JPH0773511B2 - 微生物菌数測定法 - Google Patents
微生物菌数測定法Info
- Publication number
- JPH0773511B2 JPH0773511B2 JP31321686A JP31321686A JPH0773511B2 JP H0773511 B2 JPH0773511 B2 JP H0773511B2 JP 31321686 A JP31321686 A JP 31321686A JP 31321686 A JP31321686 A JP 31321686A JP H0773511 B2 JPH0773511 B2 JP H0773511B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell membrane
- lysing agent
- microorganisms
- measuring
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は食品、医薬品、化粧品、水等の中に存在する微
生物の菌数の迅速測定法に関する。食品、医薬品、化粧
品等の製造、品質管理のためにはこれら検体中に含まれ
る少量の微生物の菌数を短時間に測定することが求めら
れる。
生物の菌数の迅速測定法に関する。食品、医薬品、化粧
品等の製造、品質管理のためにはこれら検体中に含まれ
る少量の微生物の菌数を短時間に測定することが求めら
れる。
（従来の技術） 短時間に微生物の菌数を測定する方法として、４−メチ
ル−ウンベリフェロン誘導体（以下、4MU−誘導体と略
す。）及び、７−アミノ−４−メチルクマリン誘導体
（以下、AMC−誘導体と略す。）を検体中に含まれる微
生物の酵素で水解させ、生成する４−メチル−ウンベリ
フェロン（以下、4MUと略す。）及び７−アミノ−４−
メチルクマリン（以下、AMCと略す。）を蛍光光度計で
測定する方法が知られている（特開昭57−144995）。
ル−ウンベリフェロン誘導体（以下、4MU−誘導体と略
す。）及び、７−アミノ−４−メチルクマリン誘導体
（以下、AMC−誘導体と略す。）を検体中に含まれる微
生物の酵素で水解させ、生成する４−メチル−ウンベリ
フェロン（以下、4MUと略す。）及び７−アミノ−４−
メチルクマリン（以下、AMCと略す。）を蛍光光度計で
測定する方法が知られている（特開昭57−144995）。
この方法において、菌体あたりの酵素活性を高め菌検出
感度を上げる目的で、菌体の破壊法としてトルエンなど
の有機溶媒の添加、超音波処理或はフレンチプレスなど
の物理的破壊リゾチームなどの酵素的破壊などを行うこ
とは、知られている。
感度を上げる目的で、菌体の破壊法としてトルエンなど
の有機溶媒の添加、超音波処理或はフレンチプレスなど
の物理的破壊リゾチームなどの酵素的破壊などを行うこ
とは、知られている。
（発明が解決しようとする問題点） 従来の技術では、検体1g或は1ml当り104個以上の微生物
がいるときには、短時間（３時間以内）で測定すること
が出来る。しかし、これ以下の菌数の検体中の微生物菌
数を測定するには測定前に培養を行い菌数を増やさない
と出来なかった。またこの条件で測定出来る菌の種類は
限られており特に細菌類では多くのものが検体中に105
〜106個以上いないと短時間では測定出来なかった。
がいるときには、短時間（３時間以内）で測定すること
が出来る。しかし、これ以下の菌数の検体中の微生物菌
数を測定するには測定前に培養を行い菌数を増やさない
と出来なかった。またこの条件で測定出来る菌の種類は
限られており特に細菌類では多くのものが検体中に105
〜106個以上いないと短時間では測定出来なかった。
（問題点を解決する為の手段） 上記問題点を解決するために、種々検討を行ったところ
微生物を非蛍光物質に対し、微生物のもつ酵素を作用さ
せて蛍光物質を生成せしめ、この蛍光物質を測定するこ
とにより、微生物菌数を測定する方法において該微生物
の細胞膜溶解剤単独又はリゾチームと細胞膜溶解剤を添
加する方法を実施することにより、短時間で高感度に微
生物数を測定することができた。
微生物を非蛍光物質に対し、微生物のもつ酵素を作用さ
せて蛍光物質を生成せしめ、この蛍光物質を測定するこ
とにより、微生物菌数を測定する方法において該微生物
の細胞膜溶解剤単独又はリゾチームと細胞膜溶解剤を添
加する方法を実施することにより、短時間で高感度に微
生物数を測定することができた。
（発明の効果） 従来よりも多くの種類の微生物を検体1g或は1ml当り104
個以下で或は104個で測定することができることを知っ
た。
個以下で或は104個で測定することができることを知っ
た。
細胞膜溶解剤単独又はリゾチームと細胞膜溶解剤を添加
することによって、菌体内の酵素が溶出し、一菌体あた
りの酵素活性が増大し、微生物の検出感度が高まった。
することによって、菌体内の酵素が溶出し、一菌体あた
りの酵素活性が増大し、微生物の検出感度が高まった。
本発明における微生物とは、食品、水、医薬品等に存在
する細菌ならびに真菌である。
する細菌ならびに真菌である。
本発明における非蛍光物質とは、４−メチルウンベリフ
ェロン誘導体（以下4MU誘導体）と、７−アミノ−４−
メチル−クマリン誘導体（以下、AMC誘導体と略す）で
ありこれらの１種或は２種以上添加する4MU−誘導体は
一般式〔１〕で示されるものでＸとしては糖類、アルコ
ール類、無機酸類などであり、該溶液或はけん濁液中に
含まれる微生物の加水分解酵素により水解されることを
防げないものであればよい。
ェロン誘導体（以下4MU誘導体）と、７−アミノ−４−
メチル−クマリン誘導体（以下、AMC誘導体と略す）で
ありこれらの１種或は２種以上添加する4MU−誘導体は
一般式〔１〕で示されるものでＸとしては糖類、アルコ
ール類、無機酸類などであり、該溶液或はけん濁液中に
含まれる微生物の加水分解酵素により水解されることを
防げないものであればよい。
AMC−誘導体は、一般式〔１〕で示されるものでＲとし
ては分子中の水素の一又は二以上が置換され又は置換さ
れていないアルキル基、アリル基、アラルキル基および
複素環基であり、該溶液又はけん濁液中に含まれる微生
物の加水分解酵素により水解されることを防げないもの
であればよい。
ては分子中の水素の一又は二以上が置換され又は置換さ
れていないアルキル基、アリル基、アラルキル基および
複素環基であり、該溶液又はけん濁液中に含まれる微生
物の加水分解酵素により水解されることを防げないもの
であればよい。
本発明における微生物菌数の測定法とは、一定量の検体
に、4MU誘導体及びAMC誘導体を１種又は２種以上を添加
し、25℃ないし60℃に保ち生成された７−アミノ−４−
メチルクマリンを測定することにより成る微生物菌数の
測定法である。検体に含まれる微生物の菌数が蛍光強度
と相関することに基づいて検体中の微生物の菌数を測定
するものである。
に、4MU誘導体及びAMC誘導体を１種又は２種以上を添加
し、25℃ないし60℃に保ち生成された７−アミノ−４−
メチルクマリンを測定することにより成る微生物菌数の
測定法である。検体に含まれる微生物の菌数が蛍光強度
と相関することに基づいて検体中の微生物の菌数を測定
するものである。
微生物の菌数を測定する検体は、飲食品、医薬品、化粧
品、飲料水など固体状、液状のもののいずれでもよい。
飲食品としては、固形調味料や乾燥食品のような固形
物、野菜サラダなどの生野菜や動物性の肉が含まれてい
るもの、一部水分を含むペースト状調味料などのもの、
さしみなどの生鮮魚貝類、ハムや蓄肉などの蓄産製品な
どが含まれる。固形物を含んでいる検体の場合には、ワ
ーニングブレンダー、ミキサーなどにより検体中の微生
物が死滅しない程度に固形物を微細粒子にホモゲナイズ
すれば液状のものと同一に扱うことができる。
品、飲料水など固体状、液状のもののいずれでもよい。
飲食品としては、固形調味料や乾燥食品のような固形
物、野菜サラダなどの生野菜や動物性の肉が含まれてい
るもの、一部水分を含むペースト状調味料などのもの、
さしみなどの生鮮魚貝類、ハムや蓄肉などの蓄産製品な
どが含まれる。固形物を含んでいる検体の場合には、ワ
ーニングブレンダー、ミキサーなどにより検体中の微生
物が死滅しない程度に固形物を微細粒子にホモゲナイズ
すれば液状のものと同一に扱うことができる。
この様に調整した該溶液或はけん濁液を遠心分離し、沈
殿部に4MU誘導体及びAMC誘導体を１種或は２種以上添加
する。
殿部に4MU誘導体及びAMC誘導体を１種或は２種以上添加
する。
添加量は該誘導体が該溶液或はけん濁液に溶解する最大
量まで可能であり本発明においては通常10-5M添加す
る。
量まで可能であり本発明においては通常10-5M添加す
る。
この時、細胞膜溶解剤１種或は２種以上又はリゾチーム
と細胞膜溶解剤を１種或は２種以上添加する。細胞膜溶
解剤とはトリブチルチン、トリプロピルチン、デカノシ
ル−Ｎ−メチルグルカシド又はこれらの塩である。添加
濃度はトリブチルチン、トリプロピルチン又はこれらの
塩は１〜100μg/ml望ましくは１〜10μg/mlデカノシル
−Ｎ−メチルグルカシド又はこれらの塩は、10〜1000μ
g/ml望ましくは、100〜1000μg/mlである。
と細胞膜溶解剤を１種或は２種以上添加する。細胞膜溶
解剤とはトリブチルチン、トリプロピルチン、デカノシ
ル−Ｎ−メチルグルカシド又はこれらの塩である。添加
濃度はトリブチルチン、トリプロピルチン又はこれらの
塩は１〜100μg/ml望ましくは１〜10μg/mlデカノシル
−Ｎ−メチルグルカシド又はこれらの塩は、10〜1000μ
g/ml望ましくは、100〜1000μg/mlである。
次に25ないし60℃で30分ないし２時間程度保温する。こ
の保温後、反応液中に生成されるAMC或は4MUの蛍光量を
定量する。検体中に含まれる微生物菌数と蛍光量は比例
するので、予め求められている相関に基づいて該溶液或
はけん濁液の蛍光量から検体中の微生物の菌数を求め
る。
の保温後、反応液中に生成されるAMC或は4MUの蛍光量を
定量する。検体中に含まれる微生物菌数と蛍光量は比例
するので、予め求められている相関に基づいて該溶液或
はけん濁液の蛍光量から検体中の微生物の菌数を求め
る。
4.実施例 実施例１ 表１に示した菌株を肉エキス１％、ペプトン１％、NaCl
0.5％、Agar1.5％を含有するpH7.0の平板培地で17〜24h
r培養し、生理食塩水にけん濁し、106コ/ml程度の菌液
を作った。この1mlを試験管10本に分注し、4MU−P,4MU
−Glu,Arg−MCA,Leu−MCAを各10-5M含有するpH7.0の のバルビトールバッファーを3ml加え表１に示した菌体
破壊法を行った。次に、40℃で２時間保温した後pH11.0
の グリシンバッファーを1ml添加した後、蛍光光度計（島
津製作所製RF−520型）を用い励起波長350nm、蛍光波長
450nmの条件下で、蛍光強度を測定し、菌体破壊を行な
わなかった時の蛍光強度を100にした時の各破壊法の蛍
光強度を示した。
0.5％、Agar1.5％を含有するpH7.0の平板培地で17〜24h
r培養し、生理食塩水にけん濁し、106コ/ml程度の菌液
を作った。この1mlを試験管10本に分注し、4MU−P,4MU
−Glu,Arg−MCA,Leu−MCAを各10-5M含有するpH7.0の のバルビトールバッファーを3ml加え表１に示した菌体
破壊法を行った。次に、40℃で２時間保温した後pH11.0
の グリシンバッファーを1ml添加した後、蛍光光度計（島
津製作所製RF−520型）を用い励起波長350nm、蛍光波長
450nmの条件下で、蛍光強度を測定し、菌体破壊を行な
わなかった時の蛍光強度を100にした時の各破壊法の蛍
光強度を示した。
表１に示したように、リゾチーム単独の場合、効果のあ
る菌の種類は限られていた。またトルエンの場合は阻害
を示す場合が多くソニック処理は、ほとんど効果がなか
った。
る菌の種類は限られていた。またトルエンの場合は阻害
を示す場合が多くソニック処理は、ほとんど効果がなか
った。
しかし、細胞膜溶解剤単独の場合は、ほとんどの菌で効
果がみられた。またリゾチームと併用すると、さらに効
果が倍増した。したがって、より少ない菌で、蛍光が測
定されるようになるため、細胞膜溶解剤単独又はリゾチ
ームと細胞膜溶解剤を添加すれば検出感度が上がること
がいえる。
果がみられた。またリゾチームと併用すると、さらに効
果が倍増した。したがって、より少ない菌で、蛍光が測
定されるようになるため、細胞膜溶解剤単独又はリゾチ
ームと細胞膜溶解剤を添加すれば検出感度が上がること
がいえる。
実施例２ 市販の焼売を10g秤量し、生理食塩水90mlを加えストマ
ッカーを用いて均一化した後、115℃10分オートクレー
プをかけ殺菌した。これを10ml試験管にとり、生理食塩
水にけん濁したバシルスパミルスの菌体を104〜105個加
えた。3000rpmで10分間遠心分離し、上澄液を除去し
た。管底の沈殿部に実施例１で示した酵素基質液を3ml
加え、表１に示した様な処理を行った。40℃で２時間保
温した後、 のpH11.0のグリシンバッファーを1ml添加し、3000rpmで
10分間遠心分離を行い、上澄液の蛍光強度を実施例１と
同様の方法で測定した。また対照系として、検体に菌体
を加えないものを同様のフローを行い、試料系との差を
求めた。どの菌数によって蛍光が検出されたかを表２に
示した 表２に示したように、細胞膜溶解剤とリゾチームを添加
した時は５×104コ/gの菌の添加で蛍光が検出された。
ッカーを用いて均一化した後、115℃10分オートクレー
プをかけ殺菌した。これを10ml試験管にとり、生理食塩
水にけん濁したバシルスパミルスの菌体を104〜105個加
えた。3000rpmで10分間遠心分離し、上澄液を除去し
た。管底の沈殿部に実施例１で示した酵素基質液を3ml
加え、表１に示した様な処理を行った。40℃で２時間保
温した後、 のpH11.0のグリシンバッファーを1ml添加し、3000rpmで
10分間遠心分離を行い、上澄液の蛍光強度を実施例１と
同様の方法で測定した。また対照系として、検体に菌体
を加えないものを同様のフローを行い、試料系との差を
求めた。どの菌数によって蛍光が検出されたかを表２に
示した 表２に示したように、細胞膜溶解剤とリゾチームを添加
した時は５×104コ/gの菌の添加で蛍光が検出された。
リゾチームや細胞膜溶解剤単独の場合は105コ/gの菌の
添加で検出された。細胞膜溶解剤とリゾチームを併用す
ることによって効果が増大した。
添加で検出された。細胞膜溶解剤とリゾチームを併用す
ることによって効果が増大した。
Claims (2)
- 【請求項１】微生物を非蛍光物質に対し、微生物のもつ
酵素を作用させて、蛍光物質を生成せしめ、この蛍光物
質を測定することにより、微生物菌数を測定する方法に
おいて、該微生物の細胞膜溶解剤単独又はリゾチームと
細胞膜溶解剤を添加することを特徴とする微生物菌数測
定方法。 - 【請求項２】細胞膜溶解剤がトリブチルチン、トリプロ
ピルチン、デカノシル−Ｎ−メチルグルカミド又はこれ
らの塩より成る群から選ばれる１以上の細胞膜溶解剤で
ある特許請求の範囲第１項記載の微生物菌数測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31321686A JPH0773511B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 微生物菌数測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31321686A JPH0773511B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 微生物菌数測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63167799A JPS63167799A (ja) | 1988-07-11 |
| JPH0773511B2 true JPH0773511B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=18038508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31321686A Expired - Lifetime JPH0773511B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 微生物菌数測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0773511B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6081457B2 (ja) | 2012-06-13 | 2017-02-15 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の特定物質を検出する方法 |
| NZ721261A (en) | 2013-12-18 | 2017-09-29 | Asahi Chemical Ind | Method for detecting coliform bacteria contained in milk |
| DK3085770T3 (en) | 2013-12-18 | 2019-01-07 | Asahi Chemical Ind | Method for detecting staphylococci in milk |
-
1986
- 1986-12-29 JP JP31321686A patent/JPH0773511B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63167799A (ja) | 1988-07-11 |
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