulfarester i biologiska vaetskor och framstaellda enheter
JPS624120B2 (ja)
US11085065B2 (en) Phenotypic engineering of spores
SK123496A3 (en) A rapid microbiological test for the detection of antibacterial compounds
JPH06311879A (ja) バイオセンサ
BG61400B1 (en) Means for detecting residual quantities of bactericidal compounds in liquids
US20070238145A1 (en) Phenotypic engineering of spores
FI57128B (fi) Saett att identifiera mikroorganismer
Liu et al. Antimicrobial susceptibility testing by measuring bacterial oxygen consumption on an integrated platform
JPH08103293A (ja) 臨床細菌薬剤感受性の迅速選別方法
WO2019012321A1 (en) TEST DEVICE FOR DETERMINING MINIMUM INHIBITOR CONCENTRATION AND ANTIMICROBIAL RESISTANCE IN PATHOGENIC / NON-PATHOGENIC ORGANISMS
Hossain Methods for screening and evaluation of antimicrobial activity: A review of protocols, advantages, and limitations
EP0124285A2 (en) Method and device for detecting microorganisms
CA2187406A1 (fr) Temoin de revelation de contaminants et procede d'application a la realisation d'un antibiogramme directement effectue sur prelevement
WO1999041408A1 (en) Microbial assay
BE1028631B1 (fr) Phagogramme automatique
JPH04370100A (ja) 微生物の薬剤感受性試験法
Zhu et al. CHAPTER IV. Immuno-affinity amperometric detection of bacterial infections
US20030040032A1 (en) Methods of screening for antimicrobial compounds
SU1472506A1 (ru) Реагент дл определени ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов
JPH02190197A (ja) 殺菌剤耐性検知用判定媒体及び検定法

Legal Events

Date Code Title Description
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20030812

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080829

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090829

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100829

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110829

Year of fee payment: 8

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees