JPH0792164A - ホモバニリン酸とバニルマンデル酸の同時定量のための方法及び装置 - Google Patents
ホモバニリン酸とバニルマンデル酸の同時定量のための方法及び装置Info
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- JPH0792164A JPH0792164A JP26534393A JP26534393A JPH0792164A JP H0792164 A JPH0792164 A JP H0792164A JP 26534393 A JP26534393 A JP 26534393A JP 26534393 A JP26534393 A JP 26534393A JP H0792164 A JPH0792164 A JP H0792164A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 フローインジェクション分析法により酸化剤
を充填した固体反応器を使用してホモバニリン酸とバニ
ルマンデル酸を同時に定量する高感度蛍光定量方法にお
いて、試料をｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イオンを含
むアンモニアアルカリ溶液からなるキャリヤー溶液と混
合し、輸送してホモバニリン酸とバニルマンデル酸の両
者を定量すると共に、更に、試料をｐＨ１１．５〜１
２．５の塩化物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液か
らなるキャリヤー溶液と混合し、輸送してホモバニリン
酸を定量することを特徴とするホモバニリン酸とバニル
マンデル酸の定量方法、及び該方法に用いるフローイン
ジェクション分析装置。 【効果】 神経芽細胞腫のスクリーニング法としての尿
中ホモバニリン酸とバニルマンデル酸の同時定量に際
し、迅速、簡便で廃液も少なく、低コストな方法及び装
置が提供される。
を充填した固体反応器を使用してホモバニリン酸とバニ
ルマンデル酸を同時に定量する高感度蛍光定量方法にお
いて、試料をｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イオンを含
むアンモニアアルカリ溶液からなるキャリヤー溶液と混
合し、輸送してホモバニリン酸とバニルマンデル酸の両
者を定量すると共に、更に、試料をｐＨ１１．５〜１
２．５の塩化物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液か
らなるキャリヤー溶液と混合し、輸送してホモバニリン
酸を定量することを特徴とするホモバニリン酸とバニル
マンデル酸の定量方法、及び該方法に用いるフローイン
ジェクション分析装置。 【効果】 神経芽細胞腫のスクリーニング法としての尿
中ホモバニリン酸とバニルマンデル酸の同時定量に際
し、迅速、簡便で廃液も少なく、低コストな方法及び装
置が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】小児癌の１種である神経芽細胞腫
の簡便、迅速で安価なスクリーニングのためのホモバニ
リン酸とバニルマンデル酸の同時定量のための方法及び
装置に関する。
の簡便、迅速で安価なスクリーニングのためのホモバニ
リン酸とバニルマンデル酸の同時定量のための方法及び
装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】神経芽細胞腫は、小児期の悪性固形腫瘍
の１種であり、早期発見できれば、良好な予後が期待で
きる。従って、現在、乳児健康診断の一環として尿検査
によるマススクリーニングが実施されている。
の１種であり、早期発見できれば、良好な予後が期待で
きる。従って、現在、乳児健康診断の一環として尿検査
によるマススクリーニングが実施されている。
【０００３】この腫瘍の発症の指標となる物質は尿中の
ホモバニリン酸（以下「ＨＶＡ」という。）とバニルマ
ンデル酸（以下「ＶＭＡ」という。）の含量であり、分
析方法として、これまでに、ジアゾ化試薬との反応によ
るＶＭＡの発色を測定する定性分析法（ＶＭＡスポット
テスト）や高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）を
使用した定量方法を用いた方法等が知られている。しか
しながら、ジアゾ化ＶＭＡの発色による方法では一部の
ＶＭＡ非排泄型の神経芽細胞腫を検出できないという問
題がある。
ホモバニリン酸（以下「ＨＶＡ」という。）とバニルマ
ンデル酸（以下「ＶＭＡ」という。）の含量であり、分
析方法として、これまでに、ジアゾ化試薬との反応によ
るＶＭＡの発色を測定する定性分析法（ＶＭＡスポット
テスト）や高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）を
使用した定量方法を用いた方法等が知られている。しか
しながら、ジアゾ化ＶＭＡの発色による方法では一部の
ＶＭＡ非排泄型の神経芽細胞腫を検出できないという問
題がある。
【０００４】また、ＨＰＬＣ法を用いる方法としては、
特開平２−２２７６６５号公報等に分別定量方法が開示
されているが、分析に長時間を要し、多数の検査試料を
分析する必要があり、迅速性が要求されるマススクリー
ニングには不適であることや、装置が高価であること、
分析用カラム消耗時の交換等、装置の保守管理が煩雑で
あること、連続して分析する場合、使用する試薬の量が
多く、廃液も大量になること等の問題があった。
特開平２−２２７６６５号公報等に分別定量方法が開示
されているが、分析に長時間を要し、多数の検査試料を
分析する必要があり、迅速性が要求されるマススクリー
ニングには不適であることや、装置が高価であること、
分析用カラム消耗時の交換等、装置の保守管理が煩雑で
あること、連続して分析する場合、使用する試薬の量が
多く、廃液も大量になること等の問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、神経芽細胞
腫のスクリーニング法としての尿中ＨＶＡとＶＭＡの同
時定量に際し、迅速、簡便で廃液も少なく、低コストな
方法及び装置を提供することを目的とする。
腫のスクリーニング法としての尿中ＨＶＡとＶＭＡの同
時定量に際し、迅速、簡便で廃液も少なく、低コストな
方法及び装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これまで
にフローインジェクション分析法（連続流れ分析法又は
フロー注入分析法とも呼ばれる。）（以下「ＦＩＡ法」
という。）を用いることにより、ＨＶＡ、ＶＭＡの各々
の分析が可能であるという知見を得、その条件を検討し
てきた。即ち、アンモニアアルカリ条件下で酸化剤とＨ
ＶＡ及びＶＭＡとが反応する際に発生する蛍光強度が試
料中のＨＶＡ及びＶＭＡ濃度に比例することを見出し
た。その後、更に改良を加え、本発明を完成するに至っ
た。
にフローインジェクション分析法（連続流れ分析法又は
フロー注入分析法とも呼ばれる。）（以下「ＦＩＡ法」
という。）を用いることにより、ＨＶＡ、ＶＭＡの各々
の分析が可能であるという知見を得、その条件を検討し
てきた。即ち、アンモニアアルカリ条件下で酸化剤とＨ
ＶＡ及びＶＭＡとが反応する際に発生する蛍光強度が試
料中のＨＶＡ及びＶＭＡ濃度に比例することを見出し
た。その後、更に改良を加え、本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】本発明におけるＦＩＡ法とは、装置内を一
定の流速でキャリヤー溶液を流し、その過程で混合、反
応、検出を連続的に行う分析方法をいう。ＨＶＡ、ＶＭ
Ａの両物質は、アンモニアアルカリ溶液中で、酸化剤と
接触反応することにより酸化されて蛍光を発する。両物
質とも蛍光スペクトルは、ほぼ同じであり、Ｅｍ＝４０
０ｎｍ、Ｅｘ＝２３５ｎｍ及びＥｍ＝４１０ｎｍ、Ｅｘ
＝３００ｎｍ付近に極大値を示す。ここで前者は後者の
約１０倍の強度を示すが、他の有機化合物の発する蛍光
が妨害する可能性があり、Ｅｍ＝４１０ｎｍ、Ｅｘ＝３
００ｎｍの条件で蛍光強度を測定することによって、よ
り正確な定量が可能になる。
定の流速でキャリヤー溶液を流し、その過程で混合、反
応、検出を連続的に行う分析方法をいう。ＨＶＡ、ＶＭ
Ａの両物質は、アンモニアアルカリ溶液中で、酸化剤と
接触反応することにより酸化されて蛍光を発する。両物
質とも蛍光スペクトルは、ほぼ同じであり、Ｅｍ＝４０
０ｎｍ、Ｅｘ＝２３５ｎｍ及びＥｍ＝４１０ｎｍ、Ｅｘ
＝３００ｎｍ付近に極大値を示す。ここで前者は後者の
約１０倍の強度を示すが、他の有機化合物の発する蛍光
が妨害する可能性があり、Ｅｍ＝４１０ｎｍ、Ｅｘ＝３
００ｎｍの条件で蛍光強度を測定することによって、よ
り正確な定量が可能になる。
【０００８】また、この時の蛍光強度は、それぞれ試料
中の物質の量に比例するが、酸化剤との反応条件、特に
ｐＨの変化によりその強度は大きく異なる。実際に、図
１に示す装置を用い、キャリヤー溶液として０．０３Ｍ
塩化アンモニウムを添加した各種ｐＨの水酸化アンモニ
ウム水溶液を用いる以外は実施例１と同様の条件でＨＶ
Ａ及びＶＭＡを測定した結果、図３に示すように前記条
件で検出される蛍光強度は、ＨＶＡではｐＨ１０．６付
近で極大を示し、ＶＭＡではｐＨ９．６付近で極大を示
した。また、ｐＨ１１以上ではＨＶＡは蛍光強度を示す
が、ＶＭＡはほとんど示さなかった。
中の物質の量に比例するが、酸化剤との反応条件、特に
ｐＨの変化によりその強度は大きく異なる。実際に、図
１に示す装置を用い、キャリヤー溶液として０．０３Ｍ
塩化アンモニウムを添加した各種ｐＨの水酸化アンモニ
ウム水溶液を用いる以外は実施例１と同様の条件でＨＶ
Ａ及びＶＭＡを測定した結果、図３に示すように前記条
件で検出される蛍光強度は、ＨＶＡではｐＨ１０．６付
近で極大を示し、ＶＭＡではｐＨ９．６付近で極大を示
した。また、ｐＨ１１以上ではＨＶＡは蛍光強度を示す
が、ＶＭＡはほとんど示さなかった。
【０００９】従って、両者の分別定量を行うためには、
ＨＶＡ、ＶＭＡが共に蛍光強度を示す条件で両者の合計
の蛍光強度を測定し、更にＨＶＡのみが蛍光強度を示す
条件での測定値を別に求め、これらの測定値から両者の
定量を行えばよい。種々条件を検討した結果、ＦＩＡ法
で分析する場合、ｐＨ９．５〜１０．９、好ましくはｐ
Ｈ１０５〜１０．８で反応した場合にはＨＶＡ、ＶＭＡ
両者が蛍光を発し、その強度も最も強く、かつＨＶＡ、
ＶＭＡそれぞれの含量が異なる試料でも定量性に優れて
いた。
ＨＶＡ、ＶＭＡが共に蛍光強度を示す条件で両者の合計
の蛍光強度を測定し、更にＨＶＡのみが蛍光強度を示す
条件での測定値を別に求め、これらの測定値から両者の
定量を行えばよい。種々条件を検討した結果、ＦＩＡ法
で分析する場合、ｐＨ９．５〜１０．９、好ましくはｐ
Ｈ１０５〜１０．８で反応した場合にはＨＶＡ、ＶＭＡ
両者が蛍光を発し、その強度も最も強く、かつＨＶＡ、
ＶＭＡそれぞれの含量が異なる試料でも定量性に優れて
いた。
【００１０】また、ｐＨ１１．５〜１２．５、好ましく
はｐＨ１２．２〜１２．４ではＨＶＡのみが蛍光を発
し、ＶＭＡは蛍光を示さず、かつ、他の有機物による妨
害もなく、ＨＶＡの濃度と測定される蛍光強度の間には
良好な直線関係が得られた。
はｐＨ１２．２〜１２．４ではＨＶＡのみが蛍光を発
し、ＶＭＡは蛍光を示さず、かつ、他の有機物による妨
害もなく、ＨＶＡの濃度と測定される蛍光強度の間には
良好な直線関係が得られた。
【００１１】従って、ＦＩＡ法において、酸化反応及び
蛍光測定時のｐＨを前記の条件下で行い蛍光強度を測定
することにより両者を分別定量することができる。な
お、この際フローインジェクション分析（以下「ＦＩ
Ａ」という。）でキャリャー溶液として用いるアンモニ
アアルカリ溶液中に、例えば塩化アンモニウムや塩化カ
リウム、塩化ナトリウム等の塩化物イオンを与える化合
物を添加した溶液を使用することにより、蛍光検出時の
ベースラインが安定し、より再現性に優れた正確な測定
値が得られる。
蛍光測定時のｐＨを前記の条件下で行い蛍光強度を測定
することにより両者を分別定量することができる。な
お、この際フローインジェクション分析（以下「ＦＩ
Ａ」という。）でキャリャー溶液として用いるアンモニ
アアルカリ溶液中に、例えば塩化アンモニウムや塩化カ
リウム、塩化ナトリウム等の塩化物イオンを与える化合
物を添加した溶液を使用することにより、蛍光検出時の
ベースラインが安定し、より再現性に優れた正確な測定
値が得られる。
【００１２】前記のアンモニアアルカリ溶液中での酸化
剤との酸化反応と蛍光強度測定を以下に記載する方法で
行うことにより、従来のクロマトグラフ法のように分離
操作を伴うことなく同時分別定量を行うことができる。
また、本発明によれば、測定時間はＨＰＬＣ法に比べ１
／５程度の２〜３分と迅速であり、使用する試料も１試
料当り１ｍｌ以下と少なく、従って廃液量も少なくな
り、また有機溶媒を必要としない。
剤との酸化反応と蛍光強度測定を以下に記載する方法で
行うことにより、従来のクロマトグラフ法のように分離
操作を伴うことなく同時分別定量を行うことができる。
また、本発明によれば、測定時間はＨＰＬＣ法に比べ１
／５程度の２〜３分と迅速であり、使用する試料も１試
料当り１ｍｌ以下と少なく、従って廃液量も少なくな
り、また有機溶媒を必要としない。
【００１３】即ち、本発明は、以下の発明を包含する。 （１）ＦＩＡ法により酸化剤を充填した固体反応器を使
用してＨＶＡとＶＭＡを同時に定量する高感度蛍光定量
方法において、試料をｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イ
オンを含むアンモニアアルカリ溶液からなるキャリヤー
溶液と混合し、輸送してＨＶＡとＶＭＡの両者を定量す
ると共に、更に、試料をｐＨ１１．５〜１２．５の塩化
物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液からなるキャリ
ヤー溶液と混合し、輸送してＨＶＡを定量することを特
徴とするＨＶＡとＶＭＡの定量方法。 （２）ｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イオンを含むアン
モニアアルカリ溶液及びｐＨ１１．５〜１２．５の塩化
物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液が水酸化アンモ
ニウム及び塩化アンモニウムの水溶液である前記（１）
に記載の定量方法。 （３）（ａ）試料及びキャリヤー溶液を送液するための
送液ポンプと、（ｂ）試料溶液を入れるため切替えバル
ブが接続された試料ループと、（ｃ）キャリヤー溶液を
選択するための切替えバルブと、（ｄ）前記試料溶液を
入れるため切替えバルブが接続された試料ループと前記
キャリヤー溶液を選択するための切替えバルブとから送
液された溶液を混合するための混合器と、（ｅ）恒温槽
内で所定温度に加温される酸化剤を充填した試料酸化用
固体反応器と、（ｆ）蛍光検出器と、（ｇ）前記蛍光検
出器に接続された出力演算装置及び出力・記録装置と、
（ｈ）前記装置類を制御する制御装置とからなることを
特徴とするフローインジェクション分析装置（以下「Ｆ
ＩＡ装置」という。）。 （４）（ｅ）の試料酸化用固体反応器が、内径２〜６ｍ
ｍ、長さ２〜５ｃｍの反応器に二酸化マンガンが充填さ
れている前記（３）に記載のＦＩＡ装置。 （５）（ｂ）の試料ループが、内径０．３〜１．０ｍ
ｍ、長さ２０〜２００ｃｍであって、各々の試料ループ
の間隔が試料ループの長さの５倍以上である前記（３）
又は（４）に記載のＦＩＡ装置。 （６）前記（５）に記載のＦＩＡ装置を使用して請求項
１記載の定量方法を実施するに際し、キャリヤー溶液又
は試料液の送液量を１．０ｍｌ／分〜１．５ｍｌ／分に
調整することを特徴とするＨＶＡとＶＭＡの定量方法。
用してＨＶＡとＶＭＡを同時に定量する高感度蛍光定量
方法において、試料をｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イ
オンを含むアンモニアアルカリ溶液からなるキャリヤー
溶液と混合し、輸送してＨＶＡとＶＭＡの両者を定量す
ると共に、更に、試料をｐＨ１１．５〜１２．５の塩化
物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液からなるキャリ
ヤー溶液と混合し、輸送してＨＶＡを定量することを特
徴とするＨＶＡとＶＭＡの定量方法。 （２）ｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イオンを含むアン
モニアアルカリ溶液及びｐＨ１１．５〜１２．５の塩化
物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液が水酸化アンモ
ニウム及び塩化アンモニウムの水溶液である前記（１）
に記載の定量方法。 （３）（ａ）試料及びキャリヤー溶液を送液するための
送液ポンプと、（ｂ）試料溶液を入れるため切替えバル
ブが接続された試料ループと、（ｃ）キャリヤー溶液を
選択するための切替えバルブと、（ｄ）前記試料溶液を
入れるため切替えバルブが接続された試料ループと前記
キャリヤー溶液を選択するための切替えバルブとから送
液された溶液を混合するための混合器と、（ｅ）恒温槽
内で所定温度に加温される酸化剤を充填した試料酸化用
固体反応器と、（ｆ）蛍光検出器と、（ｇ）前記蛍光検
出器に接続された出力演算装置及び出力・記録装置と、
（ｈ）前記装置類を制御する制御装置とからなることを
特徴とするフローインジェクション分析装置（以下「Ｆ
ＩＡ装置」という。）。 （４）（ｅ）の試料酸化用固体反応器が、内径２〜６ｍ
ｍ、長さ２〜５ｃｍの反応器に二酸化マンガンが充填さ
れている前記（３）に記載のＦＩＡ装置。 （５）（ｂ）の試料ループが、内径０．３〜１．０ｍ
ｍ、長さ２０〜２００ｃｍであって、各々の試料ループ
の間隔が試料ループの長さの５倍以上である前記（３）
又は（４）に記載のＦＩＡ装置。 （６）前記（５）に記載のＦＩＡ装置を使用して請求項
１記載の定量方法を実施するに際し、キャリヤー溶液又
は試料液の送液量を１．０ｍｌ／分〜１．５ｍｌ／分に
調整することを特徴とするＨＶＡとＶＭＡの定量方法。
【００１４】図１に本発明のＦＩＡ装置の構成を示す。
本発明のＦＩＡ装置において、送液ポンプ（ａ）として
は、送液量が１．０ｍｌ／分〜１．５ｍｌ／分の条件で
運転ができるポンプであれば特に限定はないが、特に、
送液量が一定しており、脈流が少ないポンプを使用する
ことが試料中のＨＶＡとＶＭＡを正確に定量するために
は好ましい。
本発明のＦＩＡ装置において、送液ポンプ（ａ）として
は、送液量が１．０ｍｌ／分〜１．５ｍｌ／分の条件で
運転ができるポンプであれば特に限定はないが、特に、
送液量が一定しており、脈流が少ないポンプを使用する
ことが試料中のＨＶＡとＶＭＡを正確に定量するために
は好ましい。
【００１５】試料を入れるための試料ループ（ｂ）は、
内径０．３〜１．０ｍｍ、長さ２０〜２００ｃｍ程度の
チューブであればよく、材質としてはアルカリ耐性があ
るものが好ましい。例えば、金属、フッ素樹脂等が好適
に使用できる。また、ループが接続したバルブは通常使
用される切替えバルブであれば、いずれも問題なく使用
できる。例えば、本発明においては、８方バルブや１６
方バルブ等が使用できる。なお、２つの試料ループの間
隔は試料ループを１ｍとした場合には、試料ループの長
さの５倍以上である５ｍ以上あることが蛍光検出ピーク
を完全に分離するためには好ましい。但し、試料ループ
が１ｍ以下の場合には、試料ループの間隔は５ｍ前後と
することが好ましい。
内径０．３〜１．０ｍｍ、長さ２０〜２００ｃｍ程度の
チューブであればよく、材質としてはアルカリ耐性があ
るものが好ましい。例えば、金属、フッ素樹脂等が好適
に使用できる。また、ループが接続したバルブは通常使
用される切替えバルブであれば、いずれも問題なく使用
できる。例えば、本発明においては、８方バルブや１６
方バルブ等が使用できる。なお、２つの試料ループの間
隔は試料ループを１ｍとした場合には、試料ループの長
さの５倍以上である５ｍ以上あることが蛍光検出ピーク
を完全に分離するためには好ましい。但し、試料ループ
が１ｍ以下の場合には、試料ループの間隔は５ｍ前後と
することが好ましい。
【００１６】キャリヤー溶液を選択するための切替えバ
ルブ（ｃ）は、キャリヤー溶液の流路を切替えられるも
のであればいずれでもよく、送液ポンプ（ａ）で送液さ
れる流速に合わせて試料が混合器（ｄ）に到達する時に
同期して２種以上のキャリヤー溶液が切替えられて送液
される。また、切替えバルブ（ｃ）に（ｂ）と同様なル
ープを接続し、キャリャー溶液を充填して用いることも
できる。
ルブ（ｃ）は、キャリヤー溶液の流路を切替えられるも
のであればいずれでもよく、送液ポンプ（ａ）で送液さ
れる流速に合わせて試料が混合器（ｄ）に到達する時に
同期して２種以上のキャリヤー溶液が切替えられて送液
される。また、切替えバルブ（ｃ）に（ｂ）と同様なル
ープを接続し、キャリャー溶液を充填して用いることも
できる。
【００１７】混合器（ｄ）は、２系統の配管からの溶液
が送液中に混合できる構造を有しているものであればい
ずれでも使用できる。例えば、三又状のパイプ等を使用
できる。
が送液中に混合できる構造を有しているものであればい
ずれでも使用できる。例えば、三又状のパイプ等を使用
できる。
【００１８】試料酸化用固体反応器（ｅ）において、酸
化剤としては、例えば二酸化マンガン、ヘキサシアノ鉄
（ＩＩＩ）酸カリウム、二酸化鉛を使用できる。酸化剤
として二酸化マンガンを使用する場合、試料酸化用固体
反応器（ｅ）は、内径２〜６ｍｍ、好ましくは４ｍｍ程
度、長さ２〜５ｃｍ、好ましくは２〜３ｃｍであればよ
く、該反応器内には、酸化剤として、好ましくは１０〜
１００メッシュ程度、更に好ましくは２０メッシュの粒
状二酸化マンガンを充填して使用し、反応温度は２０〜
６０℃、好ましくは５０℃で酸化反応を行うことにより
良好な定量性が得られる。該反応器の内径が大きくなっ
たり及び／又は該反応器の長さが長くなると蛍光検出の
ピーク幅が広くなり、ピークの分離が悪くなる。また、
反応後のＨＶＡとＶＭＡの蛍光強度は、比較的変化が早
く、短時間で蛍光が減少するため、反応器（ｅ）と検出
器（ｆ）の間はできるだけ接近していることが好まし
い。
化剤としては、例えば二酸化マンガン、ヘキサシアノ鉄
（ＩＩＩ）酸カリウム、二酸化鉛を使用できる。酸化剤
として二酸化マンガンを使用する場合、試料酸化用固体
反応器（ｅ）は、内径２〜６ｍｍ、好ましくは４ｍｍ程
度、長さ２〜５ｃｍ、好ましくは２〜３ｃｍであればよ
く、該反応器内には、酸化剤として、好ましくは１０〜
１００メッシュ程度、更に好ましくは２０メッシュの粒
状二酸化マンガンを充填して使用し、反応温度は２０〜
６０℃、好ましくは５０℃で酸化反応を行うことにより
良好な定量性が得られる。該反応器の内径が大きくなっ
たり及び／又は該反応器の長さが長くなると蛍光検出の
ピーク幅が広くなり、ピークの分離が悪くなる。また、
反応後のＨＶＡとＶＭＡの蛍光強度は、比較的変化が早
く、短時間で蛍光が減少するため、反応器（ｅ）と検出
器（ｆ）の間はできるだけ接近していることが好まし
い。
【００１９】蛍光検出器（ｆ）と出力演算装置及び出力
・記録装置（ｇ）は、通常使用される装置であれば特に
制限はなく、測定波長としてはＥｍ＝４１０ｎｍ 、Ｅ
ｘ＝３００ｎｍで行うことが好ましい。前記装置類を制
御する制御装置（ｈ）は、一般に使用される装置であれ
ばいずれも使用できる。前記条件によれば、ＨＶＡとＶ
ＭＡを約３分という短時間で確実に分別して定量でき
る。
・記録装置（ｇ）は、通常使用される装置であれば特に
制限はなく、測定波長としてはＥｍ＝４１０ｎｍ 、Ｅ
ｘ＝３００ｎｍで行うことが好ましい。前記装置類を制
御する制御装置（ｈ）は、一般に使用される装置であれ
ばいずれも使用できる。前記条件によれば、ＨＶＡとＶ
ＭＡを約３分という短時間で確実に分別して定量でき
る。
【００２０】本発明においては、高ｐＨの条件下でＨＶ
Ａを定量した後、低ｐＨの条件下でＨＶＡとＶＭＡを定
量してもよいが、低ｐＨの条件下でＨＶＡとＶＭＡを定
量した後、高ｐＨの条件下でＨＶＡを定量した方が、ｐ
Ｈの調整のためのキャリヤー溶液の量が少なくて済むた
め好ましい。また、本発明において、吸光光度計を前記
装置に接続してＦＩＡを行うことにより、一般に神経芽
細胞腫マススクリーニングの際、濾紙等の吸収乾燥させ
た尿の抽出時の希釈率の指標となるクレアチニンの定量
も同時に行うことができる。また、前記の装置を用い、
Ｌ−チロシン、Ｌ−チラミン、Ｌ−ドーパ、ドーパミ
ン、エピネフリン等の尿中の共存成分を含有する溶液に
ＨＶＡ、ＶＭＡを添加して測定した結果は、前記５種の
共存成分を含有しない試料と測定される蛍光強度に変化
はなく、ピークの分離も良好であり、影響はなかった。
Ａを定量した後、低ｐＨの条件下でＨＶＡとＶＭＡを定
量してもよいが、低ｐＨの条件下でＨＶＡとＶＭＡを定
量した後、高ｐＨの条件下でＨＶＡを定量した方が、ｐ
Ｈの調整のためのキャリヤー溶液の量が少なくて済むた
め好ましい。また、本発明において、吸光光度計を前記
装置に接続してＦＩＡを行うことにより、一般に神経芽
細胞腫マススクリーニングの際、濾紙等の吸収乾燥させ
た尿の抽出時の希釈率の指標となるクレアチニンの定量
も同時に行うことができる。また、前記の装置を用い、
Ｌ−チロシン、Ｌ−チラミン、Ｌ−ドーパ、ドーパミ
ン、エピネフリン等の尿中の共存成分を含有する溶液に
ＨＶＡ、ＶＭＡを添加して測定した結果は、前記５種の
共存成分を含有しない試料と測定される蛍光強度に変化
はなく、ピークの分離も良好であり、影響はなかった。
【００２１】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものでは
ない。
【００２２】（実施例１） 標準試料の定量と分別定量 （１）試薬 ＨＶＡ標準溶液：ＨＶＡ（化学名：４−ヒドロキシ−３
−メトキシフェニル酢酸）を水に溶解し、１．０×１０
−３Ｍ溶液を調製した。これを適当に希釈して用いた。 ＶＭＡ標準溶液：ＶＭＡ（化学名：４−ヒドロキシ−３
−メトキシマンデル酸）を水に溶解し、１．０×１０
−３Ｍ溶液を調製した。これを適当に希釈して用いた。 二酸化マンガン：ナカライテスク社製粒状二酸化マンガ
ン（２０メッシュ）を用いた。 その他の試薬は特に断らないかぎり市販特級品を用い
た。
−メトキシフェニル酢酸）を水に溶解し、１．０×１０
−３Ｍ溶液を調製した。これを適当に希釈して用いた。 ＶＭＡ標準溶液：ＶＭＡ（化学名：４−ヒドロキシ−３
−メトキシマンデル酸）を水に溶解し、１．０×１０
−３Ｍ溶液を調製した。これを適当に希釈して用いた。 二酸化マンガン：ナカライテスク社製粒状二酸化マンガ
ン（２０メッシュ）を用いた。 その他の試薬は特に断らないかぎり市販特級品を用い
た。
【００２３】（２）固体反応器及び装置 粒状二酸化マンガンをガラスカラム（内径４ｍｍ、長さ
３０ｍｍ）に充填したものを試料酸化用固体反応器とし
て用いた。この反応器は使用後、アンモニア緩衝液を満
たした状態で保存した。 送液ポンプ：東京理化ＬＰ−１０００型及びサヌキ工業
ＤＭ２Ｍ−１０２４型 検出器：島津ＲＦ−５３５型蛍光検出器 記録計：理化電機Ｒ−２１型自記記録計 恒温槽：トーソーＲＥ−８０００型 インジェクター：日立製作所Ｋ−１６００型１６方バル
ブ及びサヌキ工業ＳＶＭ−６Ｍ２型６方バルブ
３０ｍｍ）に充填したものを試料酸化用固体反応器とし
て用いた。この反応器は使用後、アンモニア緩衝液を満
たした状態で保存した。 送液ポンプ：東京理化ＬＰ−１０００型及びサヌキ工業
ＤＭ２Ｍ−１０２４型 検出器：島津ＲＦ−５３５型蛍光検出器 記録計：理化電機Ｒ−２１型自記記録計 恒温槽：トーソーＲＥ−８０００型 インジェクター：日立製作所Ｋ−１６００型１６方バル
ブ及びサヌキ工業ＳＶＭ−６Ｍ２型６方バルブ
【００２４】（３）運転条件 試料ループ 内径０．５ｍｍ、長さ１ｍ 反応温度 ５０℃ 流速 １．０ｍｌ／分 検出用キャリヤー溶液 ｐＨ１０．８液（ＨＶＡとＶＭ
Ａの分析用） ０．３Ｍ水酸化アンモニウム水溶液 ０．０３Ｍ塩化アンモニウム添加 ｐＨ１２．２液（ＨＶＡの分析用） ５．０Ｍ水酸化アンモニウム水溶液 ０．０２４Ｍ塩化アンモニウム添加 検出波長 Ｅｍ＝４１０ｎｍ Ｅｘ＝３０
０ｎｍ
Ａの分析用） ０．３Ｍ水酸化アンモニウム水溶液 ０．０３Ｍ塩化アンモニウム添加 ｐＨ１２．２液（ＨＶＡの分析用） ５．０Ｍ水酸化アンモニウム水溶液 ０．０２４Ｍ塩化アンモニウム添加 検出波長 Ｅｍ＝４１０ｎｍ Ｅｘ＝３０
０ｎｍ
【００２５】（４）実験方法 二成分同時定量のためのフローシステムの概略を図１に
示す。チュービング及びコネクター等の配管は全てテフ
ロン製又はダイフロン製を用いた。試料溶液をＳ１、Ｓ
２ループに充填した後、１６方バルブと６方バルブを同
期して注入状態に切替えることにより試料及び試薬溶液
が注入され、数分後に分析シグナルが記録された。ＨＶ
Ａ４．０×１０−７Ｍ及びＶＭＡ３．２×１０−６Ｍを
含有する試料溶液を用いて本発明方法に従ってＨＶＡと
ＶＭＡを同時定量した結果を図２に示す。記録されたピ
ーク高さのうち、Ｈ２からＨＶＡが、またＨ２からＨＶ
Ａに相当するピーク高さ（Ｈ２）を差し引くことによっ
てＶＭＡがそれぞれ定量できる。図４にｐＨ１０．８の
キャリヤー溶液で測定した時のＨＶＡの検量線を示す。
図５にｐＨ１２．２のキャリヤー溶液で測定した時のＨ
ＶＡの検量線を示す。図６にｐＨ１０．８のキャリヤー
溶液で測定した時のＶＭＡの検量線を示す。
示す。チュービング及びコネクター等の配管は全てテフ
ロン製又はダイフロン製を用いた。試料溶液をＳ１、Ｓ
２ループに充填した後、１６方バルブと６方バルブを同
期して注入状態に切替えることにより試料及び試薬溶液
が注入され、数分後に分析シグナルが記録された。ＨＶ
Ａ４．０×１０−７Ｍ及びＶＭＡ３．２×１０−６Ｍを
含有する試料溶液を用いて本発明方法に従ってＨＶＡと
ＶＭＡを同時定量した結果を図２に示す。記録されたピ
ーク高さのうち、Ｈ２からＨＶＡが、またＨ２からＨＶ
Ａに相当するピーク高さ（Ｈ２）を差し引くことによっ
てＶＭＡがそれぞれ定量できる。図４にｐＨ１０．８の
キャリヤー溶液で測定した時のＨＶＡの検量線を示す。
図５にｐＨ１２．２のキャリヤー溶液で測定した時のＨ
ＶＡの検量線を示す。図６にｐＨ１０．８のキャリヤー
溶液で測定した時のＶＭＡの検量線を示す。
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、神経芽細胞腫のスクリ
ーニング法としての尿中ＨＶＡとＶＭＡの同時定量に際
し、迅速、簡便で廃液も少なく、低コストな方法及び装
置を提供することができる。
ーニング法としての尿中ＨＶＡとＶＭＡの同時定量に際
し、迅速、簡便で廃液も少なく、低コストな方法及び装
置を提供することができる。
【図１】本発明のＦＩＡ装置の構成を示す図である。
ａ 送液ポンプ ｂ 試料溶液を入れるため切替えバルブが接続された試
料ループ ｃ キャリヤー溶液を選択するための切替えバルブ ｄ 混合器 ｅ 試料酸化用固体反応器 ｆ 蛍光検出器 ｇ 出力演算装置及び出力・記録装置 ｈ 制御装置 Ｓ１，Ｓ２ 試料ループ Ｘ キャリヤー溶液（ｐＨ１０．８） Ｙ 両溶液が自動的に混合される部分
料ループ ｃ キャリヤー溶液を選択するための切替えバルブ ｄ 混合器 ｅ 試料酸化用固体反応器 ｆ 蛍光検出器 ｇ 出力演算装置及び出力・記録装置 ｈ 制御装置 Ｓ１，Ｓ２ 試料ループ Ｘ キャリヤー溶液（ｐＨ１０．８） Ｙ 両溶液が自動的に混合される部分
【図２】本発明方法に従ってＨＶＡとＶＭＡを同時定量
した結果を示す図である。
した結果を示す図である。
Ｈ１ ｐＨ１０．８のキャリヤー溶液で測定した時のＨ
ＶＡとＶＭＡのピーク Ｈ２ ｐＨ１２．２のキャリヤー溶液で測定した時のＨ
ＶＡのピーク
ＶＡとＶＭＡのピーク Ｈ２ ｐＨ１２．２のキャリヤー溶液で測定した時のＨ
ＶＡのピーク
【図３】各種ｐＨのキャリヤー溶液で測定した時のＨＶ
ＡとＶＭＡのピーク高さを示す図である。
ＡとＶＭＡのピーク高さを示す図である。
【図４】ｐＨ１０．８のキャリヤー溶液で測定した時の
ＨＶＡの検量線を示す図である。
ＨＶＡの検量線を示す図である。
【図５】ｐＨ１２．２のキャリヤー溶液で測定した時の
ＨＶＡの検量線を示す図である。
ＨＶＡの検量線を示す図である。
【図６】ｐＨ１０．８のキャリヤー溶液で測定した時の
ＶＭＡの検量線を示す図である
ＶＭＡの検量線を示す図である
Claims (6)
- 【請求項１】 フローインジェクション分析法により酸
化剤を充填した固体反応器を使用してホモバニリン酸と
バニルマンデル酸を同時に定量する高感度蛍光定量方法
において、試料をｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イオン
を含むアンモニアアルカリ溶液からなるキャリヤー溶液
と混合し、輸送してホモバニリン酸とバニルマンデル酸
の両者を定量すると共に、更に、試料をｐＨ１１．５〜
１２．５の塩化物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液
からなるキャリヤー溶液と混合し、輸送してホモバニリ
ン酸を定量することを特徴とするホモバニリン酸とバニ
ルマンデル酸の定量方法。 - 【請求項２】 ｐＨ９．５〜１０．９の塩化物イオンを
含むアンモニアアルカリ溶液及びｐＨ１１．５〜１２．
５の塩化物イオンを含むアンモニアアルカリ溶液が水酸
化アンモニウム及び塩化アンモニウムの水溶液である請
求項１記載の定量方法。 - 【請求項３】 （ａ）試料及びキャリヤー溶液を送液す
るための送液ポンプと、（ｂ）試料溶液を入れるため切
替えバルブが接続された試料ループと、（ｃ）キャリヤ
ー溶液を選択するための切替えバルブと、（ｄ）前記試
料溶液を入れるため切替えバルブが接続された試料ルー
プと前記キャリヤー溶液を選択するための切替えバルブ
とから送液された溶液を混合するための混合器と、
（ｅ）恒温槽内で所定温度に加温される酸化剤を充填し
た試料酸化用固体反応器と、（ｆ）蛍光検出器と、
（ｇ）前記蛍光検出器に接続された出力演算装置及び出
力・記録装置と、（ｈ）前記装置類を制御する制御装置
とからなることを特徴とするフローインジェクション分
析装置。 - 【請求項４】 （ｅ）の試料酸化用固体反応器が、内径
２〜６ｍｍ、長さ２〜５ｃｍの反応器に二酸化マンガン
が充填されている請求項３記載のフローインジェクショ
ン分析装置。 - 【請求項５】 （ｂ）の試料ループが、内径０．３〜
１．０ｍｍ、長さ２０〜２００ｃｍであって、各々の試
料ループの間隔が試料ループの長さの５倍以上である請
求項３又は４記載のフローインジェクション分析装置。 - 【請求項６】 請求項５記載のフローインジェクション
分析装置を使用して請求項１記載の定量方法を実施する
に際し、キャリヤー溶液又は試料液の送液量を１．０ｍ
ｌ／分〜１．５ｍｌ／分に調整することを特徴とするホ
モバニリン酸とバニルマンデル酸の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26534393A JPH0792164A (ja) | 1993-09-20 | 1993-09-20 | ホモバニリン酸とバニルマンデル酸の同時定量のための方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26534393A JPH0792164A (ja) | 1993-09-20 | 1993-09-20 | ホモバニリン酸とバニルマンデル酸の同時定量のための方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0792164A true JPH0792164A (ja) | 1995-04-07 |
Family
ID=17415864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26534393A Pending JPH0792164A (ja) | 1993-09-20 | 1993-09-20 | ホモバニリン酸とバニルマンデル酸の同時定量のための方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0792164A (ja) |
-
1993
- 1993-09-20 JP JP26534393A patent/JPH0792164A/ja active Pending
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