JPH079380B2 - 光電変換部材の作製方法 - Google Patents

光電変換部材の作製方法

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JPH079380B2
JPH079380B2 JP2247877A JP24787790A JPH079380B2 JP H079380 B2 JPH079380 B2 JP H079380B2 JP 2247877 A JP2247877 A JP 2247877A JP 24787790 A JP24787790 A JP 24787790A JP H079380 B2 JPH079380 B2 JP H079380B2
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Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、光電変換機能材料に関し、特に光合成細菌等
から調製した光捕獲蛋白質複合体(PRU)や光合成反応
中心(RC)等の光反応性蛋白質を用いた光電変換部材の
作製方法に関する。
これらの光電変換部材は、通常少なくとも一方が透明電
極である電極対の間に挾んで光電変換素子として使用さ
れる。
[従来の技術] これまで、光合成細菌等の光合成機能を利用した光電変
換素子においては、光電変換層としてクロマトフォアが
用いられてきた。光合成細菌を超音波等で破砕し、遠心
分離して光合成器官を取出すと、クロマトフォアと呼ば
れる膜小胞が得られる。このクロマトフォアは、脂質二
重層からなる小胞に疎水性の蛋白質である光合成光捕獲
色素蛋白質複合体や酸化還元酵素、またその他の脂溶性
の電子伝達物質等が埋め込まれた生体由来のものであ
る。クロマトフォアにおいては、これらの蛋白質は生体
中で制御された方向性を失うことなく保持している。
光電変換機能を持つ蛋白質、すなわち光捕獲蛋白質複合
体や光合成反応中心だけを取出してその機能を利用しよ
うとする場合、クロマトフォアを界面活性剤で可溶化
し、目的の蛋白質をゲルろ過クロマトグラフィ等の手法
を用いて分離精製することにより、目的の蛋白質を得る
ことができる。これらの光捕獲蛋白質複合体(PRU)
や、光合成反応中心(RC)は、疎水性の膜蛋白質である
ため、水に安定して分散させるためには両親媒性である
界面活性剤が必要となる。これらの疎水性蛋白質は、界
面活性剤が結合した状態で水に分散する。しかしなが
ら、界面活性剤で分散させた状態の蛋白質水溶液を用い
て光電変換層を形成した場合、乾燥時にも界面活性剤が
残り、乾燥と共にその濃度は高くなり、蛋白質を変性さ
せる可能性がある。また、クロマトフォアにおいては、
生体中に制御された蛋白質の方向性をそのまま保持して
いるのに比べ、界面活性剤で分散した状態では蛋白質に
何ら方向性を与えることはできなくなる。
[発明が解決しようとする課題] 以上説明したように、界面活性剤で分散させた状態で光
反応性蛋白質を使用すると、光電変換層を形成した場
合、乾燥後に光電変換層に界面活性材が残る。このた
め、蛋白質の界面活性剤による変性が生じる可能性があ
る。
クロマトフォアにおいては、保持されている生体中に作
られた淡白質の方向性が、界面活性剤で可溶化すること
によって失われる。したがって、光電変換層での蛋白質
の方向性を積極的に制御することができない。
本発明の目的は、界面活性剤を残さずに光反応性蛋白質
を集めて光電変換部材を作製する方法を提供することで
ある。
本発明の他の目的は、蛋白質の方向性を積極的に制御で
きる光電変換部材の作製方法を提供することである。
[課題を解決するための手段] 本発明の光電変換部材の作製方法は、光反応機能を有す
る生体細胞から調製した光電変換機能を有する蛋白質を
リポソームに組込む工程を有する。
蛋白質をリポソームに組込む工程は、好ましくはクロマ
トフォアを界面活性剤で可溶化し目的の光電変換機能を
有する蛋白質を分離・精製し、また所定の脂質を界面活
性剤で可溶化し、両者を混合した後、透析することによ
って行なう。
[作用] 光電変換機能を有する蛋白質を、リポソームに組込むこ
とによって、界面活性剤を除去した状態で光電変換機能
を有する蛋白質を、水溶液中に分散させることが可能に
なる。
好ましくは、クロマトフォアを界面活性剤で可溶化し目
的の光電変換機能を有する蛋白質を分離・精製し、また
所定の脂質を界面活性剤で可溶化し、両者を混合した
後、透析することにより、界面活性剤は除去され、脂質
がリポソームを形成し、そのリポソームに光電変換機能
を有する蛋白質が組込まれる。この際、組込まれる蛋白
質の方向性が整う。
[実施例] 以下、光電変換素子の作製方法を説明する。光合成細菌
から調製したクロマトフォアを界面活性剤で可溶化し、
光捕獲蛋白質複合体(PRU)や、光合成反応中心(RC)
を分離精製する。
一方、フォスファチジルエタノールアミン(PE)や、フ
ォスファチジルコリン(PC)等の脂質を界面活性剤で可
溶化しておく。これらの蛋白質溶液と、脂質溶液とを混
合し、純水または緩衝溶液に透析することで界面活性剤
を除去し、疎水性の資質分子が互いに集まってリポソー
ムを形成する。また、疎水性の蛋白質膜がこの脂質の集
まりであるリポソームに組込まれる。この際、蛋白質は
脂質中に配向して組込まれる。この状態では、界面活性
剤を使うことなく水溶液中に蛋白質を安定して分散させ
ることができる。このリポソーム溶液を用いて透明電極
基板にリポソーム電着する。すなわち、方向性電荷を持
つリポソームに電界を印加することによって、電極に脂
質を含む目的の光電変換機能を有する蛋白質を整列させ
ることができる。このような電着によって、方向性を持
った光電変換部材を形成することができる。
以上の工程において用いる資質としては、フォスファチ
ジルエタノールアミン(PE)、フォスファチジルコリン
(PC)等の天然または人工の脂質を単体または組合わせ
で用いることができる。また、これらの脂質にステアリ
ン酸メチルエステル等の脂肪酸エステルを膜の極性制御
を目的として添加することにより、ガラス基板への付着
力の改善を行なうことができる。
リポソームに組込める光電変換機能を有する蛋白質とし
ては、紅色非硫黄光合成細菌(Rodopseudomonus viridi
s,Rhodobacter sphaeroides等)の光合成反応中心、光
捕獲蛋白質複合体を用いることができる。また、チトク
ロームbc1複合体と呼ばれる上述の蛋白質と対をなして
循環的な酸化還元を行なう蛋白質を同時に組込むことも
できる。
蛋白質以外では、キノン等の電子伝達物質として知られ
る脂溶性(疎水性)の添加物を脂質に添加することがで
きる。光電変換層の形成方法として、電着法を行なう
と、電界によって蛋白質が向きを整え、蛋白質の配向性
が向上する。組込んだ蛋白質が電圧印加やそれに伴う酸
化還元等に弱い場合は、ハケ塗り、スピンコート等の塗
布による膜形成を行なうこともできる。
以下光電変換部材の作製方法をより詳細に説明する。
RCリポソームの調製 紅色非硫黄光合成細菌(Rps.viridis)を超音波により
粉砕し、遠心分離によりクロマトフォア溶液を得た。
このクロマトフォア溶液を、界面活性剤ラウリルジメチ
ルアミンオキシド(LDAO、N,N−ジメチルドデシルアミ
ン N−オキサイド)で可溶化する。
たとえば、蛋白質溶液のpHを調製するため、燐酸緩衝液
(pH7.0)を10mM、クロマトフォアを最終濃度で光学密
度OD(波長1015nm)=50、LDAOを10%として、可溶化溶
液を作製する。
この可溶化溶液を遠心後、その上清をゲルろ過クロマト
グラフィにかけてLDAOで界面活性化した光合成反応中心
(LADO−RC)を調製した。その後、界面活性剤をデオキ
シコール酸(DOC)で置換した。たとえば、最終濃度0.3
%のDOCと最終濃度10mMの燐酸緩衝液(pH7.0)を混ぜ、
1,000倍量の溶液に透析して置換する。このようにし
て、DOC−RCが調製された。
別にDOCで可溶化しておいた大腸菌由来のPE溶液を、DOC
−RC溶液とPE/RC=100/1となるように混合した。KOHでp
H7.8に調製したHEPES(N−2−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−N′−2−エタンサルフォニックアシッド)緩
衝液(K−HEPES)を作った。この緩衝液に透析し、界
面活性剤を除去した。透析の工程でPEの脂質が集まり、
リポソームを形成する。このリポソームにRCの蛋白質が
組込まれ、プロテオリポソームが調製された。
PRUリポソームの調製 紅色非硫黄光合成細菌(Rps.viridis)のクロマトフォ
ア溶液を界面活性剤Triton X−100で可溶化する。ク
ロマトフォアは波長1015nmでの光学濃度OD=50の濃度、
pHを6.0に調製した酢酸ナトリウム緩衝液を20mM、界面
活性剤Triton X−100を5%、PRUの収率を上げるため
のKCl1Mを、それぞれ最終濃度として混合しクロマトフ
ォア可溶化溶液を調製した。このクロマトフォア溶液を
遠心後、その上清をゲルろ過クロマトグラフィにかけて
PRUを調製した。
その後界面活性材をCHAPS(3−[(3−コルアミドプ
ロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルフォ
ネート)に置換した。たとえば、CHAPSを最終濃度0.1
%、酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を10mM、LiClを150
mMを用い、限外ろ過法を用いて上記溶液による希釈・濃
縮を繰返して置換した。なお、LiClは過溶化力を増し、
界面活性材の濃度を下げることのできる機能を有する。
PRUを濃縮・精製するには、CHAPS−PRU溶液を400,000xg
150分遠心し、沈降したPRUを再びCHAPSを含む溶液に分
散することによって行なえる。
PE溶液の調製は、アセトン洗浄済みのPEを最終濃度とし
て10mg/ml、DOCを最終濃度として5mg/ml、K−HEPES(p
H7.8)を最終濃度として50mM混合し、超音波をかけて溶
解させることにより行なう。
濃縮・精製したCHAPS−PRUとPE溶液とをPE/PRU=1000/1
となるように混合し、その後K−HEPES緩衝液に透析す
ることによって界面活性剤を除去する。
透析によって界面活性剤は除去され、リポソームが調製
される。ここで、K−HEPES(pH7.8)を最終濃度で10m
M、1,000倍量の上記溶液に透析して置換した。
リポソーム状態でのPRUおよびRCの配向性を以下のよう
にして評価した。
ロドシュードモナスビリディスのRCには、結合性チトク
ロームCが存在する。第1図(A)に示すように、RC11
が脂質二重層10に組込まれる際、チトクロームCが二重
層の内側に配置される場合(11b)と、二重層の外側に
配置される場合(11a)がある。アスコルビン酸で還元
した時、アスコルビン酸は二重層を通れないので、内側
のチトクロームCは還元されない。界面活性剤Tritonで
脂質を可溶化すると、第1図(B)に示すように二重層
が壊れ、全てのチトクロームCを還元できる。このリポ
ソーム破壊前後のチトクロームの酸化還元差スペクトル
を比較することで配向性を評価した。
フェリシアン化カリウム(K3Fe(CN))で全てのチト
クロームを完全に酸化させた後、アスコルビン酸を加
え、リポソームで外側に向かって配向するRC(第1図
(A)の11a)に結合するチトクロームのみを還元し、
スペクトルを測定した。その後、Triton X−100を加
え、リポソームを破壊し、全てのチトクローム(第1図
(B)の11)を還元してスペクトルを測定した。両者の
スペクトルにおける558nmのチトクロームの吸収強度を
比較することにより、リポソーム内でのPRU、またはRC
の配向性を見積ったところ、80%以上がチトクローム側
をリポソームの外側に向けて配向していることがわかっ
た。
リポソームの電着と素子の作製 ガラス等の透明基板上にITO(インジウム−錫酸化物)
の薄膜を形成し、透明電極基板を作製した。この透明電
極基板の透明電極上約1mmの間隔に、Au電極を配置し、
電極間にRCリポソーム溶液またはPRUリポソーム溶液を
注ぎ込む。この状態で透明電極を正、Au電極を負の極性
として約3.25Vの電圧を約3分間印加した。この直流電
圧印加によってリポソームは電着される。電着後、表面
上のAu電極を除去し、リポソーム電着膜を乾燥した。乾
燥後リポソーム電着膜を設けた透明基板を真空蒸着層に
設置し、Au膜を厚さ約250Å真空蒸着した。その後、素
子を取出し、ITO電極およびAu電極にリード線を接続し
て光応答素子を作製した。
第2図(A)に、この光応答素子の構造を概略的に示
す。
ガラス基板1の上にITO電極2が形成されており、このI
TO電極2の上にリポソーム電着膜3が形成されている。
なお、ITO電極2は、2つの部分に分割されている。リ
ポソーム電着膜3上に、Au対向電極4が形成され、ITO
電極2の一方と接続される。2つの電極部分にリード線
5が銀ペースト等によって接続される。このように形成
した光応答素子に対し、ガラス基板側から光を入射する
ことによって、リード線5間から光電応答を取出す。応
答の取り出し方はリード5間に直接電圧計を接続しても
よいし、リード線5間に抵抗を接続し、その抵抗両端の
電圧を測定することによって流れる電流値を測定しても
よい。
第2図(B)は、このようにして光照射によって検出さ
れる電圧波形および電流波形を概略的に示すグラフであ
る。なお、光パルスとして50msecの場合を示したが、光
パルスの幅は10msecから約5secの間で変化させた。照射
励起光としては、850nmにピーク波長を持つLEDのパルス
光を用いた。
以上説明したように、PRUまたはRCのように光電変換機
能を有する蛋白質を用い、光電変換部材を作製すること
ができた。この光電変換部材は以下のような特徴を有す
る。
1.光電変換部材に界面活性剤が残らない。
界面活性剤は透析により除去することができる。このた
め、乾燥後の光電変換部材には界面活性剤が残らない。
その結果蛋白質を変性させる可能性が減少する。
2.蛋白質を配向させることができる。
PRUやRCのような光電変換機能を有する蛋白質をリポソ
ームに組込むことにより、界面活性剤で分散した時に一
旦失われた方向性(配向)を取戻すことができる。たと
えば、80%以上配向が回復される。
3.蛋白質固有の電化の片寄りを利用して電着により固定
化をすることができる。
蛋白質は電荷の分布を有する。この蛋白質の電荷分布を
利用して蛋白質を配向させることができる。脂質膜に配
向性を持って蛋白質が取込まれると、この蛋白質の電荷
の片寄りを利用して電解によって脂質膜を配向させ、固
定化することができる。
以上実施例に沿って本発明を説明したが、本発明はこれ
らに制限されるものではない。たとえば、種々の変更、
改良、組み合わせ等が可能なことは当業者に自明であろ
う。
[発明の効果] 以上説明したように、本発明によれば、光電変換機能を
有する蛋白質をリポソームに組込むことにより界面活性
剤を除去し、蛋白質を配向させた光電変換部材を作製す
ることができる。
また、電着を用いて光電変換機能を有する蛋白質を固定
化する時は、蛋白質の配向性をさらに向上させることが
できる。
【図面の簡単な説明】
第1図(A)、(B)は、蛋白質の配向性を説明するた
めの概略図、 第2図(A)、(B)は、本発明の実施例により作製さ
れる光電変換素子を説明するための図であり、第2図
(A)は構成を示す断面図、第2図(B)は特性を示す
グラフである。 図において、 1……ガラス基板 2……ITO電極 3……リポソーム電着膜 4……Au対向電極 5……リード線

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】光合成細菌であるクロマトフォアを界面活
    性剤で可溶化し、分離・精製して、可溶化した光電変換
    機能を有する蛋白質を得る第1の工程と、 所定の脂質を界面活性剤で可溶化し、可溶化した脂質を
    得る第2の工程と、 前記第1の工程で得られた可溶化した蛋白質に前記第2
    の工程で得られた可溶化した脂質を添加、混合する第3
    の工程と、 第3の工程で得られた混合液を透析することにより界面
    活性剤を除去し、前記添加した脂質でリポソームを再構
    成し、前記光電変換機能を有する蛋白質を再構成するリ
    ポソームに組み込む第4の工程と を有することを特徴とする光を電気信号に変換する光電
    変換部材の作製方法。
  2. 【請求項2】前記蛋白質を組み込んだリポソームを含む
    溶液を電極基板上に電着させて、光電変換層を形成する
    工程を含む請求項1に記載の光電変換部材の作製方法。
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