JPH0767645A

JPH0767645A - 単子葉植物における遺伝子発現のための組換えプロモーター

Info

Publication number: JPH0767645A
Application number: JP3113549A
Authority: JP
Inventors: David I Last; アイ．ラストデイビッド; Richard I S Brettell; アイ．エス．ブレッテルリチャード; Douglas A Chamberlain; エー．チャンバレンダグラス; Philip J Larkin; ジェイ．ラーキンフィリップ; Ellen L Marsh; エル．マーシュエレン; James W Peacock; ダブリュー．ピーコックジェームズ; Elizabeth S Dennis; エス．デニスエリザベス; Mark R Olive; アール．オリーブマーク; Jeffrey G Ellis; ジー．エリスジェフリー
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Lubrizol Genetics Inc
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Mycogen Plant Science Inc
Priority date: 1990-05-18
Filing date: 1991-05-17
Publication date: 1995-03-14
Anticipated expiration: 2017-09-17
Also published as: EP0459643B1; AU643521B2; CN1063506A; AU7710791A; DE69132366D1; DE69132366T2; EP0459643A3; ATE195554T1; EP0459643A2; CA2042831C; CA2042831A1; ES2149758T3; JP3325589B2; DK0459643T3

Abstract

(57)【要約】【目的】単子葉植物細胞で、植物で発現可能な構造遺
伝子の発現を促進するための、組換えプロモーター分子
を提供する。【構成】ＡＲＥおよびＯＣＳエレメントからなる群よ
り選択される複数のエンハンサーエレメント、植物で発
現可能な切形のプロモーター、および植物で発現可能な
構造遺伝子中の転写開始部位と翻訳開始部位との間に位
置するイントロンとして天然に見いだされるヌクレオチ
ド配列を有する組換えプロモーター分子。その組換えプ
ロモーター分子を有するベクター。そのベクターを含む
細菌細胞およびそのベクターで形質転換された単子葉植
物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、１９９０年５月１８日に出願され
た米国特許出願Ｎｏ．０７／５２５８６６に基づく。

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明は、一般に植物の分子生物
学の領域に関し、特に、エンハンサー配列と、遺伝子の
発現が促進されるようにプロモーター領域内に組換えら
れたその配列とに関する。本発明は単子葉植物において
所望の構造遺伝子の発現を選択的に促進することを可能
にする。

【０００３】

【従来の技術】植物の形質転換方法を開発するときに考
慮される最も重要な要因の一つは、標的細胞中で、導入
された遺伝子の高レベルの発現を確実にするプロモータ
ーの利用可能性である。例えば、抗生物質耐性マーカー
をコードするＤＮＡを有する植物細胞の形質転換の場
合、形質転換体の効果的な選択を可能にするために、導
入される遺伝子を高レベルで発現させることが明らかに
望ましい。さらに、形質転換されない組織が、ある程度
の生来の抗生物質耐性を示す場合、例えばカナマイシン
で選択される小麦やトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）の胚組
織の場合、形質転換された植物の製造を成功させるため
には強力な選択系が必要である。

【０００４】プロモーターは遺伝子の初めにあるＤＮＡ
配列部分であり、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始する
ためのシグナルを含み、続くタンパク質合成の進行が可
能となる。真核生物のプロモーターは複雑であり、転写
開始部位の５’側の−７５ｂｐにあるＴＡＴＡボックス
のコンセンサス配列、即ち＋１と定義されるｃａｐ部位
を含む構成成分を包含する（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈａ
ｎｄＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９−３８３；Ｍｅｓｓｉｎ
ｇら（１９８３）ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇｏｆＰｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ，Ｍｅｒｅ
ｄｉｓｈａｎｄＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ，（編），ｐ
ｐ．２１１−２２７）。多くの場合、ＴＡＴＡボックス
は正確な転写の開始に必要である。さらに上流に、しば
しば−８０と−１００との間には、コンセンサス配列Ｃ
ＣＡＡＴと相同のプロモーターエレメントが存在し得る
（ＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８
１）上記）。植物ではＣＣＡＡＴボックスは、Ｍｅｓｓ
ｉｎｇら（１９８３）がＡＧＧＡボツクスと名付けた、
ｃａｐ部位から同じ距離に位置するコンセンサス配列で
置き換えられていても良い。５’非翻訳領域にある他の
ＤＮＡ配列も、遺伝子の発現の調節に関係するものと考
えられている。例えば、照明、栄養分の使用可能性、あ
るいは熱ショック、嫌気生活（ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｉ
ｓ）、重金属の存在を含む不利な条件のような、環境か
らの刺激に反応して遺伝子の発現に影響を与えるＤＮＡ
配列が存在する。発育中または組織に特異的な様式で遺
伝子の発現を制御するＤＮＡ配列も存在する。他のＤＮ
Ａ配列は、近くの遺伝子の全体的な発現レベルを上昇さ
せることが見い出されている。このような配列は動物お
よび植物の系において”エンハンサー”と名付けられ
た。酵母では、”上流活性化配列”配列とよばれる同様
の刺激配列が知られており、これもまた、しばしば調節
情報を担うようである。プロモーターは通常、対応する
遺伝子のコーディング領域開始の５’側またはその上流
に位置する。そして調節または全転写レベルに影響を与
えるすべての補助的なエレメントを含む区域は、１００
ｂｐより少ないか１ｋｂｐにもなるものを含み得る。

【０００５】植物細胞の形質転換に広く使用されてきた
プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ａｄ
ｈ１およびＡｄｈ２をコードする２つの遺伝子のプロモ
ーターがある。Ａｄｈ１およびＡｄｈ２は共に嫌気（ａ
ｎａｅｒｏｂｉｏｓｉｓ）の開始後に誘導される（Ｆｒ
ｅｅｌｉｎｇ（１９７３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１２７：２１５−２２７）。２つの酵素のうち、Ａ
ｄｈ１は嫌気条件下で最も重要なものの一つである（Ｆ
ｒｅｅｌｉｎｇら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．８：２７−２３）。Ａｄｈ２（Ｄｅｎｎｉｓら
（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１３：７
２７−７４３）と同様にトウモロコシＡｄｈ１はクロー
ン化されそして配列決定されている（Ｄｅｎｎｉｓら
（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３
９８３−４０００）。他の起源のＡｄｈ１遺伝子も最近
クローン化され配列決定された（Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎら
（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．１９５：１１５−
１２３）．Ｈｏｗａｒｄら（１９８７）Ｐｌａｎｔａ
１７０：５３５−５４０はトウモロコシのプロトプラス
ト中の内因性Ａｄｈ１遺伝子およびキメラのＡｄｈ１遺
伝子の発現を調べた。Ａｄｈ１キメラ遺伝子のＡＤＨ−
ＣＡＴは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配列およびノパリン（ｎ
ｏｐａｌｉｎｅ）合成（ｎｏｓ）３’シグナルに結合し
たＡｄｈ１プロモーターからなる。電気穿孔法によりト
ウモロコシのプロトプラストに導入されたＡＤＨ−ＣＡ
Ｔは、コントロール条件下に比較して低酸素濃度では約
４倍高く表現された。トウモロコシプラスト中の内因性
Ａｄｈ１遺伝子の発現および細胞培養の嫌気性反応に平
行するＡＤＨ−ＣＡＴの発現は、トウモロコシ苗の反応
と量的に同じであった。Ｗａｌｋｅｒら（１９８７）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６６２４
−６６２８は、インビトロ操作されたＡＤＨ−ＣＡＴキ
メラ遺伝子の一連の発現に基づき、ＡＤＨ−ＣＴＡの嫌
気的誘導に必要な配列エレメントを確認した。彼らは、
トウモロコシのＡｄｈ１プロモーターの−１４０位と−
９９位の間に嫌気性調節エレメント（ＡＲＥ）の存在す
ること、そしてＡＲＥが、−１３３〜−１２４位と−１
１３〜−９９位との少なくとも２つの配列エレメントを
包み、ＡＤＨ−ＣＡＴ遺伝子活性の低酸素発現のために
は両者が必要かつ充分であることを示した。

【０００６】さらに、トウモロコシのＡｄｈ２遺伝子も
嫌気性生活によって調節され、Ａｄｈ１ＡＲＥに相同
性を有することが報告された（Ｗａｌｋｅｒら、（１９
８７）上記）。相同性はＡＲＥのＩ領域において約８１
％であり、II領域に於て約６９％である。さらに、Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびエンドウ由来のＡｄｈ遺伝子
の５’隣接領域は、１０ｂｐ領域にわたり、トウモロコ
シＡｄｈ１ＡＲＥに対する相同性が６０％よりも少な
いことが報告されている。

【０００７】カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプ
ロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙら（１９８２）Ｃｅｌｌ
３０：７６３−７７３；Ｏｄｅｌｌら、（１９８５）上
記）は植物の形質転換方法において最もよく知られてい
るプロモーターの一つである。この双子葉植物ウイルス
プロモーターは、双子葉および単子葉植物のプロトプラ
スト内に導入された遺伝子の発現を支配する（Ｆｒｏｍ
ｍら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８２：５８２４−５８２８；Ｎａｇａｔａら、
（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：２
４２−２４４；Ｏｄｅｌｌら、（１９８８）Ｐｌａｎ
ｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２６３−２７３）。形質
転換されたタバコ細胞（Ｍｏｒｅｌｌｉら、（１９８
５）Ｎａｔｕｒｅ３１５：２００−２０４；Ｎａｇｙ
ら（１９８５）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＰ
ｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ：Ｒｅｌｅｖａｎｃｅｔｏ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｉｎＥｉｇｈｔｉｅｓ，
Ｍ．Ｚａｉｔｌｉｎ，Ｐ．ＤａｙおよびＡ．Ｈｏｌｌａ
ｅｎｄｅｒ（編），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２２７−２３６）または遺伝子
導入されたペチュニア植物（Ｓａｎｄｅｒｓら（１９８
７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１５：１５４３−１
５５８）中の相対的な転写レベルの定量により、３５Ｓ
プロモーターがｎｏｓプロモーターの少なくとも３０倍
強力であることが示された。３５Ｓプロモーターは強力
であるので、遺伝子導入された植物における所望の特性
の高レベルの発現のために、このプロモーターが広く用
いられる。Ｆａｎｇら（（１９８９）ＴｈｅＰｌａｎ
ｔＣｅｌｌ１：１４１−１５０）は５’側、３’側
および中間の遺伝子欠失によって、−３４３〜−４６の
上流の断片が３つの機能性領域、即ち−３４３〜−２０
８、−２０８〜−９０、−９０〜−４６に分かれ得るこ
とを示した。彼らは、適当な３５Ｓプロモーター配列を
用いての試験で初めの２つの領域は転写活性を有するこ
とを示した。これに対し、−９０〜−４６領域は、それ
自身には低い活性しかないが、２つの末端領域の転写活
性を増大させる補助的な役割を果たした。ＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターは、ウイルス宿主範囲からかけはなれ
た植物を含む広い種類の植物において、高レベルのＲＮ
Ａ産生を生じさせる強力なプロモーターであるにもかか
わらず、コムギのような農業上重要なイネ科植物におい
ては比較的低い活性しか有さない（Ｌｅｅら（１９８
７）”ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＰｌａｎｔＰｒｏｔ
ｏｐｌａｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓｏｆｔｈｅ７ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌＰｒｏｔｏｐｌａｓｔＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，
Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄ
ｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ６−１１，１９８７，Ｐｕｉｔ
ｅら編；Ｈａｕｐｔｍａｎｎら（１９８７）Ｐｌａｎｔ
ＣｅｌｌＲｅｐ．６：２６５−２７０）。反対に、
トウモロコシのＡｄｈ１遺伝子由来の単子葉植物プロモ
ーターは双子葉植物であるＮｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕ
ｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａのプロトプラスト中では非常
に低い発現しか与えない（Ｅｌｌｉｓら（１９８７）Ｅ
ＭＢＯＪ．，６：１１−１６）。これらの観察から、
単子葉植物と双子葉植物との間には、転写因子およびプ
ロモーター配列の認識に関して相違があることが示唆さ
れる。

【０００８】導入遺伝子の発現レベルは、プロモーター
の転写レベルを増大させるｃｉｓ差動性の配列としての
エンハンサーエレメントを加えることにより、しばしば
増大させることが出来る（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８
１）Ｃｅｌｌ２７：２９９−３０８）。Ｋｈｏｕｒｙ
およびＧｒｕｓｓ（（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：３１
３−３１４）が定義したように、近くの遺伝子に関して
位置や方向に比較的非依存的な様式で転写効率を増大さ
せるように見える、真核生物のプロモーターエレメント
の組の１つである。エンハンサーの原型はＳＶ４０の７
２ｂｐ反復内に見出される。これは転写開始部位から１
００ｂｐよりさらに上流に位置し、ＧＴＧＧＡＡＡ（ま
たはＴＴＴ）Ｇのコンセンサス配列を有する。一般に、
動物又は動物のウイルスのエンハンサーは５’側１ｋｂ
ｐにも及ぶ距離にわたり両方向に作動可能であり、遺伝
子に対し５’側または３’側に作動可能である。配列モ
チーフは一般に、数回反復される。エンハンサーは弱い
プロモーターを有する遺伝子を研究するために動物のウ
イルス系において使用される（Ｌｅｅら（１９８１）Ｎ
ａｔｕｒｅ２９４：２２８−２３２；Ｈｕａｎｇら
（１９８１）Ｃｅｌｌ２７：２４５−２５５）。動物の
エンハンサーのコンセンサス核配列に相同性のある植物
遺伝子由来の配列も報告されている。Ｏｄｅｌｌら
（（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１
２）は、−１０５〜−４６間の配列がＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの最大の発現のために必要であることを示し
た。この領域内に含まれる配列は、動物のエンハンサー
の核コンセンサス配列に部分的に相同である。さらにＢ
ｏｕｃｈｅｚら（（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：４１
９７−４２０４）によって、−８９〜−５９の３５Ｓプ
ロモーター由来の３１ｂｐ断片は、トウモロコシとタバ
コの核中の核タンパク質因子に対する結合部位（Ｓｉｎ
ｇｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８６：３７３３−３７３７）を含み、そしてプロ
モーターの最大の活性のために必要不可欠であることが
示された。同様のエンハンサー配列は、フィグウォルト
モザイクウイルス（ｆｉｇｗｏｒｔｍｏｓａｉｃｖ
ｉｒｕｓ：ＦＭＶ）、カーネーションエッチトリングウ
イルス（ｃａｒｎａｔｉｏｎｅｔｃｈｅｄｒｉｎｇ
ｖｉｒｕｓ：ＣＥＲＶ）の上流の領域、ならびにＲｉ
およびＴｉプラスミド由来の７個のＴ−ＤＮＡオピン合
成遺伝子（ｓｅｖｅｎＴ−ＤＮＡｏｐｉｎｅｓｙ
ｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ）の上流の領域に見い出され
ている。

【０００９】Ｅｌｌｉｓら（（１９８７）ＥＭＢＯ
Ｊ．６：１１−１６）は、Ａｄｈ１プロモーターの上流
の配列（−１０９４〜−１４０位）の遺伝子欠失によ
り、遺伝子導入タバコにおいてＡｄｈ１遺伝子構築物が
極端に低くしか発現しなくなることを示した。しかし、
２つの構成的遺伝子、即ち双子葉植物において発現され
るオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびＣａＭＶ３
５Ｓ遺伝子に由来したエンハンサー様の性質を有する配
列が、トウモロコシＡｄｈ１プロモーター領域の上流に
位置する場合、活性が容易に検出された。トウモロコシ
Ａｄｈ１遺伝子の転写開始コドンの上流にある配列のは
じめの２４７ｂｐは、遺伝子導入タバコのハイブリッド
遺伝子に対して正確な転写開始を授け、嫌気性調節を授
けることが示された。さらに、ｏｃｓプロモーターの上
流領域に由来する１７６ｂｐＤＮＡ配列は、単子葉植物
であるＺｅａｍａｙｓおよび双子葉植物であるＮｉｃ
ｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａのプロ
トプラストにおいてエンハンサーとして機能することが
示された（Ｅｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．
６：３２０３−３２０８）。この１７６ｏｃｓ配列は両
方向に機能することが報告されているが、その促進活性
はＡｄｈ１プロモーターからの距離に依存すること、さ
らに、配列ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴを有する
１６ｂｐパリンドロームの存在によることが見出され
た。

【００１０】他の研究によれば、Ｋａｙらは（（１９８
７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２９９−１３０２）Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターを有する遺伝子導入タバコ
植物中で１０倍高い転写活性を報告し、そのプロモータ
ーＣａＭＶ３５Ｓ上流配列の２６０ｂｐを２回に含む
ものであった。さらに、この２回含んだ領域は、異種性
プロモーターの強力なエンハンサーとして作動して、こ
れに隣接していて、そして分かれて転写される移入ＤＮ
Ａ遺伝子の活性を数百倍増大させることが報告された。

【００１１】さらにＯｗら（（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４８７０−４８７
４）によって、３５Ｓプロモーター（−１４８〜−８９
位間）の末端領域の多重体は、３５Ｓプロモーターコア
を天然の３５Ｓプロモーターよりもさらに高い発現のレ
ベルに活性化し得ることが報告された。さらに、Ｆａｎ
ｇら（（１９８９）上記）は、上流３５Ｓプロモーター
断片（−２０９〜−４６）の単量体および多重体は、異
種体プロモーターからの転写を増大させるエンハンサー
として作動し得ることを報告した。これらの研究におい
て、３５Ｓプロモーターの−２０９〜−４６位間にある
上流領域の８反復が、リブロースビスホスフェートカル
ボキシラーゼの小サブユニットであるｒｂｃＳ−３Ａ遺
伝子の−５０位にクローン化された。８量体はｒｂｃＳ
−３Ａ上流領域を用いて得られるよりも、さらに高いレ
ベルにｒｂｃＳ−３Ａ転写を増大させた（Ｆａｎｇら
（１９８９）上記）。

【００１２】ウイルスまたは細菌のゲノムのような起源
から得られたエンハンサーは、植物において、所望の発
現を促進するときに機能することが示された。このよう
な場合の１つとして、トウモロコシＡｄｈ１プロモータ
ーに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ由来のオクトピンシダーゼ（ＯＣＳ）エンハンサ
ーを加えることにより、プロモーターの種特異性が修飾
された（Ｅｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：
１１−１６）。ＯＣＳエンハンサーを加えた後、トウモ
ロコシＡｄｈ１プロモーターは遺伝子導入タバコ植物に
おいて、嫌気生活的に観察される発現を強力にすること
ができた。もう一つの場合として、ＯＣＳエンハンサー
がＡＲＥに直接隣接した位置にあるとき、そのＯＣＳ−
ＡＲＥ構築物はトウモロコシのプロトプラスト中で最大
の発現を示し、ＣＡＴ発現は嫌気的なストレスによって
も、さらに増大しないことが報告された（Ｐｅａｃｏｃ
ｋら（１９８７）ＰｌａｎｔＧｅｎｅＳｙｓｔｅｍ
ｓａｎｄＴｈｅｉｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．２６３−２７７）。さ
らに、非翻訳リーダー中に、Ａｄｈ１プロモーターの下
流にあるトウモロコシＡｄｈ１イントロン１を含ませる
ことにより、トウモロコシのプロトプラスト中の導入さ
れたクロムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）マーカー遺伝子からの発現が１０倍増大され
ることが示された。

【００１３】

【発明の要旨】本発明の第１の目的は、組換えプロモー
ター分子を提供することにあり、その組換えプロモータ
ー分子は、当業者が、標的細胞中に導入された遺伝子の
発現を確実に高レベルで得ることを可能にする。この目
的は、植物で発現可能な遺伝子の５’非翻訳領域由来の
エンハンサー配列の組み合わせを利用することにより達
成される。好ましい実施態様において、エンハンサー配
列は、トウモロコシアルコールデビドロゲナーゼ１（Ａ
ｄｈ１）遺伝子およびオクトピンシンターゼ遺伝子の上
流領域の由来し、さらに好ましくは、例えば嫌気生活調
節エレメント（ＡＲＥ）、オクトピンシンターゼエレメ
ント（ＯＣＳ）のようなエンハンサー配列の反復又は組
み合わせおよびＡｄｈ１遺伝子のイントロン１を含有す
る。

【００１４】本発明の他の目的は、改良されたプロモー
ター構築物を提供することであり、その改良されたプロ
モーター構築物は、カリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターを用いて得られる
発現よりも、単子葉浮遊細胞プロトプラスト中に導入さ
れたマーカー遺伝子の、１０〜５０倍高い発現を与え
る。好ましくは、本発明の組換えプロモーター分子は、
互いに隣接するかまたは距離をおいて互いに一組となっ
たＡＲＥの多重コピーと、互いに隣接するかまたは距離
をおいて一組となったＯＣＳの多重コピーを含有する。

【００１５】さらに好ましくは、ＡＲＥエレメントがＯ
ＣＳエレメントの５’側に位置し、ＯＣＳエレメントが
ＴＡＴＡボックスの５’側に位置する。例示される実施
態様としては、単子葉植物のための改良されたプロモー
ター構築物は、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子のＡＲＥの
６回反復されたコピー、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＯＣＳ）のオクトピンシンタ
ーゼ遺伝子由来のＯＣＳエレメントの４回反復されたコ
ピー、植物で発現可能なプロモーター由来のＴＡＴＡボ
ックス領域、例えばトウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイン
トロン１（ヌクレオチド−１１９〜＋６７２内の非翻訳
リーダーの部分）のような植物で発現可能な遺伝子の非
翻訳リーダーの部分、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ β−グ
ルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）のような植物で発現可
能な構造遺伝子、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ遺伝子
由来のｎｏｓターミネーターを包含する。

【００１６】本発明の他の目的は、単子葉植物細胞にお
いてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターよりもマーカー遺伝
子の発現を促進する、改良されたプロモーター構築物を
提供することにあり、例えば、オオムギでは約１６倍促
進し、双子葉植物細胞のプロトプラストではＣａＭＶ
３５Ｓプロモーターよりもマーカー遺伝子の発現を７〜
１０倍促進する。組換えプロモーター分子は、互いに一
定間隔または隣接した関係で位置するＯＣＳエレメント
の複数回コピーを含むことが好ましい。例示される実施
態様としては、改良されたプロモーター構築物は、ＯＣ
Ｓの４回反復されたコピーと、例えば切形のＣａＭＶ△
３５Ｓプロモーター（ヌクレオチド−９０まで欠失され
ている）のような植物で発現可能なプロモーター由来の
ＴＡＴＡボックス領域と、例えばトウモロコシＡｄｈ１
遺伝子のイントロン１のような植物で発現可能な遺伝子
の非翻訳リーダーの部分であるイントロンと、例えば、
ＧＵＳのコーディング領域のような植物で発現可能な構
造遺伝子と、および例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ遺伝
子由来のｎｏｓターミネーターのような植物で発現可能
なターミネーションシグナルとを包含する。

【００１７】形質転換された植物細胞についての効果的
な選択系の開発を可能にすることも本発明の目的であ
る。このような改良された選択系は、遺伝子導入された
組織における構造遺伝子の発現の確実な促進に基づく。
例えば、本発明によって提供される組換えプロモーター
構築物は、抗生物質耐性遺伝子に結合されるときには、
その形質転換の間に、選択のための抗生物質耐性を増大
されたレベルで発生させるのに有用である。

【００１８】本発明の他の目的は、植物において高いレ
ベルの、組織特異的な発現を示すように設計された、組
換えプロモーター構築物を供給することである。例示さ
れる実施態様としては、本発明のｐ４ＯＣＳ△３５ＳＩ
ＧＮ構築物は、葉に特異的な発現のために優れた効用を
示す。

【００１９】本発明はさらに、単子葉植物細胞において
所望の遺伝子の高いレベルの発現を得るための方法を提
供する。このような所望の植物で発現可能な遺伝子に
は、当業者に知られているように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶性のトキシンタンパ
ク質、グリホセート耐性遺伝子、修飾された種子貯蔵タ
ンパク質遺伝子などを包含する。この方法には、組換え
プロモーター分子の構築が含まれ、例示される実施態様
としては、植物で発現可能な、切形のプロモーターの
５’側に、複数のＡＲＥおよび／または複数のＯＣＳエ
レメントを含み、その植物で発現可能な切形のプロモー
ターはＴＡＴＡボックス領域および選択物を提供し、
３’方向にはトウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイントロン
１、植物で発現可能な構造遺伝子（例えばＧＵＳ遺伝
子）、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ遺伝子由来のｎｏｓ
ターミネーターが続く。好ましい実施態様においては、
６コピーのＡＲＥと４コピーのＯＣＳとがプロモーター
構築物中に用いられる。

【００２０】本発明の他の目的は、誘導可能な遺伝子
を、遺伝子発現の調節に関して構成的にする方法を提供
することである。本発明の例示される実施態様として
は、通常嫌気生活に反応して機能するＡｄｈ１プロモー
ターは、エンハンサーエレメントと共に設計され、高レ
ベルの遺伝子発現を構成的な方法で示すようになる。

【００２１】組換えプロモーター分子の構築は、上記の
ように、植物のエンハンサー断片を用いた通常の手法で
達成される。さらに、このようなＤＮＡ分子の構築は、
本願中に記載の既知の遺伝子に由来する特定の配列、ま
たはその調節制御下に位置された異種性遺伝子の発現の
促進を授けることが示されている、他の起源由来の、機
能的に同等な配列、例えば７８０Ｔ−ＤＮＡエンハンサ
ーを用いることができる。切形のＡｄｈ１プロモーター
および切形のＣａＭＶ△３５Ｓプロモーターに代えて、
植物で発現可能な切形のプロモーターを、これらの構築
中に必要なＴＡＴＡボックス配列を提供するために使用
することができる。植物で発現可能な任意の構造遺伝子
が、これらの構築に使用可能である。

【００２２】構築の後、エンハンサーエレメント／切形
のプロモーター／構造遺伝子の結合体が所望の植物組織
中で、好ましくは単子葉植物の組織中で、高レベルで発
現されるように、改良されたプロモーター分子を含む本
願記載の組換えＤＮＡ発現系は植物の組織中に導入され
る。外来ＤＮＡによる植物の細胞または組織の形質転換
は、当業者に知られた種々の方法で行うことができる。
例示される実施態様としては、電気穿孔法が使用され
る。

【００２３】本発明の方法は一般に、単子葉植物および
双子葉植物の両者における構造遺伝子の発現に対して適
用できる。この方法は、単子葉植物のプロモーターの構
築に使用されるが、特にＧｒａｍｉｎａｃｅａｅ属、そ
の中でもトウモロコシおよびコムギに適用できる。

【００２４】本発明の他の目的は、本願に記載された組
換えプロモーター分子を含む植物、植物細胞および植物
組織である。さらなる目的は、該組換えプロモーター分
子を含む発現カセットおよびベクターにあり、並びにそ
のようなベクターを、維持、複製および植物の形質転換
に適当な状態に含む細菌細胞にある。

【００２５】本発明は、単子葉植物細胞において、植物
で発現可能な構造遺伝子の発現を促進する組換えプロモ
ーター分子を包含する。この組換えプロモーター分子
は、（ａ）ＡＲＥおよびＯＣＳエレメントからなる群より選
択される複数のエンハンサーエレメント；（ｂ）該複数のエンハンサーエレメントの３’側に位置
し、転写開始に必要なＴＡＴＡボックス領域を提供す
る、植物で発現可能な切形のプロモーター；および（ｃ）植物で発現可能な構造遺伝子中の転写開始部位と
翻訳開始部位との間に位置するイントロンとして天然に
見いだされるヌクレオチド配列；を有し、このことによ
って該組換えプロモーター分子の３’側に位置する植物
で発現可能な構造遺伝子が、該組換えプロモーター分子
の調節制御下において、該単子葉植物中で発現される。

【００２６】好適な実施態様においては、上記切形のプ
ロモーターは、切形のトウモロコシＡｄｈ１プロモータ
ーおよび切形のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターからなる
群より選択される。

【００２７】好適な実施態様においては、上記切形のプ
ロモーターは、切形のトウモロコシＡｄｈ１プロモータ
ーである。

【００２８】好適な実施態様においては、上記切形のプ
ロモーターは、切形のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
ある。

【００２９】好適な実施態様においては、上記組換えプ
ロモーター分子は４ＯＣＳΔ３５ＳＩ構造を有するプロ
モーター分子であって、４ＯＣＳとはＯＣＳの４回の反
復コピーをさして言い、Δ３５Ｓは切形のＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターであり、そして、Ｉは植物で発現可能
な遺伝子中の転写開始部位と翻訳開始部位との間に位置
するイントロンとして天然に見い出されるヌクレオチド
配列である。

【００３０】好適な実施態様においては、上記組換えプ
ロモーター分子は６ＡＲＥΔＡＤＨＩ構造を有するプロ
モーター分子であって、６ＡＲＥとは、ＡＲＥの６回の
反復コピーをさして言い、ΔＡＤＨは切形のＡｄｈプロ
モーターであり、そしてＩは、植物で発現可能な遺伝子
中の転写開始部位と翻訳開始部位との間に位置するイン
トロンとして天然に見い出されるヌクレオチド配列であ
る。

【００３１】好適な実施態様においては、上記組換えプ
ロモーター分子は６ＡＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨＩ構造を有
するプロモーター分子であって、６ＡＲＥとは、ＡＲＥ
の６回の反復コピーをさして言い、４ＯＣＳとはＯＣＳ
の４回反復コピーをさして言い、ΔＡＤＨは切形のＡｄ
ｈプロモーターであって、そしてＩは、植物で発現可能
な遺伝子中の転写開始部位と翻訳開始部位との間に位置
するイントロンとして天然に見い出されるヌクレオチド
配列である。

【００３２】本発明は上記の組換えプロモーター分子を
有するベクターを包含する。

【００３３】本発明は上記の組換えプロモーターを有す
るベクターを包む細菌細胞を包含する。

【００３４】本発明は上記組換えプロモーター分子を有
するように転換され、その組換えプロモーター分子の制
御下に構造遺伝子を発現する、形質転換可能で再生可能
な単子葉植物を包含する。

【００３５】好適な実施態様においては、上記単子葉植
物は、トウモロコシ、コムギ、オオムギまたはコメであ
る。

【００３６】

【発明の構成】明細書および請求の範囲における用語の
意図あるいは範囲のあいまいさを除外するために次の定
義を提供する。

【００３７】発現とは、構造遺伝子の転写および翻訳の
ことであって、その結果タンパクが合成される。

【００３８】プロモーターとは、転写開始を命令する構
造遺伝子の５’末端の配列である。プロモーター配列
は、下流遺伝子の発現を導くのに必ずしも十分ではない
が必要である。真核生物のプロモーターは、一般に、転
写開始（ｃａｐ）部位の５’側の約１０から３５ｂｐの
コンセンサス５’−ＴＡＴＡＡＴ−３’（ＴＡＴＡボッ
クス）に相同の配列を含有する。ｃａｐ部位は従来から
＋１と番号を付けられており、すなわちｃａｐ部位から
の距離に従ってｃａｐ部位の３’側の塩基は、プラスの
番号が付けられ、他方、ｃａｐ部位の５’側塩基はマイ
ナスの番号が付けられる。ＴＡＴＡボックスの５’側の
約３０から７０ｂｐに、しばしば正規の型の５’−ＣＣ
ＡＡＴ−３’に相同なもう１つ別のプロモーター要素が
ある（Ｒ．ＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＰ．Ｃｈａｍｂ
ｏｎ（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５
０：３４９−３８３）。植物では、ＣＣＡＡＴ”ボック
ス”はときどき、ＡＧＧＡ”ボックス”に置換されてい
る（Ｍｅｓｓｉｎｇらの（１９８３）Ｇｅｎｅｔｉｃ
ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＰｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｋ
ｏｓｕｇｅらの（編）、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ｐ
ｐ．２１１−２２７）。組織特異性、環境シグナルへの
応答あるいは、転写の最大効果を賦与する他の配列は、
これらのプロモーターエレメントに点在して見い出され
るか、あるいはｃａｐ部位から５’側の方向にさらに見
い出され得る。このような配列は、しばしばｃａｐ部位
の４００ｂｐ以内に見い出されるが、１０００ｂｐから
それ以上に延長していることもある。

【００３９】切形の（切り出された）プロモーターと
は、転写開始に必要な基本配列を有するが、エンハンサ
ー配列を除いたＴＡＴＡボックス領域のことである。本
発明では、切形のプロモーターは、ｃａｐ部位（＋１）
の５’側に約２００ｂｐと３’側に約２００ｂｐの領域
を有し、さらに好ましくはｃａｐ部位から５’側に約１
００ｂｐと、３’側に約１１０ｂｐの領域を有すること
を意図している。

【００４０】ＡＤＨとは、一般に、植物で発現可能なア
ルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および、特に、トウモ
ロコシ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のこと
である。

【００４１】Ａｄｈ１プロモーターとは、トウモロコシ
由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子１のヌクレオ
チド位置の約−１０９４から−１０６の領域をもつＤＮ
Ａ断片、あるいは、機能的に同等な相同の断片である。
この配列に、上記Ｅｌｌｉｓら（１９８７）により発表
された修正に従ってｃａｐ部位を＋１として番号を付け
た。

【００４２】プロモーターの△印（例えば、Ａｄｈプロ
モーターに対する△ＡＤＨ、あるいは３５Ｓプロモータ
ーに対する△３５Ｓ）は、プロモーターがここで定義さ
れているように切形になっていることを意味する。

【００４３】△ＡＤＨとは、一般に、転写を開始するの
に必要なＴＡＴＡボックス配列を提供する、植物で発現
可能な切形のＡｄｈプロモーターのことであり、特に上
記のＥｌｌｉｓら（１９８７）に記載のように、ヌクレ
オチドの−１００付近から＋１０６付近のＤＮＡ領域あ
るいはこれと機能的に同等な相同の断片をもつトウモロ
コシ由来のＡｄｈ１遺伝子からの切形Ａｄｈ１プロモー
ターのことである。

【００４４】△３５Ｓとは、転写を開始するのに必要な
ＴＡＴＡボックス配列を提供する植物で発現可能な切形
のＣａＭＶプロモーターのことであり、特にヌクレオチ
ドの−９０付近から＋３付近のＤＮＡ領域、あるいはこ
れと機能的に同等な相同の断片を持つカリフラワモザイ
クウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子からの切形の３５
Ｓプロモーターのことである。ＣａＭＶ３５Ｓプロモー
ターのヌクレオチド−９０付近から−４５付近の領域で
はＯＣＳエレメントを有する（Ｂｏｕｃｈｅｚら、（１
９８９）前出）。

【００４５】ＡＲＥあるいはＡＲＥエレメントとは、上
記のＷａｌｋｅｒら、（１９８７）により定義された嫌
気性の制御エレメント、あるいは機能的に同等な相同の
断片のことである。トウモロコシＡｄｈ１遺伝子由来の
ＡＲＥ断片は、ヌクレオチドの−１４０から−９９のＤ
ＮＡ領域を持つ。ＡＲＥは、少なくとも２つの配列エレ
メントを含有している。すなわち−１３３から−１２４
と−１１３から−９９であって、両者ともＡｄｈ−ＣＡ
Ｔ遺伝子発現の低酸素発現にとって必要であり、かつ共
に十分である（Ｗａｌｋｅｒら、（１９８７）前出）。
領域ＩおよびIIのＤＮＡ配列は、５’−ＧＧＴＴＴ−
３’を含まねばならなく、おそらく５’−ＴＧＧＴＴＴ
−３’を含まねばならない。本発明では、ＡＲＥは、領
域Ｉのみからなり、領域IIを除き得ることを意図する。
さらに、機能性の植物ＡＲＥエレメントは、嫌気的に他
の起源から誘導された遺伝子由来であり得て、限定され
ないが、これは、トウモロコシＡｄｈ１およびＡｄｈ２
遺伝子、ならびにトウモロコシアルドラーゼ遺伝子の上
流領域からの配列を含む。

【００４６】ＯＣＳあるいはＯＣＳエレメントとは、１
７６ｂｐのｏｃｓエンハンサー断片のことであって、こ
の断面はトランスジェニックタバコでの、トウモロコシ
Ａｄｈ１プロモーターの発現を提供するのに用いられた
オクトピンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド−２９２か
ら−１１６を持つ（Ｅｌｌｉｓら、（１９８７）ＥＭＢ
ＯＪ．６：１１−１６および（１９８７）ＥＭＢＯ
Ｊ．６：３２０３−３２０８）か、あるいはこれと機能
的に同等な相同の断片を持つ。ＯＳＣは、１６ｂｐのパ
リンドローム性の配列、すなわち５’−ＡＣＧＴＡＡＧ
ＣＧＣＴＴＡＣＧＴ−３’であるＯＣＳエレメントを含
み、これは、ｏｃｓエンハンサーの必須要素である。

【００４７】ＯＣＳエレメントは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のオクトピンシ
ンターゼ遺伝子の−１９３から−１７８にある。ＯＣＳ
エレメントに対して相同かつ機能的に同等な配列の存在
は、他の起源においても認められている（Ｂｏｕｃｈｅ
ｚら、（１９８９）前出）。本発明でのＯＣＳエレメン
トは、またＥｌｌｉｓら、（１９８７）ＥＭＢＯＪ．
６：３２０３−３２０８に記載のＯＣＳエレメントに対
して、少なくとも５０％相同性があり、かつ機能的に同
等な（Ｂｏｕｃｈｅｚら（１９８９）前出）他の起源の
配列を含む。

【００４８】プロモーターエンハンサーエレメント中の
表示Ｉはイントロンを意味する。

【００４９】イントロンとは、一般に、植物で発現可能
な遺伝子中の転写開始部位と翻訳開始部位との間に位置
するイントロンとして、天然に見い出されるヌクレオチ
ド配列のことである。特に実施例において用いられてい
るイントロンは、１１９から６７２のヌクレオチド（Ｄ
ｅｎｎｉｓらの（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１２：３９８３−４０００に従ってヌクレオチドに
番号を付けた）を持つトウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイ
ントロンＩからの５５７ｂｐの断片、あるいは機能的に
同等な相同の断片である。

【００５０】ＥｍｕあるいはＥｍｕカセットとは、’６
ＡＲＥ４ＯＣＳ△ＡＤＨＩ’構造からなる発現カセット
である。

【００５１】ｐＥｍｕＧＮは、ｐ６ＡＲＥ４ＯＣＳ△Ａ
ＤＨＩＧＮ構造の省略である。

【００５２】Ｇとは、Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダー
ゼ遺伝子のことである。

【００５３】Ｎとは、ノパリンシンターゼ遺伝子の転写
終止シグナル配列のことである。

【００５４】発現の高いレベルとは、本発明の組換えプ
ロモーターの制御の下に、目的の遺伝子の発現が、単子
葉植物細胞中で、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御
下に、同じ植物系で得られるよりも、少なくとも１０か
ら５０倍高くなることである。

【００５５】調節制御とは、一般に、ＤＮＡ配列エレメ
ント、特に転写開始部位の上流（５’側に）に位置する
エレメントにより誘導される遺伝子発現の調節のことで
ある。調節は、環境条件に応答する切／入スイッチに似
ており、あるいは調節の結果、遺伝子発現のレベルに変
化が生じる。例えば、嫌気性調節エレメントは、環境条
件が嫌気性であるときのみに下流遺伝子の発現が起こる
ような方法で、機能する。実験的嫌気性とは、植物組
織、培養細胞、あるいはプロトプラストが必要とする５
％酸素と９５％チッ素を含む大気のことである。

【００５６】プロモーター調節制御のもとにある構造遺
伝子、あるいは調節配列エレメントを配置することは、
遺伝子の発現がこれらの遺伝子により制御されるように
構造遺伝子を配置することを意味する。プロモーター
は、一般に、これらが制御する遺伝子の５’側（上流）
に位置する。異種のプロモーター／構造遺伝子組み合わ
せの構築では、遺伝子の転写開始部位からの距離、その
距離はもともとの位置にある遺伝子、すなわちプロモー
ターが誘導される遺伝子とプロモーターとの間の距離と
ほぼ同じであることが好ましい。当該分野において知ら
れているように、この距離の変化は、プロモーター機能
を失うことなく行われ得る。同様に、異種遺伝子がその
制御の下に位置されることが期待されている。制御配列
エレメントの好ましい配置は、天然にもともと位置する
エレメント、すなわちそれが由来する遺伝子の配置によ
り決められる。さらに、当該分野では知られており、こ
こで制御エレメントの複数コピーで示されているよう
に、この距離に変化が起こりうる。

【００５７】構造遺伝子は、タンパク、ポリペプチド、
あるいはそれらの一部分をコードするＤＮＡ断片を含む
遺伝子部分である。この用語は、細胞内で天然に見い出
されるが、しかし人工的に導入された構造遺伝子の複製
物を意味する。あるいはこの構造遺伝子は、遺伝子が導
入された植物細胞中で通常見い出されないタンパクをコ
ードし得、この場合には、異種遺伝子と呼ばれる。異種
の構造遺伝子は、その全体にせよ一部分にせよ、細菌の
ゲノムあるいはエピソーム、真核生物ゲノムあるいはプ
ラスチドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスのＤＮＡ、あるい
は化学的に合成されたＤＡＮから由来し得る。構造遺伝
子は、コード領域あるいは非翻訳領域のいずれかにおい
て、１つあるいはそれ以上の修飾を含み得る。この修飾
は、発現産物の生物的活性あるいは化学的な構造、発現
の速度あるいは、発現制御の方法に影響し得る。このよ
うな修飾としては、たとえば変異、挿入、欠損、および
１つあるいはそれ以上のヌクレオチドの置換が含まれ
る。しかしこれらに限定されるものではない。この構造
遺伝子は、妨害されていないコード配列を構成し得る、
あるいは、適当な植物の機能性のスプライス結合部位で
結合された一つあるいはそれ以上のイントロンを含み得
る。この構造遺伝子は、天然由来であっても合成された
ものであっても複数の起源に由来する断片の構成要素で
ありうる。実験操作によりコード配列を接続すること
で、その機能性を保持することができるならば構造遺伝
子は、また融合タンパクをコードし得る。

【００５８】構造遺伝子、エンハンサーあるいは制御配
列、あるいは他の配列の相同なものは、これらと機能的
に同等であって、かつ少なくとも５０％の相同性がある
相同配列である。このような配列は、当該分野でよく理
解されている。適切な厳密な条件下で、交叉ハイブリダ
イズする能力のある核酸により、当該分野の当業者によ
り同定され得る（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ
（編）（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂ
ｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，ＵＫの記載に従って）。本願において使用され
る、あるいは開示されている配列あるいは断片におい
て、わずかな配列の変化があり得ることは理解されるで
あろう。これらの変化は、標準的な技術によって決定さ
れ、当業者は、調節エレメント、転写の開始を指令する
のに必要なプロモーターエレメントおよび植物で発現可
能な転写終止（おそらくポリアデニル化）シグナルの機
能的単位を操作して用いることができる。

【００５９】例えば、ＯＣＳエレメントは、最初に、１
６ｂｐのパリンドローム性の配列として同定されている
ｏｃｓ遺伝子のプロモーター中のエンハンサーエレメン
トとして単離された（Ｅｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭＢ
ＯＪ．６：１１−１６）。ＯＣＳエレメントの転写促
進活性は、転写因子のインビトロ結合と相関性がある。
ＯＣＳエレメントは、オピン合成に関与する６個の他の
Ｔ−ＤＮＡ遺伝子のプロモーター領域、およびＣａＭＶ
３５Ｓプロモーターを含む３個の植物ウイルスプロモ
ーターにおいて同定された（Ｂｏｕｃｈｅｚら（１９８
９）前出）。これらのエレメントは、ＯＣＳ転写因子を
インビトロで結合すること、および植物細胞での転写を
促進することが示された。これらの１０個のエレメント
（ｏｃｓ遺伝子中でまず認められるＯＣＳエレメントに
対して、少なくとも約５０％の相同性を示す）の２０ｂ
ｐのヌクレオチド配列の比較で、２０ｂｐのコンセンサ
ス配列、すなわちＴＧＡＣＧ（Ｔ／Ｃ）ＡＡＧ（Ｃ／
Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ａ／Ｃ）Ｔ（Ｇ／Ｔ）ＡＣＧ（Ｔ／
Ｃ）（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｃ）が明らかになった。これは、
この配列の中央に１６ｂｐのパリンドロームを含んでい
る。本発明では、ＯＣＳエレメントは、上記Ｂｏｕｃｈ
ｅｚら（１９８９）前出で認められた１０個のエンハン
サーエレメントのいずれかにより例示される。コンセン
サス配列とＥｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．
６：１１−１６に記載のｏｃｓ遺伝子中に、最初に認め
られたＯＣＳエレメントと５０％の相同性を有するヌク
レオチド配列の例示されることを意図している。さらに
本発明では、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子中にまず示さ
れるＡＲＥエレメントに対して、少なくとも約５０％の
相同性を示すＤＮＡ断片は、ＡＲＥエレメントと機能的
に同等であることを示し、さらに組換えプロモーターの
構築物中のＡＲＥエレメントの位置に用いられ得ること
を意図している。

【００６０】植物組織には、分化した植物の組織と分化
していない植物の組織とが含まれる。それには、根、
茎、葉、花粉、種子、腫瘍組織および培養細胞の種々の
形のもの、例えば、単細胞、プロトプラスト、胚および
カルス組織などがあるが、これらに限定されるものでは
ない。植物組織は、植物体として存在し得るし、あるい
は器官、組織あるいは細胞培養物中に存在し得る。

【００６１】調節エレメントおよび下流のプロモーター
の制御のもとに、構造遺伝子を発現する、遺伝子的に修
飾された植物組織の生産は、本明細書の教示と、当該分
野における既知の種々の技術および手段とを組み合わせ
ておこなわれる。ほとんどの場合に、全工程中の各段階
に対して代替手段がある。手段の選択は、組換えＤＮＡ
分子のクローニングおよび導入のためのプラスミドベク
ター系、修飾される植物種、特定の構造遺伝子、プロモ
ーターエレメントおよび使用される調節エレメントのよ
うな多様性に依存している。当業者は、機能性を得るた
めの適切な代替手段を選択し使用し得る。目的の遺伝子
を培養細胞で発現する培養条件は、当該分野では周知で
ある。当該分野に知られた、多くの単子葉および双子葉
両者の植物種は、形質転換可能でありかつ再生可能であ
り、これらは、本発明のプロモーター分子の調節制御の
下に、目的の遺伝子を有し、発現する全ての植物であ
る。当業者に知られているように、形質転換された植物
での発現は、組織特異的であり、および／または、特定
の発生段階に特異的であり得る。切形のプロモーターの
選択および構造遺伝子の選択は、当業者に知られている
ところであり、ここに教示されているように、目的の植
物発現を得るために最適化し得るパラメーターである。

【００６２】本発明は、トウモロコシＡｄｈ１プロモー
ターの−３５から＋１０６までの部分を−４５のところ
で切断されたＣａＭＶ△３５Ｓプロモーターで置換する
ことで、トウモロコシのプロトプラストにおいて分析さ
れる場合に、親遺伝子の嫌気性調節が保持されているハ
イブリッドプロモーターをもたらすという、出願人の発
見にある程度基づいている。しかしながら、替わりに−
９０で切断されたＣａＭＶ△３５Ｓプロモーターを用い
たならば、発現は、再び構成的である。

【００６３】ＣａＭＶ△３５Ｓプロモーター中の−９０
から−４５の領域は、ＯＣＳエレメント（Ｂｏｕｃｈｅ
ｚら（１９８９）前出）を含むことが示された。このＯ
ＣＳエレメントは、もともとＯＣＳエンハンサー断片中
に１６ｂｐのパリンドロームを含むところの２０ｂｐの
コンセンサス配列である（Ｅｌｌｉｓら（１９８７）Ｅ
ＭＢＯＪ．６：３２０３−３２０８）。それ故に、Ｃ
ａＭＶ△３５Ｓプロモーターあるいはｏｃｓ遺伝子断片
からのＯＣＳエレメントと、トウモロコシＡｄｈ１プロ
モーター上流領域との結合により、トウモロコシ細胞中
で構成的に発現される構築物が与えられる。

【００６４】４回反復のＯＣＳエレメント（４ＯＣＳ）
の配列は、Ａｄｈ１プロモーターによってなされるＣＡ
Ｔ遺伝子の発現を促進することにおいては、１個のＯＣ
Ｓエレメントより強い活性を有する。

【００６５】同様に、トウモロコシＡｄｈ１プロモータ
ー中の１個のＡＲＥを６回反復のＡＲＥに置換すること
は、嫌気条件の発現に１１倍の増加を与えることが示さ
れた。

【００６６】本発明では、多くのＤＮＡ構築物が植物細
胞での構造遺伝子の高いレベル発現を可能とするために
調製された。一連のプロモーターは、切形のトウモロコ
シＡｄｈ１プロモーター（−１００から＋１０６におよ
ぶヌクレオチド、Ｅｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭＢＯ
Ｊ．６：３２０３−３２０８）あるいは切形の３５Ｓプ
ロモーター（−９０から＋３におよぶヌクレオチド）の
いずれかに基づいて構築（図１から図６を参照）され
た。ＯＣＳエレメントとＡＲＥとの種々の組み合わせ
が、高発現プロモーターを作るために上流に加えられ
た。さらに、トウモロコシＡｄｈ１プロモーターのイン
トロン１を含む断片が、いくつかの構築物においてプロ
モーターと構造遺伝子との間に挿入された。

【００６７】組換えプロモーターの相対的な強さは、１
つの双子葉および４つの単子葉植物細胞系のプロトプラ
ストにおいて、ＤＮＡ構築物を、電気穿孔法によって植
物プロトプラスト中に導入して４４〜４８時間後に、リ
ポーター遺伝子の生産物、例えばＧＵＳ酵素の活性を測
定することによって分析された。後述の表１に示されて
いる結果は、ｐ３５ＳＧＮに対する値を１．０として標
準化されている。この標準化は、異なるプロトプラスト
調製物について行われた実験間で観察されたばらつきを
小さくした。示されている値は、少なくとも３回の異な
る単離によるプロトプラストを用いての、少なくとも５
から最高８回のレプリカ実験の平均である。ｐ３５ＳＧ
Ｎ、ｐ４ＯＣＳ△３５ＳＩＧＮおよびｐ６ＡＲＥ４ＯＣ
Ｓ△ＡＤＨＩＧＮを用いて生産されたＧＵＳの比活性の
範囲が後述の表２に示されている。多くの場合におい
て、ＧＵＳ比活性の値は、複製部間で変動したのが、そ
の順位、各々の植物種の内での複製物間で概して同じで
あった。相対的な発現レベルは、目的の構造遺伝子の選
択に依存しなかった。本研究での標準条件では、比較的
少ない量のＤＮＡ（１．２μｇ／１０⁵プロトプラス
ト）ですむことが強調される。このＤＮＡ濃度は、異な
る構築物間のＧＵＳ酵素活性において最も明確に異なる
応答を与えることが認められた。ＤＮＡ濃度を増したと
きには、効果の少ない構築物のいくつかに、より高いＧ
ＵＳ活性値が認められた。

【００６８】後述の表１に示されているように、テスト
された全ての単子葉細胞系、例えば、トウモロコシ、コ
ムギ、ヒトツブコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍｍｏｎｏｃ
ｏｃｃｕｍ）、ｌｏｌｉｕｍ（Ｌｏｌｉｕｍｍｕｌｔ
ｉｆｌｏｒｕｍ）、およびコメにおいて、ＣａＭＶ△３
５Ｓプロモーターは、弱い発現を示した。そのマーカー
であるＧＵＳ遺伝子の発現は、”プロモーターのない”
構築物であるｐＧＮおよびｐＩＧＮに対して得られた発
現と同程度である。一般に、切形のＡｄｈ１プロモータ
ーに基づく構築物は、切形のＣａＭＶ△３５Ｓプロモー
ターに基づくものよりも、単子葉植物においてより高い
レベルで発現された。トウモロコシＡｄｈ１イントロン
１を含んでいるトウモロコシＡｄｈ１プロモーターに、
６個のＡＲＥエレメントが結合されている構築物によっ
て、単子葉細胞系において一貫して高い発現が得られ
た。構築物ｐ６ＡＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨＩＧＮは、さら
に４個のＯＣＳエレメントのコピーを含んでおり、全て
の単子葉細胞系において最も高い発現レベルを示した。
このプラスミドは、単子葉の浮遊細胞のプロトプラスト
中でのＧＵＳ発現において、ＣａＭＶΔ３５Ｓプロモー
ターよりも１０倍から５０倍の増加を示した。この構築
物によって得られた高発現は、おそらくは、数個の因子
によるものであった。トウモロコシＡｄｈ１遺伝子から
の単子葉ＴＡＴＡボックスの使用は、まちがいなく正に
寄与している。トウモロコシＡｄｈ１遺伝子からの非翻
訳リーダー配列は、この構築物中では長く（１０６塩
基）、また重要な因子であるが、トウモロコシＡｄｈ１
遺伝子の＋８０から３’側のリーダー配列の削除は、多
くの系において発現を示さなかった。一般に、単子葉細
胞系においては、△３５Ｓに基づくものよりもΔＡＤＨ
に基づく構築物のほうが良く作用した。逆に、Δ３５Ｓ
に基づくプロモーターは、双子葉（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）細胞系において、
ΔＡＤＨに基づくプロモーターより性能がすぐれてい
た。トウモロコシＡｄｈ１イントロン１を包むことは、
ｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮおよびｐ６ＡＲＥ４ＯＣＳΔ
ＡＤＨＩＧＮによる発現を増加させるが、ＣａＭＶΔ３
５Ｓプロモーターに基づく構築物にはイントロンの効果
は認められなかった。”プロモーターがない”構築物の
場合には、ｐＧＮは、ＤＮＡの不存在下で電気穿孔され
たプロトプラストについて観察される対照値（バックグ
ラウンド）より大きい検出可能なＧＵＳ発現を与えなか
った。しかしながら、トウモロコシＡｄｈ１イントロン
１を含んでいるｐＩＧＮは、低いが測定可能なＧＵＳ活
性を与えた。

【００６９】ｐ６ＡＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨＩＧＮから得
られた高いレベルの発現を与える、もう１つの重要な因
子は、ＯＣＳエレメントおよびＡＲＥの複数個のコピー
の存在である。このＯＣＳエレメントは、双子葉および
単子葉の両者において、機能することが示されてきた強
いエンハンサーであり（Ｅｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭ
ＢＯＪ．６：３２０３−３２０８）、そしてさらにＡ
ＲＥのコピーを５回付加することにより、トウモロコシ
プロトプラストで測定される場合、トウモロコシＡｄｈ
１プロモーターによる発現を増加させた。ＧＵＳマーカ
ー遺伝子は、他の植物で発現可能な構造遺伝子のコーデ
ィング領域と置換され得る。従って、’６ＡＲＥ４ＯＣ
ＳΔＡＤＨＩ’カセットは、培養単子葉細胞で高いレベ
ルの発現が要求されるところで有用である。’６ＡＲＥ
４ＯＣＳΔＡＤＨＩ’カセットは、’Ｅｍｕ’カセット
と呼ばれるコードであって、したがって、ｐ６ＡＲＥ４
ＯＣＳΔＡＤＨＩＧＮ構築物はｐＥｍｕＧＮと省略され
ている。

【００７０】プラスミドｐ６ＡＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨＩ
ＧＮは、発明者によって、トウモロコシに嫌気的に誘導
可能であることが示された。嫌気的に誘導された細胞
は、嫌気的に発育した細胞よりも、１０倍も発現の増大
を示した。本発明のｐＥｍｕＧＮ構築物は、後述の表２
に挙げられているようにｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮより
も、より高いレベルの発現をもたらした。このことは、
プロモーター構築物にＯＣＳエレメントを付加すること
により、嫌気的条件下に嫌気的に誘導された発現のレベ
ルと同等の発現レベルに到達しうることを示唆した。こ
の示唆はさらに特徴づけられた。ｐＥｍｕＧＮ、ｐ６Ａ
ＲＥΔＡＤＨＩＧＮおよびｐ６ＡＲＥΔ３５ＳＩＧＮの
嫌気的な誘導能は、コムギ（Ｌ１）プロトプラストを用
いて決定された。いくつかのサンプルは振盪しながら空
気中（好気的に）で、２５℃においてインキュベートさ
れた。一方、他のサンプルは（’嫌気的に誘導された’
と言われる）、インキュベーションの間（４４〜４８時
間）、５％Ｏ₂／９５％Ｎ₂の大気中で２５℃において振
盪された。後述の表３に示されているように、ｐ６ＡＲ
ＥΔＡＤＨＩＧＮは、コムギ（Ｌ１）プロトプラスト中
で嫌気的に約３倍多く誘導された。他方、ｐＥｍｕＧＮ
は、嫌気的および好気的条件において、同じレベルの発
現を与えた。この発現は、ｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮに
より完全に誘導された発現よりも多かった。それ故に、
４ＯＣＳエレメントのｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮへの付
加は、嫌気的誘導の要求をなくする。ΔＡＤＨがΔ３５
Ｓ（ｐ６ＡＲＥΔ３５ＳＩＧＮ）で置換されたｐ６ＡＲ
ＥΔＡＤＨＩＧＮのアナログは、嫌気的誘導性に関して
いかなる推論も可能とするような十分に高いレベルの発
現を与えなかった。

【００７１】後述の表１に示されている結果のように、
４ＯＣＳエレメントの切形のプロモーターΔ３５ＳＩＧ
Ｎ構築物への付加は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂ
ａｇｉｎｉｆｏｌｉａプロトプラスト中で発現を大きく
増大した。この構築物中のプロモーターは、双子葉植物
中で、高いレベルの遺伝子発現が要求される場合に有用
である。この構築物中および他の高いレベルに発現され
た構築物中の、トウモロコシＡｄｈ１イントロン１の存
在は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａで、トウモロコシイントロン
のスプライシングが首尾よくおこったことを示した。イ
ントロンのないｐ４ＯＣＳΔ３５ＳＩＧＮの変形体（ｐ
４ＯＣＳΔ３５ＳＧＮ）は、同様に高いレベルの発現を
与えた。このことは、イントロンの存在は、Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａでの高いレベルの発現に要求されないことを示
した。切形のＡｄｈ１プロモーターに基づく構築物は、
ｐＥｍｕＧＮの場合以外はＮｉｃｏｔｉａｎａではほと
んど、あるいは全く発現をもたらさなかった。このｐＥ
ｍｕＧＮは、４ＯＣＳエレメントを含んでいて、３５Ｓ
プロモーターによって与えられるのと同じレベルの表現
を与えた。

【００７２】異なる細胞系での、ある構築物の相対的な
作用の差が注目された。構築物ｐＥｍｕＧＮは、コム
ギ、ヒトツブコムギおよびコメでのｐ６ＡＲＥΔＡＤＨ
ＩＧＮによる発現よりも発現を２倍増す。しかし、トウ
モロコシにおいては、この割合は５倍であり、およびＬ
ｏｌｉｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍでは１６倍であっ
て、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌ
ｉａで得られた値に近い（１７倍）。Ｎｉｃｏｔｉａｎ
ａで最も高いレベルの発現を与える構築物（ｐ４ＯＣＳ
Δ３５ＳＩＧＮ）は、Ｌｏｌｉｕｍでも比較的高く発現
され（ｐＥｍｕＧＮで得られる発現の４４％）、コムギ
での値は１％以下である。これらの差は、おそらく、異
なる細胞系での転写因子の数が異なっていることを反映
しているのであろう。この点に関しては、Ｌｏｌｉｕｍ
細胞系は、コムギとＮｉｃｏｔｉａｎａ細胞系の間にあ
ると思われる。

【００７３】異なるプロモーターの構築物の相対的な強
さは、葉の組織、例えば、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ
ｖｕｌｇａｒｅ）の葉肉のプロトプラスト中で測定され
た。後述の表２に示されるように、オオムギの葉肉プロ
トプラストでは、電気穿孔法において他の細胞とは多少
異なる条件が要求された。それ故に、オオムギで得られ
た絶対値は、他の細胞系で得られた値と厳密には比較で
きない。異なるプロモーターからの発現の相対的なレベ
ルは、樹立された細胞系で認められた値とは明かに異な
っている。構築物ｐＥｍｕＧＮは発現を与えない。バッ
クグラウンドより有意に大きいレベルの発現を示した構
築物は、ｐ４ＯＣＳΔ３５ＳＩＧＮのみであった。この
構築物は、浮遊細胞プロトプラストでのｐＥｍｕＧＮに
よって認められる発現に較べて、オオムギ葉肉プロトプ
ラストでの高いレベルの発現を与えた。この結果は、単
子葉植物の葉肉プロトプラスト組織では、ｐＥｍｕＧＮ
は高く発現されないことを示唆している。トウモロコシ
の場合には、Ａｄｈ１遺伝子は葉組織で発現されない。
このことは、葉が必要な転写因子を含み得ないことを示
している。

【００７４】調節エレメントの調節制御の下に、目的の
構造遺伝子を有する組換えＤＮＡ分子は、当業者に既知
の種々の技術によって、植物細胞中へ導入され得る。あ
る植物種あるいは、植物組織の特定の型に対して用いら
れる技術は、既知の成功した技術によっている。組換え
ＤＮＡを植物組織中に導入する方法としては、形質転換
（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯＪ．
３：２７１７−２７２２）、電気穿孔法（Ｆｒｏｍｍら
（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８２：５８２４−５８２８）、あるいはＤＮＡ
のマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１
９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：１７９
−１８５）あるいはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植
物組織へのＴ−ＤＮＡの介在性の転移があるが、これら
に限定されるものではない。代表的なＴ−ＤＮＡベクタ
ー系は下記の文献に記載されている。Ａｎら（１９８
５）ＥＭＢＯＪ．４：２７７−２８４、Ｈｅｒｒｅｒ
ａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３
０３：２０９−２１３、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ
ｌａら（１９８３）ＥＭＢＯＪ．２：９８７−９９
５、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８５）
ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒ
ｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．６３−９３。一旦、
植物組織に導入されると、構造遺伝子の発現は、一過性
の発現系で測定され得て、あるいは植物ゲノム内への安
定に組み込まれるための選別ののち、決定され得る。技
術としては、植物組織のインビトロ培養、そして多くの
場合に、全植物体への移植が知られている。導入された
遺伝子を、もともと形質転換された植物から商業的に有
用な培養物に転移する技術は、当業者には知られてい
る。

【００７５】以下に示されている以外は、クローニング
の標準技術、ＤＮＡの単離、増幅および精製、ＤＮＡリ
ガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ
およびそのようなものを含む酵素反応の標準技術、ＰＣ
Ｒ技術および種々の分離技術は、既知の技術であって、
通常当業者に用いられている。多くの標準技術は以下の
文献に記載されている。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８
２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ；Ｗｕ（編）（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．６８；Ｗｕら（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１００および１０１；ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏ
ｌｄａｖｅ（編）（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（編）（１９７２）Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔ
ｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ；ＯｌｄおよびＰｒｉｍｒｏｓｅ
（１９８１）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＧｅｎｅ
Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏ
ｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａＰｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌ
ｅｙ；ＳｃｈｌｅｉｆおよびＷｅｎｓｉｎｋ（１９８
２）ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｉｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ（編）
（１９８５）ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＶｏｌＩおよび
II，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｈａｍｅ
ｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｓｅｔｌｏｗおよび
Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）ＧｅｎｅｔｉｃＥ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−４，ＰｌｅｎｕｍＰ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗｙｏｒｋ。ここに用いられている略
号および命名は、当分野に標準的であると思われ、ここ
に挙げられている専門雑誌に一般的に用いられている。

【００７６】当該分野では、修飾は遺伝子発現の改良さ
れ上昇した活性をこわすことなく、構造的配列およびこ
こに述べられている組換えプロモーター分子の特異的な
エンハンサーおよびプロモーターエレメントに対してな
されると理解されている。例えば、置換が、本発明の組
換えプロモーター分子の機能に重大な影響を及ぼすこと
なく、植物で発現可能なエンハンサーおよびプロモータ
ーエレメントを選択することにより行われ得ると考えら
れる。さらに、ここに用いられている活性エンハンサー
エレメントに相同なヌクレオチド配列が、植物細胞での
改良された遺伝子発現のために、組換えプロモーター構
築物中への置換やあるいは、付加のために良好に用いら
れると考えられる。

【００７７】出願人は、単子葉および双子葉植物を含む
植物種の、切形のプロモーターとの組み合わせに、複数
のエンハンサーエレメントを用いることで高レベルの遺
伝子発現が得られることを示した。特別な種での至適発
現のために適切なエレメントを選択することは、ここに
示されている教示（例えば、表にあげてあるガイダン
ス）を用いた当該分野の範囲内である。発現を最高にす
ることは、本開示の教示を用いることによって、当業者
に明白であるように、たがいの関係、およびＴＡＴＡボ
ックスの位置に関しての特別なエレメントの複数回の反
復と同様に異なるエンハンサーエレメントの配置方向お
よび挿入に起因することがまた理解される。

【００７８】当業者によって、本発明の目的は、ここに
記載されている方法および技術の変法、修飾あるいは同
等の方法を用いて、不当な実験上の支出を伴うことなく
達成されることが認められるであろう。当業者にはま
た、特別に記載されたものの他に、当分野の代替法がこ
こに記載されている組換えプロモーターの機能性を達成
するのに可能であることを認めており、かつ本発明の組
換えプロモーター分子と同等の機能を達成するためにど
のように代替法を用いるかは、明白である。本発明で
は、当業者により認識され、かつ本開示の精神、および
範囲に包含される変法、修飾および同等の方法を含むこ
とが意図される。

【００７９】次の実施例は、例示を目的として提供され
ているだけであって本発明の範囲を限定することを意図
しているのではない。

【００８０】

【実施例】

（実施例１）ハイブリッドプロモーターを含むプラスミ
ドの構築標準的な分子生物学的技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１
９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋに従
って実施された。本発明で用いられた全てのプラスミド
は、当該分野で容易に使用可能である物質を用いて、不
当な実験を行うことなく、当該分野の当業者により、本
明細書の指示に従って調製され得る。

【００８１】（ａ）ｐ３５ＳＧＮ、ｐ３５ＳＩＧＮ、ｐ
ＧＮおよびｐＩＧＮ構築物プラスミドｐ３５ＳＧＮは、ＮＯＳ３’終止シグナル
（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．
６：３９０１−３９０７）に結合されたβ−グルクロニ
ダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を導くＣａＭＶΔ３５Ｓプロモ
ーターを含むｐＢＩ１２１からの、８００ｂｐＨｉｎｄ
III／ＥｃｏＲ１断片をｐＵＣ１１８（Ｖｉｅｉｒａお
よびＭｅｓｓｉｎｇ（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ．１５３：３−１１）に結合することによっ
て得られた。ｐ３５ＳＩＧＮを構築するために、１１９
（Ｂｃｌ１）から６７２（Ｂａｌ３１削除された）のヌ
クレオチドを含んだトウモロコシＡｄｈ１のイントロン
１の５５７ｂｐ断片を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で末端をつな
いで、ｐＢＩ１２１のＳｍａ１部位にクローン化した。
ｐ３５ＳＩＧＮのＣａＭＶΔ３５Ｓプロモーター、イン
トロン１、ＧＵＳ遺伝子およびｎｏｓ３’終止シグナル
は、１本のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲ１断片としてｐＵＣ
１１８にサブクローン化された。

【００８２】プロモーターのない制御プラスミドｐＩＧ
Ｎを作るために、ｐ３５ＳＩＧＮ中のイントロン１−Ｇ
ＵＳ−ＮＯＳ−断片（ＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１）を、ｐ
ＵＣ１１８にクローン化した。プラスミドｐＧＮは、ト
ウモロコシＡｄｈ１のイントロン１、およびＧＵＳを含
むＢａｍＨ１／ＳａｃＩ断片を、ｐ３５ＳＧＮからのＢ
ａｍＨ１／ＳａｃＩ ’ＧＵＳ’断片で置換することに
よってｐＩＧＮから得た。

【００８３】（ｂ）ｐΔ３５ＳＧＮおよびｐΔ３５ＳＩ
ＧＮ構築物プラスミドｐΔ３５ＳＧＮおよびｐ３５ΔＳＩＧＮは、
ｐΔ３５Ｓ（−９０）のＳａｌ１／ＢａｍＨ１ ’Δ３
５Ｓ’断片を付加することによってｐＧＮおよびｐＩＧ
Ｎから得た。親プラスミド、ｐ３５ＳＣＮおよびｐ３５
ＳＩＣＮは、Ｗａｌｋｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６６２４−６６２８
に記載されている。Ｓａｌ１リンカーは、ｐ３５ＳＣＮ
中のＣａＭＶΔ３５Ｓプロモーターの−９０位のＥｃｏ
Ｒ１部位（ヌクレオチド７６６５番）に挿入された。切
形の３５Ｓプロモーター断片、ＣＡＴ遺伝子および３’
終止シグナルを含むＳａｌ１からＨｉｎｄ１１１までの
断片は、ひきつづいてｐＵＣ１９中にクローン化され、
ｐΔ３５Ｓ（−９０）が得られた。切形のプロモーター
は、３５Ｓプロモーターのｃａｐ部位から上流４５ｂｐ
に末端を有し、そしてＴＡＴＡボックスを残しているこ
とが確認されたが、しかし３５ＳＣＮの発現に必要な上
流配列が欠除していた。

【００８４】（ｃ）ｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＧＮおよびｐ６
ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮ親ベクターｐＡＤＨＣＡＴおよびｐＡＤＨＣＡＴ−１４
０の構築は、上記のＷａｌｋｅｒら（１９８７）に記載
されている。Ａｄｈ１プロモーター（−１０９４から＋
１０６）を含むＢａｍＨ１断片を、ｐＩＧＮのＡｄｈ１
イントロン１配列の上流にクローン化して、ｐＡＤＨＩ
ＧＮを得た。−１４０から＋１０６を含む切形のＡｄｈ
１プロモーター断片を、ｐＡＤＨＣＡＴ−１４０からの
ｐＧＮおよびｐＩＧＮにサブクローン化して、ｐΔＡＤ
ＨＧＮおよびｐΔＡＤＨＩＧＮを得た。

【００８５】嫌気性調節エレメント（ＡＲＥ）は、トウ
モロコシＡｄｈ１プロモーターの−１４０から−９９の
間に認められる。このＡＲＥは２の配列エレメントから
なっている。すなわち、−１３３から−１２４を含む領
域Ｉと、−１１３および−９９を含む領域IIとである。
ＡＲＥは、Ｐｓｔ１断片として単離し（Ｗａｌｋｅｒら
（１９８７）上記）、そしてｐΔＡＤＨＩＧＮの切形の
Ａｄｈ１プロモーターの上流にクローン化して、ｐＡＲ
ＥΔＡＤＨＩＧＮを得た。ＡＲＥの配列を逆にするの
に、ｐＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮのポリリンカー（−１４０
の上流）から−９９までのＳａｌ１断片を、ｐΔＡＤＨ
ＩＧＮの１個しかないＳａｌ１部位にクローン化して、
ｐＡＲＥ（−）ΔＡＤＨＩＧＮを得た。

【００８６】複数のＡＲＥ配列を含むクローン（例え
ば、ｐ２ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮ、ｐ４ＡＲＥΔＡＤＨＩ
ＧＮあるいはｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮ）は、次のよう
にクローン化した。ｐＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮは、Ｈｉｎ
ｃｌｌで消化し、そしてＰｓｔ１リンカーを加えた。次
いで−１４０から−９９のＡＲＥを含むＰｓｔ１断片を
単離し、そしてＰｓｔ１部位（−１４０）の上流にある
ｐＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮにクローン化した。反復された
ＡＲＥの数、およびその配置はヌクレオチド配列分析に
よって認められた。

【００８７】プラスミドｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＧＮは、ト
ウモロコシＡｄｈ１のイントロン１およびＧＵＳを含む
ＢａｍＨ１／Ｓａｃ１断片をｐ３５ＳＧＮのＢａｍＨ１
／Ｓａｃ１ ’ＧＵＳ’断片で置換することによってｐ
６ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮから得た。

【００８８】（ｄ）ｐ４ＯＣＳΔ３５ＳＩＧＮ、ｐ６Ａ
ＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨＩＧＮおよびｐ６ＡＲＥ４ＯＣＳ
Δ３５ＳＩＧＮ構築物ＯＣＳエレメントは、ｏｃｓ上流プロモーター領域（Ｄ
ｅＧｅｎｅら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．１：４９９−５１０）のＨｐａII（−２９２）
からＢａｍＨＩ（−１１６）の部分を含むＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ断片として、Ｅｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭ
ＢＯＪ．６：１１−１６および（１９８７）ＥＭＢＯ
Ｊ．６：３２０３−３２０８に記載の方法で単離され
た。ｏｃｓ遺伝子からのＯＣＳ−エレメントの４回のコ
ピーを含むプラスミドｐ４ＯＣＳＡＤＨＣＡＴは、Ｅｌ
ｌｉｓら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３２０３−３
２０８に従って調製された。この４ＯＣＳエレメント
は、Ｘｈｏ１リンカーのＳｍａ１部位への平滑末端連続
反応によって作られたｐ４ＯＣＳＡＤＨＣＡＴの誘導体
であるｐ４ＯＣＳＸからのＳａｌ１／Ｘｈｏ１断片とし
て調製された。４ＯＣＳエレメントは、ｐ４ＯＣＳΔ３
５ＳＩＧＮを得るためにｐΔ３５ＳＩＧＮのＳａｌ１部
位に付加され、ならびに、ｐ６ＡＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨ
ＩＧＮを得るためにｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＩＧＮのＳａｌ
１部位に付加された。この両者とも図５に示すように４
ＯＣＳ配列の同じ配向性を有している。プラスミドｐ６
ＡＲＥ４ＯＣＳΔ３５ＳＩＧＮは、’ΔＡＤＨＩＧＮ’
を含むＳａｌ１／ＥｃｏＲ１断片をｐΔ３５ＳＩＧＮの
Ｓａｌ１／ＥｃｏＲ１断片で置換することによって、ｐ
６ＡＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨＩＧＮから得られた。

【００８９】（ｅ）ｐ６ＡＲＥΔ３５ＳＩＧＮおよびｐ
６ＡＲＥΔ３５ＳＧＮ構築物プラスミドｐ６ＡＲＥΔ３５ＳＩＧＮは、’ΔＡＤＨＧ
Ｎ’を含むＳａｌ１／ＥｃｏＲ１断片をΔ３５ＳＩＧＮ
からのＳａｌ１／ＥｃｏＲ１断片で置換することによっ
てｐ６ＡＲＥΔＡＤＨＧＮから得られた。プラスミドｐ
６ＡＲＥΔ３５ＳＧＮは、Ｓａｌ１／ＢａｍＨ１ ’Δ
ＡＤＨ’断片をｐΔ３５Ｓ（−９０）からのＳａｌＩ／
ＢａｍＨＩで置換することによってｐ６ＡＲＥΔＡＤＨ
ＧＮから得られた。

【００９０】（ｆ）プラスミドＤＮＡの精製上記構築物のプラスミドＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ
１０９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら（１９８５）
Ｇｅｎｅ３３：１０３−１１９）から調製され、そし
てＣｓＣｌ濃度勾配遠心分離に２回かけることによって
精製された。最終調製物は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ中に１ｍｇ／
ｍｌになるよう再懸濁され、そしてその一部分を用いて
ファルマシアＴ７キットを用いてのＤＮＡ配列決定によ
り、およびＨｉｎｄ１１１／Ｓａｌ１／ＢａｍＨ１によ
る３ヶ所消化の制限断片およびＰｖｕ１１／Ｓｍａ１に
よる２ヶ所消化の制限断片の大きさを決めることによっ
て、配列の転位が生じていないことを確認した。これら
の調製物で、ゲル電気泳動において、偽のバンドを示さ
なかったもののみを次に続く電気穿孔法に用いた。

【００９１】（実施例２）植物細胞の培養およびプロト
プラストの単離プロトプラストは、次の細胞系から単離された。ＴＭ、
これはヒトツブコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍｍｏｎｏｃ
ｏｃｃｕｍ）の確立された系である（Ｋｏａら（１９７
０）Ｃａｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｌ．１２：２９
７−３０１）；ＢＭＳ、これは、Ｚｅａｍａｙｓｃ
ｖ．ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ（Ｃｈｏ
ｕｒｅｙおよびＺｕｒａｗｓｋｉ（１９８１）Ｔｈｅｏ
ｒ．ａｎｄＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．５９：３４１−３
４４）である；Ｌ１、これは、Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍの２群の７個の染色体と小麦の
４２個の染色体を含む６倍体小麦培養物ビルモリン２７
に２染色体付加した細胞系であり、小麦とＴｈｉｎｏｐ
ｙｒｕｍｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍの複数倍体ハイブリ
ッドの一部を小麦へもどし交配することにより得られた
（ｃｖビルモリン２７）；ＬＭ、これはＬｏｌｉｕｍ
ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ（ＳｍｉｔｈおよびＳｔｏｎｅ
（１９７３）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２６：
１２３−１３３）に由来する系である；ＮｐＴ₅、これ
はＮｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉ
ａの葉のプロトプラスト培養に由来する；およびＥＲ、
これは未成熟胚から出発し、４ヶ月間液体浮遊培養で維
持されたＯｒｙｚａｓａｔｉｖａｃｖ．Ｔａｉｐｅ
ｉ３０９の胚培養である。細胞浮遊物の維持のために
用いられる培地；プロトプラストの単離の用いられる酵
素、およびプロトプラスト培養に用いられる培地は後述
の表４に示されている。

【００９２】（実施例３）プロトプラストの電気穿孔法完全消化の後、プロトプラストは、３２８、１１０およ
び５０μｍメッシュのふるいにかけられた（Ｌ１および
ＴＭ系の場合には５０μｍメッシュに２回かける）。低
速の遠心分離（８０ｇで５分間）での次降に続いて、個
々の細胞型に対して最適である洗浄溶液中に再懸濁させ
た（後述の表１参照）。オオムギの葉肉プロトプラスト
は、０．３７５Ｍマンニトール、１０ｍＭＭＥＳ、ｐ
Ｈ５．８、２０５ｍＭＮａＣｌ、３．５ｍＭＫＣ
ｌ、９．４ｍＭＭｇＳＯ₄、８．４ｍＭＭｇＣｌ₂
３．４ＣａＣｌ₂および０．８７５ｍＭＮａＨＣＯ₃で
洗浄された。このプロトプラストは再度沈降、洗浄、沈
降され、そしてＴＢＳ９バッファー（Ｔｒｉｓ３．６
３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ８７６ｍｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ８．７８ｍｇ／ｌ、マンニトール５０ｇ／ｌ、ｐ
Ｈ９．０）に、２×１０⁶プロトプラスト／ｍｌの濃度
で再懸濁された（ＴａｙｌｏｒおよびＬａｒｋｉｎ（１
９８８）Ａｕｓｔｒ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：５２−
５５）。

【００９３】電気穿孔法の直前に、５μｌのプラスミド
ＤＮＡを、５μｌの１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ
８．０、１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ液に溶解して入れた試
験管に、２００μｌのプロトプラスト懸濁液（オオムギ
葉肉の場合は１００μｌ）を加えた。

【００９４】この混合物を、電気穿孔法用のチャンバー
（電極間が２ｍｍ）に移し、１パルス幅は５ｍｓ、１０
０ｍｓのディレイで２７５Ｖ（１３７５Ｖ／ｃｍ）のパ
ルスが３回、２４μＦのコンデンサーの電極間でかけら
れた（オオムギの葉肉プラトプラストの場合には２００
Ｖが用いられた）。プロトプラストを５秒間おいておい
た後、プロトプラスト懸濁液を、６００μｌの洗浄液を
入れた小型遠心管にピペットでもどした。そのチューブ
を、おだやかな回転で（＜１００ｇ）、５分間遠心し、
上清をとり除いた。そしてプロトプラストを１ｍｌの培
地に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液は、３５ｍｍの
ペトリ皿に移して、パラフィルムでシールし、そしてＧ
ＵＳ遺伝子の発現まで、２５℃の暗所でインキュベート
した。

【００９５】（実施例４）電気穿孔されたプロトプラス
トでのＧＵＳ遺伝子発現の分析４４〜４８時間のインキュベーションの後、４００μｌ
の洗浄液をペトリ皿に加えて、プロトプラストサンプル
をおだやかに小型遠心管にピペットで加えた。このチュ
ーブを１００ｇで８分間遠心分離して、上清を取り除い
た。必要とされるかあるいは使用されるまでプロトプラ
ストの沈澱物を−８０℃で保存した。各々の沈澱物を、
ボルテックス・ミキサーに供するために、２５０μｌの
抽出バッファー（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７）前
出）に懸濁した。このサンプルを、微小チップ・プロー
ブをとりつけたＬａｂｓｏｎｉｃ１５１０超音波機を用
いて５５Ｗにセットして、５秒間氷上で超音波処理し
た。破片は、１分間小型遠心機での遠心分離により沈澱
物とし、透明な上清については、Ｂｉｏ−Ｒａｄキット
を用いて、製造者のすすめる方法に従って、総タンパク
量を測定した。構築物の各々のセットについて、１００
μｌのリーシスバッファー中に、５−５０μｇの溶解さ
れた総タンパク量を含む上清の一部分を用いて蛍光ＧＵ
Ｓ定量法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７）前出）を
行った。さらに、２ｍＭ４−メチル−ウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）を含む、１００μ
ｌ抽出バッファーを加えて、その混合物を手短にボルテ
ックスミキサーにかけ、そして２０〜１６０分間のうち
の一定時間、３７℃でインキュベートした。１０００μ
ｌの０．２ＭＮａ₂ＣＯ₃を加えることにより反応を停
止した。そして励起波長３６５ｎｍにして、４５５ｎｍ
の蛍光を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光計を用いて測
定した。

【００９６】（実施例５）溶液および培地の調製培養培地ＣＭ１は、ｐＨを５．８に調整したＳｃｏｗｃ
ｒｏｆｔおよびＡｄａｍｓｏｎ（１９７６、Ｐｌａｎｔ
Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．７：３９−４２）に記載されたＣ
Ｓ５培地である。ＣＭ２は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅおよび
Ｓｋｏｏｇ（１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．
１５：４７３−４９７）のミネラル塩、１７０ｍｇ／ｌ
Ｌ−アスパラギン、０．７７ｍｇ／ｌグリシン、
０．１３ｍｇ／ｌニコチン酸、０．０２５ｍｇ／ｌパ
ントテン酸カルシウム、０．０２５ｍｇ／ｌサイアミン
・ＨＣｌ、０．０２５ｇ／ｌピロドキシン・ＨＣｌ、
４ｍｇ／ｌ２，４，−ジクロロフェノキシ酢酸（２，
４−ｄ）、および２０ｇ／ｌシュークロースを含む、ｐ
Ｈ５．８の培地である。ＣＭ３は、ＷｔＭ１（Ｙｏｕｎ
ｇら、１９８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２
４５−２２５１）である。ＣＭ４は、Ｗｈｉｔｅの主要
無機塩（１９６３、Ｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔｃｅｌｌ
ｓ，第２編、ＲｏｎａｌｄＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏ
ｒｋに記載）、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ
（１９６２、上記）の副成分としての塩およびビタミ
ン、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、５ｇ／ｌ酵母
抽出物、１０ｍｇ／ｌクエン酸第２鉄、１ｍｇ／ｌ
インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、および４０ｇ／ｌ
シュークロースを含むｐＨ５．５の培地である。ＣＭ５
は、Ｒ２培地の主要および副成分の無機要素（Ｏｈｉｒ
ａら、１９７３、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏ
ｌ．１４：１１１３−１１２１）、９ｍｇ／ｌＦｅＣ
ｌ₃、１１．２ｍｇ／ｌＮａ₂ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｌサ
イアミン・ＨＣｌ、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、２０ｇ／
ｌシュークロースを含むｐＨ５．９の培地である。

【００９７】プロトプラスト洗浄液ＰＷ１は、０．３Ｍ
マンニトール、１５６ｍＭＮａＣｌ、３．５ｍＭＫ
Ｃｌ、９．４ｍＭＭｇＳＯ₄、８．４ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、３．４ｍＭＣａＣｌ₂、０．９ｍＭＮａＨＣＯ
₃からなるｐＨ６．０の液である。ＰＷ２は、Ｂ５培地
の主要および副成分ミネラル塩（Ｇａｍｂｏｒｇら（１
９６８）Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．５０：１５１−１
５８）、２７ｍＭマンニトール１０９ｍＭＫＣｌ、
１０５ｍＭＭｇＣｌ₂、３３ｍＭＣａＣｌ₂、３ｍＭ
２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）からなるｐＨ５．７の液である。ＰＷ３は、０．５
６８Ｍマンニトール、８０ｍＭＣａＣｌ₂、０．２％
ＭＥＳからなるｐＨ５．８の液である。ＰＷ４は、マン
ニトールの濃度を４９ｍＭにしたＰＷ２の液である。

【００９８】消化用酵素混合物ＥＤ１は、ｐＨ５．８に
調整した洗浄液ＰＷ１に、１％（ｗ／ｖ）セルリジン
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１％（ｗ／ｖ）ドリセラー
ゼ、および１％（ｗ／ｖ）マセロザイム（Ｏｎｏｚｕｋ
ａＲ−１０）を、混合してなる。ＥＤ２は、１％（ｗ
／ｖ）セルリジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、０．５％
（ｗ／ｖ）ヘミセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、０．０２％
ペクトリアーゼＹ−２３（ＳｅｉｓｈｉｎＰｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、５０ｍＭＣａＣｌ₂、およ
び１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２Ｍマンニトール
を含み、ｐＨ５．８に調整したものである。ＥＤ３は、
１％（ｗ／ｖ）セルラーゼＲＳ（ＹａｋｕｌｔＨｏ
ｎｓｈａ）、０．１％（Ｗ／ｖ）ドリセラーゼ、０．０
６％（ｗ／ｖ）ペクトリアーゼＹ−２３、０．２％
（ｗ／ｖ）マセロザイムＲ−１０、０．４９５Ｍマ
ントニール、０．１８９Ｍグルコース、２ｍＭアス
コルビン酸、１４ｍＭＣａＣｌ₂、および３ｍＭＭ
ＥＳを含み、ｐＨ５．８に調整したものである。ＥＤ４
は、０．５％（ｗ／ｖ）セルラーゼＲＳ、０．６８％
（ｗ／ｖ）ドリセラーゼ、０．０５％ペクトリアーゼ
Ｙ−２３、６．５ｍＭＭＥＳ、０．３２５Ｍマンニトー
ルおよび４０ｍＭＣａＣｌ₂を含んでいて、これに０．
５％（ｗ／ｖ）の活性炭を加えた。３０分間おだやかに
攪拌した後、１０，０００ｇで遠心分離して、活性炭を
取り除いた。溶液をｐＨ５．９に調整して、濾過によっ
て減菌した。ＥＤ５は、１％（ｗ／ｖ）セルラーゼＲ
Ｓ、０．１％（ｗ／ｖ）ドリセラーゼ、０．１％（ｗ／
ｖ）ペクトロリアーゼＹ−２３、０．３５Ｍマンニ
トールおよび３ｍＭＭＥＳとを含み、ｐＨ５．９に調
整したものである。

【００９９】プロトプラスト培地は、全て使用の前に、
濾過により滅菌した。プロトプラスト培地ＰＣ１は、Ｋ
ａｏおよびＭｉｃｈａｙｌｕｋ（１９７５）Ｐｌａｎｔ
ａ１２６：１０５−１１０の培地のアミノ酸を含まな
い、すなわちアデニン、グアニシン、チミン、ウラシ
ル、ヒポキサンチン、ヘキサン、リボフラビンおよびビ
タミンＢ₁₂を、ＶａｓｉｌおよびＶａｓｉｌ（１９８
０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．５６：９７−９９
の指示に従って除いたもので、しかし、０．４Ｍグルコ
ース、０．１Ｍシュークロース、１ｍｇ／ｌ２，４
−Ｄ、０．２ｍｇ／ｌゼアチンを含んでいて、ｐＨを
５．６に調整したものである。この培地は、濾過滅菌の
前にＡｍｉｃｏｎＹＭ１０膜（Ｄａｖｉｅｓら（１９
８０）ＰｌａｎｔＳｃｉ．６０：２３７−２４４）で
濾過した。ＰＣ２は、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏ
ｏｇ（１９６２、前出）の無機成分、７．７ｍｇ／ｌ
グリシン、１．３ｍｇ／ｌニコチン酸、０．２５ｍｇ
／ｌチアミン・ＨＣｌ、０．２５ｍｇ／ｌピリドキ
シン・ＨＣｌ、０．２５ｍｇ／ｌパントテン酸カルシ
ウム、１６７ｍｇ／ｌＬ−アスパラギン、１ｇ／ｌ
Ｌ−グルタミン、６６ｇ／ｌマンニトール、２０ｇ／
ｌシュークロース、１．６７ｇ／ｌグルコース、２
％（ｖ／ｖ）ココナッツウォーター（Ｇｉｂｃｏ）、４
ｍｇ／ｌ２，４−Ｄおよび０．１ｍｇ／ｌ６−ベン
ジルアミノプリンとからなり、ｐＨ５．８に調整したも
のである。ＰＣ３は、ＫａｏおよびＭｉｃｈａｙｌｕｋ
（１９７５、前出）の主要および副成分ミネラル、１ｍ
ｇ／ｌニコチンアミド、１ｍｇ／ｌピロドキシン・
ＨＣｌ、１ｍｇ／ｌサイアミン・ＨＣｌ、１ｍｇ／ｌ
パントテン酸カルシウム、０．４ｍｇ／ｌ葉酸、
０．０２ｍｇ／ｌｐ−アミノ安息香酸、０．０１ｍｇ
／ｌビオチン、４００ｍｇ／ｌｍ−イノシトール、
２％（ｖ／ｖ）ココナッツウォーター、７５０ｍｇ／ｌ
カゼイン加水分解物、２００ｍｇ／ｌＬ−グルタミ
ン、１５０ｍｇ／ｌＬ−アスパラギン酸、１０ｇ／ｌ
シュークロース、１０８ｇ／ｌグルコース、１ｍｇ
／ｌ２，４−Ｄ、０．２ｍｇ／ｌ１−ナフタレン酢
酸、０．２ｍｇ／ｌゼアチンとからなり、ｐＨを５．
６に調整したものである。ＰＣ４は、ＣＭ４に７３ｇ／
ｌソルビトールに加えたものである。ＰＣ５は、ＣＭ
５の成分にＢ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇら、１９６８、上
記）のビタミン、Ｋａｏ（１９７７、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．１５０：２２５−２３０）の糖および有機
酸、１３７ｇ／ｌシュークロース、２ｍｇ／ｌ２，
４−Ｄおよび０．１ｍｇ／ｌカイネチンを加えて、ｐ
Ｈを５．７に調整したものである。

【０１００】

【表１】

【０１０１】

【表２】

【０１０２】

【表３】

【０１０３】

【表４】

【０１０４】単子葉植物細胞で、植物で発現可能な構造
遺伝子の発現を促進するための組換えプロモーター分子
が提供される。この組み換えプロモーター分子は、ＡＲ
ＥおよびＯＣＳエレメントからなる群より選択される複
数のエンハンサーエレメント、植物で発現可能な切形の
プロモーター、およびイントロンを有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】種々の組換えプロモーター分子の構築に使用さ
れるＤＮＡ結合体であって、プロモーター領域Ｘのプロ
モーター活性の測定に使用される一般的なプラスミドを
示す。

【図２】種々の組換えプロモーター分子の構築に使用さ
れるＤＮＡ結合体であって、種々の構築物中のプロモー
ター領域Ｘの構造を示す。

【図３】種々の組換えプロモーター分子の構築に使用さ
れるＤＮＡ結合体であって、△ＡＤＨプロモーターを図
示し、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位が示されて
いる。塩基番号は、構築物が得られた遺伝子の配列の中
での、天然の位置を示す。

【図４】種々の組換えプロモーター分子の構築に使用さ
れるＤＮＡ結合体であって、△３５Ｓプロモーターを図
示し、ＴＡＴＡボックスおよびｏｃｓエレメントが示さ
れている。塩基番号は、構築物が得られた遺伝子の配列
の中での、天然の位置を示す。

【図５】種々の組換えプロモーター分子の構築に使用さ
れるＤＮＡ結合体であって、６回のＡＲＥエレメントを
図示し、各ＡＲＥ（トウモロコシＡｄｈ１遺伝子中の−
１４０〜−９９位）のＩ領域およびII領域が示されてい
る。このエレメントは、天然の方向の一つのＡＲＥと、
その後の逆方向の５つのＡＲＥからなる。塩基番号は、
構築物が得られた遺伝子の配列の中での、天然の位置を
示す。

【図６】種々の組換えプロモーター分子の構築に使用さ
れるＤＮＡ結合体であって、４ＯＣＳエレメントを図示
し、このエレメントは、ＯＣＳ遺伝子由来の−２１１〜
−１７２領域の４０ｂｐの４回反復を含む。塩基番号
は、構築物が得られた遺伝子の配列の中での、天然の位
置を示す。

フロントページの続き (71)出願人 590003283 コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガナイゼーションオーストラリア国キャピタルテリトリーキャムベルライムストーンアベニュー（番地なし) (72)発明者デイビッドアイ．ラストオーストラリア連邦エーシーティ，ホールト，リンドラムクレセント 19 (72)発明者リチャードアイ．エス．ブレッテルオーストラリア連邦エーシーティ，カンバ，カットブッシュストリート 37 (72)発明者ダグラスエー．チャンバレンオーストラリア連邦エーシーティ，ファラー，ビーズリーストリート 210 (72)発明者フィリップジェイ．ラーキンオーストラリア連邦エーシーティ，ウェストン，マッキーンズストリート 82 (72)発明者エレンエル．マーシュオーストラリア連邦エーシーティ，ブラッドン，アイジョングストリート 32 (72)発明者ジェームズダブリュー．ピーコックオーストラリア連邦エーシーティ，ディーキン，ブラッシーストリート 16 (72)発明者エリザベスエス．デニスオーストラリア連邦エーシーティ，ヤラルムラ，ホープタウンサーキット 100 (72)発明者マークアール．オリーブオーストラリア連邦エーシーティ，クック，デクスターストリート 138 (72)発明者ジェフリージー．エリスオーストラリア連邦エーシーティ，マッコリー，ロバーツストリート 19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単子葉植物細胞において、植物で発現可能
な構造遺伝子の発現を促進する組換えプロモーター分子
であって、（ａ）ＡＲＥおよびＯＣＳエレメントからなる群より選
択される複数のエンハンサーエレメント；（ｂ）該複数のエンハンサーエレメントの３’側に位置
し、転写開始に必要なＴＡＴＡボックス領域を提供す
る、植物で発現可能な切形のプロモーター；および（ｃ）植物で発現可能な構造遺伝子中の転写開始部位と
翻訳開始部位との間に位置するイントロンとして天然に
見いだされるヌクレオチド配列；を有し、このことによ
って該組換えプロモーター分子の３’側に位置する植物
で発現可能な構造遺伝子が、該組換えプロモーター分子
の調節制御下において、該単子葉植物中で発現される、組換えプロモーター分子。
【請求項２】前記切形のプロモーターが、切形のトウモ
ロコシＡｄｈ１プロモーターおよび切形のＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターからなる群より選択される、請求項１
に記載の組換えプロモーター分子。
【請求項３】前記切形のプロモーターが切形のトウモロ
コシＡｄｈ１プロモーターである、請求項１に記載の組
換えプロモーター分子。
【請求項４】前記切形のプロモーターが切形のＣａＭＶ
３５Ｓプロモーターである、請求項１に記載の組換え
プロモーター分子。
【請求項５】４ＯＣＳΔ３５ＳＩ構造を有する請求項１
に記載の組換えプロモーター分子であって、４ＯＣＳと
はＯＣＳの４回の反復コピーをさして言い、Δ３５Ｓが
切形のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターであり、そして、
Ｉが植物で発現可能な遺伝子中の転写開始部位と翻訳開
始部位との間に位置するイントロンとして天然に見い出
されるヌクレオチド配列である、組換えプロモーター分
子。
【請求項６】６ＡＲＥΔＡＤＨＩ構造を有する請求項１
に記載の組換えプロモーター分子であって、６ＡＲＥと
は、ＡＲＥの６回の反復コピーをさして言い、ΔＡＤＨ
が切形のＡｄｈプロモーターであり、そしてＩが、植物
で発現可能な遺伝子中の転写開始部位と翻訳開始部位と
の間に位置するイントロンとして天然に見い出されるヌ
クレオチド配列である、組換えプロモーター分子。
【請求項７】６ＡＲＥ４ＯＣＳΔＡＤＨＩ構造を有する
請求項１に記載の組換えプロモーター分子であって、６
ＡＲＥとは、ＡＲＥの６回の反復コピーをさして言い、
４ＯＣＳとはＯＣＳの４回反復コピーをさして言い、Δ
ＡＤＨが切形のＡｄｈプロモーターであって、そしてＩ
は、植物で発現可能な遺伝子中の転写開始部位と翻訳開
始部位との間に位置するイントロンとして天然に見い出
されるヌクレオチド配列である、組換えプロモーター分
子。
【請求項８】請求項１に記載の、組換えプロモーター分
子を有する、ベクター。
【請求項９】請求項１に記載の組換えプロモーターを有
するベクターを含む細菌細胞。
【請求項１０】請求項１に記載の組換えプロモーター分
子を有するように転換され、そして、該組換えプロモー
ター分子の制御下に構造遺伝子を発現する、形質転換可
能で再生可能な単子葉植物。
【請求項１１】請求項１０に記載のトウモロコシ。
【請求項１２】請求項１０に記載のコムギ。
【請求項１３】請求項１０に記載のオオムギ。
【請求項１４】請求項１０に記載のコメ。