JPH0797990B2 - 微生物ハイブリツドプロモ−タ - Google Patents
微生物ハイブリツドプロモ−タInfo
- Publication number
- JPH0797990B2 JPH0797990B2 JP57082962A JP8296282A JPH0797990B2 JP H0797990 B2 JPH0797990 B2 JP H0797990B2 JP 57082962 A JP57082962 A JP 57082962A JP 8296282 A JP8296282 A JP 8296282A JP H0797990 B2 JPH0797990 B2 JP H0797990B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- operator
- sequence
- dna
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 125
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 77
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 46
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 39
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 31
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 24
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 13
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 42
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 26
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 26
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 18
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 18
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 18
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 18
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 16
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 16
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 13
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108050004197 Trp repressor Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 101150118377 tet gene Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 101100122010 Methanocella arvoryzae (strain DSM 22066 / NBRC 105507 / MRE50) glmM gene Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150100816 trpD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 2
- 101150079930 trpGD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150099542 tuf gene Proteins 0.000 description 2
- 101150071165 tuf1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150010742 tuf2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 101100002068 Bacillus subtilis (strain 168) araR gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480824 Bacillus subtilis (strain 168) tetB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 102100033195 DNA ligase 4 Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100476567 Enterococcus faecalis spc gene Proteins 0.000 description 1
- 101100093739 Escherichia coli (strain K12) rpsE gene Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000927810 Homo sapiens DNA ligase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 101100476575 Staphylococcus aureus ant gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206306 Streptomyces lividans tetM gene Proteins 0.000 description 1
- 101150056072 TUFB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-N dimethylarsinic acid Chemical compound C[As](C)(O)=O OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- -1 str Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 101150061352 tufA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、異種遺伝子の微生物的発現によるポリペプチ
ドの効率的かつ制御された産生を指令する新規な微生物
プロモータ／オペレータ系に関するものである。本発明
の微生物プロモータ／オペレータは、大腸菌（Ｅ.col
i）DNA−依存性RNAポリメラーゼと機能的に相互作用す
るプロモータのハイブリッドである。これらは、種々の
公知のプロモータ系の特徴的な利点に、特定の条件下で
それら系のある領域が寄与しているという知見を利用し
て、公知の組換DNA技術を用いて構築される。これらの
領域は単離された後、全体として新規かつ有利な性質を
示す新規なハイブリッドプロモータ／オペレータが生成
されるように選択的かつ機能的に再結合される。したが
って、本発明は、高度に特異的でありかつ異種遺伝子の
微生物的発現の調節において最適な効率と制御とを達成
するよう処理された新規なハイブリッドプロモータ／オ
ペレータの構築を可能にするものである。
ドの効率的かつ制御された産生を指令する新規な微生物
プロモータ／オペレータ系に関するものである。本発明
の微生物プロモータ／オペレータは、大腸菌（Ｅ.col
i）DNA−依存性RNAポリメラーゼと機能的に相互作用す
るプロモータのハイブリッドである。これらは、種々の
公知のプロモータ系の特徴的な利点に、特定の条件下で
それら系のある領域が寄与しているという知見を利用し
て、公知の組換DNA技術を用いて構築される。これらの
領域は単離された後、全体として新規かつ有利な性質を
示す新規なハイブリッドプロモータ／オペレータが生成
されるように選択的かつ機能的に再結合される。したが
って、本発明は、高度に特異的でありかつ異種遺伝子の
微生物的発現の調節において最適な効率と制御とを達成
するよう処理された新規なハイブリッドプロモータ／オ
ペレータの構築を可能にするものである。
組換DNA技術の出現により、極めて多種の有用なポリペ
プチドの制御された微生物的産生が可能になった。たと
えば白血球インターフエロンのような多くの哺乳類ポリ
ペプチドが、種々の微生物菌株により既に産生されてい
る。この技術の能力は極めて多種の有用ポリペプチドの
微生物的産生を可能にし、種々の病気に対して有用なホ
ルモン、酸素、抗体およびワクチンの微生物産生を手の
届く範囲にもたらした。
プチドの制御された微生物的産生が可能になった。たと
えば白血球インターフエロンのような多くの哺乳類ポリ
ペプチドが、種々の微生物菌株により既に産生されてい
る。この技術の能力は極めて多種の有用ポリペプチドの
微生物的産生を可能にし、種々の病気に対して有用なホ
ルモン、酸素、抗体およびワクチンの微生物産生を手の
届く範囲にもたらした。
組換DNA技術の基本的要素はプラスミド、すなわちしば
しば細菌中に細胞１個当りマルチコピーとして見出され
る二重鎖DNAの非染色体ループである。プラスミドDNA中
にコードされる情報には、娘細胞内でプラスミドを再生
するのに必要な情報（すなわち、「レプリコン」）が含
まれ、さらに通常は目的とするプラスミドを含有する宿
主細胞のクローンを識別して、選択培地で優先的に増殖
させうるような１つもしくはそれ以上の選択特性、たと
えば抗生物質に対する耐性が含まれる。細菌プラスミド
の有用性は、それぞれプラスミドDNA上の異なる部位を
識別する或る種の制限エンドヌクレアーゼすなわち「制
限酵素」により特異的に開裂されうる点にある。その
後、異種遺伝子もしくは遺伝子断片を、開裂部位または
この開裂部位に隣接する再生末端における末端−末端接
合により、プラスミド中に挿入することができる。本明
細書中で使用する「異種」という用語は、所定の微生物
中には元来見出されない遺伝子または元来産生されない
ポリペプチド配列を意味し、これに対し「同種」という
用語は対応する野性型微生物に見出されるまたはそれに
より産生される遺伝子またはポリペプチドを意味する。
DNAの組換えは微生物の外部で行なわれ、得られた「組
換体」複製可能発現ベヒクル、すなわちプラスミドを形
質転換として知られる過程により微生物中に導入し、こ
の形質転換体を増殖させることにより異種遺伝子含有の
組換ベヒクルを多量に得ることができる。さらに、コー
ドされたDNAメッセージの転写と翻訳とを支配するプラ
スミドの部分に関して遺伝子を適正に挿入すれば、得ら
れた発現ベヒクルを使用して挿入遺伝子がコードするポ
リペプチド配列を実際に産生させることができ、この過
程を発現と名付ける。この発現は、プロモータとして知
られる領域で開始される。RNAポリメラーゼはプロモー
タを識別し、転写開始前にこれに結合する。たとえば後
記するlac系およびtrp系におけるような幾つかの場合、
プロモータ領域は「オペレータ」領域と重複しており結
合プロモータ／オペレータ（combined promoter−oper
ator）を形成する。オペレータは、特定プロモータにお
ける転写開始の頻度を制御するのに役立ついわゆるリプ
レッサ蛋白質により認識されるDNA配列である。発現の
転写期において、RNAポリメラーゼはプロモータDNA中の
或る種の配列を識別してこれに結合する。この結合作用
はこの領域におけるDNAの巻き戻し（unwinding）をひき
起こし、DNAのセンス鎖（sense coding strand）を全
DNA配列の５′末端から３′末端へのメッセンジャRNAの
合成を開始する鋳型として露出させる。次いで、メッセ
ンジャRNAはリボソームに結合し、リボソームの内部
で、コードされていたメッセージはDNAがコードするア
ミノ酸配列を有するポリペプチドに翻訳される。各アミ
ノ酸は独特のヌクレオチドトリプレットすなわち「コド
ン」によりコードされ、このコドンが集合して「構造遺
伝子」すなわち発現されるポリペプチド生産物のアミノ
酸配列をコードする部分を構築する。
しば細菌中に細胞１個当りマルチコピーとして見出され
る二重鎖DNAの非染色体ループである。プラスミドDNA中
にコードされる情報には、娘細胞内でプラスミドを再生
するのに必要な情報（すなわち、「レプリコン」）が含
まれ、さらに通常は目的とするプラスミドを含有する宿
主細胞のクローンを識別して、選択培地で優先的に増殖
させうるような１つもしくはそれ以上の選択特性、たと
えば抗生物質に対する耐性が含まれる。細菌プラスミド
の有用性は、それぞれプラスミドDNA上の異なる部位を
識別する或る種の制限エンドヌクレアーゼすなわち「制
限酵素」により特異的に開裂されうる点にある。その
後、異種遺伝子もしくは遺伝子断片を、開裂部位または
この開裂部位に隣接する再生末端における末端−末端接
合により、プラスミド中に挿入することができる。本明
細書中で使用する「異種」という用語は、所定の微生物
中には元来見出されない遺伝子または元来産生されない
ポリペプチド配列を意味し、これに対し「同種」という
用語は対応する野性型微生物に見出されるまたはそれに
より産生される遺伝子またはポリペプチドを意味する。
DNAの組換えは微生物の外部で行なわれ、得られた「組
換体」複製可能発現ベヒクル、すなわちプラスミドを形
質転換として知られる過程により微生物中に導入し、こ
の形質転換体を増殖させることにより異種遺伝子含有の
組換ベヒクルを多量に得ることができる。さらに、コー
ドされたDNAメッセージの転写と翻訳とを支配するプラ
スミドの部分に関して遺伝子を適正に挿入すれば、得ら
れた発現ベヒクルを使用して挿入遺伝子がコードするポ
リペプチド配列を実際に産生させることができ、この過
程を発現と名付ける。この発現は、プロモータとして知
られる領域で開始される。RNAポリメラーゼはプロモー
タを識別し、転写開始前にこれに結合する。たとえば後
記するlac系およびtrp系におけるような幾つかの場合、
プロモータ領域は「オペレータ」領域と重複しており結
合プロモータ／オペレータ（combined promoter−oper
ator）を形成する。オペレータは、特定プロモータにお
ける転写開始の頻度を制御するのに役立ついわゆるリプ
レッサ蛋白質により認識されるDNA配列である。発現の
転写期において、RNAポリメラーゼはプロモータDNA中の
或る種の配列を識別してこれに結合する。この結合作用
はこの領域におけるDNAの巻き戻し（unwinding）をひき
起こし、DNAのセンス鎖（sense coding strand）を全
DNA配列の５′末端から３′末端へのメッセンジャRNAの
合成を開始する鋳型として露出させる。次いで、メッセ
ンジャRNAはリボソームに結合し、リボソームの内部
で、コードされていたメッセージはDNAがコードするア
ミノ酸配列を有するポリペプチドに翻訳される。各アミ
ノ酸は独特のヌクレオチドトリプレットすなわち「コド
ン」によりコードされ、このコドンが集合して「構造遺
伝子」すなわち発現されるポリペプチド生産物のアミノ
酸配列をコードする部分を構築する。
プロモータに結合した後、RNAポリメラーゼは先ず翻訳
開始すなわち「開始」信号（通常ATGであって、これは
得られるメッセンジャRNAにおいてはAUGになる）を含め
リボソーム結合部位をコードするヌクレオチドの転写を
開始し、次いで構造遺伝子自身内のヌクレオチドコドン
の転写を開始する。いわゆる停止コドンは構造遺伝子の
末端において転写され、その後ポリメラーゼはメッセン
ジャRNAの付加的配列を形成することができ、この配列
は停止信号の存在のためリボソームで翻訳されないまま
となる。
開始すなわち「開始」信号（通常ATGであって、これは
得られるメッセンジャRNAにおいてはAUGになる）を含め
リボソーム結合部位をコードするヌクレオチドの転写を
開始し、次いで構造遺伝子自身内のヌクレオチドコドン
の転写を開始する。いわゆる停止コドンは構造遺伝子の
末端において転写され、その後ポリメラーゼはメッセン
ジャRNAの付加的配列を形成することができ、この配列
は停止信号の存在のためリボソームで翻訳されないまま
となる。
リボソームは、通常、細菌中ではmRNAが形成されるの
で、メッセンジャRNA上に存在する接合部位に結合し
て、翻訳開始信号から出発して上記停止信号において終
了する、コードされているポリペプチドの産生を指令す
る。所望のポリペプチド生産物は、開始コドンに続いて
同一相内に全ての残余コドンがあれば産生される。産生
した生産物は、宿主細胞を溶菌させかつ他の細菌蛋白質
から適当な精製法で除去して生産物を回収することによ
り得られる。
で、メッセンジャRNA上に存在する接合部位に結合し
て、翻訳開始信号から出発して上記停止信号において終
了する、コードされているポリペプチドの産生を指令す
る。所望のポリペプチド生産物は、開始コドンに続いて
同一相内に全ての残余コドンがあれば産生される。産生
した生産物は、宿主細胞を溶菌させかつ他の細菌蛋白質
から適当な精製法で除去して生産物を回収することによ
り得られる。
組換DNA技術の使用により発現されるポリペプチドはヒ
ト生長ホルモンの直接的発現の場合のように全く異種で
あるか、或いはソマトスタチンの中間体やヒトインシュ
リン成分を産生する場合のように異種ポリペプチドと、
これに融合した同種ポリペプチドのアミノ酸配列の少な
くとも一部とからなることもできる。後者の場合、融合
した同種ポリペプチドはたとえβ−ガラクトシダーゼの
アミノ酸配列の一部から構築される。これらの場合、目
的とする生物活性産物は融合同種ポリペプチドにより生
物的に失活されており、この同種ポリペプチドが細胞外
環境において開裂除去されると活性化される。上記のよ
うな融合蛋白質は、たとえばメチオニンに対する臭化シ
アンの作用或いは酸素的開裂によるように、目的生産物
からの前駆体蛋白質の高度に特異的な開裂を行ないうる
よう設計することができる（たとえば英国特許出願公開
第2007676A号参照）。
ト生長ホルモンの直接的発現の場合のように全く異種で
あるか、或いはソマトスタチンの中間体やヒトインシュ
リン成分を産生する場合のように異種ポリペプチドと、
これに融合した同種ポリペプチドのアミノ酸配列の少な
くとも一部とからなることもできる。後者の場合、融合
した同種ポリペプチドはたとえβ−ガラクトシダーゼの
アミノ酸配列の一部から構築される。これらの場合、目
的とする生物活性産物は融合同種ポリペプチドにより生
物的に失活されており、この同種ポリペプチドが細胞外
環境において開裂除去されると活性化される。上記のよ
うな融合蛋白質は、たとえばメチオニンに対する臭化シ
アンの作用或いは酸素的開裂によるように、目的生産物
からの前駆体蛋白質の高度に特異的な開裂を行ないうる
よう設計することができる（たとえば英国特許出願公開
第2007676A号参照）。
組換DNA技術がその有望性を充分にささえるならば、所
期ポリペプチド生産物を制御された環境下で高収率で入
手しうるよう遺伝子挿入物の発現を最適化する系が考案
されなければならない。
期ポリペプチド生産物を制御された環境下で高収率で入
手しうるよう遺伝子挿入物の発現を最適化する系が考案
されなければならない。
乳糖プロモータ／オペレータ系が一般に使用されて有益
であるが、収率の観点からは技術の能力を充分に利用し
ていない。しかしながら、これらは極めて制御し易いと
いう明瞭な利点を有し、この特徴は大規模な微生物醗酵
生産に関しては極めて望ましいものである。制御メカニ
ズムは、オペレータの作用様式にある。オペレータが抑
制（repression）モードにある場合、結合したリプレッ
サ蛋白質のため、DNAポリメラーゼは結合と転写開始を
競合的に妨げられる。かくして転写経路が閉鎖され、こ
れはプロモータの作動性を有効に阻止する。この系は、
たとえばイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）
のような公知インデューサを添加して誘発することによ
り抑制解除（derepression）することができる。インデ
ューサはリプレッサ蛋白質を脱落させて、RNAポリメラ
ーゼが機能しうるようにする。したがって、この型式の
プロモータ／オペレータは「誘発性（inducible）」で
あると云われる。いわゆるlacプロモータ／オペレータ
系を有するプラスミドにより形質転換された細胞は、醗
酵培養においてたとえばIPTGのようなインデューサを単
に省略するだけでプロモータ／オペレータ系を抑制状態
に維持しながら、その最高密度まで増殖させることがで
きる。高レベルの細胞密度に達した時、この系をインデ
ューサの添加により抑制解除することができ、かくして
プロモータは自由に転写を開始し、プロモータ強度に見
合った収率にて遺伝子生産物の最適発現を得ることがで
きる。しかしながら、これらの利点にも拘らず、たとえ
ばlacプロモータ／オペレータ系のような或る種の誘発
性プロモータは比較的弱いものであり、この種のプロモ
ータを利用する生産は微生物に最大限の生産量を発揮さ
せない。
であるが、収率の観点からは技術の能力を充分に利用し
ていない。しかしながら、これらは極めて制御し易いと
いう明瞭な利点を有し、この特徴は大規模な微生物醗酵
生産に関しては極めて望ましいものである。制御メカニ
ズムは、オペレータの作用様式にある。オペレータが抑
制（repression）モードにある場合、結合したリプレッ
サ蛋白質のため、DNAポリメラーゼは結合と転写開始を
競合的に妨げられる。かくして転写経路が閉鎖され、こ
れはプロモータの作動性を有効に阻止する。この系は、
たとえばイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）
のような公知インデューサを添加して誘発することによ
り抑制解除（derepression）することができる。インデ
ューサはリプレッサ蛋白質を脱落させて、RNAポリメラ
ーゼが機能しうるようにする。したがって、この型式の
プロモータ／オペレータは「誘発性（inducible）」で
あると云われる。いわゆるlacプロモータ／オペレータ
系を有するプラスミドにより形質転換された細胞は、醗
酵培養においてたとえばIPTGのようなインデューサを単
に省略するだけでプロモータ／オペレータ系を抑制状態
に維持しながら、その最高密度まで増殖させることがで
きる。高レベルの細胞密度に達した時、この系をインデ
ューサの添加により抑制解除することができ、かくして
プロモータは自由に転写を開始し、プロモータ強度に見
合った収率にて遺伝子生産物の最適発現を得ることがで
きる。しかしながら、これらの利点にも拘らず、たとえ
ばlacプロモータ／オペレータ系のような或る種の誘発
性プロモータは比較的弱いものであり、この種のプロモ
ータを利用する生産は微生物に最大限の生産量を発揮さ
せない。
所望のポリペプチド生産物をより高収率で生産しうる微
生物発現ベヒクルに関する要望に答えるため、いわゆる
トリプトフアン プロモーター／オペレータが開発さ
れ、現在広く使用されている。トリプトフアン プロモ
ータ／オペレータ系は多くの公知の比較的強力な系の１
種であって、lacプロモータよりも10倍以上の強さを有
する。このような系の力は商業的生産にとって魅力的で
あるが、この力の利点はプロモータ制御性の低いことに
より若干相殺される。これら強力な系の多くは、そのオ
ペレータが上記の意味において誘発性でない。むしろ、
プロモータ経路を閉鎖する結合リプレッサを誘発により
除去することができない。トリプトフアン プロモータ
／オペレータ系の減衰域（アテニューユーター領域）が
除去されたような他の系が案出され、この系により形質
転換された細胞がトリプトフアンに富む倍地の存在下で
培養された。所望の異種ポリペプチド系の早期発現によ
り細胞増殖が阻害されずに進行するよう、オペレータを
実質上完全に抑制するに充分なトリプトフアンを与え
た。培養物が適当な増殖レベルに適した時、トリプトフ
アンをさらに供給することなく緩和なトリプトフアン制
限（limitation）を与えると、異種挿入物の高効率的発
現を有するプロモータの抑制解除が得られる。しかしな
がら、この系は産業的規模において完全な抑制と、誘発
による抑制解除とを行ないうる、という繊細な制御特性
を示すオペレータをプロモータ系ではない。たとえば、
実際上、増殖期の間トリプトフアンを高レベルに維持し
てプロモータを完全に抑制すると共に、培養物が充分に
増殖した後、培地のトリプトフアンを空にすることが必
要である。
生物発現ベヒクルに関する要望に答えるため、いわゆる
トリプトフアン プロモーター／オペレータが開発さ
れ、現在広く使用されている。トリプトフアン プロモ
ータ／オペレータ系は多くの公知の比較的強力な系の１
種であって、lacプロモータよりも10倍以上の強さを有
する。このような系の力は商業的生産にとって魅力的で
あるが、この力の利点はプロモータ制御性の低いことに
より若干相殺される。これら強力な系の多くは、そのオ
ペレータが上記の意味において誘発性でない。むしろ、
プロモータ経路を閉鎖する結合リプレッサを誘発により
除去することができない。トリプトフアン プロモータ
／オペレータ系の減衰域（アテニューユーター領域）が
除去されたような他の系が案出され、この系により形質
転換された細胞がトリプトフアンに富む倍地の存在下で
培養された。所望の異種ポリペプチド系の早期発現によ
り細胞増殖が阻害されずに進行するよう、オペレータを
実質上完全に抑制するに充分なトリプトフアンを与え
た。培養物が適当な増殖レベルに適した時、トリプトフ
アンをさらに供給することなく緩和なトリプトフアン制
限（limitation）を与えると、異種挿入物の高効率的発
現を有するプロモータの抑制解除が得られる。しかしな
がら、この系は産業的規模において完全な抑制と、誘発
による抑制解除とを行ないうる、という繊細な制御特性
を示すオペレータをプロモータ系ではない。たとえば、
実際上、増殖期の間トリプトフアンを高レベルに維持し
てプロモータを完全に抑制すると共に、培養物が充分に
増殖した後、培地のトリプトフアンを空にすることが必
要である。
したがって、所望のポリペプチド生産物を高収率で高度
制御下に生産しうるような微生物プロモータ／オペレー
タ系が要望されていることは明らかである。
制御下に生産しうるような微生物プロモータ／オペレー
タ系が要望されていることは明らかである。
本発明は現在のプロモータ／オペレータ系に関連するこ
れらの問題を解消し、実質的な利点を示す新規なハイブ
リッド系を独創的に提供する。さらに、本発明は異種ポ
リペプチドの微生物的産生方法に係り、高度に効率的で
あり、かつ制御可能なプロモータ／オペレータ系に係
り、さらにその関連手段に係る。特に、本発明は、大工
業規模の生産において良好に機能するよう設計されたハ
イブリッドプロモータ／オペレータ系の使用に係る。
れらの問題を解消し、実質的な利点を示す新規なハイブ
リッド系を独創的に提供する。さらに、本発明は異種ポ
リペプチドの微生物的産生方法に係り、高度に効率的で
あり、かつ制御可能なプロモータ／オペレータ系に係
り、さらにその関連手段に係る。特に、本発明は、大工
業規模の生産において良好に機能するよう設計されたハ
イブリッドプロモータ／オペレータ系の使用に係る。
本発明は、形質転換微生物における異種ポリペプチドの
産生を指令するよう設計された複製可能な発現ベヒクル
に使用するための新規なハイブリッドプロモータ／オペ
レータ系を提供する。これらの複製可能な発現ベヒクル
において、本発明の新規なハイブリッドプロモータ／オ
ペレータ系は、形質転換微生物がその天然の非転換状態
にある時には通常生産しない異種ポリペプチドをコード
する異種遺伝子挿入物に機能的に結合される。さらに、
本発明は新規なハイブリッドプロモータ／オペレータ系
を含有する新規な複製可能発現ベヒクル、ならびにこの
ベヒクルで形質転換された微生物に係る。さらにまた、
本発明は、この種の新規なハイブリッドプロモータ／オ
ペレータ系を用いる微生物における異種ポリペプチドの
制御下かつ高レベルの生産方法および手段、ならびにそ
れらの特定の実施態様に係る。
産生を指令するよう設計された複製可能な発現ベヒクル
に使用するための新規なハイブリッドプロモータ／オペ
レータ系を提供する。これらの複製可能な発現ベヒクル
において、本発明の新規なハイブリッドプロモータ／オ
ペレータ系は、形質転換微生物がその天然の非転換状態
にある時には通常生産しない異種ポリペプチドをコード
する異種遺伝子挿入物に機能的に結合される。さらに、
本発明は新規なハイブリッドプロモータ／オペレータ系
を含有する新規な複製可能発現ベヒクル、ならびにこの
ベヒクルで形質転換された微生物に係る。さらにまた、
本発明は、この種の新規なハイブリッドプロモータ／オ
ペレータ系を用いる微生物における異種ポリペプチドの
制御下かつ高レベルの生産方法および手段、ならびにそ
れらの特定の実施態様に係る。
慣用の番号付けを用いれば、特定のプロモータ／オペレ
ータ内における主要な配列相同性（sequence homolog
y）の第１の領域は、DNA配列の約−10ヌクレオチド塩基
に生ずる。これは、いわゆるプリブノーボックスコンセ
ンサス配列（Pirbnow box consensus sequence）の
領域であって、その原型配列（prototypic sequence）
はTATAATGであり、ここで最後のＴ（すなわちチミン）
は検討された全てのプロモータにおいて同一である。相
同部の第２の領域は、DNA配列の−35位の近傍に集中す
る。このいわゆる−35コンセンサス配列は高度に保持さ
れたトリヌクレオチドTTG配列であり、次いでこれより
は低い厳格さで保存されている前ヘキソマー配列TTGACA
が現われ、これはさらに相同性を見出しうる12個のヌク
レオチドストレッチ（stretch）の１部である。Ｅ.coli
RNAポリメラーゼが識別して機能的に特にしっかり結合
すると信じられるのは、相同なこれら２つの領域であ
る。RNAポリメラーゼ酵素とプロモータDNAとの間の主た
る接触は「開放（open）」領域をもたらし、これらの領
域は転写によるメッセンジャRNA生成を開始すべき部位
の適正な識別を容易にすると信じられている。この転写
開始部位は、慣用により、DNA配列上に＋１として標識
される。さらに、長さにおいて約15乃至約25ヌクレオチ
ド塩基の範囲にわたるPribnowボックスと−35コンセン
サス配列との間の領域は、プロモータ間で有意に相同な
領域でないようにみえる。したがって、この領域はRNA
ポリメラーゼの機能的結合に関し重要でないと思われる
（Hermann Bujard,Trends in Biological Science
s,第274頁（1980年10月）およびSiebenlist,U.et al.C
ell 20,269（1980）参照、これら文献の各々を参考の
ためここに引用する）。本発明は、この領域が配列に関
する限りシグナル強度およびオペレータ機能に関しても
重要でないことを示す。
ータ内における主要な配列相同性（sequence homolog
y）の第１の領域は、DNA配列の約−10ヌクレオチド塩基
に生ずる。これは、いわゆるプリブノーボックスコンセ
ンサス配列（Pirbnow box consensus sequence）の
領域であって、その原型配列（prototypic sequence）
はTATAATGであり、ここで最後のＴ（すなわちチミン）
は検討された全てのプロモータにおいて同一である。相
同部の第２の領域は、DNA配列の−35位の近傍に集中す
る。このいわゆる−35コンセンサス配列は高度に保持さ
れたトリヌクレオチドTTG配列であり、次いでこれより
は低い厳格さで保存されている前ヘキソマー配列TTGACA
が現われ、これはさらに相同性を見出しうる12個のヌク
レオチドストレッチ（stretch）の１部である。Ｅ.coli
RNAポリメラーゼが識別して機能的に特にしっかり結合
すると信じられるのは、相同なこれら２つの領域であ
る。RNAポリメラーゼ酵素とプロモータDNAとの間の主た
る接触は「開放（open）」領域をもたらし、これらの領
域は転写によるメッセンジャRNA生成を開始すべき部位
の適正な識別を容易にすると信じられている。この転写
開始部位は、慣用により、DNA配列上に＋１として標識
される。さらに、長さにおいて約15乃至約25ヌクレオチ
ド塩基の範囲にわたるPribnowボックスと−35コンセン
サス配列との間の領域は、プロモータ間で有意に相同な
領域でないようにみえる。したがって、この領域はRNA
ポリメラーゼの機能的結合に関し重要でないと思われる
（Hermann Bujard,Trends in Biological Science
s,第274頁（1980年10月）およびSiebenlist,U.et al.C
ell 20,269（1980）参照、これら文献の各々を参考の
ためここに引用する）。本発明は、この領域が配列に関
する限りシグナル強度およびオペレータ機能に関しても
重要でないことを示す。
本発明の新規なハイブリッドプロモータ／オペレータ系
は、Ｅ.coliDNA依存性RNAポリメラーゼ転写を指令する
ことができ、誘発により抑制が解除され得、かつ第１シ
グナル強度を示し得、その上流に機能的に位置するプロ
モータ／オペレータ配列と、より強いシグナル強度を示
す第２プロモータの−35コンセンサス配列および５′側
（フランキング）領域からなる断片とから構築され、こ
れら配列は該−35コンセンサス配列の近傍と前記プロモ
ータ／オペレータ配列のPribnowボックスとの間の共有
結合で連結されてなる。
は、Ｅ.coliDNA依存性RNAポリメラーゼ転写を指令する
ことができ、誘発により抑制が解除され得、かつ第１シ
グナル強度を示し得、その上流に機能的に位置するプロ
モータ／オペレータ配列と、より強いシグナル強度を示
す第２プロモータの−35コンセンサス配列および５′側
（フランキング）領域からなる断片とから構築され、こ
れら配列は該−35コンセンサス配列の近傍と前記プロモ
ータ／オペレータ配列のPribnowボックスとの間の共有
結合で連結されてなる。
したがって、Ｅ.coliDNA依存性RNAポリメラーゼと相互
作用するプロモータであって、誘発により抑制解除しう
るオペレータを有する第１プロモータは、そのPribnow
ボックス近傍と−35コンセンサス配列との間に存在する
個所で開裂される。Ｅ.coliDNA依存性RNAポリメラーゼ
と相互作用する第１のものより強いシグナル強度を有す
る第２プロモータも、同様に開裂される。好適具体例に
おいて、開裂の領域はほぼヌクレオチド塩基対−10乃至
−35の間に存在する。次いで、開裂されたDNA配列を公
知方法に従って結合させる。
作用するプロモータであって、誘発により抑制解除しう
るオペレータを有する第１プロモータは、そのPribnow
ボックス近傍と−35コンセンサス配列との間に存在する
個所で開裂される。Ｅ.coliDNA依存性RNAポリメラーゼ
と相互作用する第１のものより強いシグナル強度を有す
る第２プロモータも、同様に開裂される。好適具体例に
おいて、開裂の領域はほぼヌクレオチド塩基対−10乃至
−35の間に存在する。次いで、開裂されたDNA配列を公
知方法に従って結合させる。
好ましくは、制限部位は、容易に末端結合を行いうる相
補的末端を生成するように選択される。或いは、結合
は、開裂部位に隣接する末端を再編成することにより、
好ましくは合成誘導したリンカーヌクレオチドを用い
て、２つの配列に相補的制限部位を導入した後に行なう
こともできる。一具体例においては、非相補的制限部位
を有する２つのDNA配列を、これら２つのDNA配列の各制
限部位に適合するよう特異的に調製した合成挿入物に結
合させることができる。また、この挿入物も、Pribnow
ボックスと−35コンセンサス配列との間の間隔が様々な
プロモータを得ようとする場合、部分の切除を可能にす
るような種々異なる特異的な、制限部位を含有すること
ができる。
補的末端を生成するように選択される。或いは、結合
は、開裂部位に隣接する末端を再編成することにより、
好ましくは合成誘導したリンカーヌクレオチドを用い
て、２つの配列に相補的制限部位を導入した後に行なう
こともできる。一具体例においては、非相補的制限部位
を有する２つのDNA配列を、これら２つのDNA配列の各制
限部位に適合するよう特異的に調製した合成挿入物に結
合させることができる。また、この挿入物も、Pribnow
ボックスと−35コンセンサス配列との間の間隔が様々な
プロモータを得ようとする場合、部分の切除を可能にす
るような種々異なる特異的な、制限部位を含有すること
ができる。
好適な実施態様において、制限部位は、生成されるハイ
ブリッドプロモータ／オペレータがそのPribnowボック
スと−35コンセンサス配列との間に親プロモータにおけ
る対応領域とほぼ同じ長さのDNA領域を有するよう選択
されまたは構築される。
ブリッドプロモータ／オペレータがそのPribnowボック
スと−35コンセンサス配列との間に親プロモータにおけ
る対応領域とほぼ同じ長さのDNA領域を有するよう選択
されまたは構築される。
本発明のハイブリッドプロモータ／オペレータ系は二重
鎖DNAの配列を含み、これは順次に誘発性オペレータ、
転写開始部位およびPribnowボックスコンセンサス配列
に対応するヌクレオチド塩基からなり、Pribnowボック
スコンセンサス配列は、DNA組換えにより形成されるヌ
クレオチド配列を介して−35コンセンサス配列およびそ
の５′フランキング領域のヌクレオチド塩基配列に結合
している。オペレータおよび開始部位の塩基は、ここに
定義した誘発性オペレータを有するプロモータ／オペレ
ータから誘導されまたはそれを手本とした（模倣した）
ものであり、また−35コンセンサス配列以降の塩基は前
記プロモータ／オペレータよりも強いシグナル強度を有
するプロモータから誘導されまたはそれを模倣したもの
である。DNA組換えにより形成されるリンカー配列は、
親プロモータから開裂した配列の相補的結合により誘導
されるか、或いは上記したように、必要に応じ対応する
下流および上流のDNA配列と共に、合成的に生成され
る。いずれの場合も、再編成を行なって相補的末端を生
成させる場合は、Pribnowボックスおよび／または−35
コンセンサス配列を修復して元来の相同性を最適い復帰
させることが好ましい。
鎖DNAの配列を含み、これは順次に誘発性オペレータ、
転写開始部位およびPribnowボックスコンセンサス配列
に対応するヌクレオチド塩基からなり、Pribnowボック
スコンセンサス配列は、DNA組換えにより形成されるヌ
クレオチド配列を介して−35コンセンサス配列およびそ
の５′フランキング領域のヌクレオチド塩基配列に結合
している。オペレータおよび開始部位の塩基は、ここに
定義した誘発性オペレータを有するプロモータ／オペレ
ータから誘導されまたはそれを手本とした（模倣した）
ものであり、また−35コンセンサス配列以降の塩基は前
記プロモータ／オペレータよりも強いシグナル強度を有
するプロモータから誘導されまたはそれを模倣したもの
である。DNA組換えにより形成されるリンカー配列は、
親プロモータから開裂した配列の相補的結合により誘導
されるか、或いは上記したように、必要に応じ対応する
下流および上流のDNA配列と共に、合成的に生成され
る。いずれの場合も、再編成を行なって相補的末端を生
成させる場合は、Pribnowボックスおよび／または−35
コンセンサス配列を修復して元来の相同性を最適い復帰
させることが好ましい。
一面において、本発明は、Pribnowボックス配列近傍に
より下流に位置しかつ誘発性オペレータを有するプロモ
ータ／オペレータの配列に対応する配列を模倣したヌク
レオチド配列を提供する。このように、合成誘導された
DNAを使用して、ハイブリッドプロモータを構築するそ
れぞれの断片を提供することができる。たとえば、１つ
のプロモータの−35コンセンサス配列の合成もしくは天
然配列を本発明により、たとえばPribnowボックス領域
の近傍において所定の第２の誘発性プロモータの合成も
しくは天然配列と、或いはオペレータ、シャイン−ダル
ガルノ（Shine−Dalgarno）および所定の第２誘発性プ
ロモータに対応する転写開始部位からなる合成DNA断片
と適当に結合させることができる。ここでも、DNA断片
は、−35配列断片ならびにその下流に位置する翻訳開始
コドンおよび異種遺伝子配列との結合を容易にする各種
の特異（ユニーク）な制限部位を含有することができ
る。さらに、この種のDNA断片は、その移動性（portabi
lity）したがってその交換性（exchangability）を可能
にするShine−Dalgarno配列を包囲する特異な制限部位
を含むことができる。
より下流に位置しかつ誘発性オペレータを有するプロモ
ータ／オペレータの配列に対応する配列を模倣したヌク
レオチド配列を提供する。このように、合成誘導された
DNAを使用して、ハイブリッドプロモータを構築するそ
れぞれの断片を提供することができる。たとえば、１つ
のプロモータの−35コンセンサス配列の合成もしくは天
然配列を本発明により、たとえばPribnowボックス領域
の近傍において所定の第２の誘発性プロモータの合成も
しくは天然配列と、或いはオペレータ、シャイン−ダル
ガルノ（Shine−Dalgarno）および所定の第２誘発性プ
ロモータに対応する転写開始部位からなる合成DNA断片
と適当に結合させることができる。ここでも、DNA断片
は、−35配列断片ならびにその下流に位置する翻訳開始
コドンおよび異種遺伝子配列との結合を容易にする各種
の特異（ユニーク）な制限部位を含有することができ
る。さらに、この種のDNA断片は、その移動性（portabi
lity）したがってその交換性（exchangability）を可能
にするShine−Dalgarno配列を包囲する特異な制限部位
を含むことができる。
本発明の新規なハイブリッドプロモータ／オペレータ
は、複製可能な発現ベヒクル内で使用する場合には、翻
訳開始をコードするヌクレオチドおよび所望の異種ポリ
ペプチドのアミノ酸配列をコードする構造遺伝子に機能
的に結合される。
は、複製可能な発現ベヒクル内で使用する場合には、翻
訳開始をコードするヌクレオチドおよび所望の異種ポリ
ペプチドのアミノ酸配列をコードする構造遺伝子に機能
的に結合される。
誘発により抑制解除しうるオペレータを有するプロモー
タは、lac,PR,PL,galP2,araBAD,araC,tet,str,spc,rpo
B,L11およびgalP1を包含する（Siebenlist,U.,et.al.,
上記、参照）。比較的高いシグナル強度を示すプロモー
タは、trp、rrn類（rrn family）,tRNA類（tRNA fami
ly）,T7A3,T7A1,PR,PL,str,spc,tufA,rpoB,およびtufB
を包含する（Siebenlist,U.,et al.,上記、参照）。
タは、lac,PR,PL,galP2,araBAD,araC,tet,str,spc,rpo
B,L11およびgalP1を包含する（Siebenlist,U.,et.al.,
上記、参照）。比較的高いシグナル強度を示すプロモー
タは、trp、rrn類（rrn family）,tRNA類（tRNA fami
ly）,T7A3,T7A1,PR,PL,str,spc,tufA,rpoB,およびtufB
を包含する（Siebenlist,U.,et al.,上記、参照）。
プロモータの相対的強度に寄与すると思われる因子は、
Pribnowボックスと−35コンセンサス配列の組成および
配列の完全性（integrity）、Pribowボックスと−35コ
ンセンサス配列の間の間隔、ならびに特に−40ヌクレオ
チド塩基およびその近傍の領域における−35コンセンサ
ス配列より上流の５′フランキング領域の組成である。
強力なプロモータでは、DNA配列のこの領域はA/Tおよび
T/A塩基対群を伴なう極めてA/Tリッチな領域を含有す
る。本発明は、シグナル、すなわち特定のプロモータの
高強度に寄与する領域、−35プロモータコンセンサス配
列より上流のこの領域であることを示す。さらに、本発
明は、抑制解除において誘発性である第１の範疇に属す
るプロモータが特にこの特性においてPribnowボックス
コンセンサス配列近傍より上流のDNA構築により影響さ
れないことを示す。
Pribnowボックスと−35コンセンサス配列の組成および
配列の完全性（integrity）、Pribowボックスと−35コ
ンセンサス配列の間の間隔、ならびに特に−40ヌクレオ
チド塩基およびその近傍の領域における−35コンセンサ
ス配列より上流の５′フランキング領域の組成である。
強力なプロモータでは、DNA配列のこの領域はA/Tおよび
T/A塩基対群を伴なう極めてA/Tリッチな領域を含有す
る。本発明は、シグナル、すなわち特定のプロモータの
高強度に寄与する領域、−35プロモータコンセンサス配
列より上流のこの領域であることを示す。さらに、本発
明は、抑制解除において誘発性である第１の範疇に属す
るプロモータが特にこの特性においてPribnowボックス
コンセンサス配列近傍より上流のDNA構築により影響さ
れないことを示す。
Pribnowボックスと−35コンセンサス配列との間の領域
は、天然に生ずる制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含
むことができる。本発明の新規なハイブリッドプロモー
タ／オペレータの製造において、他のプロモータからの
断片と結合しうる対応とする断片を形成するようこの種
の部位を利用する。たとえば、共通の制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位が２つの適当な供与（ドナー）プロモー
タ（donor promoter）に存在する場合、機能的な相内
配列を（functional inphase sequencing）が維持し
つつ開裂とそれに続く適当な結合とが容易に達成され
る。もし同一でないエンドヌクレアーゼ開裂部位が存在
すれば、開裂とそれに続く結合との公知パターン（型）
を利用する。このことは、一般に当業者の知識範囲内で
ある。
は、天然に生ずる制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含
むことができる。本発明の新規なハイブリッドプロモー
タ／オペレータの製造において、他のプロモータからの
断片と結合しうる対応とする断片を形成するようこの種
の部位を利用する。たとえば、共通の制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位が２つの適当な供与（ドナー）プロモー
タ（donor promoter）に存在する場合、機能的な相内
配列を（functional inphase sequencing）が維持し
つつ開裂とそれに続く適当な結合とが容易に達成され
る。もし同一でないエンドヌクレアーゼ開裂部位が存在
すれば、開裂とそれに続く結合との公知パターン（型）
を利用する。このことは、一般に当業者の知識範囲内で
ある。
本発明の好適具体例は、市販されているたとえば例示と
して下記するような多数の制限エンドヌクレアーゼの使
用を含み、それらの識別配列と開裂パターン（矢印で示
す）とを下記に示す。
して下記するような多数の制限エンドヌクレアーゼの使
用を含み、それらの識別配列と開裂パターン（矢印で示
す）とを下記に示す。
開裂の個所が各鎖において離間している場合、開裂末端
は「付着性」となり、すなわち嵌接もしくはほぞ接ぎ方
式においてワトソン−クリック（Watson−Crick）塩基
対（Ａ対ＴおよびＧ対Ｃ）生成により他の相補的な「付
着性」末端DNAを再アニールまたはアニールすることが
できる。たとえば上記Hpa IおよびPvu IIのような幾つ
かの制限酵素は開裂を行なって「平滑（blunt）」末端
を形成する。上記のヌクレオチド配列は本明細書全体で
使用される慣例に従って表わされ、上方の鎖は蛋白質コ
ード鎖であり、この鎖において左側から右側に進むと
５′末端から３′末端へと移動し、すなわち「基部（pr
oximal）」点から「末端（distal）」点の方向への転写
方向で移動する。
は「付着性」となり、すなわち嵌接もしくはほぞ接ぎ方
式においてワトソン−クリック（Watson−Crick）塩基
対（Ａ対ＴおよびＧ対Ｃ）生成により他の相補的な「付
着性」末端DNAを再アニールまたはアニールすることが
できる。たとえば上記Hpa IおよびPvu IIのような幾つ
かの制限酵素は開裂を行なって「平滑（blunt）」末端
を形成する。上記のヌクレオチド配列は本明細書全体で
使用される慣例に従って表わされ、上方の鎖は蛋白質コ
ード鎖であり、この鎖において左側から右側に進むと
５′末端から３′末端へと移動し、すなわち「基部（pr
oximal）」点から「末端（distal）」点の方向への転写
方向で移動する。
特定のプロモータ／オペレータ出発物質が何らのまたは
何ら有利な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をも含まな
い場合は、二重鎖DNAを開裂に有用な方法により任意の
特に所望する部位にて処理することができる。この方法
において、二重鎖DNAは目標とする開裂点を包囲する領
域においてたとえばエンドヌクレアーゼの作用により一
重鎖DNAに変えられる。次いで、合成のまたはその他の
一重鎖DNAプライマーを従前に形成された一重鎖長さとW
atson−Crick塩基対によりハイブリッド形成させ、この
場合プライマーはその５′末端が第一鎖の目標開裂部位
の直前にあるヌクレオチドと整列するようにされる。次
いで、このプライマをDNAポリメラーゼの反応により
３′方向（prime direction）に延長させ、最初の工程
で失なわれた元来の二重鎖DNA部分を目標の開裂位置の
前まで再現させる。同時にまたはその後に、目標開裂点
を越える第１のストランドの部分を消化除去する。特に
好適な具体例において、プライマからの延長と一重鎖消
化との工程は、３′から５′方向へ突出する一重鎖末端
を同時に消化しかつ５′から３′方向へプライマを延長
するようなポリメラーゼを用いて同時に行なわれる。こ
の目的に対する好適な物質はクレノー（Klenow）ポリメ
ラーゼＩ、すなわち親酵素の５′から３′への重合活性
と３′から５′へのエキソヌクレオ分解活性（exonucle
olytic activity）と有するが５′から３′へのエキソ
ヌクレオ分解活性を欠如するDNAポリメラーゼＩの蛋白
分解開裂（proteolytic cleavage）により得られる断
片である（A.Kornberg,DNA Synthesis,98,W.H.Freeman
and Company,San Francisco（1974）参照）。
何ら有利な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をも含まな
い場合は、二重鎖DNAを開裂に有用な方法により任意の
特に所望する部位にて処理することができる。この方法
において、二重鎖DNAは目標とする開裂点を包囲する領
域においてたとえばエンドヌクレアーゼの作用により一
重鎖DNAに変えられる。次いで、合成のまたはその他の
一重鎖DNAプライマーを従前に形成された一重鎖長さとW
atson−Crick塩基対によりハイブリッド形成させ、この
場合プライマーはその５′末端が第一鎖の目標開裂部位
の直前にあるヌクレオチドと整列するようにされる。次
いで、このプライマをDNAポリメラーゼの反応により
３′方向（prime direction）に延長させ、最初の工程
で失なわれた元来の二重鎖DNA部分を目標の開裂位置の
前まで再現させる。同時にまたはその後に、目標開裂点
を越える第１のストランドの部分を消化除去する。特に
好適な具体例において、プライマからの延長と一重鎖消
化との工程は、３′から５′方向へ突出する一重鎖末端
を同時に消化しかつ５′から３′方向へプライマを延長
するようなポリメラーゼを用いて同時に行なわれる。こ
の目的に対する好適な物質はクレノー（Klenow）ポリメ
ラーゼＩ、すなわち親酵素の５′から３′への重合活性
と３′から５′へのエキソヌクレオ分解活性（exonucle
olytic activity）と有するが５′から３′へのエキソ
ヌクレオ分解活性を欠如するDNAポリメラーゼＩの蛋白
分解開裂（proteolytic cleavage）により得られる断
片である（A.Kornberg,DNA Synthesis,98,W.H.Freeman
and Company,San Francisco（1974）参照）。
この種の開裂の際または制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位における開裂により形成された断片の結合は、たとえ
ば当業者に明白な平滑末端結合またはその他の方法によ
って行なうことができる。
位における開裂により形成された断片の結合は、たとえ
ば当業者に明白な平滑末端結合またはその他の方法によ
って行なうことができる。
新規なハイブリッドプロモータ／オペレータ系を含有す
る複製可能な発現ベヒクルを用いて公知方法により形質
転換された微生物は、抑制状態のプロモータ／オペレー
タによりポリペプチドの工業生産に適するレベルまで増
殖することができる。ほぼ完全な増殖が達成された後、
インデューサを外部源から供給してオペレータを抑制解
除させることにより、異種挿入物の高度効率的な発現を
生ぜしめる。このようにして、細胞は、生成された異種
ポリペプチドがこの細胞に対し致命的であるにしても決
して早期に死滅せず、かつまた細胞培養物はその最大の
増殖状態またはそれに近い状態にあるので、異種ポリペ
プチドの最大生産をもたらす。かくして、現在高度に精
巧化された組換DNA技術により要求される高レベルの異
種ポリペプチドの生産にとって特に有用な高度に制御可
能かつ効率的な発現ベヒクルが提供される。
る複製可能な発現ベヒクルを用いて公知方法により形質
転換された微生物は、抑制状態のプロモータ／オペレー
タによりポリペプチドの工業生産に適するレベルまで増
殖することができる。ほぼ完全な増殖が達成された後、
インデューサを外部源から供給してオペレータを抑制解
除させることにより、異種挿入物の高度効率的な発現を
生ぜしめる。このようにして、細胞は、生成された異種
ポリペプチドがこの細胞に対し致命的であるにしても決
して早期に死滅せず、かつまた細胞培養物はその最大の
増殖状態またはそれに近い状態にあるので、異種ポリペ
プチドの最大生産をもたらす。かくして、現在高度に精
巧化された組換DNA技術により要求される高レベルの異
種ポリペプチドの生産にとって特に有用な高度に制御可
能かつ効率的な発現ベヒクルが提供される。
本発明によるハイブリッドプロモータ／オペレータ系に
関する発現において使用される微生物菌株は全てＥ.col
i菌株であって、Ｅ.coliDNA依存性のRNAポリメラーゼ
（酵素No.E.C.2.7.7.6.）を使用する。本発明を、その
特に好適な具体例において、Ｅ.coli菌株D1210について
記載するが、たとえばＥ.coliB,Ｅ.coliK−12のような
その他公知のＥ.coli菌種、ならびにたとえばＥ.coliK
−12 294（ATCC寄託番号第31446号），Ｅ.coliK−12RR
1（ATCC寄託番号第31343号），Ｅ.coliK−12×1776（AT
CC寄託番号第31537号）およびＥ.coliRV308（ATCC寄託
番号第31608号）のような他のＥ.coli菌株を使用するこ
ともできると理解すべきである。これらの多くは、指定
の微生物寄託機関、たとえばアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ATCC）に寄託されており、ATCC
カタログを参照して第三者による入手が可能である［ド
イツ特許公開公報第2644432号をも参照］。上記したよ
うに、特に好適なものはＥ.coli菌株D1210であって、la
c+,iq,O+,z+,y+,thi-,leu-,pro-,gal-,strr,B1 -,recA-,
r-,mB -という形態学的特徴を有する。インシュリンＢ遺
伝子を有するこの微生物のサンプルは既に寄託されてい
る。（ATCC寄託番号第31449号）。
関する発現において使用される微生物菌株は全てＥ.col
i菌株であって、Ｅ.coliDNA依存性のRNAポリメラーゼ
（酵素No.E.C.2.7.7.6.）を使用する。本発明を、その
特に好適な具体例において、Ｅ.coli菌株D1210について
記載するが、たとえばＥ.coliB,Ｅ.coliK−12のような
その他公知のＥ.coli菌種、ならびにたとえばＥ.coliK
−12 294（ATCC寄託番号第31446号），Ｅ.coliK−12RR
1（ATCC寄託番号第31343号），Ｅ.coliK−12×1776（AT
CC寄託番号第31537号）およびＥ.coliRV308（ATCC寄託
番号第31608号）のような他のＥ.coli菌株を使用するこ
ともできると理解すべきである。これらの多くは、指定
の微生物寄託機関、たとえばアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ATCC）に寄託されており、ATCC
カタログを参照して第三者による入手が可能である［ド
イツ特許公開公報第2644432号をも参照］。上記したよ
うに、特に好適なものはＥ.coli菌株D1210であって、la
c+,iq,O+,z+,y+,thi-,leu-,pro-,gal-,strr,B1 -,recA-,
r-,mB -という形態学的特徴を有する。インシュリンＢ遺
伝子を有するこの微生物のサンプルは既に寄託されてい
る。（ATCC寄託番号第31449号）。
第１図は、第２図に示した構築で使用されるプラスミド
pHGH107−11の構築を示している。
pHGH107−11の構築を示している。
第２図は、それぞれtrpおよびlacプロモータを有するプ
ラスミドから得られるDNA断片の起源を示し、これらを
使用してヒト生長ホルモン（HGH）をコードする構造遺
伝子に機能的に結合されたハイブリッドプロモータ／オ
ペレータを有するプラスミド、すなわちpHGH807−tac I
を構築した。このハイブリッドプロモータ／オペレータ
は、trpプロモータの−22位より上流の配列と、lacプロ
モータ／オペレータの−19位より下流の配列との融合体
である。Plac領域に図示した黒枠はPribnowボックス配
列である。融合個所は、破線で示されている得られたプ
ラスミドはアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン
耐性遺伝子とを有する。転写の方向は矢印で示されてい
る。
ラスミドから得られるDNA断片の起源を示し、これらを
使用してヒト生長ホルモン（HGH）をコードする構造遺
伝子に機能的に結合されたハイブリッドプロモータ／オ
ペレータを有するプラスミド、すなわちpHGH807−tac I
を構築した。このハイブリッドプロモータ／オペレータ
は、trpプロモータの−22位より上流の配列と、lacプロ
モータ／オペレータの−19位より下流の配列との融合体
である。Plac領域に図示した黒枠はPribnowボックス配
列である。融合個所は、破線で示されている得られたプ
ラスミドはアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン
耐性遺伝子とを有する。転写の方向は矢印で示されてい
る。
第３図はtrpプロモータとlacUV5プロモータと２種のtac
ハイブリッドプロモータ／オペレータのDNA配列を示
し、この２種のtacハイブリッドプロモータ／オペレー
タの構築を第２図に示しかつ以下詳細に説明する。trp
プロモータとlacプロモータのDNA配列は公知である［Si
ebenlistet al.上記、参照］。tacプロモータのDNA配
列は、ジデオキシ配列決定法（dideoxy sequencing m
ethod）を用いて決定し、その際trp−プロモータの−40
領域に見合った合成一重鎖DNA断片をアニールさせた変
性プラスミドDNAを使用した。HGH遺伝子のShine−Dalga
rnoおよび開始コドンの個所に上線を施こした。プロモ
ータのPribnowボックスと−35配列とには下線を施こし
た。オペレータ配列は破線で示されている。出発ヌクレ
オチド（starting nucleotide）は、＋１で示されてい
る。該当する制限部位Taq IとHpa IIとは、矢印で示さ
れている。tacプロモータの場合、「trp」配列と「la
c」配列との間の結合部を二重矢印で示した。−35コン
センサス配列とPribnowボックスとの間のヌクレオチド
間隔は、Ptrpについては17bpであり、Placについては18
bpであり、Ptac Iについては16bpであり、またPtac II
については17bpである。
ハイブリッドプロモータ／オペレータのDNA配列を示
し、この２種のtacハイブリッドプロモータ／オペレー
タの構築を第２図に示しかつ以下詳細に説明する。trp
プロモータとlacプロモータのDNA配列は公知である［Si
ebenlistet al.上記、参照］。tacプロモータのDNA配
列は、ジデオキシ配列決定法（dideoxy sequencing m
ethod）を用いて決定し、その際trp−プロモータの−40
領域に見合った合成一重鎖DNA断片をアニールさせた変
性プラスミドDNAを使用した。HGH遺伝子のShine−Dalga
rnoおよび開始コドンの個所に上線を施こした。プロモ
ータのPribnowボックスと−35配列とには下線を施こし
た。オペレータ配列は破線で示されている。出発ヌクレ
オチド（starting nucleotide）は、＋１で示されてい
る。該当する制限部位Taq IとHpa IIとは、矢印で示さ
れている。tacプロモータの場合、「trp」配列と「la
c」配列との間の結合部を二重矢印で示した。−35コン
センサス配列とPribnowボックスとの間のヌクレオチド
間隔は、Ptrpについては17bpであり、Placについては18
bpであり、Ptac Iについては16bpであり、またPtac II
については17bpである。
第４図は第２図の方法で構築されたハイブリッドプロモ
ータ／オペレータによりプロモートされるヒト生長ホル
モン（HGH）の生産を示す。Ｅ.coliD1210/pHGH807−tac
IとＥ.coliD1210/pHGH107−11（標準的形質転換法によ
り調製）との新鮮な一晩培養物を使用して、50mlのLB−
アンピシリン（20μg/ml）に細胞密度0.03（OD550）ま
で接種した。１時間後に第１の試料を採取した。（ｔ＝
Omin）。D1210におけるtac−プロモータの誘発は、ｔ＝
80minにおける1.0mMのIPTGの添加によって行なった。
（矢印で示す）。HGHレベルはラジオイムノアッセイに
より測定した。記号 はD1210/pHGH107−11（単一lac−プロモータ）を示し、 はD1210/pHGH807−tac I（単一tac−プロモータ）を示
す。pHGH907tac IIハイブリッドプロモータ／オペレー
タを使用するHGHの生産は、この図に示したように、pHG
H807tac Iプロモータ／オペレータ使用して得られたレ
ベルとほぼ同じである。同様に、Prrnlacハイブリッド
プロモータ／オペレータを使用したHGHの生産は、第４
図に示したように（データは図示せず）、Ptacプロモー
タ／オペレータを使用して得られたレベルと同様であ
る。
ータ／オペレータによりプロモートされるヒト生長ホル
モン（HGH）の生産を示す。Ｅ.coliD1210/pHGH807−tac
IとＥ.coliD1210/pHGH107−11（標準的形質転換法によ
り調製）との新鮮な一晩培養物を使用して、50mlのLB−
アンピシリン（20μg/ml）に細胞密度0.03（OD550）ま
で接種した。１時間後に第１の試料を採取した。（ｔ＝
Omin）。D1210におけるtac−プロモータの誘発は、ｔ＝
80minにおける1.0mMのIPTGの添加によって行なった。
（矢印で示す）。HGHレベルはラジオイムノアッセイに
より測定した。記号 はD1210/pHGH107−11（単一lac−プロモータ）を示し、 はD1210/pHGH807−tac I（単一tac−プロモータ）を示
す。pHGH907tac IIハイブリッドプロモータ／オペレー
タを使用するHGHの生産は、この図に示したように、pHG
H807tac Iプロモータ／オペレータ使用して得られたレ
ベルとほぼ同じである。同様に、Prrnlacハイブリッド
プロモータ／オペレータを使用したHGHの生産は、第４
図に示したように（データは図示せず）、Ptacプロモー
タ／オペレータを使用して得られたレベルと同様であ
る。
第５図および第６図はpHGH−Prrnlacから得られる発現
プラスミドpHGH−Prac5−16の構築を示し、これはハイ
ブリッドプロモータ／オペレータを有し、すなわちrrn
プロモータの−28位より上流の配列とlacプロモータ／
オペレータの−19位より下流の配列とを合成誘導された
DNA配列を介し融合させて有している。
プラスミドpHGH−Prac5−16の構築を示し、これはハイ
ブリッドプロモータ／オペレータを有し、すなわちrrn
プロモータの−28位より上流の配列とlacプロモータ／
オペレータの−19位より下流の配列とを合成誘導された
DNA配列を介し融合させて有している。
第７図はハイブリッドプロモータ／オペレータを有する
プラスミドpHGH907tac IIの構築を示し、lacプロモータ
／オペレータの−10位より下流の配列とtrpプロモータ
／オペレータの−12位より上流の配列とを有する。この
プラスミドも移動性Shine−Dalgarno配列を有する。
プラスミドpHGH907tac IIの構築を示し、lacプロモータ
／オペレータの−10位より下流の配列とtrpプロモータ
／オペレータの−12位より上流の配列とを有する。この
プラスミドも移動性Shine−Dalgarno配列を有する。
第８図はLac−UV5とrrnBと短縮ハイブリッドプロモータ
（Prrn−lac I）と伸長ハイブリッドプロモータ（Prrn
−lac II）と活性ハイブリッドプロモータ（rac5−16）
のDNA配列を示す。それぞれ−35配列とPirbnowボックス
配列とに上線を施こし、Prrn−lac IIの合成挿入物には
下線を施こした。PlacおよびPrrnの転写開始部位または
Prrn−lac I,Prrn−lac IIおよびPrac5−16の場合のそ
の開始部位に対応するヌクレオチドが示されている。
（Prrn−lac I）と伸長ハイブリッドプロモータ（Prrn
−lac II）と活性ハイブリッドプロモータ（rac5−16）
のDNA配列を示す。それぞれ−35配列とPirbnowボックス
配列とに上線を施こし、Prrn−lac IIの合成挿入物には
下線を施こした。PlacおよびPrrnの転写開始部位または
Prrn−lac I,Prrn−lac IIおよびPrac5−16の場合のそ
の開始部位に対応するヌクレオチドが示されている。
1. pHGH207−１の構築 プラスミドpGM1は欠損LE1413を含むＥ.coliトリプトフ
アンオペロンを有し（G.F.Miozzari,et al.Ｊ.Bacteri
ology（1979）1457〜1466）、したがってtrpリーダーの
最初の６個のアミノ酸とtrpEポリペプチドの後方約３分
の一（以下、LE′として示す）と完全な状態のtrpDポリ
ペプチドとからなる融合蛋白質を全てtrpプロモータ／
オペレータ系の制御下に発現する。プラスミド20μｇを
制限酵素Pvu IIによって消化したが、この酵素は５つの
部位においてプラスミドを開裂する。次いで、遺伝子断
片をEcoR Iリンカー（pCATGAATTCATGの配列の自己相補
性オリゴヌクレオチドよりなる）と結合させて後にEcoR
I部位を有するプラスミド内でクローンするためのEcoR
I開裂部位を形成した。pGM1から得られたDNA断片20μ
ｇを、200ピコモルの５′−燐酸化合成オリゴヌクレオ
チドpCATGAATTCATGの存在下、20μのT4DNAリガーゼ緩
衝液（20mMトリス,pH7.6,0.5mM ATP,10mM MgCl2,5mMジ
チオスレイトール）中、10単位のT4DNAリガーゼにより
４℃で一晩処理した。次いで、この溶液を70℃にて10分
間加熱することによりリガーゼを失活させた。リンカー
をEcoR I消化により開裂させ、かくしてEcoR I末端を形
成した断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以
下、「PAGE」と云う）によって分離し、３個の最大断片
をゲルから単離したが、この単離は先ず臭化エチジウム
で染色し、染外光により断片の位置を決定し、次いで興
味ある部分をゲルから切除することにより行なった。各
ゲル断片を300μの0.1×TBEと共に透析袋に入れ、0.1
×TBE緩衝液（TBE緩衝液は10.8gのトリス塩基と5.5gの
硼酸と0.09gのNa2EDTAとを水１中に含有する）中100
ボルトで１時間電気泳動にかけた。水溶液を透析袋から
回収し、フエノール抽出し、クロロホルム抽出しかつ0.
2M塩化ナトリウムにし、そしてエタノール沈澱の後にDN
Aを水中で回収した（以下に記載する全てのDNA断片の単
離はPAGEを使用し次いで上記の電気溶出法にかけること
により行なうものとする）。EcoR I付着性末端を有する
trpプロモータ／オペレータ含有の遺伝子を下記する手
順により同定したが、これはテトラサイクリン感受性の
プラスミド中に断片を挿入することを含み、このプラス
ミドはプロモータ／オペレータを挿入するとテトラサイ
クリン耐性になる。
アンオペロンを有し（G.F.Miozzari,et al.Ｊ.Bacteri
ology（1979）1457〜1466）、したがってtrpリーダーの
最初の６個のアミノ酸とtrpEポリペプチドの後方約３分
の一（以下、LE′として示す）と完全な状態のtrpDポリ
ペプチドとからなる融合蛋白質を全てtrpプロモータ／
オペレータ系の制御下に発現する。プラスミド20μｇを
制限酵素Pvu IIによって消化したが、この酵素は５つの
部位においてプラスミドを開裂する。次いで、遺伝子断
片をEcoR Iリンカー（pCATGAATTCATGの配列の自己相補
性オリゴヌクレオチドよりなる）と結合させて後にEcoR
I部位を有するプラスミド内でクローンするためのEcoR
I開裂部位を形成した。pGM1から得られたDNA断片20μ
ｇを、200ピコモルの５′−燐酸化合成オリゴヌクレオ
チドpCATGAATTCATGの存在下、20μのT4DNAリガーゼ緩
衝液（20mMトリス,pH7.6,0.5mM ATP,10mM MgCl2,5mMジ
チオスレイトール）中、10単位のT4DNAリガーゼにより
４℃で一晩処理した。次いで、この溶液を70℃にて10分
間加熱することによりリガーゼを失活させた。リンカー
をEcoR I消化により開裂させ、かくしてEcoR I末端を形
成した断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以
下、「PAGE」と云う）によって分離し、３個の最大断片
をゲルから単離したが、この単離は先ず臭化エチジウム
で染色し、染外光により断片の位置を決定し、次いで興
味ある部分をゲルから切除することにより行なった。各
ゲル断片を300μの0.1×TBEと共に透析袋に入れ、0.1
×TBE緩衝液（TBE緩衝液は10.8gのトリス塩基と5.5gの
硼酸と0.09gのNa2EDTAとを水１中に含有する）中100
ボルトで１時間電気泳動にかけた。水溶液を透析袋から
回収し、フエノール抽出し、クロロホルム抽出しかつ0.
2M塩化ナトリウムにし、そしてエタノール沈澱の後にDN
Aを水中で回収した（以下に記載する全てのDNA断片の単
離はPAGEを使用し次いで上記の電気溶出法にかけること
により行なうものとする）。EcoR I付着性末端を有する
trpプロモータ／オペレータ含有の遺伝子を下記する手
順により同定したが、これはテトラサイクリン感受性の
プラスミド中に断片を挿入することを含み、このプラス
ミドはプロモータ／オペレータを挿入するとテトラサイ
クリン耐性になる。
プラスミドpBRH1（R.I.Rodriguez,et al.,Nucleic Ac
ides Research,6,3267〜3287（1979））はアピシリン
耐性を示しかつテトラサイクリン耐性の遺伝子を有する
が、関連プロモータが存在しないのでその耐性を示さな
い。したがって、このプラスミドはテトラサイクリン感
受性である。EcoR I部位にプロモータ／オペレータ系を
導入することにより、このプラスミドをテトラサイクリ
ン耐性にすることができる。
ides Research,6,3267〜3287（1979））はアピシリン
耐性を示しかつテトラサイクリン耐性の遺伝子を有する
が、関連プロモータが存在しないのでその耐性を示さな
い。したがって、このプラスミドはテトラサイクリン感
受性である。EcoR I部位にプロモータ／オペレータ系を
導入することにより、このプラスミドをテトラサイクリ
ン耐性にすることができる。
pBRH1をEcoR Iで消化し、フェノール／クロロホルム抽
出次いでクロロホルム抽出することにより酵素を除去し
そしてエタノール沈澱の後に水中で回収した。得られた
DNA分子を、別々の反応混合物において、上記のように
得られた３個のDNA断片のそれぞれと混合し、前記した
ようにT4DNAリガーゼにより結合した。反応混合物中に
存在するDNAを使用してコンピテント（受容能力のあ
る）Ｅ.coli K−12菌株294（K.Backman et al.,Proc
Nat′ｌ Acad Sci USA73,4174〜4198（1976））
（ATCC No.31446）を標準技術（V.Hershfield et a
l.,Proc Nat′ｌ Acad Sci USA,71,3455−3459（19
74））により形質転換し、この細菌を20μg/mlのアンピ
シリンと５μg/mlのテトラサイクリンとを含有するLBプ
レート上に接種した。数個のテトラサイクリン耐性コロ
ニーを選択し、プラスミドDNAを単離しそして所望断面
の存在を制限酵素分析により確認した。pBRHtrpと名付
けるこの得られたプラスミドはアンピシリン耐性を付与
するβ−ラクタマーゼを発現し、かつtrpプロモータ／
オペレータを含むDNA断片を含有し、このDNA断片はtrp
リーダーの最初の６個のアミノ酸とtrpEポリペプチドの
後方約三分の一（このポリペプチドをLE′と名付ける）
との融合体からなる第１の蛋白質と、trpDポリペプチド
（このポリペプチドをＤ′と名付ける）のほぼ最初の半
分に相当する第２の蛋白質と、テトラサイクリン耐性遺
伝子によりコードされる第３の蛋白質とをコードしてい
る。
出次いでクロロホルム抽出することにより酵素を除去し
そしてエタノール沈澱の後に水中で回収した。得られた
DNA分子を、別々の反応混合物において、上記のように
得られた３個のDNA断片のそれぞれと混合し、前記した
ようにT4DNAリガーゼにより結合した。反応混合物中に
存在するDNAを使用してコンピテント（受容能力のあ
る）Ｅ.coli K−12菌株294（K.Backman et al.,Proc
Nat′ｌ Acad Sci USA73,4174〜4198（1976））
（ATCC No.31446）を標準技術（V.Hershfield et a
l.,Proc Nat′ｌ Acad Sci USA,71,3455−3459（19
74））により形質転換し、この細菌を20μg/mlのアンピ
シリンと５μg/mlのテトラサイクリンとを含有するLBプ
レート上に接種した。数個のテトラサイクリン耐性コロ
ニーを選択し、プラスミドDNAを単離しそして所望断面
の存在を制限酵素分析により確認した。pBRHtrpと名付
けるこの得られたプラスミドはアンピシリン耐性を付与
するβ−ラクタマーゼを発現し、かつtrpプロモータ／
オペレータを含むDNA断片を含有し、このDNA断片はtrp
リーダーの最初の６個のアミノ酸とtrpEポリペプチドの
後方約三分の一（このポリペプチドをLE′と名付ける）
との融合体からなる第１の蛋白質と、trpDポリペプチド
（このポリペプチドをＤ′と名付ける）のほぼ最初の半
分に相当する第２の蛋白質と、テトラサイクリン耐性遺
伝子によりコードされる第３の蛋白質とをコードしてい
る。
pBRHtrpをEcoR I制限酵素で消化し、得られた断片１をP
AGEおよび電気溶出により単離した。EcoR Iを消化した
プラスミドpSom11（K.Itakura et al.,Science,198,1
056（1977）および英国特許出願公開第2007676A号）を
この断片１と混合した。この混合物を前記と同様にT4DN
Aリガーゼにより結合し、得られたDNAを前記と同様に
Ｅ.coli K−12株菌294に形質転換した。形質転換細菌を
アンピシリン含有プレート上で選択した。得られたアン
ピシリン耐性コロニーをコロニーハイブリダイゼーショ
ン法（M.Gruenstein et al.,Proc Nat′ｌ Acad S
ci USA,72,3951−3965（1975））により選別したが、
この場合プローブとしては予めP32により放射能標識し
たpBRHtrpから単離されたtrpプロモータ／オペレータ含
有断片１を使用した。コロニーハイブリダイゼーション
により陽性（positive）を示した幾つかのコロニーを選
択し、プラスミドDNAを単離し、そして挿入断片の方向
性（orientation）を制限酵素Bgl IIとBamH Iによる二
重消化法（double digestion）を用いる制限分析（rest
riction analysis）によって決定した。pSOM7△２と名
付けられ所望の方向性でtrpプロモータ／オペレータ断
片を有するプラスミドを含有するＥ.coli294を、10μg/
mlのアンピシリンを含有するLB培地で増殖させた。細胞
を光学密度１（550nMにおいて）まで増殖させ、遠心分
離により回収し、そしてM9培地中に10倍希釈で再懸濁さ
せた。細胞を再び光学密度１まで２〜３時間増殖させ、
次いで溶菌させて全細胞蛋白質をSDS（ドデシル硫酸ナ
トリウム）面積（15％）ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（J.V.Maizel Jr.et.al.,Meth Viral,5,180−246
（1971））により分析した。
AGEおよび電気溶出により単離した。EcoR Iを消化した
プラスミドpSom11（K.Itakura et al.,Science,198,1
056（1977）および英国特許出願公開第2007676A号）を
この断片１と混合した。この混合物を前記と同様にT4DN
Aリガーゼにより結合し、得られたDNAを前記と同様に
Ｅ.coli K−12株菌294に形質転換した。形質転換細菌を
アンピシリン含有プレート上で選択した。得られたアン
ピシリン耐性コロニーをコロニーハイブリダイゼーショ
ン法（M.Gruenstein et al.,Proc Nat′ｌ Acad S
ci USA,72,3951−3965（1975））により選別したが、
この場合プローブとしては予めP32により放射能標識し
たpBRHtrpから単離されたtrpプロモータ／オペレータ含
有断片１を使用した。コロニーハイブリダイゼーション
により陽性（positive）を示した幾つかのコロニーを選
択し、プラスミドDNAを単離し、そして挿入断片の方向
性（orientation）を制限酵素Bgl IIとBamH Iによる二
重消化法（double digestion）を用いる制限分析（rest
riction analysis）によって決定した。pSOM7△２と名
付けられ所望の方向性でtrpプロモータ／オペレータ断
片を有するプラスミドを含有するＥ.coli294を、10μg/
mlのアンピシリンを含有するLB培地で増殖させた。細胞
を光学密度１（550nMにおいて）まで増殖させ、遠心分
離により回収し、そしてM9培地中に10倍希釈で再懸濁さ
せた。細胞を再び光学密度１まで２〜３時間増殖させ、
次いで溶菌させて全細胞蛋白質をSDS（ドデシル硫酸ナ
トリウム）面積（15％）ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（J.V.Maizel Jr.et.al.,Meth Viral,5,180−246
（1971））により分析した。
10μｇのプラスミドpSom7△２をEcoR Iにより開裂さ
せ、トリプトフアン遺伝子要素を含有するDNA断片１をP
AGEおよび電気溶出により単離した。この断片２μｇを
２単位の制限エンドヌクレアーゼTaq Iにより37℃で10
分間消化して、平均で各分子当り約５個のTaq I部位の
１つのみを開裂させた。この部分消化された断片の混合
物をPAGEにより分離し、１個のEcoR I末端と１個のTaq
I末端とを含有する約300塩基対の断片２を電気溶出によ
り単離した。対応するTaq I部位は転写開始部位と翻訳
開始部位との間に位置し、trpリーダーペプチドのATGコ
ドンにより５個ヌクレオチド上流にある。前記のように
処理して、trpオペロンの全ての制御要素、すなわちプ
ロモータ／オペレータ系と転写開始信号とtrpリーダー
リボソーム結合部位の一部とを含有する断片を単離する
ことができた。
せ、トリプトフアン遺伝子要素を含有するDNA断片１をP
AGEおよび電気溶出により単離した。この断片２μｇを
２単位の制限エンドヌクレアーゼTaq Iにより37℃で10
分間消化して、平均で各分子当り約５個のTaq I部位の
１つのみを開裂させた。この部分消化された断片の混合
物をPAGEにより分離し、１個のEcoR I末端と１個のTaq
I末端とを含有する約300塩基対の断片２を電気溶出によ
り単離した。対応するTaq I部位は転写開始部位と翻訳
開始部位との間に位置し、trpリーダーペプチドのATGコ
ドンにより５個ヌクレオチド上流にある。前記のように
処理して、trpオペロンの全ての制御要素、すなわちプ
ロモータ／オペレータ系と転写開始信号とtrpリーダー
リボソーム結合部位の一部とを含有する断片を単離する
ことができた。
trpリーダー配列に対する翻訳開始信号に隣接した得ら
れた断片の３′末端におけるTaq I残基（residue）を、
次いでXba I部位へ転換させた。これは、上記で得られ
た断片２を唯一（すなわち１個のみ）のEcoR I部位と唯
一のXba I部位とを有するプラスミドに結合させること
により行なった。この目的には、順次にレプリコンとた
とえば抗生物質耐性のような選択マーカーとEcoR I,Xba
IおよびBamH I部位とを有する殆んど如何なるプラスミ
ドをも使用することができる。このようにして、たとえ
ばXba I部位を、たとえばプラスミドの唯一のHind III
部位においてHind IIIにより開裂させ次いで得られた付
着性末端を一重鎖特異性のヌクレアーゼで消化させかつ
たとえばCCTCTAGAGGのような識別部位を有する自己アニ
ーリング二重鎖合成ヌクレオチドを平滑末端結合するこ
とにより、pBR322（F.Bolivar et al.,Gene ２,95−
119（1977））のEcoR I部位とBamH I部位との間に導入
することができる。或いは本明細書で行なったと同様に
EcoR I開裂残基とBamH I開裂残基との間に単一のXba I
部位を有する天然に生じたDNA断片を使用することもで
きる。たとえば、Ｂ型肝炎のウイルスゲノムのEcoR Iお
よびBamH I消化生成物を慣用手段により得、これをプラ
スミドpGH6（D.V.Goeddel et al.,Nature.281,544（1
979））のEcoR I部位とBamH I部位とにクローン化させ
てプラスミドpHS32を生成させた。このプラスミドpHS32
をXba Iで開裂させ、フエノール抽出し、クロロホルム
抽出しそしてエタノール沈澱させた。次いで、これを0.
1mMのdTTPと0.1mMのdCTPとを含有する30μのポリメラ
ーゼ緩衝液（50mMの燐酸カリウム、pH7.4、7mMのMgC
l2、1mMのβ−メルカプトエタノール）中において１μ
のＥ.coliポリメラーゼＩ、クレノー（Klenow）断片
（Boehringer−Mannheim）によって０℃で30分間、次い
で37℃にて２時間処理した。この処理は、Xba I開裂部
位の５′突出末端部に対して相補的な４個のヌクレオチ
ドのうち２個を充填させる： ２つのヌクレオチドdCとdTとを組込んで、５′に突出す
る２ヌクレオチドを持つ末端を得た。プラスミドpHS32
のこの線状残基（linear residue）を（フエノールお
よびクロロホルム抽出とエタノール沈澱後における水中
での回収の後）EcoR Iにより開裂させた。大きい方のプ
ラスミド断片をより小さいEcoR I−Xba I断片からPAGE
により分離し、電気溶出後に単離した。pHS32からのこ
のDNA断片（0.2μｇ）を、上記と同様な条件下におい
て、トリプトフアンオペロンのEcoR I−Taq I断片（0.0
1μｇ）に結合させた。この過程でTaq I突出末端は、た
とえ完全なWatson−Crick塩基対にならなくとも、Xba I
残留突出末端に結合される： この結合反応混合物の一部を上記と同様にＥ.coli294細
胞へ形質転換させ、熱処理しそしてアンピシリン含有の
LBプレートの上に接種した。24個のコロニーを選択し、
3mlのLB培地中で増殖させ、プラスミドを単離した。こ
れらのうち６個が、Ｅ.coliで触媒されるDNA修復および
複製により再生されたXba I部位を有すると判明した： さらに、これらのプラスミドは、EcoR IとHpa Iとの両
者により開裂しかつ予想された制限断片（restriction
fragment）を与えることも判明した。pTrp14と名付け
る１つのプラスミド14を使用して、下記するように異種
ポリペプチドを発現させた。
れた断片の３′末端におけるTaq I残基（residue）を、
次いでXba I部位へ転換させた。これは、上記で得られ
た断片２を唯一（すなわち１個のみ）のEcoR I部位と唯
一のXba I部位とを有するプラスミドに結合させること
により行なった。この目的には、順次にレプリコンとた
とえば抗生物質耐性のような選択マーカーとEcoR I,Xba
IおよびBamH I部位とを有する殆んど如何なるプラスミ
ドをも使用することができる。このようにして、たとえ
ばXba I部位を、たとえばプラスミドの唯一のHind III
部位においてHind IIIにより開裂させ次いで得られた付
着性末端を一重鎖特異性のヌクレアーゼで消化させかつ
たとえばCCTCTAGAGGのような識別部位を有する自己アニ
ーリング二重鎖合成ヌクレオチドを平滑末端結合するこ
とにより、pBR322（F.Bolivar et al.,Gene ２,95−
119（1977））のEcoR I部位とBamH I部位との間に導入
することができる。或いは本明細書で行なったと同様に
EcoR I開裂残基とBamH I開裂残基との間に単一のXba I
部位を有する天然に生じたDNA断片を使用することもで
きる。たとえば、Ｂ型肝炎のウイルスゲノムのEcoR Iお
よびBamH I消化生成物を慣用手段により得、これをプラ
スミドpGH6（D.V.Goeddel et al.,Nature.281,544（1
979））のEcoR I部位とBamH I部位とにクローン化させ
てプラスミドpHS32を生成させた。このプラスミドpHS32
をXba Iで開裂させ、フエノール抽出し、クロロホルム
抽出しそしてエタノール沈澱させた。次いで、これを0.
1mMのdTTPと0.1mMのdCTPとを含有する30μのポリメラ
ーゼ緩衝液（50mMの燐酸カリウム、pH7.4、7mMのMgC
l2、1mMのβ−メルカプトエタノール）中において１μ
のＥ.coliポリメラーゼＩ、クレノー（Klenow）断片
（Boehringer−Mannheim）によって０℃で30分間、次い
で37℃にて２時間処理した。この処理は、Xba I開裂部
位の５′突出末端部に対して相補的な４個のヌクレオチ
ドのうち２個を充填させる： ２つのヌクレオチドdCとdTとを組込んで、５′に突出す
る２ヌクレオチドを持つ末端を得た。プラスミドpHS32
のこの線状残基（linear residue）を（フエノールお
よびクロロホルム抽出とエタノール沈澱後における水中
での回収の後）EcoR Iにより開裂させた。大きい方のプ
ラスミド断片をより小さいEcoR I−Xba I断片からPAGE
により分離し、電気溶出後に単離した。pHS32からのこ
のDNA断片（0.2μｇ）を、上記と同様な条件下におい
て、トリプトフアンオペロンのEcoR I−Taq I断片（0.0
1μｇ）に結合させた。この過程でTaq I突出末端は、た
とえ完全なWatson−Crick塩基対にならなくとも、Xba I
残留突出末端に結合される： この結合反応混合物の一部を上記と同様にＥ.coli294細
胞へ形質転換させ、熱処理しそしてアンピシリン含有の
LBプレートの上に接種した。24個のコロニーを選択し、
3mlのLB培地中で増殖させ、プラスミドを単離した。こ
れらのうち６個が、Ｅ.coliで触媒されるDNA修復および
複製により再生されたXba I部位を有すると判明した： さらに、これらのプラスミドは、EcoR IとHpa Iとの両
者により開裂しかつ予想された制限断片（restriction
fragment）を与えることも判明した。pTrp14と名付け
る１つのプラスミド14を使用して、下記するように異種
ポリペプチドを発現させた。
プラスミドpHGH107［D.V.Goeddel et al,Nature,281,
544,1979］は、合成DNA断片から生成された23アミノ酸
コドンとヒト生長ホルモンメッセンジャRNAの逆転写に
より生成された相補的DNAより得られる163アミノ酸コド
ンとで構築されたヒト生長ホルモン遺伝子を含有する。
544,1979］は、合成DNA断片から生成された23アミノ酸
コドンとヒト生長ホルモンメッセンジャRNAの逆転写に
より生成された相補的DNAより得られる163アミノ酸コド
ンとで構築されたヒト生長ホルモン遺伝子を含有する。
この遺伝子３は、ヒト生長ホルモンの「予備（pre）」
配列のコドンを欠如するが、ATG翻訳開始コドンを含有
している。この遺伝子を、上記のようにEcoR Iでの処理
に次いでＥ.coliポリメラーゼＩ Klenow断片とdTTPお
よびdATPとでの処理により10μｇのpHGH107から単離し
た。フエノールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈
澱との後、プラスミドをBamH Iで処理した。
配列のコドンを欠如するが、ATG翻訳開始コドンを含有
している。この遺伝子を、上記のようにEcoR Iでの処理
に次いでＥ.coliポリメラーゼＩ Klenow断片とdTTPお
よびdATPとでの処理により10μｇのpHGH107から単離し
た。フエノールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈
澱との後、プラスミドをBamH Iで処理した。
ヒト生長ホルモン（「HGH」）遺伝子含有断片３を、PAG
E次いで電気溶出により単離した。得られたDNA断片も、
テトラサイクリン耐性構造遺伝子の最初の350個のヌク
レオチドを有するが、テトラサイクリン プロモータ／
オペレータ系を欠如しており、したがって続いて発現プ
ラスミドにクローン化させれば、この挿入物を含有する
プラスミドをテトラサイクリン耐性の回復により検出す
ることができる。断片３のEcoR I末端はKlenowポリメラ
ーゼＩの過程により充填されているので、この断片は１
個の平滑末端と１個の付着性末端とを有して、後に発現
プラスミド中に挿入されている際適正な方向性を確保す
る。
E次いで電気溶出により単離した。得られたDNA断片も、
テトラサイクリン耐性構造遺伝子の最初の350個のヌク
レオチドを有するが、テトラサイクリン プロモータ／
オペレータ系を欠如しており、したがって続いて発現プ
ラスミドにクローン化させれば、この挿入物を含有する
プラスミドをテトラサイクリン耐性の回復により検出す
ることができる。断片３のEcoR I末端はKlenowポリメラ
ーゼＩの過程により充填されているので、この断片は１
個の平滑末端と１個の付着性末端とを有して、後に発現
プラスミド中に挿入されている際適正な方向性を確保す
る。
次いで、上記のHGH遺伝子含有断片を受入れるため、発
現プラスミドpTrp14を調製した。たとえば、pTrp14をXb
a Iで消化し、得られた付着性末端をKlenowポリメラー
ゼＩ過程によりdATPとdTTPとdGTPとdCTPとを用いて充填
した。フエノールおよびクロロホルム抽出とエタノール
沈澱との後、得られたDNAをBamH Iで処理し、得られた
大きい方のプラスミド断片をPAGEおよび電気溶出により
単離した。pTrp14から誘導された断片は１個の平滑末端
と１個の付着性末端とを有し、前記断片３を有するHGH
遺伝子との適正な方向性における組換えを可能にする。
現プラスミドpTrp14を調製した。たとえば、pTrp14をXb
a Iで消化し、得られた付着性末端をKlenowポリメラー
ゼＩ過程によりdATPとdTTPとdGTPとdCTPとを用いて充填
した。フエノールおよびクロロホルム抽出とエタノール
沈澱との後、得られたDNAをBamH Iで処理し、得られた
大きい方のプラスミド断片をPAGEおよび電気溶出により
単離した。pTrp14から誘導された断片は１個の平滑末端
と１個の付着性末端とを有し、前記断片３を有するHGH
遺伝子との適正な方向性における組換えを可能にする。
HGH遺伝子断片３とpTrp14のXba−BamHI断片とを混合
し、上記と同様な条件下で結合させた。充填されたXba
I末端とEcoR I末端とを平滑末端結合により結合させ
て、Xba I部位とEcoR I部位との両者を再生させた： この構築は、さらに、テトラサイクリン耐性遺伝子をも
再生させる。プラスミドpHGH107はHGH遺伝子より上流に
存在するプロモータ（lacプロモータ）からテトラサイ
クリン耐性を発現するので、pHGH207と名付けるこの構
築物はトリプトフアン プロモータ／オペレータの制御
下におけるテトラサイクリン耐性遺伝子の発現を可能に
する。このように、この結合混合物をＥ.coli294へ形質
転換させ、５μg/mlのテトラサイクリンを含有するLBプ
レート上でコロニーを選択した。
し、上記と同様な条件下で結合させた。充填されたXba
I末端とEcoR I末端とを平滑末端結合により結合させ
て、Xba I部位とEcoR I部位との両者を再生させた： この構築は、さらに、テトラサイクリン耐性遺伝子をも
再生させる。プラスミドpHGH107はHGH遺伝子より上流に
存在するプロモータ（lacプロモータ）からテトラサイ
クリン耐性を発現するので、pHGH207と名付けるこの構
築物はトリプトフアン プロモータ／オペレータの制御
下におけるテトラサイクリン耐性遺伝子の発現を可能に
する。このように、この結合混合物をＥ.coli294へ形質
転換させ、５μg/mlのテトラサイクリンを含有するLBプ
レート上でコロニーを選択した。
A.pHGH107−11の構築 プラスミドpHGH107−11をpHGH107、すなわち前述のプラ
スミド［Goeddel et al.,1979,Nature.281,544〜54
8］から誘導した。両プラスミドはpBR322から誘導され
たものであり、上記のように挿入されたHGH遺伝子を有
する。（第１図参照）。pHGH107−11はHGH遺伝子に融合
された単一のlacプロモータを有するのに対し、pHGH107
はDNAの異種片により分離された２個のlacプロモータを
有する。pHGH107−11を得るため、６％ポリアクリルア
ミドゲルを用いてEcoR I−Alu I105bpDNA断片を単離し
た。１個の平滑末端を有するこの断片に、T4−ポリヌク
レオチドリガーゼを用いて、下記配列 を有するEcoR Iリンカーを結合させた。次いで、この結
合した物質をEcoR Iで処理してリンカーの中央で開裂さ
せると共に、元来のEcoR I部位を介して共有結合してい
るDNA断片の鎖状体をも開裂させた。この混合物を12％
ポリアクリルアミドゲルにて分離し、大きさが105bpか
ら110bpまで僅かに増大した断片を抽出しかつエタノー
ル沈澱させた。かくして、この断片はその両末端にEcoR
I付着性末端を有し、pHGH207−１誘導されたベクター
中に容易に挿入することができる。
スミド［Goeddel et al.,1979,Nature.281,544〜54
8］から誘導した。両プラスミドはpBR322から誘導され
たものであり、上記のように挿入されたHGH遺伝子を有
する。（第１図参照）。pHGH107−11はHGH遺伝子に融合
された単一のlacプロモータを有するのに対し、pHGH107
はDNAの異種片により分離された２個のlacプロモータを
有する。pHGH107−11を得るため、６％ポリアクリルア
ミドゲルを用いてEcoR I−Alu I105bpDNA断片を単離し
た。１個の平滑末端を有するこの断片に、T4−ポリヌク
レオチドリガーゼを用いて、下記配列 を有するEcoR Iリンカーを結合させた。次いで、この結
合した物質をEcoR Iで処理してリンカーの中央で開裂さ
せると共に、元来のEcoR I部位を介して共有結合してい
るDNA断片の鎖状体をも開裂させた。この混合物を12％
ポリアクリルアミドゲルにて分離し、大きさが105bpか
ら110bpまで僅かに増大した断片を抽出しかつエタノー
ル沈澱させた。かくして、この断片はその両末端にEcoR
I付着性末端を有し、pHGH207−１誘導されたベクター
中に容易に挿入することができる。
単一のtrp−プロモータを有するプラスミドpHGH207−１
は、二重lac−プロモータに続いて単一のtrp−プロモー
タを有するpHGH207から二重lac−プロモータを除去する
ことにより得られた。これは次のようにして行なった。
先ずtrp−プロモータ310bpDNA断片をpF I Ftrp−69［Go
eddel et al.,Nucleic Acids Research,８,4057（1
980）参照］からEcoR Iでの消化によって得た。この断
片を、EcoR Iにより開裂されたpHGH107に、T4DNAリガー
ゼを用いて挿入した（第１図参照）。かくして、二重la
c−プロモータに続いてtrp−プロモータを有し、それが
EcoR I部位により囲まれたプラスミド（pHGH207）が得
られた。このようにして得られたpHGH207をBamH Iで消
化し、これをEcoR Iで部分消化しそして最大断片を単離
した。したがって、この断片は完全なtrp−プロモータ
を有する。pBR322から最大のEcoR I−BamH I断片を単離
した。両断片を結合させ、この混合物を用いてＥ.coli2
94Tetrを形質転換した。Amprコロニーを単離し、その大
部分はpHGH207−１について示した構造のプラスミドを
有した。
は、二重lac−プロモータに続いて単一のtrp−プロモー
タを有するpHGH207から二重lac−プロモータを除去する
ことにより得られた。これは次のようにして行なった。
先ずtrp−プロモータ310bpDNA断片をpF I Ftrp−69［Go
eddel et al.,Nucleic Acids Research,８,4057（1
980）参照］からEcoR Iでの消化によって得た。この断
片を、EcoR Iにより開裂されたpHGH107に、T4DNAリガー
ゼを用いて挿入した（第１図参照）。かくして、二重la
c−プロモータに続いてtrp−プロモータを有し、それが
EcoR I部位により囲まれたプラスミド（pHGH207）が得
られた。このようにして得られたpHGH207をBamH Iで消
化し、これをEcoR Iで部分消化しそして最大断片を単離
した。したがって、この断片は完全なtrp−プロモータ
を有する。pBR322から最大のEcoR I−BamH I断片を単離
した。両断片を結合させ、この混合物を用いてＥ.coli2
94Tetrを形質転換した。Amprコロニーを単離し、その大
部分はpHGH207−１について示した構造のプラスミドを
有した。
制限酵素EcoR Iを用いてこのプラスミド（pHGH207−
１）を開裂させ、大きい方の断片すなわちベクターを６
％ゲルから単離した。このベクターDNA約0.1μｇに、上
記の完全lac−プロモータ／オペレータを含有する100bp
EcoR I断片の５倍モル過剰を加えた。これら断片をT4DN
A−リガーゼにより共有結合させ、この混合物を用いて
Ｅ.coli294を標準法により形質転換させた。細胞を、５
μg/mlのテトラサイクリンを含有するＸ−gal−インジ
ケータ プレートの上に接種した。pHGH107−11のプラ
スミド構造体を含む青色コロニーをピックアップした。
１）を開裂させ、大きい方の断片すなわちベクターを６
％ゲルから単離した。このベクターDNA約0.1μｇに、上
記の完全lac−プロモータ／オペレータを含有する100bp
EcoR I断片の５倍モル過剰を加えた。これら断片をT4DN
A−リガーゼにより共有結合させ、この混合物を用いて
Ｅ.coli294を標準法により形質転換させた。細胞を、５
μg/mlのテトラサイクリンを含有するＸ−gal−インジ
ケータ プレートの上に接種した。pHGH107−11のプラ
スミド構造体を含む青色コロニーをピックアップした。
B.Lac−PribnowボックスとLac−オペレータとを有する
配列の調製 約10μｇのpHGH107−11をHpa IIによって消化した。独
特の450bp断片を単離した。次いで、このDNAをPst Iに
よって消化し、得られた200bp断片を単離した（第２図
参照）。この断片は、転写の開始点に対し−19位に相当
する１個の付着性Hpa II末端を有する。lac−Pribnowボ
ックスの下流にはlac−オペレータ配列が続いている。
ヌクレオチド＋１がlac−オペレータ配列の最初の部分
に生ずる。この断片は、Pst I部位までHGHの配列をもっ
て終端する（Goeddal et al,上記、参照）。
配列の調製 約10μｇのpHGH107−11をHpa IIによって消化した。独
特の450bp断片を単離した。次いで、このDNAをPst Iに
よって消化し、得られた200bp断片を単離した（第２図
参照）。この断片は、転写の開始点に対し−19位に相当
する１個の付着性Hpa II末端を有する。lac−Pribnowボ
ックスの下流にはlac−オペレータ配列が続いている。
ヌクレオチド＋１がlac−オペレータ配列の最初の部分
に生ずる。この断片は、Pst I部位までHGHの配列をもっ
て終端する（Goeddal et al,上記、参照）。
C.Trp−35コンセンサス配列を有する配列の調製 trp−プロモータから誘導されたtac−プロモータの部分
を次のようにして得た。先ず310bpEcoR I断片を約10μ
ｇのpHGH207−１（上記のように調製）から単離した。
この断片は、trp−リプレッサ結合部位を含めて完全なt
rp−プロモータ配列を有するが、trpアテニュエータ（a
ttenuator）を欠如している。この310bp断片をTaq Iに
よって部分消化した。上流EcoR I部位から−22位のTaq
I部位に至る全配列を含むがtrp−Pribnowボックスを欠
如する240bp断片を６％ゲルから単離した。ベクターと
しては、pBR322から誘導された大きいEcoR I−Pst I断
片を使用した。これら３種の断片を混合し、標準技術を
用いて結合させ、一方向にのみ円形を形成させた。上記
と同様に形質転換と接種とを行なった後、第２図に示し
たようなプラスミドpBR322−Ptac13を有する幾つかの青
色コロニーが見出された。
を次のようにして得た。先ず310bpEcoR I断片を約10μ
ｇのpHGH207−１（上記のように調製）から単離した。
この断片は、trp−リプレッサ結合部位を含めて完全なt
rp−プロモータ配列を有するが、trpアテニュエータ（a
ttenuator）を欠如している。この310bp断片をTaq Iに
よって部分消化した。上流EcoR I部位から−22位のTaq
I部位に至る全配列を含むがtrp−Pribnowボックスを欠
如する240bp断片を６％ゲルから単離した。ベクターと
しては、pBR322から誘導された大きいEcoR I−Pst I断
片を使用した。これら３種の断片を混合し、標準技術を
用いて結合させ、一方向にのみ円形を形成させた。上記
と同様に形質転換と接種とを行なった後、第２図に示し
たようなプラスミドpBR322−Ptac13を有する幾つかの青
色コロニーが見出された。
D.pHGH807tac Iの構築 このプロモータは極めて強力であり、したがってその発
現は細胞に対し有害もしくは致死作用をもたらすことが
予想された。pBR322tac Iの場合と同様に、転写を破壊
アンピシリン遺伝子（destroyed amp gene）の方向に
指向させることにより、急速に減成（分解、degrade）
されることが予想され、したがって致死作用を失なうと
予想されるノンセンサ蛋白質（nonsense protein）を
生成させる。次いで、tac−プロモータをEcoR Iにより
切除し、そして300bp断片をpHGH207−１（ここからは、
trp−プロモータをEcoR I消化により除去されている）
から誘導されたベクターに挿入した。結合後、混合物を
用いてＥ.coliD1210（laciq）を形質転換させた。これ
ら細胞にはlac−リプレッサ蛋白質が過剰産生され、し
たがって天然のlac−オペレータ配列を有するtac−プロ
モータが抑制され、かくして如何なる遺伝子生産物の致
死的蓄積も生じない。得られたプラスミドを第２図に示
す（pHGH807 tac I）。Ptrp、Plac、Ptac IおよびPtac
IIの該当する配列を第３図に示す。
現は細胞に対し有害もしくは致死作用をもたらすことが
予想された。pBR322tac Iの場合と同様に、転写を破壊
アンピシリン遺伝子（destroyed amp gene）の方向に
指向させることにより、急速に減成（分解、degrade）
されることが予想され、したがって致死作用を失なうと
予想されるノンセンサ蛋白質（nonsense protein）を
生成させる。次いで、tac−プロモータをEcoR Iにより
切除し、そして300bp断片をpHGH207−１（ここからは、
trp−プロモータをEcoR I消化により除去されている）
から誘導されたベクターに挿入した。結合後、混合物を
用いてＥ.coliD1210（laciq）を形質転換させた。これ
ら細胞にはlac−リプレッサ蛋白質が過剰産生され、し
たがって天然のlac−オペレータ配列を有するtac−プロ
モータが抑制され、かくして如何なる遺伝子生産物の致
死的蓄積も生じない。得られたプラスミドを第２図に示
す（pHGH807 tac I）。Ptrp、Plac、Ptac IおよびPtac
IIの該当する配列を第３図に示す。
E.ハイブリッドrrn−lacプロモータおよびrac5−16プロ
モータの構築Ｅ .coliにおける８個のタンデムリボソーム−RNAプロモ
ータ（rrnB）の１つをコードするDNA断片を、次のよう
にして得られたプラスミドpKK3535から誘導した。pKH23
61の7.5kb挿入物と4.3kbプラスミドpBR322との両者のヌ
クレオチド配列が入手しうるので［Brosius et al.,P
roceedings of the National Academy of Scienc
es,77,201（1980）および75,4801ならびにSutcliff,（1
978）Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol.43,7
7］、pKK2361からの7.5kb BamH I断片をpBR322のBamH
I部位にサブクローンした。結合後、Ｅ.coli菌株HB101
を形質転換し、アンピシリン耐性かつテトラサイクリン
感受性のコロニーを予想サイズのプラスミドにつき選別
（スクリーン）した。12種の形質転換体のうち３種をさ
らにEcoR IによるそれらのプラスミドDNAの消化により
試験した。全ての場合、３種の断片（6.17kb、3.54kbお
よび2.15kb）が１％アガロースゲル上で分離されたの
で、このことはrrnBオペロンを有する7.5kb断片が同じ
方向性にてベクターpBR322中にクローン化されたことを
示している。３種の陽性コロニーのうち１種からの細胞
を増殖させ、プラスミドpKK3535を単離した。このプラ
スミドをHind IIIとSac IIとにより消化して、完全な２
個のrrnBタンデムプロモータを有する906bpDNA断片を得
た。この断片は１個のAlu I部位を有し、その酵素によ
り切断された。このAlu I部位にEcoR Iリンカーを前記
と同様に結合し（第１図参照）、次いでこの結合混合物
をHpa IIとEcoR Iとで消化した。この断片上の唯一のHp
a II部位は、第1rrnB−プロモータの転写開始部位に対
し−28位に見出された。かくして、130bpEcoR I−Hpa I
I断片が得られた。
モータの構築Ｅ .coliにおける８個のタンデムリボソーム−RNAプロモ
ータ（rrnB）の１つをコードするDNA断片を、次のよう
にして得られたプラスミドpKK3535から誘導した。pKH23
61の7.5kb挿入物と4.3kbプラスミドpBR322との両者のヌ
クレオチド配列が入手しうるので［Brosius et al.,P
roceedings of the National Academy of Scienc
es,77,201（1980）および75,4801ならびにSutcliff,（1
978）Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol.43,7
7］、pKK2361からの7.5kb BamH I断片をpBR322のBamH
I部位にサブクローンした。結合後、Ｅ.coli菌株HB101
を形質転換し、アンピシリン耐性かつテトラサイクリン
感受性のコロニーを予想サイズのプラスミドにつき選別
（スクリーン）した。12種の形質転換体のうち３種をさ
らにEcoR IによるそれらのプラスミドDNAの消化により
試験した。全ての場合、３種の断片（6.17kb、3.54kbお
よび2.15kb）が１％アガロースゲル上で分離されたの
で、このことはrrnBオペロンを有する7.5kb断片が同じ
方向性にてベクターpBR322中にクローン化されたことを
示している。３種の陽性コロニーのうち１種からの細胞
を増殖させ、プラスミドpKK3535を単離した。このプラ
スミドをHind IIIとSac IIとにより消化して、完全な２
個のrrnBタンデムプロモータを有する906bpDNA断片を得
た。この断片は１個のAlu I部位を有し、その酵素によ
り切断された。このAlu I部位にEcoR Iリンカーを前記
と同様に結合し（第１図参照）、次いでこの結合混合物
をHpa IIとEcoR Iとで消化した。この断片上の唯一のHp
a II部位は、第1rrnB−プロモータの転写開始部位に対
し−28位に見出された。かくして、130bpEcoR I−Hpa I
I断片が得られた。
ハイブリッドプロモータのlac−部分はtac−プロモータ
すなわち200bpHpa II−Pst断片の構築に関する前記のも
のと正確に同じであった。前記したように、Hpa II末端
はlac−プロモータの転写開始部位に対し−19位に存在
する。rrn−プロモータは極めて強力であり、Ｅ.coliの
最も効率的なプロモータであって、Ｅ.coliの高増殖速
度を保持するのに必要な多量のリボソームRNAを合成さ
せる。通常、このプロモータは、翻訳されないRNA種の
合成を指令する。もしこのプロモータを翻訳可能なメッ
センジャRNAを合成するように強制すれば、これは細胞
を死滅させるであろう。したがって、ハイブリッドrrn
−lacプロモータの構築の際、このプロモータを抑制状
態に保ちながら構築することが重要であった。
すなわち200bpHpa II−Pst断片の構築に関する前記のも
のと正確に同じであった。前記したように、Hpa II末端
はlac−プロモータの転写開始部位に対し−19位に存在
する。rrn−プロモータは極めて強力であり、Ｅ.coliの
最も効率的なプロモータであって、Ｅ.coliの高増殖速
度を保持するのに必要な多量のリボソームRNAを合成さ
せる。通常、このプロモータは、翻訳されないRNA種の
合成を指令する。もしこのプロモータを翻訳可能なメッ
センジャRNAを合成するように強制すれば、これは細胞
を死滅させるであろう。したがって、ハイブリッドrrn
−lacプロモータの構築の際、このプロモータを抑制状
態に保ちながら構築することが重要であった。
130bpEcoR I−Hpa II「Prrn」断片と200bpHpa II−Pst
「Plac」断片とを、tac−プロモータについて記載した
と全く同様にpBR322の大型EcoR I−Pst断片とを結合さ
せた。得られたプラスミドpBR322−Prrnlacを第５図に
示す。
「Plac」断片とを、tac−プロモータについて記載した
と全く同様にpBR322の大型EcoR I−Pst断片とを結合さ
せた。得られたプラスミドpBR322−Prrnlacを第５図に
示す。
rrn−lacハイブリッドの場合、Placの−19位とPrrnの−
28ヌクレオチドの結合が生ずる。Pribnowボックスと−3
5領域との間隔はずっと短かく、この種のプロモータで
は全く転写が開始しえない。かくして、pBR322−Prrnla
cにおいて２種のプロモータ断片が多量に得られた。プ
ラスミドDNA（20μｇ）をEcoR Iで消化し、190bp断片を
精製し、次いでHpa IIによって消化した。両断片、すな
わち130bp「Prrn」断片と60bp「Plac」断片とを精製し
た。130bp断片に、２個の自己相補的合成断片１および
２を結合させた。これらの配列は次の通りである： 結合とEcoR IおよびXho Iによる消化との後、約140bpの
DNA断片を単離した。
28ヌクレオチドの結合が生ずる。Pribnowボックスと−3
5領域との間隔はずっと短かく、この種のプロモータで
は全く転写が開始しえない。かくして、pBR322−Prrnla
cにおいて２種のプロモータ断片が多量に得られた。プ
ラスミドDNA（20μｇ）をEcoR Iで消化し、190bp断片を
精製し、次いでHpa IIによって消化した。両断片、すな
わち130bp「Prrn」断片と60bp「Plac」断片とを精製し
た。130bp断片に、２個の自己相補的合成断片１および
２を結合させた。これらの配列は次の通りである： 結合とEcoR IおよびXho Iによる消化との後、約140bpの
DNA断片を単離した。
同様にして60bp「Plac」断片を生成させたが、これは次
のような２つの自己相補的合成断片３および４を有し
た： 結合混合物をEcoR IとXho Iとで消化した後、70bp断片
を単離した。Hpa II末端に結合した合成リンカーを有す
ると共にXho IおよびEcoR Iの付着性末端を有するこれ
らの２つの断片を、EcoR IとXho Iとで開裂されたベク
ターPCVIに挿入した。ベクターPCVIの構築を示せば次の
通りである（第６図参照）。
のような２つの自己相補的合成断片３および４を有し
た： 結合混合物をEcoR IとXho Iとで消化した後、70bp断片
を単離した。Hpa II末端に結合した合成リンカーを有す
ると共にXho IおよびEcoR Iの付着性末端を有するこれ
らの２つの断片を、EcoR IとXho Iとで開裂されたベク
ターPCVIに挿入した。ベクターPCVIの構築を示せば次の
通りである（第６図参照）。
F.PCVIの構築 ４種の断片PP−１乃至PP−４をCren et al.の方法［N
ucleic Acids Research,８,2331（1980）］に従って
合成した。これら断片の合成は、適当な充分保護された
モノ−もしくはトリ−ブロック体の順次添加により、適
当な固体支持体（solid support）から達成された。サ
イクルは、オリゴチミンジリン酸（oligothymic dilic
acid）の合成（Crea et al.上記、参照）で記載さ
れたと同じ条件下で行なった。最終ポリマーを塩基（濃
NH3水溶液）と酸（80％AcOH水溶液）とで処理し、ポリ
マーをペレット化させ、そして上澄液を蒸発させて乾固
した。４％NH3水溶液中に溶解させた残渣をエーテルで
洗浄し、充分に脱保護した断片を単離するのに使用し
た。精製は、パーマフエースPermaphaseAAX上でのhplc
により行なった。ゲル電気泳動分析は、各断片すなわち
PP−１乃至PP−４が次のような正確なサイズを有するこ
とを示した： これら合成の自己相補的配列1,2,3および４を混合して
結合させた。混合物をHpa IIとCla Iとで開裂し、21bp
断片を精製しそしてCla Iで開裂したpBR322中に挿入し
た。pBR322のCla I部位がtet−プロモータ内に存在する
ので、挿入物を含有する宿主はtet−感受性であるため
容易に識別することができた。かくして、形質転換後、
細胞をamp−プレート上に接種した。これらのコロニー
をtet−プレート上に移植し、プラスミドDNAをtet−感
受性のものにつき分析した。得られたプラスミドを示
し、これをPCVIと呼ぶ（プロモータ・クローニング・ベ
クターＩ）。このベクターはtet−遺伝子の前部に６個
の独特な制限部位を有する。これらの部位のいずれかに
挿入されたプロモータは、有用なtet耐性を復帰するで
あろう。
ucleic Acids Research,８,2331（1980）］に従って
合成した。これら断片の合成は、適当な充分保護された
モノ−もしくはトリ−ブロック体の順次添加により、適
当な固体支持体（solid support）から達成された。サ
イクルは、オリゴチミンジリン酸（oligothymic dilic
acid）の合成（Crea et al.上記、参照）で記載さ
れたと同じ条件下で行なった。最終ポリマーを塩基（濃
NH3水溶液）と酸（80％AcOH水溶液）とで処理し、ポリ
マーをペレット化させ、そして上澄液を蒸発させて乾固
した。４％NH3水溶液中に溶解させた残渣をエーテルで
洗浄し、充分に脱保護した断片を単離するのに使用し
た。精製は、パーマフエースPermaphaseAAX上でのhplc
により行なった。ゲル電気泳動分析は、各断片すなわち
PP−１乃至PP−４が次のような正確なサイズを有するこ
とを示した： これら合成の自己相補的配列1,2,3および４を混合して
結合させた。混合物をHpa IIとCla Iとで開裂し、21bp
断片を精製しそしてCla Iで開裂したpBR322中に挿入し
た。pBR322のCla I部位がtet−プロモータ内に存在する
ので、挿入物を含有する宿主はtet−感受性であるため
容易に識別することができた。かくして、形質転換後、
細胞をamp−プレート上に接種した。これらのコロニー
をtet−プレート上に移植し、プラスミドDNAをtet−感
受性のものにつき分析した。得られたプラスミドを示
し、これをPCVIと呼ぶ（プロモータ・クローニング・ベ
クターＩ）。このベクターはtet−遺伝子の前部に６個
の独特な制限部位を有する。これらの部位のいずれかに
挿入されたプロモータは、有用なtet耐性を復帰するで
あろう。
G.PCVI中への140bp「Prrn」配列と70bp「Plac」配列の
挿入 プラスミドPCVIをXho IとEcoR Iとで開裂させ、大きい
ベクター断片を単離した。標準技術を用いて前記断片を
挿入した。挿入物を有するプラスミドのみが再閉鎖しう
るので、大部分のプラスミドは示したような構造を有し
た（PCVI−PrrnおよびPCVI−Plac）。このプラスミドを
増殖させ、単離しそして140bpと70bpとの２つの断片を
単離した。これらを混合し、結合させ、そしてコンカテ
マーをEcoR IとXho Iとで開裂させた。この消化物を６
％ゲル上にて分離し、210bp断片を回収した。この断片
をpHGH207−１（このものからはtrp−プロモータをEcoR
Iにより除去した。上記参照）から誘導されたベクター
に挿入した。
挿入 プラスミドPCVIをXho IとEcoR Iとで開裂させ、大きい
ベクター断片を単離した。標準技術を用いて前記断片を
挿入した。挿入物を有するプラスミドのみが再閉鎖しう
るので、大部分のプラスミドは示したような構造を有し
た（PCVI−PrrnおよびPCVI−Plac）。このプラスミドを
増殖させ、単離しそして140bpと70bpとの２つの断片を
単離した。これらを混合し、結合させ、そしてコンカテ
マーをEcoR IとXho Iとで開裂させた。この消化物を６
％ゲル上にて分離し、210bp断片を回収した。この断片
をpHGH207−１（このものからはtrp−プロモータをEcoR
Iにより除去した。上記参照）から誘導されたベクター
に挿入した。
かくして、−28/−19結合部に21bp挿入物を有するハイ
ブリッドプロモータが構築される。Pribnowボックスと
−35配列との間の間隔は長過ぎるため活性でない。この
プロモータを活性化させるため、すなわちPribnowボッ
クスと−35配列との適正間隔を確立させるため、プラス
ミドpHGH−PrrnlacをSac IとXba Iとで開裂した。付着
性末端を酵素S1によって除去し、平滑末端を結合させ
た。得られた「rac」−プロモータ［pHGH−Prrnlac（第
６図）参照］の配列をlacおよびrrnBプロモータと共に
下記に示す： H.Tac IIハイブリッドプロモータの構築 lac−リプレッサにより制御されかつtrp−リプレッサに
は影響されないような他のハイブリッドプロモータを構
築した。trp−プロモータにおいては、trp−リプレッサ
結合部位がPribnowボックスと重複し（Siebenlist、上
記）この場合さらにHpa I部位（gTTAAC）をも特定する
（第７図参照）。このHpa I部位より下流の配列を合成D
NA断片で交換した。かくして、trp−リプレッサ結合部
位が破壊された。プラスミドpHG207−１をHpa IとXba I
とで開裂し、そして42bpの合成DNA断片を挿入した。こ
の合成断片の配列は、lac−UV5プロモータ／オペレータ
の相同領域に見出されるものと同一である。すなわち、
trp−Pribnowボックス（TTAACTA）の最初の2bpをlac−U
V5Pribnowボックス（TATAATG）の最後の5bpに結合させ
てハイブリッドPribnowボックス（TTTAATG）を得る。こ
のハイブリッドPribnowボックスの下流には５塩基対配
列が存在し、これはlac−UV5プロモータ／オペレータに
見出されるもとの同一である。この5bp配列は、天然lac
−オペレータの中核を囲む対称の領域の左腕である。こ
の5bp配列に続いて、lac−オペレータのコアを特定する
ヌクレオチドが存在する［Heyneker et al.,Nature,2
63,748（1976）］。lac−オペレータの次にはHind III
部位およびShine−Dalgarno配列が続き、これは16sリボ
ソームRNAと相同な４塩基対を有する。合成断片はXba I
部位をもって終端し、この部位によりHGH遺伝子に融合
される。かくして、Shine−Dalgarno領域は２つの異な
る制限部位で囲まれ、これらはこのプラスミドについて
独特である。tac IIプロモータ／オペレータは、天然la
c−オペレータを囲む対称領域の右腕を欠如することに
注目すべきである。したがって、得られるハイブリッド
プロモータpHGH907tac IIは、lc−プロモータに対応す
るオペレータと、Pirbnowボックス領域内で結合され
た、trp−プロモータの上流の５′−DNA配列を有する。
ブリッドプロモータが構築される。Pribnowボックスと
−35配列との間の間隔は長過ぎるため活性でない。この
プロモータを活性化させるため、すなわちPribnowボッ
クスと−35配列との適正間隔を確立させるため、プラス
ミドpHGH−PrrnlacをSac IとXba Iとで開裂した。付着
性末端を酵素S1によって除去し、平滑末端を結合させ
た。得られた「rac」−プロモータ［pHGH−Prrnlac（第
６図）参照］の配列をlacおよびrrnBプロモータと共に
下記に示す： H.Tac IIハイブリッドプロモータの構築 lac−リプレッサにより制御されかつtrp−リプレッサに
は影響されないような他のハイブリッドプロモータを構
築した。trp−プロモータにおいては、trp−リプレッサ
結合部位がPribnowボックスと重複し（Siebenlist、上
記）この場合さらにHpa I部位（gTTAAC）をも特定する
（第７図参照）。このHpa I部位より下流の配列を合成D
NA断片で交換した。かくして、trp−リプレッサ結合部
位が破壊された。プラスミドpHG207−１をHpa IとXba I
とで開裂し、そして42bpの合成DNA断片を挿入した。こ
の合成断片の配列は、lac−UV5プロモータ／オペレータ
の相同領域に見出されるものと同一である。すなわち、
trp−Pribnowボックス（TTAACTA）の最初の2bpをlac−U
V5Pribnowボックス（TATAATG）の最後の5bpに結合させ
てハイブリッドPribnowボックス（TTTAATG）を得る。こ
のハイブリッドPribnowボックスの下流には５塩基対配
列が存在し、これはlac−UV5プロモータ／オペレータに
見出されるもとの同一である。この5bp配列は、天然lac
−オペレータの中核を囲む対称の領域の左腕である。こ
の5bp配列に続いて、lac−オペレータのコアを特定する
ヌクレオチドが存在する［Heyneker et al.,Nature,2
63,748（1976）］。lac−オペレータの次にはHind III
部位およびShine−Dalgarno配列が続き、これは16sリボ
ソームRNAと相同な４塩基対を有する。合成断片はXba I
部位をもって終端し、この部位によりHGH遺伝子に融合
される。かくして、Shine−Dalgarno領域は２つの異な
る制限部位で囲まれ、これらはこのプラスミドについて
独特である。tac IIプロモータ／オペレータは、天然la
c−オペレータを囲む対称領域の右腕を欠如することに
注目すべきである。したがって、得られるハイブリッド
プロモータpHGH907tac IIは、lc−プロモータに対応す
るオペレータと、Pirbnowボックス領域内で結合され
た、trp−プロモータの上流の５′−DNA配列を有する。
第１図はプラスミドpHGH107−11の構築を示す図、第２
図はDNA断片の起源を示す図、第３図はtrpプロモータと
lacUV5プロモータと２種のtacハイブリッドプロモータ
／オペレータとのDNA配列を示す図、第４図は第２図に
示された構築のハイブリッドプロモータ／オペレータに
よりプロモートされるヒト生長ホルモン（HGH）生産の
説明図、第５図および第６図はpHGH−Prrnlacから得ら
れた発現プラスミドpHGH−Prac5−16の構築を示す図、
第７図はハイブリッドプロモータ／オペレータを有する
プラスミドpHGH907tac IIの構築を示す図、第８図はLac
−UV5とrrnBと短縮ハイブリッドプロモータ（Prrn−lac
I）と伸長ハイブリッドプロモータ（Prrn−lac II）と
活性ハイブリッドプロモータ（Prac5−16）との各DNA配
列を示す図である。
図はDNA断片の起源を示す図、第３図はtrpプロモータと
lacUV5プロモータと２種のtacハイブリッドプロモータ
／オペレータとのDNA配列を示す図、第４図は第２図に
示された構築のハイブリッドプロモータ／オペレータに
よりプロモートされるヒト生長ホルモン（HGH）生産の
説明図、第５図および第６図はpHGH−Prrnlacから得ら
れた発現プラスミドpHGH−Prac5−16の構築を示す図、
第７図はハイブリッドプロモータ／オペレータを有する
プラスミドpHGH907tac IIの構築を示す図、第８図はLac
−UV5とrrnBと短縮ハイブリッドプロモータ（Prrn−lac
I）と伸長ハイブリッドプロモータ（Prrn−lac II）と
活性ハイブリッドプロモータ（Prac5−16）との各DNA配
列を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】ハイブリッドプロモータ／オペレータの下
流に位置する組換えDNA断片の大腸菌DNA依存性RNAポリ
メラーゼによる転写を指令することができるハイブリッ
ドプロモータ／オペレータであって、以下の要素（ａ）
および（ｂ）、 （ａ） 組換えDNA断片の上流に位置し、誘発により抑
制の解除が可能であり、第１強度を示すことができるプ
ロモータ／オペレータ配列と、 （ｂ） （ａ）のプロモータ／オペレータ配列の上流に
機能的に位置する、該（ａ）の配列とは異なる起源のプ
ロモータであって、より大きい強度を持つ第２のプロモ
ータの−35コンセンサス配列と該−35コンセンサス配列
の上流のDNAとを含む断片 とからなり、ここに、要素（ａ）および（ｂ）は（ｂ）
の該−35コンセンサス配列と、（ａ）のプロモータ／オ
ペレータ配列のプリブノーボックスとの間の領域で共有
結合的に連結されているハイブリッドプロモータ／オペ
レータ。 - 【請求項２】要素（ａ）と（ｂ）とがその相補的制限部
位を介して結合されていることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載のハイブリッドプロモータ／オペレー
タ。 - 【請求項３】該相補的制限部位が合成的に誘導されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載のハイブリ
ッドプロモータ／オペレータ。 - 【請求項４】誘発により抑制が解除され得るオペレータ
を含む該プロモータ／オペレータがlacプロモータ／オ
ペレータであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載のハイブリッドプロモータ／オペレータ。 - 【請求項５】trpプロモータの−22位より上流のDNA配列
に結合したlacプロモータ／オペレータの−19位より下
流のDNA配列を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
４項に記載のハイブリッドプロモータ／オペレータ。 - 【請求項６】lacプロモータの−11位より下流のDNA配列
を模倣して作成されたDNA配列に結合した、trpプロモー
ターの−12位より上流のDNA配列を含むことを特徴とす
る特許請求の範囲第４項に記載のハイブリッドプロモー
タ／オペレータ。 - 【請求項７】lacプロモータの−19位より下流のDNA配列
とrrnプロモータの−28位より上流のDNA配列とがヌクレ
オチド塩基の合成DNA配列を介して結合されていること
を特徴とする特許請求の範囲第４項に記載のハイブリッ
ドプロモータ／オペレータ。 - 【請求項８】その発現がハイブリッドプロモータ／オペ
レータの下流に位置する組換えDNA断片の大腸菌DNA依存
性RNAポリメラーゼによる転写を指令することができる
ハイブリッドプロモータ／オペレータであって、以下の
要素（ａ）および（ｂ）、 （ａ） 組換えDNA断片の上流に位置し、誘発により抑
制の解除が可能であり、第１強度を示すことができるプ
ロモータ／オペレータ配列と、 （ｂ） （ａ）のプロモータ／オペレータ配列の上流に
機能的に位置する、該（ａ）の配列とは異なる起源のプ
ロモータであって、より大きい強度を持つ第２のプロモ
ータの−35コンセンサス配列と該−35コンセンサス配列
の上流のDNAとを含む断片 とからなり、ここに、要素（ａ）および（ｂ）は（ｂ）
の該−35コンセンサス配列と、（ａ）のプロモータ／オ
ペレータ配列のプリブノーボックスとの間の領域で共有
結合的に連結されているハイブリッドプロモータ／オペ
レータの制御下にある異種遺伝子挿入物を含んでいる複
製可能な発現ベヒクル。 - 【請求項９】pHGH807−tac I、pBR322−Prrnlac、pHGH
−Prac5−16およびpHGH907−tac IIよりなる群から選択
される特許請求の範囲第８項記載のプラスミド。 - 【請求項１０】ハイブリッドプロモータ／オペレータの
下流に位置する組換えDNA断片の大腸菌DNA依存性RNAポ
リメラーゼによる転写を指令することができるハイブリ
ッドプロモータ／オペレータであって、以下の要素
（ａ）および（ｂ）、 （ａ） 組換えDNA断片の上流に位置し、誘発により抑
制の解除が可能であり、第１強度を示すことができるプ
ロモータ／オペレータ配列と、 （ｂ） （ａ）のプロモータ／オペレータ配列の上流に
機能的に位置する、該（ａ）の配列とは異なる起源のプ
ロモータであって、より大きい強度を持つ第２のプロモ
ータの−35コンセンサス配列と該−35コンセンサス配列
の上流のDNAとを含む断片 とからなり、ここに、要素（ａ）および（ｂ）は（ｂ）
の該−35コンセンサス配列と、（ａ）のプロモータ／オ
ペレータ配列のプリブノーボックスとの間の領域で共有
結合的に連結されているハイブリッドプロモータ／オペ
レータの指令下での異種ポリペプチドをコードしている
遺伝子の発現により、該異種ポリペプチドを生産するこ
とができる大腸菌。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26430681A | 1981-05-18 | 1981-05-18 | |
| US32817481A | 1981-12-07 | 1981-12-07 | |
| US338397 | 1982-01-11 | ||
| US264306 | 1982-01-11 | ||
| US328174 | 1982-01-11 | ||
| US06/338,397 US4551433A (en) | 1981-05-18 | 1982-01-11 | Microbial hybrid promoters |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57194790A JPS57194790A (en) | 1982-11-30 |
| JPH0797990B2 true JPH0797990B2 (ja) | 1995-10-25 |
Family
ID=27401690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57082962A Expired - Lifetime JPH0797990B2 (ja) | 1981-05-18 | 1982-05-17 | 微生物ハイブリツドプロモ−タ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0067540B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0797990B2 (ja) |
| AU (1) | AU553901B2 (ja) |
| CA (1) | CA1210347A (ja) |
| DE (1) | DE3276330D1 (ja) |
| DK (1) | DK170477B1 (ja) |
| IE (1) | IE53341B1 (ja) |
| IL (1) | IL65775A (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0753111B2 (ja) * | 1982-09-16 | 1995-06-07 | ベンツォン ファーマ エイ／エス | 条件非制御の複製挙動を持つプラスミド |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| US4912046A (en) * | 1983-06-27 | 1990-03-27 | Genentech, Inc. | Portable inducible control system |
| ATE60803T1 (de) * | 1983-06-27 | 1991-02-15 | Genentech Inc | Uebertragbare induzierbare kontrollsysteme, diese enthaltende expressionsvektoren, mit diesen transformierte mikroorganismen und ihre verwendung bei der expression von exogenem protein. |
| JPS6087792A (ja) * | 1983-09-23 | 1985-05-17 | ジェネックス・コーポレイション | 雑種制御領域 |
| US5162216A (en) * | 1983-09-23 | 1992-11-10 | Enzon Labs Inc. | Hybrid gene regulatory region operable in E. coli |
| JPS60221091A (ja) * | 1983-12-21 | 1985-11-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規プロモ−タ− |
| AU587176B2 (en) * | 1984-02-14 | 1989-08-10 | Mycogen Plant Science, Inc. | Transfer vector |
| US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| EP0165613B1 (en) * | 1984-06-22 | 1992-01-15 | Hitachi, Ltd. | Process for controlling culture of recombinants |
| DE3430683A1 (de) * | 1984-08-21 | 1986-03-06 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Synthetische regulationsregion |
| JPS6196998A (ja) * | 1984-10-16 | 1986-05-15 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | ヒトアポリポプロテインａ−ｉ様蛋白の産生方法 |
| HU194309B (en) * | 1984-11-26 | 1988-01-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing expressive vectors |
| GB8431818D0 (en) * | 1984-12-17 | 1985-01-30 | Bujard H | Expression control sequence |
| IT1208514B (it) * | 1985-03-19 | 1989-07-10 | Eniricerche Spa | Vettori plasmidici ad espressione in escherichia coli e/o bacillussubtilis. |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| ATE80913T1 (de) * | 1986-03-12 | 1992-10-15 | Int Minerals & Chem Corp | Hybride expressionsvektoren, deren herstellung und verwendungen. |
| DE3853932D1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-07-13 | Hoffmann La Roche | Hochreprimierbare Expressionskontrollsequenzen. |
| HU197595B (en) * | 1987-09-16 | 1989-04-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing expression vectors |
| DE68922546T2 (de) * | 1988-08-16 | 1995-11-09 | Otsuka Pharma Co Ltd | Gen-Regulationskassetten, Expressionsvektoren, die diese enthalten und Mikroorganismen, die mit diesen transformiert sind. |
| WO2000060103A2 (en) * | 1999-04-01 | 2000-10-12 | Monsanto Technology Llc | Dna construct comprising a cyanophage of cyanobacteria promoter and its use |
| US20020150979A1 (en) * | 2000-10-04 | 2002-10-17 | Naokazu Naitou | Process for producing a protein |
-
1982
- 1982-05-14 IL IL6577582A patent/IL65775A/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-05-17 AU AU83760/82A patent/AU553901B2/en not_active Expired
- 1982-05-17 JP JP57082962A patent/JPH0797990B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1982-05-17 IE IE117482A patent/IE53341B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-05-17 DK DK221282A patent/DK170477B1/da active
- 1982-05-18 CA CA000403215A patent/CA1210347A/en not_active Expired
- 1982-05-18 DE DE8282302532T patent/DE3276330D1/de not_active Expired
- 1982-05-18 EP EP19820302532 patent/EP0067540B1/en not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，［１（１９７９）Ｐ．１０６−１１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE821174L (en) | 1982-11-18 |
| IL65775A (en) | 1985-05-31 |
| EP0067540A2 (en) | 1982-12-22 |
| IE53341B1 (en) | 1988-10-26 |
| AU553901B2 (en) | 1986-07-31 |
| AU8376082A (en) | 1982-11-25 |
| EP0067540A3 (en) | 1984-01-18 |
| DE3276330D1 (en) | 1987-06-19 |
| DK170477B1 (da) | 1995-09-11 |
| DK221282A (da) | 1983-01-07 |
| CA1210347A (en) | 1986-08-26 |
| EP0067540B1 (en) | 1987-05-13 |
| JPS57194790A (en) | 1982-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0797990B2 (ja) | 微生物ハイブリツドプロモ−タ | |
| US4551433A (en) | Microbial hybrid promoters | |
| CA1213539A (en) | Bacterial polypeptide expression employing tryptophan promoter-operator | |
| EP0075444B1 (en) | Methods and products for facile microbial expression of dna sequences | |
| US4711845A (en) | Portable temperature-sensitive control cassette | |
| KR870000701B1 (ko) | 인체 성장 호르몬의 제조방법 | |
| JPH0815440B2 (ja) | ヘテロローガスタンパク質の分泌およびペリプラズムタンパク質の回収 | |
| HU197349B (en) | Process for producing cloning vectors usable for the expression of growth hormones | |
| US4663283A (en) | Method of altering double-stranded DNA | |
| CA1327329C (en) | Recombinant diphtheria toxin fragments | |
| US5254463A (en) | Method for expression of bovine growth hormone | |
| JPS5951793A (ja) | 新規クロ−ニングビヒクル | |
| US4880910A (en) | Terminal methionyl bovine growth hormone and its use | |
| US5489529A (en) | DNA for expression of bovine growth hormone | |
| CA1242981A (en) | Portable temperature-sensitive control cassette | |
| FR2573773A1 (fr) | Vecteurs de replication et leur procede de production | |
| JPS59501243A (ja) | ベクタ− | |
| NO165555B (no) | Kunstig hybrid humant leukocytt-interferon-kodende dna-sekvens. |