【発明の詳細な説明】
症状発現前のIDDMの検出方法
本発明は、自己免疫疾患および症状発現前の自己免疫疾患の検出方法に関するも
のである。
特に、本発明は、インスリン依存性真性糖尿病(insulindepende
nt diabetes mellitus) (I DDM)および症状発現
前のIDDMの検出方法に関するものである。ペプチド断片を上記方法に用いる
ために提供する。
症基
ヒトにおける疫学的証明(1〜4)及び動物の飼育に関する研究からのデータ(
5〜8)によって、食用のウシのミルクタンパク質の糖尿病誘発効果が示唆され
た。ウシのミルクタンパク質に対する免疫性及びタンプ1の糖尿病(Type
l diabrfes)に関連した上記を支持する血清学的な発見が動物(5,
9)及びヒト(10〜12)で同定された。
ウシのミルクタンパク質と糖尿病との病因的な関連に関する最も直接的な証拠が
フィンランドの血縁の研究から明らかになり、これによると人生の初めの3〜4
力月間を母乳のみで育てると後の糖尿病の発達から保護できることがI分かった
(4)。
はとんどの研究では特異的なウシのミルクタンノくり質が同定されずまたはIl
乳で育てることを強調しているにも拘らず糖尿病の発生率がほとんど全地球で増
加していることを説明してはいなかった。しかしながら、これらの後者の観察(
4)は、ヒトにおいて(糖尿病になりやすいラット(13)等において)、ウシ
血清アルブミン(BSA)にまたはこれのペプチド断片若しくは部分に対する免
疫反応に関連した糖尿病が出生後初期の段階で起こる(14.15)という観察
と一致するものである。
症状発現前のIDDMの現状の検出方法は、島細胞の抗体の検出を基礎としてい
る(16〜18)。残念なことに、この方法は非常に難しく、もともと不正確に
結果を目視で判断するというマニュアルの過程を必要とする手間のかかる(20
間)アッセイ法である。国際的な標準にしたがって1−記アッセイを行うことが
できるセンターはいずれの国でも数箇所しかない。20%までのC上集団および
30〜50%のIDDMの血縁の人々がこのような抗体を持っている。この試験
はある部分集合しか臨床的なIDDMを予測できず、さらに80%しか診断て陽
性がでない。
BB糖尿病ラットを用いた動物実験によって、IDDM及びIDDMではないが
ある種の組織学的な島の変化を有する動物においてウシ血清アルブミンに対する
検出可能な抗体が示された(13)。このような変化を示すすべての動物が明白
なIDDMに進行する(progress)わけではないので、これらの研究は
、ウシ血清アルブミンに対する抗体の検出がI D D Mの進行を)測できる
ことを示すものてはなかった。
本発明者らの研究がなされるまで、十分な予測及び識別能をHする簡便な臨床方
法がヒトの患者をスクリーニングするのにおよび症状発現前のIDDMを検出す
るのに使用されていなかった。
図
図1:図IAは、142人の小児(斜線によるハツチ)及び79人の正常な小児
(水平線によるハツチ)におけるインスリン依存性糖尿病の診断時の血清1gG
抗BSA抗体濃度を示すものである。図IBは血清1gA抗BSA抗体濃度の分
布を示すものであり、図ICは血清1gM抗BSA抗体濃度の分布を示すもので
あり、両方とも平滑化による正規化がなされた後のグラフである。
図2=17人の糖尿病患者における全及びABBO3に特異的な抗BSA抗体の
測定を示すものである。図2AはIgGを、図2BはIgAを、図2CはIgM
をそれぞれ示す。ハツチのついているバーは患者の抗BSAレベルを表わし、白
抜きのバーはABBO3に特異的な抗体を除去した後に残っているレベルを表わ
す。水平方向のバーは、17人の正常な小児の平均抗BSA濃度(上部線)およ
び同じ血清中の抗ABBO3抗体を除去した後の濃度を示す。
図3二図3Aは、粒子濃度蛍光イムノアッセイ(particle conce
ntration fluoroimmunoassay) (P CF I
A)によって測定された40人の糖尿病の小児における適度に(水10線による
ハツチ)、かなり(斜線によるハツチ)、および非常にかなり(縦線によるハツ
チ)上昇したIgG抗ウシ血清アルブミン抗体の分布を示すものである。図3B
及び3Dは、(3B)12.3KfU/μmのIgG−および(3D)4.2K
fU/μmのIgA−抗つシBSA抗体を角む血清貯溜(糖尿病の小児からの)
に関するPCFIA標準カーブ、即ちBSA及びオボアルブミン/ツイーン20
の量が増加することによる結合の競合を示すものである。図30は、エンサイム
イムノアッセイ(E I A)に関するIgG抗B抗BS準標準カーブすもので
ある。図3Eは、エンザイムイムノアッセイ(E I A)に関するIgA抗B
SA標章カーブを示すものである。図3Fは、IgG−(○)及びIgA−(■
)抗BSA抗体に関する遊離したオボアルブミン/ツイーン20の量が増加する
ことによる、さらにはIgG−(ロ)及びIgA−(■)抗BSA抗体に関する
遊離したBSAの量が増加することによる結合の競合を示すものである。KfU
は、キロ蛍光単位(kilo fluorescence unillを示すも
のである。
図4=粒子濃度蛍光イムノアッセイ(paNicle concenfrali
on fluoroimmunoassay) (PCF IA、図4A及び図
4B)およびエンサイムイムノアソセイ(EIA、図40及び図4D)によって
検出されるタイプ1糖尿病の及び相当するコントロールの小児における抗BSA
抗体の平均値(±SEM)を示すものである。糖尿病及びコントロールの小児の
間の相違は以下の通りである。PCFIA:IgG、p<Q、0001 ; I
gA、pro、001゜EIA:IgASp<0.01゜
図5:糖尿病及びコントロールの小児におけるエンザイムイムノアッセイ(E
I A)および粒子濃度蛍光イムノアッセイ(PCFIA)によって測定される
抗BSA抗体しヘル間の相関関係を示すものである。影線を付された領域は「上
昇しない(non−elevated) Jと考えられるBSA抗体レベルを表
わす: (縦方向のバンド)はPCFIAでBSA抗体に対して陰性となるもの
であり、(水平方向のバンド)EIAでBSA抗体に対して陰性となるものであ
る。
図5A:糖尿病の小児におけるIgGSn=40S r =0.28、p=0.
09H図58:糖尿病の小児におけるI gA、 n=40、rs=0.11、
p=0.48;図5C:コントロールの小児におけるI gG、n=179、r
、=0.02、p=1. 0 ;図5D : コントロールノ小児におけるIg
A、r+=179、r=−0,05、p=1゜O0+0関係数1t、スバ? >
(D順(M、相r’A (Spearman’ t rankcorIelat
ion)によって測定した。
発明の説明
以下の記載において、本明細書の最後に列挙した文献を参考にする。
一般的な食事源由来のタンパク質またはタンパク質断片に特異的な自己免疫疾患
関連抗体量の測定、および本発明における方法による上記断片に対するTリンパ
球の感作の測定によって、以下のような独特な新規な臨床用及び調査用具が得ら
れる:
1、)疾患を遅延するまたは予防するための治療を開発しこれに用いるために必
要な初期の症状発現前の疾患の診断;
2、)初期の臨床発症時における自己免疫患者の識別できる診断;
3、)病気の過程及び治療の効果の観察。
本発明者らは、第一に、記載された方法によってウシ血清アルブミンに対する若
しくはこの天然或いは合成ペプチド断片に対する抗体のヒトの血清レベルを測定
することによって、将来IDDMを発症するであろう人々を検出することができ
ることを研究によって示す。
本発明の一実施態様によると、実施例1及び3に記載された粒子濃度蛍光イムノ
アッセイ(PCFIA)技術によってウシ血清アルブミン(B S A)に対す
る血清抗体を測定することによるIDDMまたは症状発現前のIDDMの検出方
法を提供するものである。関連抗体は粒子結合BSAに結合することによって検
出される。
さらに、例えば、実施例2に記載されるようなELISA技術等の、他の方法を
用いて、血清中の抗BSA抗体を検出した。実施例2から、EL I SA法に
よって検出される抗体によっては糖尿病または糖尿病前の信頼性の高い診断に必
要な識別性は得られないと考えられる。
t17子濃度蛍光イムノアッセイは、すべての糖尿病の小児においてIgG抗ウ
シ血清アルブミン抗体の上昇を検出するが、エンザイムイムノアッセイでは25
%の小児で抗体の上昇を検出した(p<0.0001)。蛍光イムノアッセイは
、コントロールの小児の2.2%で上昇レベルを検出したが、エンザイムイムノ
アッセイでは10%で上昇レベルを検出した(p < 0. 002)。患者に
おける上昇したIgA抗ウシ血清アルブミン抗体は、エンザイムイムノアッセイ
によるより蛍光イムノアッセイによる方が若干多(検出されたが、コントロール
の小児ではエンザイムイムノアッセイの方が3倍多く上昇レベルを検出した(p
ro。
01)。いずれかのアッセイで測定された値は、いずれかの患者(IgG: r
=0.28; IgA: r =0.1S
1)またはコントロール血清(IgG: r =0.02;I gA : r
=−0,05)で相関関係をまったく示さなかった。IgGに関する蛍光イムノ
アッセイは100%患者に感受性があり(エンザイムイムノアッセイ:25%、
p<0.0001) 、より疾患に特異的であった(IgG。
p < 0.02)。
これらの発明者らの発見によって、上記アッセイ技術によってほとんど(IgG
が)オーバーラツプせずにまたはいくらか(IgA力りオーバーラツプして抗ウ
シ血清アルブミン抗体のサブセット(subset)が明らかに検出されること
が示される。蛍光イムノアッセイ法では、抗原抗体結合が1〜2分以内で生じる
一方、エンザイムイムノアッセイでは数時間かかる。したがって、超免疫化後の
免疫反応に典型的な高いオンオフの結合率(on−all binding r
an)を有する抗体が粒子濃度蛍光イムノアッセイによって選択的に測定され、
これは糖尿病に関連があると考えられる抗体である。このような観察は、臨床を
目的として使用されるイムノアッセイ法を有効にする疫学的な調査の必要性を強
調するものである。
ヒト及びウシのタンパク質等の、様々な血清アルブミンタンパク質のアミノ酸配
列の比較によって、本発明者らは、ヒト及びウシの間の最も相違する領域である
、138〜166番目のアミノ酸領域に焦点を合わせた(19)。
本発明のさらなる実施態様によると、上記領域内の様々な新規なペプチドが、実
施例4に記載されたように、合成された。
上記したようなPCFIAによって検出された診断用抗体のバルクは、実施例1
に記載されたように、ペプチドC52185、ABBO5に結合することが分か
った。
上記したPCFIAアッセイを、粒子結合BSAの代わりに粒子結合ABBO5
等の粒子結合BSAペプチドを用いて行ってもよい。
ABBOSペプチドを用いることによって、実施例4に記載したようにC末端で
修飾された際でもIDDM関連抗BSA抗体の90%までが検出できる。
これらのペプチドは、天然のBSAタンパク質の断片または適当な技術によって
調製された合成ペプチドであってもよい。このような技術は、当業者には既知で
あるが、例えば、化学合成及び組換技術が挙げられる。
I D D M関連抗BSA抗体への結合能を残しているこれらのペプチドの類
似体も本発明の概念の中に含まれる。
本発明のさらなる実施態様によると、IDDM患者におけるおよび症状発現前の
IDDM被験者におけるABBO8及びC52267等の、BSAのペプチド断
片を特異的に認識し該ペプチド断片に応答して増殖する感作されたTリンパ球の
検出方法を提供するものである。
上記検出方法を用いることによって、IDDM、症状発現前のIDDMが検出で
き、さらにβ細胞または島移植後の患者のβ細胞攻撃免疫プロセスの再活性化を
検出することもできる。
本発明のさらなる実施態様によると、IDDM及び症状発現前のI DDM患者
中に存在する感作されたTリンパ球に特異的に結合するC32267のペプチド
を提供するものである。
C32267等のペプチドを毒素化合物に連結することによって、IDDMにお
けるβ細胞の破壊を仲介する特異的なTリンパ球に向かいこのTリンパ球を破壊
できる免疫毒素が調製でき、これによって疾患プロセスの停止手段が得られる。
実施例1−PCFIAによる抗BSA抗体の検出患者Iv集団:血液サンプルを
、新たにインスリン依存性真性糖尿病であると診断された142人のフィンラン
ドの小児(男性83人、女性59人、平均(士標準偏差)年齢8.4±4.3歳
)から得た。50人の患者は糖尿病性酸性症を、48人が糖尿病性ケトン症のみ
を、さらに残りが低血糖症のみを有していた。すべての患者が少なくとも一日に
1回ヒトインスリンを注射し続けなければならず、診断後はインスリン依存性が
増加した。本発明者らはまた、軽い外科手術を受けた79人の年齢、性別及び住
んでいる所が一致している小児(男性42人、女性37人、平均年齢 8.4±
3.1歳)、および300人の成人のトロントの血液ドナーについて研究した。
血液サンプルを、初めてインスリンを注射する前におよび3から4力月後に採血
し、さらに、44人の任意に選択した患者の部分集団については、1から2年後
にも採血した。2グループの小児からの血清サンプルをトロントに暗号を付して
(coded)送付した。
臨床評価としては、組織学およびインスリン及び間接免疫蛍光法または補体結合
試験のいずれかによって同定される島細胞の自己抗体の測定が挙げられる。サン
プルの容積は最先のサンプルを十分滴定するには不十分であるため、島細胞抗体
結果は陽性または陰性として表わされる。すべての患者のHLA−A、−B、−
C、ディアール、ディダブル(Dγ、 Di)のハブロタイブを(17)に記載
したように抗BSA抗体を、ドラシュ(Doschl ら(21)に記載された
粒子濃度蛍光イムノアッセイ(PCFIA)によって測定した。
96大の一方向流れ真空濾過プレート(9B−well unidirscti
onal flow vacuum 1ibration plan)をアッセ
イに用い、相分離処理(phage 5eparation procedur
e)を、ドラシュ(Doschi ら(22)およびチュング(Cheung)
ら(23)に記載されたようにして、試薬の添加、所定のインキュベーン、相分
離(phase 5eparation)、洗浄および粒子が結合したフルオレ
セイン化(Iluo+esceined)第二抗体の測定がプログラム可能であ
るロボット化スクリーンマシン(登録商標) (robofic 5creen
MachineTM)器具(アイディイーエックスエックス(IDEXX)製
、ポートランド、エムイー(Porlland、Me)、アメリカ合衆国)によ
って行った。
200μlのBSA [グレードV1シグマ ケミカルコーポレーション(Si
gma Chemical Co、)製、セントルイス、エムオー(st、Lo
uis、 Mo) 、アメリカ合衆国、10%のリン酸緩衝溶液(PBS ;4
0g NaC1、Ig KCI、Ig KH2PO4,5,75g Na2 H
PO4,0゜5g CaC1,0,5g MgCl215リットル蒸留水、pH
7,2)]を400μmの(5%ストック;アイディイーエックスエックス(I
DEXX)製)のカルボキシル化ポリスチレンビーズ(直径0.75xtm)上
に共有結合(100ulの10mg/mlの1−エチル−3−(3−ジメチルア
ミノプロピル)−カルボジイミド)した。次に、1.0%オボアルブミンーPB
Sに溶解した10% ツイーン20を遮断剤として用いた。0.1%オボアルブ
ミンーPBSに溶解した1%までの濃度のツイーン20を遮断剤として用いても
よい。繰り返し洗浄した後、ビーズを1% ツイーン2O−PBS中で貯蔵した
。9力月にわたり、ビーズの活性は変化せずに残った。オボアルブミンはシグマ
(Sigma)より得た。
20μ】の試験血清希釈液(1: 100〜1:1.0OO)を、20μmの1
:20の希釈BSA被覆微小球(初1t12,5%重曾/容積)を含むマイクロ
ウェルに添加した。
10プレートまでを、相分離(phase 5eparation)、洗浄およ
びアフィニティ精製された(affinity purified)市販のBS
Aをaまないフルオレセイン−複合体形成(fluorescein−conj
adaled)ヤキ抗ヒトIgG、IgA及びIgMの添加(100ng/ウェ
ル)(Fc−断片に特異的、)くイオカン(BioCan)製、ミッンサーガ、
オンタリオ(Mississauga、0nta+io]、カナダ)がプログラ
ムされたスクリーンマシンtscreen Machinei中に挿入した。短
時間(1分間)インキュベーション、相分離及び低い(5m m Hg )真空
圧で洗浄処理することによって、血清タンパク質の乾燥及び沈殿を防止した。読
み込む前に、ウェルを1分間真空乾燥し、蛍光発光(4721512nm)を、
ウェルの底面の濃縮された粒子ケーキ(particle cake)から高真
空下で読んだ。
このシステムの速度論は公表されている(ドラシュ(Dosch)ら(1988
年)上記)。本発明者らは、1人の作業者当たり1器具当たり1日で3,000
個までのサンプルを繰り返し測定した。
糖尿病患者からの血清の検量された貯溜を各プレートにおいて標準物質として用
いた。この標準物質は、1μm当たり12.3キロ蛍光単位(K f U)のI
gG抗B抗B抗A抗体さらに、4.2KfU/μmのIgA抗B抗B抗A抗体4
,0KfU/μmのIgM抗B抗B抗A抗体んでいた。抗BSAアッセイは1.
O(IgG、IgA)及び10、 0 (I gM) n g/m 1の感受性
を有しており、アッセイ内−およびアッセイ間の変動係数はそれぞれ8.9%及
び9,8%であった。BSA (オボアルブミンではない)の添加は、用量に依
存して抗体の結合を遮断した。79人の正常な小児の平均+25Dを超える抗B
SA抗体濃度を置ヒ昇した(elevajed) Jと規定した。
データ分析:抗体濃度は、標準血清貯溜に対するキロ蛍光単位/μlとして表現
した。カイ二乗の統計学、分散のパラメトリック ワン−ウェイ分析(para
mrfric one−vtalanalysis of variance)
、および一般的に分布した値に関してはステニープントの非対を一試験(Hu
dent’s unpaired 1−test)を用いて結果を分析した。抗
BSA濃度の分布は各イソタイプでは正常であった。ゆがんだ分布の場合には、
マンーホイットニーーユー試験(Mann−WhNne7−1l jtsj)及
びスパーマンの順位相関(Spearman’s rank correlat
ion)試験を用いた(r )。診断後の抗BSA抗体濃度を対試験(pair
ed 1est)を用いて評価した。
抗BSA抗体:糖尿病患者の血清1gG抗BSA抗体濃度は、正常な小児の値に
比べてかなり高く (図1)、平均濃度はほとんど7倍高かった(表1、P<0
.001、表2)。糖尿病患者及び正常な小児は主要なウシのミルクタンパク質
であるカゼイン及びβ−ラクトグロブリンに対するIgG抗体の血清濃度が等し
かった(表1)ため、糖尿病患者の上昇した血清IgG抗B抗B抗A抗体濃度養
面での抗原(nufritional antigen)に対する一般的な免疫
反応を反映するものではなかった。
IgA抗B抗B抗A抗体均血清濃度は、正常な小児に比べて糖尿病患者の方が高
かった(P<0.001、表1)が、値はオーバーラツプしていた(図1)。2
/3の糖尿病患者(および2人の正常な小児)の濃度が上昇していた(Pro、
001、表2)。若い年齢の糖尿病患者には一致していることであるが、IgA
抗B抗B抗A抗体する患者は抗体濃度の低い患者に比べて年齢が高かった(10
゜1±3.4歳対6.0±4.6歳;p<o、0001)。
糖尿病患者のIgM抗B抗B抗A抗体均血清濃度は、正常な小児に比べて若干低
かった(P<0.05、表1)。
8%の正常な小児が濃度が」1昇していたのに比べて、1%未満の患者が濃度が
上昇していた(P<0.01、表2、図1)。
糖尿病患者または正常な小児はIgD抗B抗B抗A抗体しておらず、任意に選択
した患者の部分集団では、IgE抗B抗B抗A抗体出されなかった。
低い濃度の(主にIgM)抗BSA抗体が糖尿病の及び正常な小児の両方で検出
されたが、高い濃度のIgG及びIgA抗B抗B抗A抗体尿病の小児のみで観察
された。後者の発見によって、BSAに特異的な免疫反応とインスリン依存性糖
尿病の臨床学的な発症との間に密接な(100%の)関係があることが示された
。糖尿病患者のBSAに対する活性、抗原由来の免疫反応と一致することである
が、IgM及びIgG抗BSA濃度の間にはかなりの相関関係があった(「5=
0.77;Pくo、oool)。
寿命の長いIgG抗B抗B抗A抗体濃度断後3がら4力月たった糖尿病患者内に
残ったが、寿命の短いIgA抗B抗B抗A抗体濃度り低かった(Pro、001
、表3)。
診断から1から2年たった後研究した44人の患者では、3タイプすべての抗B
SA抗体濃度がより低くなっており(P<0.001) 、はとんどの患者で正
常な値に達していたCI gG : 27人の患者、IgA:43人の患者、表
2)。これらの結果はβ細胞p6913.14による抗原の刺激の減少と一致し
ている。
特異性の研究=44人の糖尿病の小児と44人の正常な小児からの血清を用いて
さらに研究を行った。ウシのミルクカゼイン(シグマ(Sigma)製)及びβ
−ラクトグロブリン(ジグ?(Sigma)製)に対するIgG抗体を、BSA
で記載したのと同様にして被覆した微小球を用いて測定した。
ABBOSペプチド(BSA配列配列位置1御2〜168相同性のある領域を天
然の配列中には存在しないC末端システィン残基を用いて合成し、C末端のシス
ティンはビオチン化した。ドラシュ(Doschl ら(1 988年)上記に
よって記載されたようにして、カルボキシル化されたポリスチレン微小球にカッ
プリングされたストレプトアビジン(S+repavidin) にビオチン化
ペプチドを結合することによって、固相A B B O S (solid p
hase ABBOS)及び固相ABRA S (solid phase A
BRAS)を調製した。20μm (0.5%w/v)のABBOS−またはA
BRAS=複合体形成(conjuga+yed)微小球を最終的な容積を0.
3または3mlにして3μmの患者若しくは正常な血清と混合した。4℃で15
分間インキュベーションした後、混合物を遠心し、20Allの上清を残存する
抗BSA抗体の測定に使用した。
抗ABBO3抗体.固相ABDOSペプチドに血清をさらす前(図2、黒いバー
)およびさらした後(白いバー)の抗BSA抗体の測定を行い、BSAのABB
O3領域に特異的に結合する抗BSA抗体の割合を1il11定した。
高い、適度な及び比較的低い抗BSA濃度および全体の゛■也均に近い平均値を
rイする44人の糖尿病患者からの血清を用いて、上記研究を行った(図2、1
7人の代表的なサンプル)。IgG抗B抗B抗A抗体濃度血清がABBOSペプ
チドと反応した後2/3(30〜70%の範囲)減少した。同様にして、多くの
割合のIgA及びIgM抗B抗B抗A抗体3〜71%)がABBOSに特異的で
あり(表3)、これから2%未満のBSA分子を表わしている上記の短い配列に
関するきびしい偏見(severe bias)が示された。ABRASペプチ
ドと共に血清をインキュベーションすることによって除去された抗BSA抗体量
は正常なアッセイ偏差以内であった(〜10%)。
診断後の抗BSA抗体濃度は、ABBOSに特異的な抗体の消失によって減少し
始めた(90%、p<o.oo。
1)。診断後1から2年たつと、研究した44人の患者のうち7人の患者が、A
BBOSペプチドに特異性を有する抗BSA抗体を何しているのみであり、44
人のうち17人の患者が若干抗BSAe度が上昇していた。抗BSA濃度か最も
高かった17人の正常な小児の血清サンプルについて、固相ABBOSペプチド
と共に血清をインキュベーションした後同様にして研究した。抗BSA抗体濃度
は吸収された血清中でかなり減少し、2血清サンプルのみがそれぞれ検出可能な
IgGまたはIgA抗ABBOS抗体を念むのみてあった。300人のトロント
の成人血液ドナーでは、IgG抗B抗B抗A抗体濃度囲及び平均が79人の正常
なフィンランドの小児のものと同様であり(表3)、IgG抗ABBO3抗体は
サンプルの3%で見付かった。
抗BSA抗体および疾患マーカー:抗BSAまたは抗ABBO5抗体濃度および
疾患の発症の重症度(血中グルコース、HbAl、血清C−ペプチド濃度)、診
断前の症状の期間、または糖尿病性ケトン症若しくは酸性症の重症度との間には
同等関係は認められなかった。特異性、濃度および抗体のイソタイプの分布は多
様な(multiplex)及び単純な(simplex)家系でも同様であっ
た。
診断時に78%の患者は島細胞抗体が陽性であり、58%が捕体結合島細胞自己
抗体を有しており、47%がインスリン自己抗体を有していた。抗BSA濃度、
イソタイプの多様性または特異性のいずれもが島細胞−若しくはインスリン−自
己抗体の存在または不存在に関連していなかった。
HLA−DR3/4若しくは−Dw3/4に異種接合の小児は、初期に、このよ
うなハブロタイブの組合わせに陰性の小児と比較するとより重症な糖尿病(より
高い血中グルコース及びHbA、およびより低い血清C−ペプチド濃度)を示す
が、インスリン−及び島細胞−自己抗体の頻度または濃度は両方のハロタイプの
グループで等しかった。
BSA/ABBO8抗体の濃度は、HLA−DR3/4若しくは−DW3/4を
有するまたは持たない糖尿病の小児のうちで、さらにはHLA−DR3/x、−
DR4/x及び−D w 4 / xを1するものの中では同等であった(co
mparable)。
また、固相ABBO3を用いて、固相BSA (BSA被覆微小球)を使用して
上記したのと同様にして、血清抗ABBO3抗体をアッセイした。
BSA及びABBO3の両方を結合したモノクローナル抗体(抗B S A/A
B B OS抗体)を、新たに糖尿病であると診断された患者のニブスティン
−バーウィルスを形質転換した8928球から得た(24)。モノクローナル抗
体、さらにはポリクローナルなラットの抗ABBO3抗血清(19)はインスリ
ン及び島細胞自己抗体に対して陰性の反応を示した。これに対して、それぞれ、
1000及び100μgまでのBSAまたはABBOSペプチドを添加しても、
すべての15人の試験した糖尿病患者の血清における島細胞抗体およびインスリ
ン自己抗体に関するアッセイ結果は変わらなかった。
実施例2−PCFIAおよびEL I SAの比較患者:50人のフィンランド
の糖尿病の小児(男性22人、平均上標準偏差年齢 6.2±4,5歳、範囲
0゜9〜15.5歳)が、比較アッセイのために、実施例1の患名母集団から任
意抽出され、そして彼らはBSA抗体の代表的範囲の上昇レベルを含むものであ
った(図3A)。
サンプルは、糖尿病の診断の際に採取され、そして選択された血清は、EIAに
よって分析するためにフィンランド国の研究所へ暗号を付して(coded)送
り返された。コントロールの被験者は、179人の年齢および性別が一致した糖
尿病に罹っていないフィンランドの小児たちであった(男性98人、平均上標準
偏差年齢 6.2±3.6歳、範囲 0.9〜15.9歳)。
患者およびコントロールの血清中の抗BSA抗体を実施例1に記載されたのと同
様にしてT’CFIAにより測定した。
糖尿病の小児の一集団の(陽性)標準血清貯溜が用いられ、そしてすべてのプレ
ートにおいて標準曲線が準備された(図3B)。競合実験によって、BSAに関
して充分な特異性が示された。遊離したBSAは用量に依存して抗体の結合を遮
断するが、オボアルブミンまたはツイーン20またはこれらの組み合わせは抗体
を置換することができなかったく図3D)、結果は、12,300Kfu/ml
IgG−および4,200Kfu/ml IgA−抗BSA抗体を含む標準物質
から導き出された器具の増大(gain)C5x) 、血清希釈およびアツセイ
容積に基づいてキロ蛍光単位(KfU)/μmとして表わされる。蛍光発光エネ
ルギーの直線性により、値は正常に分布した。上昇した抗体レベルはコントロー
ル被験者の平均レベル+28Dを超えるものとして規定した。
酵素結合イムノソルヘント検定法(:ELISA)上記に述べたようなI’CF
IAにより検定された血清サンプルハまた、タイニオら(Tainio et
at) (25) lこより修飾された既知の三層固相法である、抗BSA抗体
(こ関する酵素結aイムノソルヘント技術によって測定されt二。
このノブ法は、ポリスチレン製マイクロストリ・ンプウエルtpok4!1Be
ne Mic+oNrip well) (ラボシステムス(Labsys+e
mi)製、ヘルシンキ、フィンランド)を用い、これを10当り3プレート(6
6個のサンプル)まで操作できる自動EIA分析器(オート−イーアイニー I
I (Auto−EIAll)、ラボシステムス(Labsystemsl製
、ヘルシンキ、フィンランド)において操作した。プレートを、0.1モル/I
PBs−5モル/I NaN3 (pH7,4)中で2μg/ml (100μ
1)BSA (A−4378、シグマIS i gmai製)で、1晩室温にて
被覆した。PBS−NaN3で洗浄した後、ウェルを1%ゼラチン−PBS−N
aN3で37℃で1時間飽和し、使用するまで+4℃で貯蔵した。
血清サンプルを、0.05% ツイーン20中で調製された0、5%ゼラチン
PBS NaN3で1=40に希釈した。血清希釈物100μmの3つのレプリ
ケートをプレート付けし、そのうち2つは被覆されたウェルに、1つは被覆され
ていないウェルに付けられた。37°Cで60分間インキュベートした後、ウェ
ルを洗浄(4回)した。希釈アルカリホスファターゼ複合体形成抗ヒトIgG−
または−IgA(カタログ番号+ 67806および67808 。
オリオン ダイアゴノステイ力(Orion Diagnostica)製、ニ
スポー(Espoo) 、フィンランド)を添加し、60分間インキユヘーした
後、前記したように4回洗浄した。基質[DEA (N−N−ジエチルアニリン
)−バッファ中のpNPP (p−二トロフェニルホスフエート)2mg/ml
コを45分間インキュベートした後、反応を1モル/I NaOHで停止した。
被覆されていないウェルにおける吸光度(光学密度405nm)を、試験値から
引いた。 アッセイのアッセイ内およびアッセイ間の偏差は、それぞれ9゜3%
および15.8%であった。血清アッセイに関して、BSA抗体陽性標準物質の
連続希釈がそれぞれのプレート」二で行われ(図3C)、結果を標準血清の結合
の割合(%)として表わした。IgGおよびIgA双方に関する値は、対数変換
にもかかわらずゆがんだものであるため、陽性の限界はコントロール被験者の値
の90パーセントで設定された。この限界は、許容できる特異性での最も高い感
受性を与えるものとして、一連のカットオフ値の試験の後選択されt:。IgG
に関し標準物質の3.9%、またIgAに関し標準物質の14.2%の吸光度を
有する血清は陽性であるとみなした。
統計学的分析
統計学的分析を、正規分布関数の場合において、交差図表作成、カイ二乗の統計
学およびステニープントの非対t−試験(Sludenl’+ unpai+e
d 1−test)を用いて行なった。
EIAによって得られたBSA抗体レベルの分布は変換にもかかわらずゆがんだ
ものであったので、糖尿病の小児およびコントロールの小児間の相違は、マンー
ホイットニーー1−試験fMann−Whitney−υ1est)によって評
価された。
マンーホイットニーーユー試験(Mann−Whitney−U test)お
よびスパーマンの順位相関(Speavin’s rank correlat
ion)試験を用いて、EIAとPCFIAとの間の抗体レベルを比較した。ア
ッセイの感応性および特異性が測定され、結果をカイ二乗の統計学での交差図表
作成によって評価した。結果は平均±SEMとして表される。
糖尿病の小児からの40個の血清は上昇したIgG抗BCFIA
SA 抗体の範囲を含んでいた;しかしながら、EIAによってはわずか25%
が陽性とされたのみであった(表4、p<0.0001)。一方、コントロール
被験者のIgG抗BSAEIA抗体は、PCF IAによって検出されるものよ
り高い頻度で11昇した(表4、p<Q、oo。
2)。PCFIAおよびEIAにおいて、糖尿病の小児においてIgA抗B抗B
抗A抗体昇したものは、それぞれ50%および42%(p=NS)であったが、
コントロールの小児のわずか3.3%および10%がPCFIAおよびEIAに
おいてそれぞれ陽性であった(表4、p<Q、。
1)。これらの結果から、EIAではなくPCFIAの方がタイプ1の糖尿病の
小児における疾患関連BSA抗体を選択的に検知することが示された。これに対
して、EIAは、一般的な母集団でより一般に行われる抗体の検知には好ましい
。いずれの方法もすべてのBSA抗体を検知できるものではなかった。
糖尿病の小児におけるBSA抗体レベルを図4に示す。
PCFIAによってii[lJ定した場合には、糖尿病の小児とコントロールの
小児との間にIgG−およびIgA−抗BSA抗体の両方のレベルに顕著な相違
が現れた(p<o、0001およびp<0.001)。これに対して、I gG
−抗BS A E I A抗体のレベルは、糖尿病の小児とコントロールの小児
とではおおよそ同様であった。IgA−抗BSAEIA抗体は糖尿病の小児にお
いてより高いものであったが、その差異(p<0.01)はPCFIA (p<
0.001)におけるものよりも顕著なものではなかった。これらの知見は、P
CFIAにより検知された抗体のサブセットにおける定量的相違を示唆するもの
であり、この相違は糖尿病の小児とコントロールの小児とを識別するものである
。
個々のI’CF IAおよびEIAの値を、糖尿病の小児およびコントロールの
小児に関して図5において比較する。
影線を付された範囲は、陰性であるとみなされるレベルを示すものである(上記
参照)。PCFIAとEIAとの間の相関性は非常に乏しかった(−0,05≦
r ≦0.28.0.09≦p≦0.1)。糖尿病の患者では、血清の1部分集
団(IgG:〜20%およびIgA:〜32%)のみが、双方のアッセイにおい
て比較的低いないし高い抗B S A 値を示した、すなわち相関性を示した。
さらに、コントロールの被験者のなかで、わずか1つのIgAサンプル(0,3
%)のみが双方のアッセイで陽性であった。
コントロール血〆hにおけるBSA−抗体は、PCFIAにおけるよりもEIA
においかなり頻繁に結合しくIgG:p<0.002およびIgA:p<0.0
1、表4)、■gG=またはIgA−抗BSAEIAに対して陽性の18個のコ
ントロールの被験者うち、たった1つがPCFIAによって陽性であった。これ
に対して、PCFIAによって検出された4つのIgG陽性のおよび6つのIg
A陽性のコントロール血清のうち、わずか1つのみがEIAによって陽性であっ
た(図5)。したがって、はとんどの疾患関連BSA抗体はPCFIAによって
のみ検出されt;。疾患関連1gG抗BSA抗体の検出におけるPCFIAの感
度は、EIAと比較した場合優れたものであり(100%対25%、表5;p<
0.0001)、疾患特異性はPCFIAO方がより高いものであった(表5;
p<0.02)。
IgAイソタイプアッセイに関しては、結果は疾患感応性については同等であっ
たが、EIAではアッセイの特異性が犠牲にされた(p < 0. 05)。こ
れらの知見から、PCFIAおよびEIAは、BSA抗体の様々なサブセットを
重複なしに(IgG)あるいはわずかの重複(IgA)をもって差別的に検出す
るものであることが示唆される。
EIAで検出された抗体は、タイプ1の糖尿病と関連しないが、一般的な母集団
では共通して見い出される。
表 5
表 抗BSA抗体検出時のPCFIAおよびEIAの感受性および特異性PCF
IA EIA P PCFIA EIA Pより一般的に入手可能なEIAとP
CFIAアッセイ法を比較するために、本発明者らは両者の技術を使用して多(
のサンプルを分析した。この比較によって、PCFIAによってほとんど排他的
に検出された糖尿病関連抗BSA分子による相違は曖昧でないことが明かとなっ
た。糖尿病の小児の陽性の応答のレベルおよび頻度は両方とも、EIAよりもP
CFIAにおいてより顕著であった。患者およびコントロールの被験者に対する
EIAの抗体レベルの広範な広がりによって、グループ間において重要な重なり
を生じ、相違を統計的に無意味なものとした。大部分のサンプルは、EIAの検
出限界以下であり、これによって試験した両イソタイプの測定をかなりゆがんだ
ものとした。
PCFIAは、糖尿病の患者のBSA抗体を検出し、糖尿病でない小児は数人が
陽性であるのみであった。これに対して、EIAにおいて病気と関連した抗体の
割合は少なく、糖尿病でない被験者でもしばしばレベルが上昇した。
18コントロール中でたた1だけがPCFIAによってもIgG−またはIgA
−抗B S A EIAが上昇して陽性であり、いずれかの方法で検出された抗
体サブセット(subset)間では明らかに1分できた。興味あることに、1
つの上昇したIgGおよびIgA値が同じ血清サンプルを用いて両者の方法で検
出されたことから、宿主が食用BSAに対する一般的な免疫応答に利用された抗
体種の選択性を決定することが示唆される。
BSA分子は608アミノ酸からなり、配列がヒト血清アルブミンと異なる種々
の領域がある。それらの1つは、ABBO3(ブレBSA位置153−169
(19))である。
実施例1から明らかなように、糖尿病の小児においてPCFIAで検出された大
部分の糖尿病関連抗体はこのエピトープに関するものであり、それに対して糖尿
病でないコントロールの被験者においては、396未満のドナーがABBO3を
認識でき、はとんどのエピトープが相違する。ABBO3のエピトープが(β−
細胞)自己抗原、p69[1,3]、と免疫学的に交叉反応性であるので、一般
白tな母集団におけるこのエピトープの免疫抗原性が乏しいことは驚くべきには
あたらず、糖尿病母集団を明らかに同定するものである。本発明者らは、この原
理的な相違を糖尿病の患者における経口(または粘膜)耐性の発達の遅延と結び
付いた糖尿病関連MHCクラスII分子によるABBO8の有効な抗原位と結び
付けた(14.13):すなわち、後者に関する本発明者らの焦点は、糖尿病の
危険性(DQβ 非−A S P 57)の単一の最も高いマーカーが、IgA
欠陥に対する疑い、即ち粘膜免疫の調節の異常性、をもマークするという報告に
よって誘発された(26)。
BSAなどの抗原は高いおよび低い親和抗体の広範なスペクトルを誘導できる種
々のエピトープをh゛する。本発明者らの結果は、EIAにより検出されたイン
スリン自己抗体(IAA)は病気関連性が薄く、さらに流用放射性結合検定法C
RI A)に比較して予言性の低い値であるという観71111(28−30)
に非常に懐占的である。EIAは、本研究で得られた結果に類似して、低感受性
および許容できないはと高い比率の虚偽の陽性によって特徴付けられる(27)
。EIAは高結合能を有する低親和性IAAを主に検出し、RIAは高親和性、
低結合能およびIAAの強力な病気関連サブセットを検出する(3o)。同じこ
とは、エピトープに対する受入れ易さがEIAと相違するPCFIAなとの流用
アッセイにも適用できる。同じエピトープは、異なる結合方法によりPCFIA
およびEIAにおいて利用できない。病気関連エピトープは、EIAプレートに
結合しても、用いることはできない(31)。他方、EIAプレート表面上の過
剰の接着性抗原は、健常な血液ドナーにおけるIAAに関して報告されたように
、高結合能を酊する非病気関連、低親和性抗体の結合を片寄らせる(32)。
2つのアッセイシステム間の相関関係の著しい欠如は、平均的な抗体親和力での
漸近的な相違をあまり示唆していないが、検出された抗体量が絶対的に相違する
ことを示す。
抗原ドライブ(超)免疫応答[anligen drive (hlper−)
immune responselの成熟によって、高親和性ばかりでなく高
速結合連動を有する免疫グロブリンを好む抗体レパートリ−が得られ(33)、
すなわち、抗体は高いオンオフ(onO(1)抗原結合速度および、例えば病原
体の素早いオプソニン作用及び抗体の再−利用に必要である放出によって特徴付
けられる。本発明賃らは、抗原−複合体形成微小球の大きな表面積、抗I3九の
その後の接近し易さおよびPCF IAの高速力学(1分の結合間開)全ての組
み合わせによって高いオンオフ結合速度を有する抗体の選択的な検出が可能とな
る。ここで提供された意見は、目的とする抗原と結合できる全ての可能な免疫グ
ロブリンレパートリ−を必ずしもカバーしない血清検定方法の臨床的な価値の重
要性を強調するものである。
実施例3 PCFIAによる症状発現前のIDDMの検出患者および症例:本研
究におけるサンプルは、数年間にわたりIDDM(r標題の症例」)であると新
たに診断された小児の全血縁の90%以上を含む、実施例1で使用された血液サ
ンプルのサブセットとして得られた(この研究は継続中である)。血液サンプル
を、後者の診断時および6〜12力月毎に標題の症例の子孫から採取した。70
0家族以上が登録され、標題の症例の19子孫が今までのところ糖尿病になった
。本発明者らのサンプルは、11人の糖尿病になった人々のサブセットおよび健
康と思われる100人の子孫を示すものである(これらの少なくとも1〜2人は
糖尿病に変換すると予想される)。これらすべての小児のうち、1〜6サンプル
を上記間隔で採取して使用した。
血清1gG抗BSA抗体レベルは、実施例1に記載したのと同様にして測定され
た。
結果を、表6及び7に列挙する。
表6は、各被験者から採取されたまさに最初(すなわち、「標題の症例」である
と診断された際)のサンプル中に存在するIgG抗B抗B抗A抗体レベルすもの
である。糖尿病は、これらの小児において1〜5年後に生じた。表7は、標題の
症例に対する100人の健康な子孫がら任意に選択されたサブセットにおけるI
gG抗B抗B抗A抗体レベルすものである。
表 6
傘 標題の症例の100人の健常な子孫の任意の部分集団表 7
表 7 続き
実施例4 BSA−感作IDDM関連Tリンパ球の検出患者;静脈血液サンプル
は、最近IDDMになった患者および健常なコントロールからインフォームド
コンセントを経て採取した。Tリンパ球は血液サンプルから調製され、BSAお
よびBSAの種々の合成ペプチド断片に応答するT細胞増殖を、血清を含まない
培地を代わりに使用する以外、ドラシュら(Doschl らの方法と同様にし
て検定した。
合成ペプチドは、ファルマシア ペプチド シンセサイザー(Pha+maci
a peptide 5ynthesise+) (ファルマシアリミテッド(
Pha+macia LTD)製、モントリオール、ケベック(Montrea
l、 Quebec))を用いて製造業省の勧めにしたがって製造し、既知のH
PLC技術によって精製した。
次の合成ペプチドを用いた:
A B B OS : ac−Phe−Lys−Ala−Aap−Glu−Ly
g−Lys−Phe−Trp−Gly−Lys−Tyr−Leu−Tyr−Gl
u−11e−Ala−Arg−−A B RA S : ac−Gln−Glu
−Asn−4ro−Thr−3e+−Phe−Leu−C7s−His−Tyr
−Leu−His−Glu−Val−Ala−Lys−Lys−NH2CS 2
270 : ac−Tyr−Ala−^5n−Lys−Tyr−Gly−Val
−Nl2(YANKYGV)
CS 2268 + ac−Lys−Phe−Trp−Gly−Lys−Tyr
−Nl2(KFWGKY)
CS 2267 : ac−Glu−Phe−Lys−Ala−Asp−Glu
−Lys−Ly+−Nl2
(EFKADEKK)
CS 2240 : ac−11e−Glu−Thr−Met−Arg−Glu
−Lys−val−Leu簡潔にいうと、ヘパリン化した血液を血清を角まなl
、SHL / 1 )5地で1;1に希釈し、単核細胞をフィコール−71イパ
クーグラシエント(Ficoll−Hypaque g+adients)で精
製上HL/1中で洗浄腰カウントし、2×105を容量200μI HL/1の
96ウエルのマイクロカルチャー プレー)・(mic+ocullu+e p
latelに加えた。コントロールの培養液は、pan−T細胞ミトゲンフィト
へマグルチニン(lAlg)を追加するかまたは全く追加しな力)つt二。
BSA (0,01〜10μg)またはその他のテストタンパク質、または0.
1〜1 tt gの合成ペプチドを3連で培養液に加えた。培養液を空気中で5
%濃度のCO2の湿潤した雰囲気下で37°Cにおいて8〜10日間インキュベ
ー・ 3
トシた後、11tcl HTdRと共に6時間ノぐルスしt二(pulse)。
さらに、細胞を自動/’%−ベスターで収集し、力nえたチミジンをンンチレー
ション カウンターで測定した。
または、CCFAなどのT細胞の活性化の測定若しくはIL2産生などの測定も
同様に用いてもよい。ここに示した全てのデータは上記した標準的なTdR添加
法を用いた。
IDDM患者から得られた結果を表8に示し、正常のコントロールからの結果を
表9に示す。
すべてのデータは、PHAで誘導された値に対する増殖性応答として表わす([
cpm実験/cpmPHA)*100コ。陽性反応は、非刺激細胞における平均
応答+2SDとして規定した。コントロール以外のすべての患者が、少なくとも
BSAまたはABBO8,通常両方、および試験した際には、この条件における
最小T細胞刺激ペプチドであるC82267に対して陽性の反応を示した。小さ
い反応がC32268では見られることもあったが、C32270またはC32
240では見られなかった。
表 8
表 9
表 9 続き
IDDM患者は、ペプチドC82267を特異的に認識し該ペプチドに応答して
増殖する感作されたTリンパ球を何することが分かったが、正常なコントロール
はこのような感作されたTリンパ球を持たない。現在入手できる指示薬によって
評価される症状発現前のIDDMを有する被験者は、IDDMの患者と同じ応答
を示した。
抗ABBO8および抗BSA免疫性の予測力が確立されたので、本発明者らは、
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抗−BSA、IgG (KfU/μe)図 I A
rgA tN−BSA (KfTJ / peJ図 I B
IgM 抗−BSA (KflJ / pe)被験者(N = 17)
図 2 A
被験音(N : 17)
図 2 B
彼 駐 者 (N = 171
′2 2 C
2,04,06,08,010,012,014,016,01B、OIgG−
抗−BSA (KfIJ / pe)図 3 A
600 200 70 25 B 2.7 0.9 0.3 0.1希 釈 (
XIO3)
図 3B
希 釈 (×103)
図 3 c
希 釈(×103)
図 3 D
ρCFIA
図 3 E
リガンドの添加隈(1g)
図 3 F
口l^
PCFIA (KfU / Jul )IgA: 糖尿病、の者
01 234567B
PCFIA (KfU / Jul )IgG: :l 、)。−1゜
PCFIA (KfU 71m)
0 0.5 1 2 3 4
PCFIA (KfU 71m)
フロントページの続き
(51) Int、 C1,6識別記号 庁内整理番号GOIN 33153
D 7055−2J331564 Z 7055−2J
(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IE、IT、LU、MC,NL、PT、SE)
、0A(BF、BJ、CF、CG、 CI、 CM、 GA、 GN、 ML、
MR,NE、SN。
TD、 TG)、 AT、 AU、 BB、 BG、 BR,BY。
CA、CH,CZ、DE、DK、ES、FI、GB、HU、JP、KP、KR,
KZ、LK、LU、MG、MN、MW、NL、No、NZ、PL、PT、RO,
RU。
SD、SE、SK、UA、US、VN
I
(72)発明者 口ビンソン、プライアン ホワードカナダ国 エム4ダブリニ
ー 2テイー4(72)発明者 マーチン、ジュリオ マリオカナダ国 エム2
ジエー 2ダブリユー6オンタリオ州 ライロウディル セネ力ヒル ドライブ
621