JPH07509363A

JPH07509363A - 生来の肝機能に障害を有する動物における，細胞移植による非生来の肝臓の生成

Info

Publication number: JPH07509363A
Application number: JP6504654A
Authority: JP
Inventors: ブリンスター，ラルフ　エル．; パルミター，リチャード　ディー．; デーガン，ジェイ　エル．; サンドグレン，エリック　ピー．
Original assignee: ザ　トラスティーズ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　ペンシルベニア; ユニバーシティオブワシントン; チルドレンズホスピタルメディカルセンター
Priority date: 1992-07-24
Filing date: 1993-07-23
Publication date: 1995-10-19
Also published as: AU676194B2; EP0652949A1; EP0652949A4; WO1994002601A1; CA2140785A1; AU4778293A; IL106368A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生来の肝機能に障害を有する動物における、細胞移植による非生来の肝臓の生成発明の技術分野本発明は、生来（ｎａｔｉｖｅ）の肝機能に障害を存する動物において非生来的に機能する肝臓の生成および機能する非生来（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）の肝臓を有する（トランスジェニック）動物に関する。

背景技術現在、ドナーの提供する肝臓が目立って不足している。例えば１９９０年には、２６５６件の肝臓移植が行われたが、その１０倍の人が肝臓病で亡（なった。健康な肝細胞を移植することによる肝疾患の治療は長い間、肝疾患に対する有力な解決の一法と見なされてきた。肝細胞の移植は、先天性肝酵素欠損患者の治療において、病気（ウィルス性肝炎、アルコール性肝硬変あるいは繊維症など）によって失った肝臓に置き変わるものとして、あるいは急性の肝機能障害が時の経過によって再生するまでの一時的なサポートシステムを提供するものとして用いられ得たてあろう。肝細胞の移植はまた、ヒトの肝機能を体現する動物モデルを創製する機会を提供する。そのような動物は、肝臓のウィルス感染（ヒト肝炎ウィルスまたはサイトメガロウィルスによる感染）の研究および／またはそのような感染に対する処置や治療の有効性および安全性の試験において非常に有用であろう。それらの動物はまたヒトの肝臓や化学的に誘導された肝硬変や繊維症における薬物毒性（アルコールなど）の研究や化学的に誘導された肝臓損傷に対する処置や治療の有効性および安全性の試験においても役立っであろう。

歴史的には、補助的肝臓を作るためにいくつかの方法が研究されてきた。肝臓の一部の移植は１９３０年代には早くも行われていた。しかしながら、多くの場合、移植された肝臓組織は、２．３日ないし数週間で変性するか消退してしまった。

肝細胞移植におけるより大きな成功が、生存可能な肝細胞を単離する種々の方法の開発の過程で得られている。これらの方法のうち、バリーとフレンドＩｎＶｉｔｒｏ、（１９８１）旦：９３５−９４１Ｌおよび注入−分解（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）　（ウッドら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ　ｉｏｎ。

（＋９８２）３３　：１２３−１２６）においては、注射投与するための生存可能な成熟肝細胞が高収率で産生されている。そのレビューについてはグブタら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、（１９９２）１５：１５６−１６２を参照されたい。

肝細胞の単離に関する問題とともに、移植の方法と部位が移植効果について研究されている。肝細胞懸濁液の門脈への直接投与がラットを用いて研究されている。しかしながら、当初信じられていたのとは逆に、門脈血供給は肝細胞の生存には卓越したものではないことがわかった。筋注、腹腔内投与、膵臓、肝臓、腎臓への接種、および腹腔や腎臓の動脈への投与の後における肝細胞の生育に関し、様々な例証か挙げられてきた。上述の方法は少量の生育可能な移植肝細胞を産生ずることはできるが、その肝機能に対する寄与はどちらがといえば少なく、しばしば一時的なものにすぎなかった。

肝臓移植に対する現在研究されている別の手法としては、新しい肝細胞を生分解可能なポリマーの台に載せて移植するものがあり、これは肝細胞が再生して増え、少なくとも生来の肝機能の一部を引き継ぐことを期待するものである。この手法によるとマトリックス上の肝細胞はラットで移植後６力月から１年の間生き延びて機能を発揮できることが報告されているが、移植された細胞の生存率は低く、幾つかの動物実験ではマトリックス中に多量の結合組織が生成しすぎ、ポリマーに緊密に結合して廠痕組織を形成するので肝細胞がマトリックスに分散するのを妨げてしまう（”Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗ’　１９９２年７月、ページ１２．１３）。

上とは異なる方向で、トランスジェニック動物の技法は、トランスジエン発現を行わせることができる器官のはとんとあらゆるものを冒す遺伝子病の動物モデルを創製し解析するための手段を提供している。医学的に重要な多くの病気への関わりから、肝臓かしはしばこのタイプの解析の対象となっている。

肝臓の病変に関連するとして報告されているトランスジエンとしては、以下をコートするものがあげられる　肝細胞の大きさと核特性を変えるホルモンである成長ホルモン、肝臓腫瘍を誘発する癌遺伝子、成人において肝細胞の壊死とカルチノーマ形成を誘発するＢ型肝炎つィルス大エンベロープポリペプチド；腫瘍と肝過剰成長をもたらす形質転換成長ファクトα；新生児や成人を含むヒトにおけるＡＡＴ欠ｔｍ症のいくつかの特徴を再現するα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）変異体。

肝臓は合成能および分泌能が高いことから、この臓器における目的のトランスツエン発現は、生物学的に有力な分子の過剰産生の全身的影響を判定する方法として役に立つものである。この手法はすてに、アルブミンエンハンサ−／プロモーターに融合した配列をコードするウロキナーゼ梨のプラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ）を保持するトランスジエンを、マウスにインビボで導入した時の不適切なプラスミノーゲンアクチベータ発現を研究するために用いられてきた（へッケルら、Ｃｅ１ｌ　（＋９９００．６２：４４７−４５６）。

プラスミノーゲンアクチベータは、タンパク分解開裂およびプラスミノーゲンからプラスミン（これはその後フィブリン凝固を分解する）への活性化を触媒的に促進する（コーレン、Ｄ、およびリジネン、Ｈ，Ｒ，（＋９８７）　“Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆＨｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ、Ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、、Ｇ、スタマトヤンノブロス、Ａ、Ｗ、Ｎ１ｅｎｈｕ　ｉ　ｓ、Ｐ、ＬｅｄｅｒおよびＰ、　Ｗ、　７ジ工ラス編（フィラデルフィア　Ｗ、Ｂ　サンダース社）、６６２−６８８ページ）。

ｕＰＡもまた排卵、乳腺退縮、転移なと、組織の改造や破壊を含む生物学的過程多くのトランスジエン創立者（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスにおいては、アルブミンーウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチヘータ（Ａｌｂ−ｕＰＡ）構造体は肝細胞に対して高レベルのｕＰ△発現を指向し、新生児における血漿ｕＰＡを上昇させ、胎児出血の結果をもたらした。２系統のＡｌｂ−ｕＰＡトランスジエンマウスが、生存しているトランスジエン創立者マウスで低レベルのｕＰＡを発現するものから確立された。これらの系統においては、トランスジエン新生児の約半分が腸または腹部に出血を起こし、誕生後４日以内に死に、一方、残ったトランスジエンの子孫は正常に見えかつ生育した。出血したトランスジエン新生児も出血しなかったトランスジエン新生児も双方ともに顕著な低フィブリノーゲン血症と血液が凝固しない症状を示したので、冒されたマウスでは出血を起こさせるだけの損傷がすぐに致命的になることが結論された（へッヶルら、（１９９０）、同上）。

このタイプの実験においては、トランスジエン発現は標的細胞において長期間にわたり安定であろうというのが一般的な予想である。しかしながら予想外なことに、両Ａｌｂ−ｕＰＡ系において生き残ったマウスは徐々に血漿ｕＰＡ活性が低下するとともに、月１！ｌｔｌか月と２力月の間に完成される凝結機能の修復が見られた（へツケルら、（１９９０）、同上）。この現象は、ｕＰＡが肝細胞にとって細胞毒性を有し、Ａｌｂ−ｕＰＡマウスにおける単離された肝細胞中のＤＮＡの再編成によるトランスジエン発現の不活化の後、全肝臓がもはやｕＰＡを産生しない細胞によって占められてしまうことによって説明されてきた（サンドグレンら、Ｃｅ１ｌ　（１９９１）６６：２４５−２５６）。このように、Ａｌｂ−ｕＰＡ発現によって提供されるトランスジエンマウスは、内因性のトランスジエン発現肝細胞がそのトランスジエンを発現しない（生来の、あるいは非生来の）肝細胞に比し、選択的に不利益を受けるようなものである。加えて、これらのマウスの肝臓は、そのトランスジエンを発現しない（生来の、あるいは非生来の）肝細胞か成長するための環境を提供している。これらの細胞はトランスジエン発現細胞を犠牲にして生育するものであり、その結果は、見たところ正常な構造の肝臓である。

発明の開示成熟した肝細胞の移植と発達の分野における進歩にもかがゎらず、現在の技術では、（８！能的な）非生来の肝臓を動物、特に肝機能に欠陥のある動物において生成することはできていない。ヒトにおいては、そのような技術は肝臓病の治療および／または処置において作用であろう。またヒト以外の動物においても、そのような技術は、例えばヒトの肝臓病に対する有効な処置および／または治療の研究に有用な（病気の）ヒト肝臓のモデルを提供することができるなど、高い価値を有するものである。

従って、本発明の目的は、動物宿主における欠陥のある肝機能を正常化する方法であって、特定の非生来の細胞を（または対応する組織）を、肝機能に障害を存する宿主動物の肝臓領域へと移植することによって、宿主中で非生来の機能する肝臓を生成させ肝機能障害を正常化する方法を提供するものである。本発明の他の目的は、生来の肝細胞に対して不利益を与えるが致死的ではないようなつまり生来の肝機能に障害を与えるような産物をコードするトランスジエンを保持する、ヒト以外のトランスジェニック動物（たとえばマウスなどの纂歯類など）を提供することである。このようなヒト以外のトランスジェニック動物は、非生来の（ヒトなどの）肝臓の宿主システムとして有用である。本発明のさらに他の目的は、完全に機能する非生来の（ヒトなとの）肝臓組織を維持しかつ大きくすることができるヒト以外の宿主動物を提供することであり、これにより以下の有用性を有するものである・　（１）肝疾患のモデル化、（２）肝組織バンク（たとえば後での分析やドナーに再移植してもどすなとのために肝組織を維持して増やすこと）、（３）薬剤のヒト肝臓に対する毒性をインビボでテストすること、および／または（４）再移植前の遺伝子操作（すなわち肝細胞指向性の遺伝子療法）。

本発明の更なる目的は宿主動物中で機能する非生来の肝臓を生成する方法を提供するものであって、これは非生来の肝細胞（または組織）を、遺伝子によって肝機能障害がもたらされている宿主動物へと移植することによってなされるものである。本発明の別の目的は、機能する非生来の肝臓を保持する、ヒト以外の動物を提供することである。本発明のまた別の目的は、ドナーに戻すに先立って遺伝子操作を行うために、インビボで完全に分化し完全に機能するドナー（例えばヒト）の肝細胞を維持するための新規な方法を提供することである。遺伝子操作としては、例えば、医療上重要なタンパクの生産を指向する発現ベクターを移植のレノビエントへ導入することなとが挙げられるであろう。

本発明者は、上記の目的および以下に記す発明の詳細な説明から明白となるであろう他の目的が、非生来の細胞（例えば胎児、新生児、あるいは成人の、非造血肝臓幹、始原または成熟細胞、胎児の、幹、始原、または成人胆汁腎細胞；内胚葉性（膵臓、腸など）の細胞：　（培養された）全能性幹細胞；または培養動物細胞）や対応する組織を、生来の肝機能が障害を有する宿主動物の肝臓領域に移植し、この移植された細胞（あるいは組織）を宿主動物中に落ちつかせそこで機能する非生来肝臓を発達させることによって達成されることを見いだした。

好ましい実施態様の詳細な説明本発明における宿主動物としては、生来の肝機能に障害があるどのような動物でも好適に用いることができる。従って適切な宿主動物としては魚、トリ類（例えば鶏、鴨、鵞鳥、七面鳥なと）、または経由類（マウスやラットなど）、モルモット、豚、犬、猫、ウサギ、山羊、羊、馬、牛などの反招動物：サル、その他の霊長目やヒト等の１１１１？乳類が挙げられる。

宿主動物の生来の肝機能の障害は、肝硬変、肝炎、繊維症、あるいは第１Ｘ因子、第Ｖｌ１１因子、ＬＤＬ受容体または種々の酵素のあるもの（例えばフェニルアラニンヒドロキンラーゼ）における欠陥なとの遺伝子的肝臓障害疾病や、肝臓を冒す他の何百もの公知の代謝疾病のうちの何れがから偶然起こったものであるかもしれない。

好ましい態様においては、本発明は、肝臓障害を存するヒトを含む上記の動物に対する治療および／または処置に適用される。この状況において、本発明は肝機能を回復するための肝臓移植に代わるものとして利用することができる。

他の態様においては、肝不全を導入したヒト以外の動物において非生来の肝臓を生成し、機能を有する非生米の（ヒトや他の動物なとの）肝臓で動物モデルシステムを得る。これらのヒト以外の動物においては、生来の肝機能に対する損傷は、遺伝子工学的に生来の肝細胞を弱体化し、それらが移植された非生来の細胞（肝細胞など）に対して選択的に不利益を被るように、意図的に操作して達成される。

本発明においては、正常な肝細胞の物質交代過程において、移植された非生来の肝細胞は、偶然にあるいは意図的に不利益を被った生来の肝細胞に比べ、増殖する利点を有し、最終的には宿主のすべての生来の肝細胞が置き換えられる。これにより、もしあったとしても実質的に非常に少ない生来の肝細胞を保持しているが、機能的で実質的に非生来であってその移植した非生来の細胞から生成された肝臓を有する宿主が提供される。（生成された肝臓には、生来の肝臓に見いだされるいくらかの非肝細胞と、恐らくいくらかの生来の肝細胞が含まれることは当然であろうと思われる以上、実質的に非生来である）。

ヒト以外の動物における肝臓不全の遺伝子工学的誘発は、本発明のこの態様に従って、生来の肝細胞には不利益を与えるが即座に致死的なものではない産物をコードするトランスジエンを保持する、ヒト以外のトランスジェニック動物を利用することによって達成されるであろう。一般的に、その遺伝子を発現する肝細胞がトランスジエンを発現しない細胞（例えば移植された非生米の肝細胞など）に比しはっきりとした生育上の不利益を有するものである限り、細胞機能を損傷させるような存寄なトランスジエン産物が使用できる。

そのようなトランスジエン産物の例としては、ウロキナーゼ盟または組織型のプラスミノーゲンアクチベータなとあらゆる型のプラスミノーゲンアクチベータ、細菌性プラスミノーゲンアクチベータ（例えばストレプトキナーゼ）、あるいは無毒化ジフテリアトキシンなどのトキシンが挙げられる。本発明のこの態様に従って用いることができるトランスジエン産物の池の例としては、生来の肝細胞の代謝や生育能力に対し、これを損なうように作用する薬剤が挙げられる。例えば生来の肝細胞の能力を弱体化し成長因子信号を伝達する薬剤（例えば信号変換経路における各ステップに影響を与える、優性で負のトランスジエン）や循環経路を閉塞させる突然変異タンパクを産生することによってこれを損なう薬剤が挙げられる。

肝機能の遺伝子工学的導入の例としては、本発明者らによって高レベルのウロキナーゼ型りラスミノーゲンアクチヘータ（ｕＰＡ）の発現が哺乳類における肝力のあるトランスジェニック動物か生まれ、その肝臓は滑らかで白味を帯びたほぼ白色の組織から成るｒ白色肝」てあって、その中では多くの赤味を帯ひた小結節が発生し数と齢を増やしていく。白色の領域は元来のトランスジェニックな肝臓組織を表し、一方、赤色の領域は肝機能や肝臓の構造の幾つかの様相において生後変化した結果、赤い結節の生育をもたらしていることを表す。白色の組織サンプルは高レベルのｕＰＡ　ｍＲＮＡを発現し、一方、赤い結節のサンプルはすへて検出可能なトランスジエン発現を欠く。

この白い肝組織は粗面小胞体の形態が改変された小さい肝細胞を存しているが、壊死性でも繊維症性でもない。ｕＰＡ）ランスジエンの発現は肝細胞にとってはＩＴ害であるように見えるが、即座には致死的でない。生来の肝機能の遺伝子工学的手段による損傷の種類から、ＤＮＡ組み換えとトランスジエン・タンデム・アレーのすへての機能的なコピーの喪失によってｕＰＡ）ランスジエン発現が自然に止んでしまった内因性の肝細胞あるいはドナー動物（例えばヒト）から肝臓の再生的派生物を確立するだめの適切なフォーマットが提供される。

あとの例では、ヘテロ接合のＡｌｂ−ｕＰＡマウスがしばしば正常な赤味を帯びた肝臓色を存する再性的肝臓小結節を発生し、これが周囲の「白いＪ肝臓組織を犠牲にして生育して遂には肝臓を再構築している。これらの「赤い」肝臓小結節は、トランスジエン組み換えの後に残されたトランスジエンの残りの分析によると単一肝細胞のクローンの派生物である。すへての機能的なトランスジエンが除去され、検出可能なトランスジエン発現を欠く肝細胞は、選択された利点を獲得し、急速に増えて回りの「白い」組織中のトランスジエンを発現する肝細胞に置き代わる。これらの観察の延長としての一想様においては、非生来の（例えばヒトの）肝細胞がこれらのマウス（またはその機能的等個物）に移植でき、それらか生来のトランスジエンを発現する肝細胞に比へ固存の生育上の利点を有する結果、それらは死んだり消失したりする内因性の肝細胞の犠牲の上に成長して肝臓を再構築する。

この一般的な遺伝子工学的誘発方法に従えば、宿主動物の肝臓に対して直ぐには致死的でないか不利益を与える産物をコートするトランスジエンが構築される。

これから得られた融合構造体を公知の技法によって有性卵に挿入し、妊娠した、あるいは擬妊娠の女性に移植する。次いてその構造体を発現する、生来の肝機能に障害を有する子孫を生育する。

本発明に従って宿主に移植を行うには種々の異なった非生来の細胞（または対応する組織）を用いることができる。これらの細胞（または組織）は胎児、新生児、および／または成人の幹細胞、始原および／または成熟非造血性肝細胞である。好ましくは非造血性の肝臓始原細胞であり、より好ましくは非造血性の肝臓幹細胞が用いられる。この状況において、肝細胞−これは哺乳類肝臓の約６０％を占めるものであるが−を上記の肝臓細胞として用いることができる。

本発明において用いられる非生来の肝細胞は胎児の造血幹細胞とははっきり異なったものである。胎児造血幹細胞は造血系における前駆体であり、従前より宿主において非生来の造血系を生成するために用いられてきた。

本発明において用いられる他の非生来の肝細胞（または組織）としては、次のものが挙げられる。（ｉ）幹、始原、および／または成熟胆汁骨細胞、（ｉ　ｉ）膵臓や腸なとの内胚葉性組繊細胞、（ｉ　ｉ　１）（ＥＳ）細胞や胚カルチノーマ（Ｅ　Ｃ）細胞を含む、任意に培養されても良い全能幹細胞、および／または（１ｖ）培養ヒト細胞。

特に好ましい実施例においては、全能動物幹細胞をまず細胞培養の培地中に特定の成長因子を包含させるなとしてその分化をコントロールする条件下で培養し、ついてこれらの培養細胞を宿主動物中に落ちつかせる。あるいは全能動物幹細胞は最初に、生存率を高め、複製を促進し、および／または幹細胞を選択的に富化する成長因子と共に処理または培養することもてきる。

胚の幹細胞や胎児の内胚葉を含む（たたしこれに限定されない）、他のソースからの動物細胞（または組織）も成長因子やその他の物質で処理して肝臓幹細胞の特性を有する特定の細胞系の分化をもたらすようにすることができる。例えば、胚の幹細胞あるいは胚カルチノーマ細胞をレチノール酸や他の誘発物質で刺激して分化させる。続く内胚葉または肝細胞の系統を用いた培養中における分化は、成長因子で刺激したりおよび／または公知の技法や材料を用いた選択によって達成される。

本発明の一聾様においては、非生来の細胞（または組織）は、（公知の方法を用いて）遺伝子工学的に処理され、宿主の生体において生理的に有効量の一以上の医療関連のタンパクを産生し、それを本発明に従って移植してもよい。この技法は動物の肝細胞機能を、第１Ｘ因子、ＬＤＬ受容体、フェニルアラニンヒドロキシラーゼなどを産することによって改善したり、あるいは全身性の価値を有する第ＶＩＩ■因子、アデノシンデアミナーゼ、またはペプチドホルモンなどのタンパクを産生ずるために利用することができる。

このように、移植されるべき非生来の細胞（または組織）は、以下に記すようにしてドナー動物から単離可能であり、それは公知の技法によって任意に培養してもよい。例えば、本発明の一実施態様によれば、非造血性の肝臓幹、始原、および／または成熟細胞をまず宿主以外の成体ドナー動物の末端あるいは移行部の胆汁管から公知の技法で単離する。他の態様例においては、肝臓の細胞を生検針による採取のような公知技法によりドナー動物から単離する。あるいは、肝臓の細胞は門脈１′のコラゲナーゼ潅流によってドナー動物から単離することもできる。

１１：例えばソダら、Ｂｌｏｏｄ　（１９８４）６３．２７０−２７６、またはクローニゲら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　（１９８１）±７，９１３−９２５参照。

本発明によって用いられるドナー動物は、宿主動物と同一種でも異なった種でもよい。一般には異なった種が用いられる。ドナー動物は正常に機能する肝臓を保持する動物や、先天的あるいは獲得した肝臓疾患を有する動物なとどの様な動物であってもよい。好ましくはドナー動物はヒトである。

次いて非生来の細胞（または組織）を宿主組織体に導入するが、これは充分な数の当該非生来細胞を宿主動物の肝臓領域に移植し、それらか非生来の肝臓に発達することを許容するように行われる。本発明は移植細胞を支持するポリマーマ１へリソクスを必要としない。一旦宿主動物の肝臓領域に移植されると、移植された細胞（または組織）はそこで、その位置により種々の生来の生物学的信号に接する。この信号は生来の肝臓が通常接しているものであり、これによって移植された非生来の肝臓細胞が宿主において成長、維持されるものである。

このように各種ソースからの細胞を本発明にしたがって利用することができる。

なぜならそのような細胞は発達の程度か異なる細胞の混合物（即ち幹、始原、および成熟細胞）であるからである。三者の混合物は充分に原始的な発達段階の細胞を含有するので、宿主の肝臓領域の生物学的環境に接すると、これらの細胞は機能する非生来の肝臓を確立する。

例証として他の細胞、とくに内胚葉由来の細胞を新しい肝臓の形成のために用存し、発癌性物質で処理されたハムスター膵臓の細胞の同定について報告した。

これらの細胞および他の細胞は、本発明に従って適切な環境（例えば弱った肝臓）に置かれれば機能的な肝細胞を形成することができる。

宿主動物の肝臓への移植は別の方法によっても達成される。例証としては、ｌ× １０３からｌＸ１０’、好ましくはｌＸｌ０’からｌＸｌ０’の非生来の細胞の懸濁液を、任意に非生来細胞の移植を促進する（；Ｊ加的な助剤（非生来細胞の生存や分割２′を高めることが知られている物質）と共に幾つかの異なった部位に投与（注射針で注入するなと）すると非生来細胞がそこに落ちつくのが見られるであろう。

２″例えば細胞は生存、移植、成長を増進する成長因子や他の物質とともに導入することができる。

適切な部位としては宿主動物の腹腔、筋肉組織、腎臓、膵臓、腹腔動脈、脂肪パノｌ’、および／または皮下領域が挙げられる。本発明においては好ましい投与部位としては門脈静脈、肝臓、生来の肝臓への直接投与、および胎児肝を形成する胎児宿主の調帯血管か挙げられ、好ましくは注射によって投与される。

本発明においては、もし宿主とトナーが二種の異なった動物であるときには、移植後に起こりうる非生来細胞に対する宿主の免疫拒絶を抑制するために、移植に先立つ処理を行う。これは種々のやり方で行うことかできる。例えば宿主動物をツクロスボリンや他の宿主の免疫系を抑制する物質、即ち選択的に宿主の免疫細胞集団のサブ集団、Ｔ細胞破壊抗体等で処理することか挙げられる。あるいは、移植前に非生来細胞を宿主の胸腺に移行させて宿主に耐性を導入する（ロセルトら、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ　（１９９０）２４９　：１２９３−１２９５）か、あるいは宿主と同じ株の動物の細胞を用いることができる。さらに、非生来細胞のレシピエン１−となるように同血統交配されて得た動物（たとえば５ＣＩＤマウスやヌードマウス）なとの免疫欠陥を仔する宿主も用いられる。

例示として掲げる好ましい実施例においては、非生来細胞のレシピエンドは肝機能に障害を育するトランスジェニックマウスであり、非生来の肝臓を生成するためにはヒトの非造血肝細胞を用いる。適切なトランスジェニックマウスはサングレンらによってＣｅ１ｌ　（１９９１）６６：２４５−２５６に記載されており、この文献を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。この文献に記載の、本発明者らによるトランスジェニックマウスはアルブミン−ウロキナーゼ型のプラスミノーゲン・アクチベータ（Ａｌｂ−ｕＰＡ）融合構造体を顕著に発現する。肝機能に障害を存するこのマウスはヒトの非造血性肝細胞移植に関し良いレシピエンドである（ただし他の理由から肝臓障害を存するようになったマウスも用いられる）。

肝機能に障害を存するトランスジェニックマウスに、非生来で好ましくはヒトの非造血性肝細胞を注射投与し、注射されたヒト造血性幹細胞がトランスジェニックマウスの内因性「白色組織」を犠牲にして生来の肝臓中に落ちつくようにさせる。ヒト肝細胞は増殖して小結節を形成し、それは究極的にはヒト肝細胞で宿主の生来の肝臓全体を再構築しヒトの肝機能を確立する。これにはマウス血漿タンパクの大部分をその対応するヒト血漿タンパクで置き換えることを含む。

本発明によって得られたマウスやその他のヒト以外の宿主は以下の事項に対し好適である。（１）ヒトの肝疾患を治療するための医薬のスクリーニングを含む、ヒト肝機能モデル化の研究、（２）患者の肝臓細胞を宿主マウスに移植することによって肝臓を冒すヒトの先天的疾患（原因が不明のものも含む）のモデル化を図る、（３）肝細胞ハング（たとえば後での分析やドナーへの再移植なとのために肝組織を維持して増やすこと）、（４）完全に機能し、完全に分化した肝細胞を後でドナーに再移植するために遺伝子工学的に操作することぐすなわちウィルスに対してアンチセンスを発現する肝炎ウィルス耐性ヒト肝細胞など、肝細胞指向性の遺伝子療法）、および／または（５）肝臓の再生を促進することができる治療剤を分析するだめのヒト肝臓のモデル化。

特に本発明は以下を提供するものである。

（１）完全に機能し、完全に分化した肝細胞を後日の分析と治療用途のために維持しかつ生成するための方法、（ｉ　ｉ）下記（ａ）および（ｂ）を含む治療的用途　（ａ）一旦感染性の剤や病変組織が消失したら健康な肝臓組織をドナー患者に再移植し、（ｂ）ドナー細胞の遺伝子を修飾してドナー患者に再移植すること（例えば肝細胞指向性の遺伝子療法）、（ｉ　ｉ　ｉ）ウィルス感染（例えばヒト肝炎ウィルスやサイトメガロウィルス感染）の研究のために、またそのような感染に対する処置や治療の有効性や安全性を試験するために、非生来で機能する肝臓（例えばヒト肝細胞）で創製する動物モデル、（ｉｖ）肝臓における化学薬品毒性（アルコールなど）、化学薬品で誘発された肝硬変や繊維化症の研究のために、またそのような化学薬品で誘発された損傷に対する処置や治療の有効性や安全性を試験するために、非生来で（例えばヒトの）機能する肝臓で創製する動物モデル、（Ｖ）肝疾患と診断された患者から収集されたヒト肝臓の肝細胞で宿主動物の肝臓を再構築することによって（原因が不明であっても）先天的なヒトの肝臓障害に対するヒト以外の動物のモデルを創製する方法、（ｖｉ）処置や治療の有効性や安全性を試験するために用いられる、先天性のヒト肝臓障害（グリコーゲン蓄積症、α−アンチトリプシン欠損症、凝固因子障害および欠損なと）のモデルとなる、非生来で（例えばヒトの）機能する肝臓で創製する動物モデル、（ｖｉｉ）肝臓由来の血漿タンパク（総血漿タンパクの〉９０％を含む）が移植された、非生来の（例えばヒトの）肝臓細胞に由来するような、ヒト以外の動物を創製する方法、（ｖｉｉｉ）正常または異常なトナー肝臓由来の血漿タンパクを生成して研究するための、非生来て（例えばヒトの）機能する肝臓で創製する動物システム、（ｉｘ）トナーの肝臓由来の血漿タンパクを冒す障害に対する処置や治療の有効性や安全性を試験するために用いられる、非生来で（例えばヒトの）機能する肝臓で創製する動物モデル、および（Ｘ）治療や診断用途のために大量のりコンヒナント血漿タンパクを産生ずるシステム。

肝細胞は豊富な量の血漿タンパクを集め、適切に緩和する機能を有する。したかって、移植された肝細胞または遺伝工学的に処理されたそれらの派生物は価値あるドナータンパクまたは他の派生タンパクを産出するために使用できるものである。

上記の教示に照らして本発明の多くの変更や変形例が可能であることは明白である。従って本発明は添付の請求の範囲の記載の範囲内において、本明細書に具体的に記載された以外の態様でも実施できるものであると理解されるべきである。

フロントページの続き（７１）出願人　チルドレンズ　ホスピタル　メディカルセンターアメリカ合衆国　４５２２９−２８９９　オハイオ。

シンシナティ、エランド　アンド　ベセスダ　アベニュ（番地なし）（７２）発明者　プリンスター、ラルフ　エル。

アメリカ合衆国　１９０３５　ペンシルベニア。

グラッドウィン、クライアー　ヒルロード（７２）発明者　パルミター、リチャード　ディー。

アメリカ合衆国　９８１９９　ワシントン、シアトル、フォースセカンド　アベニューウェスト　５４００（７２）発明者　デーガン、ジェイ　エル。

アメリカ合衆国　４５２２９　オハイオ、シンシナティ、フィールドハウス　ウェイ６７４６（７２）発明者　サンドグレン、エリツク　ピー。

アメリカ合衆国　５３７０５　ライスコンシン。

マディソン、リージェント　ストリート

Claims

【特許請求の範囲】

１．移植された非生来の細胞または組織から生成される、実質的に非生来の機能する肝細胞および機能する実質的に非生来の肝臓を有するヒト以外の動物。
２．実質的に機能する非生来の機能する肝臓はヒトの肝臓である請求項１に記載のヒト以外の動物。
３．請求項１に記載の霊長類。
４．請求項２に記載の霊長類。
５．請求項１に記載の哺乳類。
６．請求項２に記載の哺乳類。
７．請求項１に記載の齧歯類。
８．請求項２に記載の齧歯類。
９．機能する実質的に非生来の肝臓を有するヒト以外の動物であって、（ｉ）生来の肝機能が障害を有するヒト以外の宿主動物の肝臓領域に、当該ヒト以外の動物にとって非生来であり、かつ（ｉ）非生米の胎児、新生児および成人の、非造血肝臓幹、始原および成熟細胞、（ｉｉ）幹の、始原および成熟胆汁管細胞、（ｉｉｉ）非生来の胎児、新生児および成人の幹の、始原または成熟内胚葉性組織細胞、（ｉｖ）全能性幹細胞、および（ｖ）培養動物細胞から成る群から選択される少なくとも一つのものである細胞を移植し、（ｉｉ）非生来の細胞を、当該ヒト以外の宿主動物内において機能する実質的に非生来の肝臓に発達させた、実質的に非生来の機能する肝細胞および機能する実質的に非生来の肝臓を有するヒト以外の動物。
１０．非生来の細胞が、胎児の幹の、始原または成熟した非造血肝臓細胞である請求項９に記載のヒト以外の動物。
１１．非生来の細胞が、幹の、始原または成人の胆汁管細胞である請求項９に記載のヒト以外の動物。
１２．非生来の細胞が、幹の、始原または成熟した内胚葉性組織細胞である請求項９に記載のヒト以外の動物。
１３．非生来の細胞が、全能性幹細胞である請求項９に記載のヒト以外の動物。
１４．動物と非生来の細胞が同じ種からのものである請求項９に記載のヒト以外の動物。
１５．動物と非生来の細胞が異なる種からのものである請求項９に記載のヒト以外の動物。
１６．非生来の細胞がヒトの細胞である請求項９に記載のヒト以外の動物。
１７．ヒト以外の動物が、アルブミンプラスミノーゲン・アクチベータ・トランスジェン、または生来の肝機能に関して機能的に等価なものを有するトランスジェニック動物である請求項９に記載のヒト以外の動物。
１８．請求項１７に記載の齧歯類。
１９．請求項１７に記載のマウス。
２０．由来の肝機能に障害を有するヒト以外の宿主動物の肝臓領域に、非生来の胎児、新生児または成人の幹の、始原または成熟した非造血肝臓細胞を移植し、当該非生来の細胞を、当該ヒト以外の宿主動物内において非生来の肝臓に発達させた、実質的に非生来の機能する肝細胞および機能する実質的に非生来の肝臓を有するヒト以外の動物。
２１．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主における肝機能を回復させる方法であって、当該ヒトの肝臓領域に、胎児、新生児または成人の、始原または成熟した非造血肝臓細胞であって、当該ヒト宿主にとって非生来である細胞を移植し、当該非生来の細胞を、当該ヒト宿主内において機能する非生来のヒト肝臓に発達させる方法。
２２．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主が、肝硬変、または肝繊維症にかかっていると診断されたものである請求項２１に記載の方法。
２３．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主が、肝炎にかかっていると診断されたものである請求項２１に記載の方法。
２４．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主が、生来の肝機能が障害を引き起こした遺伝子病にかかっていると診断されたものである請求項２１に記載の方法。
２５．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主が、生来の肝機能が障害を引き起こした外傷を有すると診断されたものである請求項２１に記載の方法。
２６．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主の門静脈へ非生来の細胞を注射することによって移植を行なう請求項２１に記載の方法。
２７．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主の脾臓へ非生来の細胞を注射することによって移植を行なう請求項２１に記載の方法。
２８．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主の肝臓へ非生来の細胞を注射することによって移植を行なう請求項２１に記載の方法。
２９．生来の肝機能に障害を有するヒト宿主の腹腔動脈へ非生来の細胞を注射することによって移植を行なう請求項２１に記載の方法。
３０．肝機能が障害を有する動物の肝機能を回復させる方法であって、（ａ）生来の肝機能に障害を有する宿主動物の肝臓領域に、当該宿主動物にとって非生来であり、かつ（ｉ）胎児、新生児および成人の、非造血肝臓幹、始原および成熟細胞、（ｉｉ）幹の、始原および成熟胆汁管細胞、（ｉｉｉ）胎児、新生児および成人の幹の、始原または成熟内胚葉性組織細胞、（ｉｖ）全能性幹細胞、および（ｖ）培養動物細胞から成る群から選択される少なくとも一つのものである細胞を移植し、（ｂ）非生来の細胞を、当該宿主動物内において機能する非生来の肝臓に発達させる方法。
３１．当該動物の門静脈、脾臓、肝臓または腹腔動脈に非生来の細胞を注射することによって移植を行なう請求項３０に記載の方法。
３２．機能する非生来の肝臓を有する動物を得る方法であって、（ａ）肝機能を回復させる必要のある宿主動物に、当該宿主動物にとって非生来であり、かつ（ｉ）胎児、新生児および成人の、非造血肝臓幹、始原および成熟細胞、（ｉｉ）幹の、始原および成熟胆汁管細胞、（ｉｉｉ）胎児、新生児および成人の幹の、始原または成熟内胚葉性組織細胞、（ｉｖ）全能性幹細胞、および（ｖ）培養動物細胞から成る群から選択される少なくとも一つのものである細胞を移植し、（ｂ）当該宿主動物内の非生来の細胞を機能する非生来の肝臓に発達させる方法。
３３．宿主動物が、生来の肝細胞を弱体化するトランスジェンを保持するトランスジェニック動物である請求項３４に記載の方法。
３４．ヒトの肝臓の障害または疾病を処置または治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、請求項２に記載の動物を使用することを含む方法。
３５．ヒトの肝臓の障害または疾病を処置または治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、請求項４に記載の霊長類を使用することを含む方法。
３６．ヒトの肝臓の障害または疾病を処置または治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、請求項６に記載の哺乳類を使用することを含む方法。
３７．ヒトの肝臓の障害または疾病を処置または治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、請求項８に記載の齧歯類を使用することを含む方法。
３８．請求項１に記載の動物を使用する方法であって、将来の分析または治療に使用するために、完全に機能し、完全に分化した肝組織を維持し、生成するために当該動物を使用することを含有する方法。
３９．請求項９に記載の動物を使用する方法であって、将来の分析または治療に使用するために、完全に機能し、完全に分化した肝組織を維持し、生成するために当該動物を使用することを含有する方法。
４０．治療上の利用には、病原菌または障害のある組織をドナー患者から一旦除去し、ヒト以外の動物にとって非生来である細胞を当該ドナー患者から得るとともに、当該ドナー患者に健康な肝組織を再移植することが含まれる請求項３９に記載の方法。
４１．肝細胞に向けた遺伝子治療方法であって、ドナー動物から肝細胞を得、この細胞を遺伝子的に変更して生理学的に効果的な量の少なくとも一つの医学的に関連するタンパクを産生できるようにし、この遺伝子的に変更された細胞を請求項１のヒト以外の動物に移植して完全に機能的で、完全に分化し、遺伝子的に変更された肝組織を生成し、当該生成された肝組織を当該ドナー動物に再移植する方法。