JPH075171A - 補体感受性赤血球の測定方法 - Google Patents
補体感受性赤血球の測定方法Info
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- JPH075171A JPH075171A JP16866693A JP16866693A JPH075171A JP H075171 A JPH075171 A JP H075171A JP 16866693 A JP16866693 A JP 16866693A JP 16866693 A JP16866693 A JP 16866693A JP H075171 A JPH075171 A JP H075171A
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- blood cell
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Abstract
(57)【要約】
【目的】血球細胞膜に存在する膜蛋白であるＣＤ５５と
ＣＤ５９とを測定することにより、発作性夜間血色素尿
症の原因となる補体感受性赤血球を測定する方法におい
て、熟練を要しない普及型のものを提供する。 【構成】抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５９抗体を発光標識物
質と共に血球に反応させ、反応後の血球をフローサイト
メトリーに通す。そして血球ごとに抗ＣＤ５５抗体の標
識物質、抗ＣＤ５９抗体の標識物質を励起させ発光させ
てそれぞれの発光強度を測定する。測定された一方の発
光物質の発光強度を横軸、他方の発光物質の発光強度を
縦軸にとって１つの血球を１点とする発光強度相関分布
図を想定する。分布図において、血球細胞膜上のＣＤ５
５、ＣＤ５９の構成により決定される血球の型に対応し
て領域を設定する。各領域内の血球数を計数してそれぞ
れの領域に含まれる血球数または全体の血球数に対する
その領域内の血球数の割合を目視可能な状態として出力
する。
ＣＤ５９とを測定することにより、発作性夜間血色素尿
症の原因となる補体感受性赤血球を測定する方法におい
て、熟練を要しない普及型のものを提供する。 【構成】抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５９抗体を発光標識物
質と共に血球に反応させ、反応後の血球をフローサイト
メトリーに通す。そして血球ごとに抗ＣＤ５５抗体の標
識物質、抗ＣＤ５９抗体の標識物質を励起させ発光させ
てそれぞれの発光強度を測定する。測定された一方の発
光物質の発光強度を横軸、他方の発光物質の発光強度を
縦軸にとって１つの血球を１点とする発光強度相関分布
図を想定する。分布図において、血球細胞膜上のＣＤ５
５、ＣＤ５９の構成により決定される血球の型に対応し
て領域を設定する。各領域内の血球数を計数してそれぞ
れの領域に含まれる血球数または全体の血球数に対する
その領域内の血球数の割合を目視可能な状態として出力
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発作性夜間血色素尿症
の原因となる補体感受性赤血球（補体の攻撃に対して過
敏で壊れ易い赤血球）の測定方法に関する。
の原因となる補体感受性赤血球（補体の攻撃に対して過
敏で壊れ易い赤血球）の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】生体
内においては、Ｃ３で表示される補体が水により分解さ
れて生じたＣ３転換酵素を細胞膜上に沈着させ、非自己
の細胞膜であればこの補体を増幅活性化して膜障害性複
合体（ＭＡＣ）を形成し、細胞膜を溶解する。この際、
自己の細胞膜上にもたえず少量のＣ３転換酵素が形成さ
れる筈であるが、自己の細胞膜が溶解されないのは、細
胞膜にＧＰＩ（Glycosylphosphatidylinositol）アンカ
ー型蛋白質の一種であるＤＡＦ（以下これをＣＤ５５と
称す）やＭＡＣＩＦ（以下これをＣＤ５９と称す）が存
在して自己の補体による細胞膜の溶解を制御しているか
らである。このうち、前記ＣＤ５５はＣ３転換酵素を単
独で失活促進し、前記ＣＤ５９は自己のＣ８やＣ９に結
合してＭＡＣ形成を阻害する。
内においては、Ｃ３で表示される補体が水により分解さ
れて生じたＣ３転換酵素を細胞膜上に沈着させ、非自己
の細胞膜であればこの補体を増幅活性化して膜障害性複
合体（ＭＡＣ）を形成し、細胞膜を溶解する。この際、
自己の細胞膜上にもたえず少量のＣ３転換酵素が形成さ
れる筈であるが、自己の細胞膜が溶解されないのは、細
胞膜にＧＰＩ（Glycosylphosphatidylinositol）アンカ
ー型蛋白質の一種であるＤＡＦ（以下これをＣＤ５５と
称す）やＭＡＣＩＦ（以下これをＣＤ５９と称す）が存
在して自己の補体による細胞膜の溶解を制御しているか
らである。このうち、前記ＣＤ５５はＣ３転換酵素を単
独で失活促進し、前記ＣＤ５９は自己のＣ８やＣ９に結
合してＭＡＣ形成を阻害する。
【０００３】後天性疾患である発作性夜間血色素尿症
（ＰＮＨ）の患者は、前記ＣＤ５５やＣＤ５９が一部欠
損する血球を産出するため、生体内では睡眠による換気
不全の結果、局所的に該血球の膜においてＣ３変換酵素
が活性化され、赤血球膜が前記ＭＡＣによって溶解さ
れ、血管内溶血が起きると考えられる。このＰＮＨを診
断する現在の一般的な検査法として、砂糖水試験とハム
（Ｈａｍ）試験とがある。砂糖水試験は、砂糖水を蒸留
水に溶かし、この溶液９容に血液１容を加え、遠沈して
溶血の有無をみる試験である。ハム試験は、血清８容に
1/5ＮのＨＣｌを１容、５０％被検赤血球浮遊液１容を
加えてｐＨを調整し、溶血を起こせば陽性と判断する方
法である。砂糖水試験の場合、砂糖水を加えることで低
イオン化することにより、補体は免疫複合体で活性化さ
れ、赤血球膜上にＣ３転換酵素が形成されるが、ＰＮＨ
血液ではＣＤ５５が欠損しているため、Ｃ３以下の補体
活性化経路が活性化され、さらにＣＤ５９が欠損してい
るため、赤血球膜に孔が開き、溶血する。一方、ハム試
験の場合、ｐＨを下げることで膜において補体が活性化
され、赤血球膜上に同様にＣ３転換酵素が形成され、同
様の理由で溶血する。
（ＰＮＨ）の患者は、前記ＣＤ５５やＣＤ５９が一部欠
損する血球を産出するため、生体内では睡眠による換気
不全の結果、局所的に該血球の膜においてＣ３変換酵素
が活性化され、赤血球膜が前記ＭＡＣによって溶解さ
れ、血管内溶血が起きると考えられる。このＰＮＨを診
断する現在の一般的な検査法として、砂糖水試験とハム
（Ｈａｍ）試験とがある。砂糖水試験は、砂糖水を蒸留
水に溶かし、この溶液９容に血液１容を加え、遠沈して
溶血の有無をみる試験である。ハム試験は、血清８容に
1/5ＮのＨＣｌを１容、５０％被検赤血球浮遊液１容を
加えてｐＨを調整し、溶血を起こせば陽性と判断する方
法である。砂糖水試験の場合、砂糖水を加えることで低
イオン化することにより、補体は免疫複合体で活性化さ
れ、赤血球膜上にＣ３転換酵素が形成されるが、ＰＮＨ
血液ではＣＤ５５が欠損しているため、Ｃ３以下の補体
活性化経路が活性化され、さらにＣＤ５９が欠損してい
るため、赤血球膜に孔が開き、溶血する。一方、ハム試
験の場合、ｐＨを下げることで膜において補体が活性化
され、赤血球膜上に同様にＣ３転換酵素が形成され、同
様の理由で溶血する。
【０００４】しかし、これら砂糖水試験やハム試験は、
一定の補体濃度での溶血反応であるため、定性的な意味
合いの強い試験であると共に、貧血の一種であるTypeII
congenital dyserythropoietic amemiaにおいても陽性
所見を呈する。さらに、後述の赤血球構成や補体感受性
赤血球の割合を決定できないという欠点がある。
一定の補体濃度での溶血反応であるため、定性的な意味
合いの強い試験であると共に、貧血の一種であるTypeII
congenital dyserythropoietic amemiaにおいても陽性
所見を呈する。さらに、後述の赤血球構成や補体感受性
赤血球の割合を決定できないという欠点がある。
【０００５】ロス（Rosse,W.F.) 等は、１９６６年発行
の学術誌「J.Clin.Invest.45:736」において、補体濃度
とＰＮＨ赤血球の溶血度との関係により、ＰＮＨ赤血球
が補体感受性の明らかに異なる２ないし３群の赤血球集
団（ＰＮＨＩ、II、III型赤血球）、すなわち補体感受
性および非感受性赤血球より構成されていることを報告
している。また、ロス等による補体溶血感受性試験（Ｃ
ＬＳテスト）は、赤血球浮遊液と抗Ｉ抗体（原発性寒冷
凝集素症患者の血清を緩衝液で希釈したもの）との混合
液を、予め補体濃度が種々に調整してある補体希釈ヒト
血清にそれぞれ等量ずつ分注して反応させ、反応後溶血
液の上清液（Ｓ）の吸光度と等量の蒸留水で溶解した沈
査溶液（Ｒ）の吸光度を測定し、図３に示すように、補
体濃度を横軸にとり、吸光度の比（溶血度）Ｓ／Ｒを縦
軸にとって各補体濃度に対して吸光度の比Ｓ／Ｒをプロ
ットして補体溶血感受性曲線を描き、曲線の変曲点のＳ
／Ｒ値より補体感受性赤血球の割合を算出し、さらに、
補体溶血感受性曲線をボンクロウ（Von Krogh ）変換
して得た直線のＳ／Ｒが１．０の時の補体量から求めた
値（Ｃ’ＬＳＨ50Ｕ）を基準としてＰＮＨ赤血球を分類
する方法である。
の学術誌「J.Clin.Invest.45:736」において、補体濃度
とＰＮＨ赤血球の溶血度との関係により、ＰＮＨ赤血球
が補体感受性の明らかに異なる２ないし３群の赤血球集
団（ＰＮＨＩ、II、III型赤血球）、すなわち補体感受
性および非感受性赤血球より構成されていることを報告
している。また、ロス等による補体溶血感受性試験（Ｃ
ＬＳテスト）は、赤血球浮遊液と抗Ｉ抗体（原発性寒冷
凝集素症患者の血清を緩衝液で希釈したもの）との混合
液を、予め補体濃度が種々に調整してある補体希釈ヒト
血清にそれぞれ等量ずつ分注して反応させ、反応後溶血
液の上清液（Ｓ）の吸光度と等量の蒸留水で溶解した沈
査溶液（Ｒ）の吸光度を測定し、図３に示すように、補
体濃度を横軸にとり、吸光度の比（溶血度）Ｓ／Ｒを縦
軸にとって各補体濃度に対して吸光度の比Ｓ／Ｒをプロ
ットして補体溶血感受性曲線を描き、曲線の変曲点のＳ
／Ｒ値より補体感受性赤血球の割合を算出し、さらに、
補体溶血感受性曲線をボンクロウ（Von Krogh ）変換
して得た直線のＳ／Ｒが１．０の時の補体量から求めた
値（Ｃ’ＬＳＨ50Ｕ）を基準としてＰＮＨ赤血球を分類
する方法である。
【０００６】図３においては、補体感受性赤血球の組合
わせに対して曲線の例が表示してある。ここで、ＰＮＨ
型について説明すると、補体感受性が正常のものと同程
度のＰＮＨ赤血球をＰＮＨＩ型、５〜１０倍程度のもの
をＰＮＨII型、さらに１０倍以上のものをＰＮＨIII型
とする。また、ＰＮＨＩ型赤血球においては、前記ＣＤ
５５は正常またはやや低下、ＣＤ５９は正常またはやや
低下であるといわれている。ＰＮＨII型赤血球において
は、ＣＤ５５は中程度低下または欠損、ＣＤ５９につい
ては中程度低下または欠損といわれている。ＰＮＨIII
型は、ＣＤ５５、ＣＤ５９共に欠損しているといわれて
いる。
わせに対して曲線の例が表示してある。ここで、ＰＮＨ
型について説明すると、補体感受性が正常のものと同程
度のＰＮＨ赤血球をＰＮＨＩ型、５〜１０倍程度のもの
をＰＮＨII型、さらに１０倍以上のものをＰＮＨIII型
とする。また、ＰＮＨＩ型赤血球においては、前記ＣＤ
５５は正常またはやや低下、ＣＤ５９は正常またはやや
低下であるといわれている。ＰＮＨII型赤血球において
は、ＣＤ５５は中程度低下または欠損、ＣＤ５９につい
ては中程度低下または欠損といわれている。ＰＮＨIII
型は、ＣＤ５５、ＣＤ５９共に欠損しているといわれて
いる。
【０００７】上述したＣＬＳテストは、患者から採った
特殊な抗Ｉ抗体血清を必要とするため、一般的な検査法
となりえない（実際、本邦では福島医大、第１内科でし
かできない）という欠点がある。また、データの分析に
熟練を必要とする（変曲点の判断が難しい）上、手間が
かかるために時間を要するという欠点がある。
特殊な抗Ｉ抗体血清を必要とするため、一般的な検査法
となりえない（実際、本邦では福島医大、第１内科でし
かできない）という欠点がある。また、データの分析に
熟練を必要とする（変曲点の判断が難しい）上、手間が
かかるために時間を要するという欠点がある。
【０００８】本発明者等は、一般化可能な補体感受性赤
血球の測定法とし、次のような方法を開発し、既に「医
学のあゆみ Vol.155 No.13 1990. P950 〜P954」
および「British Journal of Haematology 1991.7
8.P545〜P550」において発表している。この方法は、以
下の手順で測定を行う方法である。 （１）赤血球浮遊液と抗ＣＤ５９モノクローナル抗体液
とを混合し反応させる。（２）フルオレセイン イソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ
＋Ｌ）を反応させる。（３）赤血球浮遊液とビオチン化
抗ＣＤ５５モノクローナル抗体液とを混合し反応させ
る。（４）フィコエリトリン（ＰＥ）結合ストレプトア
ビジンを反応させる。（５）フローサイトメトリーによ
り分析する。
血球の測定法とし、次のような方法を開発し、既に「医
学のあゆみ Vol.155 No.13 1990. P950 〜P954」
および「British Journal of Haematology 1991.7
8.P545〜P550」において発表している。この方法は、以
下の手順で測定を行う方法である。 （１）赤血球浮遊液と抗ＣＤ５９モノクローナル抗体液
とを混合し反応させる。（２）フルオレセイン イソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ
＋Ｌ）を反応させる。（３）赤血球浮遊液とビオチン化
抗ＣＤ５５モノクローナル抗体液とを混合し反応させ
る。（４）フィコエリトリン（ＰＥ）結合ストレプトア
ビジンを反応させる。（５）フローサイトメトリーによ
り分析する。
【０００９】図４（Ａ）は前記反応を摸式的に説明する
図であり、赤血球１の表面にそれぞれ符号２、３で示す
ＣＤ５９、ＣＤ５５が任意数存在し、これらに対してそ
れぞれ符号４、５で示す抗ＣＤ５９モノクローナル抗
体、抗ＣＤ５５モノクローナル抗体が選択的に結合し、
さらにこれらの抗体４、５に対してそれぞれＦＩＴＣ６
で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ７、あるいはＰＥ８で標
識したストレプトアビジン９が結合する。
図であり、赤血球１の表面にそれぞれ符号２、３で示す
ＣＤ５９、ＣＤ５５が任意数存在し、これらに対してそ
れぞれ符号４、５で示す抗ＣＤ５９モノクローナル抗
体、抗ＣＤ５５モノクローナル抗体が選択的に結合し、
さらにこれらの抗体４、５に対してそれぞれＦＩＴＣ６
で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ７、あるいはＰＥ８で標
識したストレプトアビジン９が結合する。
【００１０】図４（Ｂ）はフローサイトメトリーにおけ
る処理を説明する図であり、前記のように反応させた赤
血球１を微細管１１中に１個ずつ通し、赤血球１にレー
ザ光１２を照射し、これにより前記標識物質であるＦＩ
ＴＣ６で発生した黄色の光１３と、ＰＥ８で発生した赤
色の光１４とを、レーザ光１２の入射方向に対して９０
度をなす角度でレンズ１５により集光し、これをプリズ
ム１６で分光し、それぞれ分光された黄色の蛍光１３と
赤色の蛍光１４を光検出器１８、１９で電気信号に変換
する。これらの検出光の強度、すなわち光検出器１８、
１９の出力は、それぞれ１個の赤血球の表面に存在する
ＣＤ５９、ＣＤ５５の数に比例する。これらの光検出器
１８、１９の出力をＡ／Ｄ変換器２０、２１によりディ
ジタル信号に変換する。このような動作を赤血球の一定
数（例えば１万個）についてまで繰り返し行ってデータ
として演算装置２２のメモリ２３に記憶し、演算装置２
２においてはこれらのデータを表示装置（または印刷装
置）２４に出力する。
る処理を説明する図であり、前記のように反応させた赤
血球１を微細管１１中に１個ずつ通し、赤血球１にレー
ザ光１２を照射し、これにより前記標識物質であるＦＩ
ＴＣ６で発生した黄色の光１３と、ＰＥ８で発生した赤
色の光１４とを、レーザ光１２の入射方向に対して９０
度をなす角度でレンズ１５により集光し、これをプリズ
ム１６で分光し、それぞれ分光された黄色の蛍光１３と
赤色の蛍光１４を光検出器１８、１９で電気信号に変換
する。これらの検出光の強度、すなわち光検出器１８、
１９の出力は、それぞれ１個の赤血球の表面に存在する
ＣＤ５９、ＣＤ５５の数に比例する。これらの光検出器
１８、１９の出力をＡ／Ｄ変換器２０、２１によりディ
ジタル信号に変換する。このような動作を赤血球の一定
数（例えば１万個）についてまで繰り返し行ってデータ
として演算装置２２のメモリ２３に記憶し、演算装置２
２においてはこれらのデータを表示装置（または印刷装
置）２４に出力する。
【００１１】この表示は、赤血球表面のＣＤ５９の数に
比例した黄色の光強度を横軸（対数目盛）、縦軸をＣＤ
５５の数に比例した赤色の光強度（対数目盛）として、
１個の赤血球に対して１個の点のプロットを行う。従っ
て、検査した赤血球の数と同数の点が画面に表示される
ことになる。
比例した黄色の光強度を横軸（対数目盛）、縦軸をＣＤ
５５の数に比例した赤色の光強度（対数目盛）として、
１個の赤血球に対して１個の点のプロットを行う。従っ
て、検査した赤血球の数と同数の点が画面に表示される
ことになる。
【００１２】図５は前記表示装置２４により表示される
画面の例を示すもので、光強度の分布に対応して描いた
図であり、左側の画面はそれぞれの赤血球タイプにおけ
る光強度の相関図で、横軸に示すＦＬ１は前記光検出器
１８の出力であり、ＣＤ５９の数に対応し、縦軸のＦＬ
２は光検出器１９の出力であり、ＣＤ５５の数に対応す
る。また、中間および右側に示す各図はそれぞれ左側に
示す相関図を描いた検体に対応したＣＤ５９、ＣＤ５５
の数に関連する光強度の頻度を示すもので、横軸のＣＤ
５９またはＣＤ５５の数対応の光強度ＦＬ１、ＦＬ２に
対し、縦軸に頻度（血球個数）を示す。最左側の図にお
いて、ａ、ｂはそれぞれ前記ＦＩＴＣ、ＰＥで標識した
抗体を加えず、他の組成は同様にした赤血球浮遊液にお
いて、それぞれＦＬ１、ＦＬ２について最大輝度がえら
れる基準線を示し、また、中間および右側の点線曲線は
その時の光強度の頻度曲線を示す。
画面の例を示すもので、光強度の分布に対応して描いた
図であり、左側の画面はそれぞれの赤血球タイプにおけ
る光強度の相関図で、横軸に示すＦＬ１は前記光検出器
１８の出力であり、ＣＤ５９の数に対応し、縦軸のＦＬ
２は光検出器１９の出力であり、ＣＤ５５の数に対応す
る。また、中間および右側に示す各図はそれぞれ左側に
示す相関図を描いた検体に対応したＣＤ５９、ＣＤ５５
の数に関連する光強度の頻度を示すもので、横軸のＣＤ
５９またはＣＤ５５の数対応の光強度ＦＬ１、ＦＬ２に
対し、縦軸に頻度（血球個数）を示す。最左側の図にお
いて、ａ、ｂはそれぞれ前記ＦＩＴＣ、ＰＥで標識した
抗体を加えず、他の組成は同様にした赤血球浮遊液にお
いて、それぞれＦＬ１、ＦＬ２について最大輝度がえら
れる基準線を示し、また、中間および右側の点線曲線は
その時の光強度の頻度曲線を示す。
【００１３】図５から判るように、基準線ａ、ｂ以下に
光強度が島状に集中する型はＣＤ５９、ＣＤ５５の欠損
を示しており、III型である。また、基準線ａ、ｂの交
差点を含む領域に分布する型はII型である。また、健常
者と同じ分布を示すものはＩ型である。
光強度が島状に集中する型はＣＤ５９、ＣＤ５５の欠損
を示しており、III型である。また、基準線ａ、ｂの交
差点を含む領域に分布する型はII型である。また、健常
者と同じ分布を示すものはＩ型である。
【００１４】図６は前記ＣＬＳテストと前記フローサイ
トメトリーによる２色分析によるIII型赤血球の割合の
相関を示す図であり、両者は非常に良好な相関関係にあ
ることが判る。
トメトリーによる２色分析によるIII型赤血球の割合の
相関を示す図であり、両者は非常に良好な相関関係にあ
ることが判る。
【００１５】また、図７Ａ〜Ｆは発作性夜間血色素尿症
以外の症例について、フローサイトメトリーを使用して
２色分析を行った場合の光強度の相関関係図である。図
７において、Ａ、Ｂは再生不良性貧血、Ｃは骨髄異形成
症候群、Ｄは前記TypeII congenital dyserythropoieti
c amemia、ＥはInab phenotype（先天性のＣＤ５５欠損
症）、Ｆは先天性のＣＤ５９欠損症の例である。いずれ
の場合にも、発作性夜間血色素尿症の場合のように、島
状に分布が集中する現象が現れず、発作性夜間血色素尿
症と区別できることがわかる。
以外の症例について、フローサイトメトリーを使用して
２色分析を行った場合の光強度の相関関係図である。図
７において、Ａ、Ｂは再生不良性貧血、Ｃは骨髄異形成
症候群、Ｄは前記TypeII congenital dyserythropoieti
c amemia、ＥはInab phenotype（先天性のＣＤ５５欠損
症）、Ｆは先天性のＣＤ５９欠損症の例である。いずれ
の場合にも、発作性夜間血色素尿症の場合のように、島
状に分布が集中する現象が現れず、発作性夜間血色素尿
症と区別できることがわかる。
【００１６】上述のように、本発明者が始めて開発した
フローサイトメトリーを使用したＣＤ５５とＣＤ５９の
２色分析法によれば、ＣＬＳテストによる場合とほぼ同
様の結果を得ることができ、また比較的入手しやすい抗
体を使用して測定を行うことが可能であるが、しかし、
島状の光強度の集中を目視して判別する方法であるか
ら、熟練を必要とするという問題点がある。
フローサイトメトリーを使用したＣＤ５５とＣＤ５９の
２色分析法によれば、ＣＬＳテストによる場合とほぼ同
様の結果を得ることができ、また比較的入手しやすい抗
体を使用して測定を行うことが可能であるが、しかし、
島状の光強度の集中を目視して判別する方法であるか
ら、熟練を必要とするという問題点がある。
【００１７】本発明は、上記の問題点に鑑み、発作性夜
間血色素尿症の原因となる補体感受性赤血球の測定を熟
練を要することなく行える測定方法を提供することを目
的とする。
間血色素尿症の原因となる補体感受性赤血球の測定を熟
練を要することなく行える測定方法を提供することを目
的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するため、血球細胞膜に存在する補体防御膜蛋白であ
るＣＤ５５抗原とＣＤ５９抗原とを測定することによ
り、発作性夜間血色素尿症の原因となる補体感受性赤血
球を測定する方法であって、抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５
９抗体を発光標識物質と共に血球に反応させ、反応後の
血球をフローサイトメトリーに通して血球ごとに抗ＣＤ
５５抗体や抗ＣＤ５９抗体の結合量に相当する発光強度
を測定し、測定された一方の発光物質の発光強度を横
軸、他方の発光物質の発光強度を縦軸にとって１つの血
球を１点とする発光強度相関分布図を想定し、血球細胞
膜上のＣＤ５５、ＣＤ５９の構成により決定される血球
の型に対応して、前記発光強度相関分布図上に領域を設
定し、各領域内の血球数を計数手段により計数してそれ
ぞれの領域に含まれる血球数または全体の血球数に対す
るその領域内の血球数の割合を目視可能な状態として出
力することを特徴とする。
成するため、血球細胞膜に存在する補体防御膜蛋白であ
るＣＤ５５抗原とＣＤ５９抗原とを測定することによ
り、発作性夜間血色素尿症の原因となる補体感受性赤血
球を測定する方法であって、抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５
９抗体を発光標識物質と共に血球に反応させ、反応後の
血球をフローサイトメトリーに通して血球ごとに抗ＣＤ
５５抗体や抗ＣＤ５９抗体の結合量に相当する発光強度
を測定し、測定された一方の発光物質の発光強度を横
軸、他方の発光物質の発光強度を縦軸にとって１つの血
球を１点とする発光強度相関分布図を想定し、血球細胞
膜上のＣＤ５５、ＣＤ５９の構成により決定される血球
の型に対応して、前記発光強度相関分布図上に領域を設
定し、各領域内の血球数を計数手段により計数してそれ
ぞれの領域に含まれる血球数または全体の血球数に対す
るその領域内の血球数の割合を目視可能な状態として出
力することを特徴とする。
【００１９】
【作用】本発明は、上述のように、経験上統計によって
ＰＮＨ血球型毎に出現が判っているＣＤ５５、ＣＤ５９
の相関分布図上の領域を設定し、その領域の数または割
合からその型の血球型が存在するか否かを判定する方法
であるから、判定結果として主観のない客観的な結果が
得られる。
ＰＮＨ血球型毎に出現が判っているＣＤ５５、ＣＤ５９
の相関分布図上の領域を設定し、その領域の数または割
合からその型の血球型が存在するか否かを判定する方法
であるから、判定結果として主観のない客観的な結果が
得られる。
【００２０】
【実施例】２色分析を行うに当り、試料として、ペパリ
ン加採血後、生理食塩水で洗浄し赤血球数を２×１０6
／ｃｃに調整したものを用いた。この赤血球を抗ＣＤ５
９モノクローナル抗体と共に氷の上で３０分ふ置した
後、３回洗浄し、フルオレセイン イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の１：
２０希釈液と溶媒液とを等量混合した。氷の上で３０分
ふ置した後、充分に洗浄し、不活化したマウスの血清を
加え、氷の上で１５分ふ置させた。次にビオチン化した
抗ＣＤ５５抗体と赤血球浮遊液とを氷上で３０分ふ置
し、洗浄した後、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ストレ
プトアビジンを３０分氷上で反応させた。そして、この
ようにして調製した試料を従来技術の欄で述べたように
フローサイトメトリーにより分析した。
ン加採血後、生理食塩水で洗浄し赤血球数を２×１０6
／ｃｃに調整したものを用いた。この赤血球を抗ＣＤ５
９モノクローナル抗体と共に氷の上で３０分ふ置した
後、３回洗浄し、フルオレセイン イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の１：
２０希釈液と溶媒液とを等量混合した。氷の上で３０分
ふ置した後、充分に洗浄し、不活化したマウスの血清を
加え、氷の上で１５分ふ置させた。次にビオチン化した
抗ＣＤ５５抗体と赤血球浮遊液とを氷上で３０分ふ置
し、洗浄した後、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ストレ
プトアビジンを３０分氷上で反応させた。そして、この
ようにして調製した試料を従来技術の欄で述べたように
フローサイトメトリーにより分析した。
【００２１】図１は本発明による測定方法を説明する発
光強度相関分布図であり、図５の左欄に示した実際の発
光強度相関分布図から統計的に血球型Ｉ、II、III型ご
とにそれぞれ領域を図示の３１（Ｉ型）、３２（II
型）、３３（III型）の典型的な分布に分ける。このよ
うな領域に分ける手法の一つとしては、前記ＣＬＳテス
トとの対応から、型が判明している血球について現れる
分布より前記したように、所定値以上の点密度を持つ領
域を線で囲んで島を描き、これらを重ね合わせて作図に
より平均的な島（領域）を描いた。このような領域３
１、３２、３３について、それぞれＣＤ５９、ＣＤ５５
の発光強度の最低、最高値ａ〜ｆ、ｈ〜ｎを設定する。
これらの値ａ〜ｎは島に対する縦横の接線の値により設
定する。図４（Ｂ）に示した演算装置２２において、図
２の機能ブロック図に示すような手順により血球型の判
定を行う。
光強度相関分布図であり、図５の左欄に示した実際の発
光強度相関分布図から統計的に血球型Ｉ、II、III型ご
とにそれぞれ領域を図示の３１（Ｉ型）、３２（II
型）、３３（III型）の典型的な分布に分ける。このよ
うな領域に分ける手法の一つとしては、前記ＣＬＳテス
トとの対応から、型が判明している血球について現れる
分布より前記したように、所定値以上の点密度を持つ領
域を線で囲んで島を描き、これらを重ね合わせて作図に
より平均的な島（領域）を描いた。このような領域３
１、３２、３３について、それぞれＣＤ５９、ＣＤ５５
の発光強度の最低、最高値ａ〜ｆ、ｈ〜ｎを設定する。
これらの値ａ〜ｎは島に対する縦横の接線の値により設
定する。図４（Ｂ）に示した演算装置２２において、図
２の機能ブロック図に示すような手順により血球型の判
定を行う。
【００２２】図２において、２０、２１は図４（Ｂ）に
示した前記Ａ／Ｄ変換器であり、この値は１つの血球の
ＣＤ５９、ＣＤ５５の数に対応した光強度を示す。３４
はこれらの光強度のデータから、該当血球が図１におけ
るどの領域に属するかを判定する領域判定手段であり、
黄色の光強度ＦＬ１がａ≦ＦＬ１≦ｂでかつ赤色の光強
度ＦＬ２がｈ≦ＦＬ２≦ｉであれば領域３３（III型）
と判定し、ｃ≦ＦＬ１≦ｄでかつｊ≦ＦＬ２≦ｋであれ
ば領域３２（II型）と判定し、ｅ≦ＦＬ１≦ｆでかつｍ
≦ＦＬ２≦ｎであれば領域３１（Ｉ型）と判定する。ま
た、各領域の血球数積算手段３５〜３７は、それぞれの
領域について、前記領域判定手段３４から与えられるデ
ータを積算し、それぞれの領域の血球数を積算する。領
域Ｉ〜III有無判定手段４０〜４２は、測定数設定手段
３９に設定された総血球数Ｔと、測定終了時における各
領域の積算手段３５〜３７にそれぞれ積算された値
Ｔ1、Ｔ2 、Ｔ3とから、それぞれこれらの値が全体の測
定血球数に対する割合Ｔ1／Ｔ、Ｔ2 ／Ｔ、Ｔ3／Ｔを算
出し、これらの値が例えば０．０３以上である場合にそ
の領域に属する血球が存在するものと判定する。この場
合、全体の血球測定数が判っている場合には、割合の値
ではなく、積算値そのものを用いてもよい。また、症状
判定手段４４は、領域Ｉ〜III有無判定手段４０〜４２
による判定結果から、特に症状に影響を与えるＰＮＨII
Iの型の割合についてその全体血球数に対する割合の値
の大きさから、症状の重さについて判定する。これらの
結果、すなわち各領域に含まれる血球数、領域毎の割
合、症状の度合（健康、軽症、重症等）の判定結果を表
示装置４５および印刷装置４６により目視可能な状態と
して出力する。ロス等は種々の赤血球の型の組合わせに
ついて、５つのグループに分類しているが、このような
グループごとに分類を行ってもよい。このような測定を
行うことにより、図６に示した相関図で示したものと同
様の相関がえられる。
示した前記Ａ／Ｄ変換器であり、この値は１つの血球の
ＣＤ５９、ＣＤ５５の数に対応した光強度を示す。３４
はこれらの光強度のデータから、該当血球が図１におけ
るどの領域に属するかを判定する領域判定手段であり、
黄色の光強度ＦＬ１がａ≦ＦＬ１≦ｂでかつ赤色の光強
度ＦＬ２がｈ≦ＦＬ２≦ｉであれば領域３３（III型）
と判定し、ｃ≦ＦＬ１≦ｄでかつｊ≦ＦＬ２≦ｋであれ
ば領域３２（II型）と判定し、ｅ≦ＦＬ１≦ｆでかつｍ
≦ＦＬ２≦ｎであれば領域３１（Ｉ型）と判定する。ま
た、各領域の血球数積算手段３５〜３７は、それぞれの
領域について、前記領域判定手段３４から与えられるデ
ータを積算し、それぞれの領域の血球数を積算する。領
域Ｉ〜III有無判定手段４０〜４２は、測定数設定手段
３９に設定された総血球数Ｔと、測定終了時における各
領域の積算手段３５〜３７にそれぞれ積算された値
Ｔ1、Ｔ2 、Ｔ3とから、それぞれこれらの値が全体の測
定血球数に対する割合Ｔ1／Ｔ、Ｔ2 ／Ｔ、Ｔ3／Ｔを算
出し、これらの値が例えば０．０３以上である場合にそ
の領域に属する血球が存在するものと判定する。この場
合、全体の血球測定数が判っている場合には、割合の値
ではなく、積算値そのものを用いてもよい。また、症状
判定手段４４は、領域Ｉ〜III有無判定手段４０〜４２
による判定結果から、特に症状に影響を与えるＰＮＨII
Iの型の割合についてその全体血球数に対する割合の値
の大きさから、症状の重さについて判定する。これらの
結果、すなわち各領域に含まれる血球数、領域毎の割
合、症状の度合（健康、軽症、重症等）の判定結果を表
示装置４５および印刷装置４６により目視可能な状態と
して出力する。ロス等は種々の赤血球の型の組合わせに
ついて、５つのグループに分類しているが、このような
グループごとに分類を行ってもよい。このような測定を
行うことにより、図６に示した相関図で示したものと同
様の相関がえられる。
【００２３】上記の説明は、赤血球を用いて測定した例
について行ったが、本発明は、他の血球を用いて測定す
ることも可能であり、同様の結果が得られることを確認
している。また、反応の手順の能率化のため、能率別の
手法として、標識物質として、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を予め抗ＣＤ５９モノクローナル抗
体に結合させておき、一方、標識物質であるＰＥ結合ア
ビジンを予め抗ＣＤ５５モノクローナル抗体に結合させ
ておき、このような標識物質を結合した抗ＣＤ５９モノ
クローナル抗体、抗ＣＤ５５モノクローナル抗体を赤血
球に反応させた。そのような手順で反応を行わせた場合
も、前記の場合と同様の結果が得られた。
について行ったが、本発明は、他の血球を用いて測定す
ることも可能であり、同様の結果が得られることを確認
している。また、反応の手順の能率化のため、能率別の
手法として、標識物質として、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を予め抗ＣＤ５９モノクローナル抗
体に結合させておき、一方、標識物質であるＰＥ結合ア
ビジンを予め抗ＣＤ５５モノクローナル抗体に結合させ
ておき、このような標識物質を結合した抗ＣＤ５９モノ
クローナル抗体、抗ＣＤ５５モノクローナル抗体を赤血
球に反応させた。そのような手順で反応を行わせた場合
も、前記の場合と同様の結果が得られた。
【００２４】
【発明の効果】請求項１によれば、発作性夜間血色素尿
症の原因となる補体感受性赤血球の測定を熟練を要する
ことなく行える普及型の測定方法を提供することが可能
となる。請求項２によれば、所定の領域内に属する型の
血球が存在するか否かを数値から判定するため、より客
観的な判定結果が得られる。請求項３によれば、症状の
度合を出力するため、症状の度合を直ちに知ることがで
きる。
症の原因となる補体感受性赤血球の測定を熟練を要する
ことなく行える普及型の測定方法を提供することが可能
となる。請求項２によれば、所定の領域内に属する型の
血球が存在するか否かを数値から判定するため、より客
観的な判定結果が得られる。請求項３によれば、症状の
度合を出力するため、症状の度合を直ちに知ることがで
きる。
【図１】本発明による測定方法の一実施例を説明する発
光強度相関分布図の模式図である。
光強度相関分布図の模式図である。
【図２】本発明の機能ブロック図である。
【図３】ＣＬＳテストの結果の３例を示す曲線図であ
る。
る。
【図４】（Ａ）はフローサイトメトリーを使用した２色
分析を行うための赤血球の処理を説明する模式図、
（Ｂ）はその機能ブロック図である。
分析を行うための赤血球の処理を説明する模式図、
（Ｂ）はその機能ブロック図である。
【図５】フローサイトメトリーを使用した２色分析を行
った場合の２色の光強度の相関図とこれに関連した光輝
度の頻度をそれぞれ左右に並べて、赤血球の型ごとに示
す図である。
った場合の２色の光強度の相関図とこれに関連した光輝
度の頻度をそれぞれ左右に並べて、赤血球の型ごとに示
す図である。
【図６】フローサイトメトリーを使用した２色分析を行
った場合とＣＬＳテストとの相関図である。
った場合とＣＬＳテストとの相関図である。
【図７】発作性夜間血色素尿症以外の症例について、フ
ローサイトメトリーを使用した２色分析を行った場合の
結果を示す２色の光強度の相関図である。
ローサイトメトリーを使用した２色分析を行った場合の
結果を示す２色の光強度の相関図である。
１ 赤血球 ２ ＣＤ５９ ３ ＣＤ５５ ４ 抗ＣＤ５９モノクローナル抗体 ５ 抗ＣＤ５５モノクローナル抗体 ６ ＦＩＴＣ ７ ヤギ抗マウスＩｇＧ ８ ＰＥ ９ ストレプトアビジン １１ 微細管 １２ レーザー光 １３ 黄色光 １４ 赤色光 １６ プリズム １８、１９ 光検出器 ２０、２１ Ａ／Ｄ変換器 ２２ 演算装置 ２３ メモリ ２４ 表示装置（印刷装置）
Claims (3)
- 【請求項１】血球細胞膜に存在する補体防御膜蛋白であ
るＣＤ５５抗原とＣＤ５９抗原とを測定することによ
り、発作性夜間血色素尿症の原因となる補体感受性赤血
球を測定する方法であって、 抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５９抗体を発光標識物質と共に
血球に反応させ、 反応後の血球をフローサイトメトリーに通して血球ごと
に抗ＣＤ５５抗体や抗ＣＤ５９抗体の結合量に相当する
発光強度を測定し、 測定された一方の発光物質の発光強度を横軸、他方の発
光物質の発光強度を縦軸にとって１つの血球を１点とす
る発光強度相関分布図を想定し、 血球細胞膜上のＣＤ５５、ＣＤ５９の構成により決定さ
れる血球の型に対応して、前記発光強度相関分布図上に
領域を設定し、 各領域内の血球数を計数手段により計数してそれぞれの
領域に含まれる血球数または全体の血球数に対するその
領域内の血球数の割合を目視可能な状態として出力する
ことを特徴とする補体感受性赤血球の測定方法。 - 【請求項２】請求項１において、各領域内の血球数また
は全体の血球数に対するその領域内の血球数の割合が所
定値以上である時にその領域に対応した血球型が存在す
るものと判定し、所定値未満であるときに存在しないも
のと判定してその結果を目視可能な状態として出力する
ことを特徴とする補体感受性赤血球の測定方法。 - 【請求項３】請求項１または２において、発作性夜間血
色素尿症に特有な発光強度分布点を示す血球数と全体の
血球数との比を求め、その比の大きさから発作性夜間血
色素尿症の症状の度合を判定してその結果を目視可能な
状態として出力することを特徴とする補体感受性赤血球
の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16866693A JPH075171A (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | 補体感受性赤血球の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16866693A JPH075171A (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | 補体感受性赤血球の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH075171A true JPH075171A (ja) | 1995-01-10 |
Family
ID=15872252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16866693A Pending JPH075171A (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | 補体感受性赤血球の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH075171A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9307797B2 (en) | 2009-05-07 | 2016-04-12 | Rosemarie Wysoczki de Sanchez | Magnetic lock, magnetic key and combination thereof |
-
1993
- 1993-06-15 JP JP16866693A patent/JPH075171A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9307797B2 (en) | 2009-05-07 | 2016-04-12 | Rosemarie Wysoczki de Sanchez | Magnetic lock, magnetic key and combination thereof |
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