JPH07509232A - 症状発現前のｉｄｄｍの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 症状発現前のＩＤＤＭの検出方法 本発明は、自己免疫疾患および症状発現前の自己免疫疾患の検出方法に関するも のである。

特に、本発明は、インスリン依存性真性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅ ｎｔ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ）　（Ｉ　ＤＤＭ）および症状発現 前のＩＤＤＭの検出方法に関するものである。ペプチド断片を上記方法に用いる ために提供する。

症基 ヒトにおける疫学的証明（１〜４）及び動物の飼育に関する研究からのデータ（ ５〜８）によって、食用のウシのミルクタンパク質の糖尿病誘発効果が示唆され た。ウシのミルクタンパク質に対する免疫性及びタンプ１の糖尿病（Ｔｙｐｅ　 ｌ　ｄｉａｂｒｆｅｓ）に関連した上記を支持する血清学的な発見が動物（５， ９）及びヒト（１０〜１２）で同定された。

ウシのミルクタンパク質と糖尿病との病因的な関連に関する最も直接的な証拠が フィンランドの血縁の研究から明らかになり、これによると人生の初めの３〜４ 力月間を母乳のみで育てると後の糖尿病の発達から保護できることがＩ分かった （４）。

はとんどの研究では特異的なウシのミルクタンノくり質が同定されずまたはＩｌ 乳で育てることを強調しているにも拘らず糖尿病の発生率がほとんど全地球で増 加していることを説明してはいなかった。しかしながら、これらの後者の観察（ ４）は、ヒトにおいて（糖尿病になりやすいラット（１３）等において）、ウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ）にまたはこれのペプチド断片若しくは部分に対する免 疫反応に関連した糖尿病が出生後初期の段階で起こる（１４．１５）という観察 と一致するものである。

症状発現前のＩＤＤＭの現状の検出方法は、島細胞の抗体の検出を基礎としてい る（１６〜１８）。残念なことに、この方法は非常に難しく、もともと不正確に 結果を目視で判断するというマニュアルの過程を必要とする手間のかかる（２０ 間）アッセイ法である。国際的な標準にしたがって１−記アッセイを行うことが できるセンターはいずれの国でも数箇所しかない。２０％までのＣ上集団および ３０〜５０％のＩＤＤＭの血縁の人々がこのような抗体を持っている。この試験 はある部分集合しか臨床的なＩＤＤＭを予測できず、さらに８０％しか診断て陽 性がでない。

ＢＢ糖尿病ラットを用いた動物実験によって、ＩＤＤＭ及びＩＤＤＭではないが ある種の組織学的な島の変化を有する動物においてウシ血清アルブミンに対する 検出可能な抗体が示された（１３）。このような変化を示すすべての動物が明白 なＩＤＤＭに進行する（ｐｒｏｇｒｅｓｓ）わけではないので、これらの研究は 、ウシ血清アルブミンに対する抗体の検出がＩ　Ｄ　Ｄ　Ｍの進行を）測できる ことを示すものてはなかった。

本発明者らの研究がなされるまで、十分な予測及び識別能をＨする簡便な臨床方 法がヒトの患者をスクリーニングするのにおよび症状発現前のＩＤＤＭを検出す るのに使用されていなかった。

図 図１：図ＩＡは、１４２人の小児（斜線によるハツチ）及び７９人の正常な小児 （水平線によるハツチ）におけるインスリン依存性糖尿病の診断時の血清１ｇＧ 抗ＢＳＡ抗体濃度を示すものである。図ＩＢは血清１ｇＡ抗ＢＳＡ抗体濃度の分 布を示すものであり、図ＩＣは血清１ｇＭ抗ＢＳＡ抗体濃度の分布を示すもので あり、両方とも平滑化による正規化がなされた後のグラフである。

図２＝１７人の糖尿病患者における全及びＡＢＢＯ３に特異的な抗ＢＳＡ抗体の 測定を示すものである。図２ＡはＩｇＧを、図２ＢはＩｇＡを、図２ＣはＩｇＭ をそれぞれ示す。ハツチのついているバーは患者の抗ＢＳＡレベルを表わし、白 抜きのバーはＡＢＢＯ３に特異的な抗体を除去した後に残っているレベルを表わ す。水平方向のバーは、１７人の正常な小児の平均抗ＢＳＡ濃度（上部線）およ び同じ血清中の抗ＡＢＢＯ３抗体を除去した後の濃度を示す。

図３二図３Ａは、粒子濃度蛍光イムノアッセイ（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｃｏｎｃｅ ｎｔｒａｔｉｏｎ　ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　（Ｐ　ＣＦ　Ｉ　 Ａ）によって測定された４０人の糖尿病の小児における適度に（水１０線による ハツチ）、かなり（斜線によるハツチ）、および非常にかなり（縦線によるハツ チ）上昇したＩｇＧ抗ウシ血清アルブミン抗体の分布を示すものである。図３Ｂ 及び３Ｄは、（３Ｂ）１２．３ＫｆＵ／μｍのＩｇＧ−および（３Ｄ）４．２Ｋ ｆＵ／μｍのＩｇＡ−抗つシＢＳＡ抗体を角む血清貯溜（糖尿病の小児からの） に関するＰＣＦＩＡ標準カーブ、即ちＢＳＡ及びオボアルブミン／ツイーン２０ の量が増加することによる結合の競合を示すものである。図３０は、エンサイム イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）に関するＩｇＧ抗Ｂ抗ＢＳ準標準カーブすもので ある。図３Ｅは、エンザイムイムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）に関するＩｇＡ抗Ｂ ＳＡ標章カーブを示すものである。図３Ｆは、ＩｇＧ−（○）及びＩｇＡ−（■ ）抗ＢＳＡ抗体に関する遊離したオボアルブミン／ツイーン２０の量が増加する ことによる、さらにはＩｇＧ−（ロ）及びＩｇＡ−（■）抗ＢＳＡ抗体に関する 遊離したＢＳＡの量が増加することによる結合の競合を示すものである。ＫｆＵ は、キロ蛍光単位（ｋｉｌｏ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｕｎｉｌｌを示すも のである。

図４＝粒子濃度蛍光イムノアッセイ（ｐａＮｉｃｌｅ　ｃｏｎｃｅｎｆｒａｌｉ ｏｎ　ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　（ＰＣＦ　ＩＡ、図４Ａ及び図 ４Ｂ）およびエンサイムイムノアソセイ（ＥＩＡ、図４０及び図４Ｄ）によって 検出されるタイプ１糖尿病の及び相当するコントロールの小児における抗ＢＳＡ 抗体の平均値（±ＳＥＭ）を示すものである。糖尿病及びコントロールの小児の 間の相違は以下の通りである。ＰＣＦＩＡ：ＩｇＧ、ｐ＜Ｑ、０００１　；　Ｉ 　ｇＡ、ｐｒｏ、００１゜ＥＩＡ：ＩｇＡＳｐ＜０．０１゜ 図５：糖尿病及びコントロールの小児におけるエンザイムイムノアッセイ（Ｅ　 Ｉ　Ａ）および粒子濃度蛍光イムノアッセイ（ＰＣＦＩＡ）によって測定される 抗ＢＳＡ抗体しヘル間の相関関係を示すものである。影線を付された領域は「上 昇しない（ｎｏｎ−ｅｌｅｖａｔｅｄ）　Ｊと考えられるＢＳＡ抗体レベルを表 わす：　（縦方向のバンド）はＰＣＦＩＡでＢＳＡ抗体に対して陰性となるもの であり、（水平方向のバンド）ＥＩＡでＢＳＡ抗体に対して陰性となるものであ る。

図５Ａ：糖尿病の小児におけるＩｇＧＳｎ＝４０Ｓ　ｒ　＝０．２８、ｐ＝０． ０９Ｈ図５８：糖尿病の小児におけるＩ　ｇＡ、　ｎ＝４０、ｒｓ＝０．１１、 ｐ＝０．４８；図５Ｃ：コントロールの小児におけるＩ　ｇＧ、ｎ＝１７９、ｒ 、＝０．０２、ｐ＝１．　０　；図５Ｄ　：　コントロールノ小児におけるＩｇ Ａ、ｒ＋＝１７９、ｒ＝−０，０５、ｐ＝１゜Ｏ０＋０関係数１ｔ、スバ？　＞ （Ｄ順（Ｍ、相ｒ’Ａ　（Ｓｐｅａｒｍａｎ’　ｔ　ｒａｎｋｃｏｒＩｅｌａｔ ｉｏｎ）によって測定した。

発明の説明 以下の記載において、本明細書の最後に列挙した文献を参考にする。

一般的な食事源由来のタンパク質またはタンパク質断片に特異的な自己免疫疾患 関連抗体量の測定、および本発明における方法による上記断片に対するＴリンパ 球の感作の測定によって、以下のような独特な新規な臨床用及び調査用具が得ら れる： １、）疾患を遅延するまたは予防するための治療を開発しこれに用いるために必 要な初期の症状発現前の疾患の診断； ２、）初期の臨床発症時における自己免疫患者の識別できる診断； ３、）病気の過程及び治療の効果の観察。

本発明者らは、第一に、記載された方法によってウシ血清アルブミンに対する若 しくはこの天然或いは合成ペプチド断片に対する抗体のヒトの血清レベルを測定 することによって、将来ＩＤＤＭを発症するであろう人々を検出することができ ることを研究によって示す。

本発明の一実施態様によると、実施例１及び３に記載された粒子濃度蛍光イムノ アッセイ（ＰＣＦＩＡ）技術によってウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）に対す る血清抗体を測定することによるＩＤＤＭまたは症状発現前のＩＤＤＭの検出方 法を提供するものである。関連抗体は粒子結合ＢＳＡに結合することによって検 出される。

さらに、例えば、実施例２に記載されるようなＥＬＩＳＡ技術等の、他の方法を 用いて、血清中の抗ＢＳＡ抗体を検出した。実施例２から、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に よって検出される抗体によっては糖尿病または糖尿病前の信頼性の高い診断に必 要な識別性は得られないと考えられる。

ｔ１７子濃度蛍光イムノアッセイは、すべての糖尿病の小児においてＩｇＧ抗ウ シ血清アルブミン抗体の上昇を検出するが、エンザイムイムノアッセイでは２５ ％の小児で抗体の上昇を検出した（ｐ＜０．０００１）。蛍光イムノアッセイは 、コントロールの小児の２．２％で上昇レベルを検出したが、エンザイムイムノ アッセイでは１０％で上昇レベルを検出した（ｐ　＜　０．　００２）。患者に おける上昇したＩｇＡ抗ウシ血清アルブミン抗体は、エンザイムイムノアッセイ によるより蛍光イムノアッセイによる方が若干多（検出されたが、コントロール の小児ではエンザイムイムノアッセイの方が３倍多く上昇レベルを検出した（ｐ ｒｏ。

０１）。いずれかのアッセイで測定された値は、いずれかの患者（ＩｇＧ：　ｒ 　＝０．２８；　ＩｇＡ：　ｒ　＝０．１Ｓ １）またはコントロール血清（ＩｇＧ：　ｒ　＝０．０２；Ｉ　ｇＡ　：　ｒ　 ＝−０，０５）で相関関係をまったく示さなかった。ＩｇＧに関する蛍光イムノ アッセイは１００％患者に感受性があり（エンザイムイムノアッセイ：２５％、 ｐ＜０．０００１）　、より疾患に特異的であった（ＩｇＧ。

ｐ　＜　０．０２）。

これらの発明者らの発見によって、上記アッセイ技術によってほとんど（ＩｇＧ が）オーバーラツプせずにまたはいくらか（ＩｇＡ力りオーバーラツプして抗ウ シ血清アルブミン抗体のサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）が明らかに検出されること が示される。蛍光イムノアッセイ法では、抗原抗体結合が１〜２分以内で生じる 一方、エンザイムイムノアッセイでは数時間かかる。したがって、超免疫化後の 免疫反応に典型的な高いオンオフの結合率（ｏｎ−ａｌｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒ ａｎ）を有する抗体が粒子濃度蛍光イムノアッセイによって選択的に測定され、 これは糖尿病に関連があると考えられる抗体である。このような観察は、臨床を 目的として使用されるイムノアッセイ法を有効にする疫学的な調査の必要性を強 調するものである。

ヒト及びウシのタンパク質等の、様々な血清アルブミンタンパク質のアミノ酸配 列の比較によって、本発明者らは、ヒト及びウシの間の最も相違する領域である 、１３８〜１６６番目のアミノ酸領域に焦点を合わせた（１９）。

本発明のさらなる実施態様によると、上記領域内の様々な新規なペプチドが、実 施例４に記載されたように、合成された。

上記したようなＰＣＦＩＡによって検出された診断用抗体のバルクは、実施例１ に記載されたように、ペプチドＣ５２１８５、ＡＢＢＯ５に結合することが分か った。

上記したＰＣＦＩＡアッセイを、粒子結合ＢＳＡの代わりに粒子結合ＡＢＢＯ５ 等の粒子結合ＢＳＡペプチドを用いて行ってもよい。

ＡＢＢＯＳペプチドを用いることによって、実施例４に記載したようにＣ末端で 修飾された際でもＩＤＤＭ関連抗ＢＳＡ抗体の９０％までが検出できる。

これらのペプチドは、天然のＢＳＡタンパク質の断片または適当な技術によって 調製された合成ペプチドであってもよい。このような技術は、当業者には既知で あるが、例えば、化学合成及び組換技術が挙げられる。

Ｉ　Ｄ　Ｄ　Ｍ関連抗ＢＳＡ抗体への結合能を残しているこれらのペプチドの類 似体も本発明の概念の中に含まれる。

本発明のさらなる実施態様によると、ＩＤＤＭ患者におけるおよび症状発現前の ＩＤＤＭ被験者におけるＡＢＢＯ８及びＣ５２２６７等の、ＢＳＡのペプチド断 片を特異的に認識し該ペプチド断片に応答して増殖する感作されたＴリンパ球の 検出方法を提供するものである。

上記検出方法を用いることによって、ＩＤＤＭ、症状発現前のＩＤＤＭが検出で き、さらにβ細胞または島移植後の患者のβ細胞攻撃免疫プロセスの再活性化を 検出することもできる。

本発明のさらなる実施態様によると、ＩＤＤＭ及び症状発現前のＩ　ＤＤＭ患者 中に存在する感作されたＴリンパ球に特異的に結合するＣ３２２６７のペプチド を提供するものである。

Ｃ３２２６７等のペプチドを毒素化合物に連結することによって、ＩＤＤＭにお けるβ細胞の破壊を仲介する特異的なＴリンパ球に向かいこのＴリンパ球を破壊 できる免疫毒素が調製でき、これによって疾患プロセスの停止手段が得られる。

実施例１−ＰＣＦＩＡによる抗ＢＳＡ抗体の検出患者Ｉｖ集団：血液サンプルを 、新たにインスリン依存性真性糖尿病であると診断された１４２人のフィンラン ドの小児（男性８３人、女性５９人、平均（士標準偏差）年齢８．４±４．３歳 ）から得た。５０人の患者は糖尿病性酸性症を、４８人が糖尿病性ケトン症のみ を、さらに残りが低血糖症のみを有していた。すべての患者が少なくとも一日に １回ヒトインスリンを注射し続けなければならず、診断後はインスリン依存性が 増加した。本発明者らはまた、軽い外科手術を受けた７９人の年齢、性別及び住 んでいる所が一致している小児（男性４２人、女性３７人、平均年齢　８．４± ３．１歳）、および３００人の成人のトロントの血液ドナーについて研究した。

血液サンプルを、初めてインスリンを注射する前におよび３から４力月後に採血 し、さらに、４４人の任意に選択した患者の部分集団については、１から２年後 にも採血した。２グループの小児からの血清サンプルをトロントに暗号を付して （ｃｏｄｅｄ）送付した。

臨床評価としては、組織学およびインスリン及び間接免疫蛍光法または補体結合 試験のいずれかによって同定される島細胞の自己抗体の測定が挙げられる。サン プルの容積は最先のサンプルを十分滴定するには不十分であるため、島細胞抗体 結果は陽性または陰性として表わされる。すべての患者のＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、− Ｃ、ディアール、ディダブル（Ｄγ、　Ｄｉ）のハブロタイブを（１７）に記載 したように抗ＢＳＡ抗体を、ドラシュ（Ｄｏｓｃｈｌ　ら（２１）に記載された 粒子濃度蛍光イムノアッセイ（ＰＣＦＩＡ）によって測定した。

９６大の一方向流れ真空濾過プレート（９Ｂ−ｗｅｌｌ　ｕｎｉｄｉｒｓｃｔｉ ｏｎａｌ　ｆｌｏｗ　ｖａｃｕｕｍ　１ｉｂｒａｔｉｏｎ　ｐｌａｎ）をアッセ イに用い、相分離処理（ｐｈａｇｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒ ｅ）を、ドラシュ（Ｄｏｓｃｈｉ　ら（２２）およびチュング（Ｃｈｅｕｎｇ） ら（２３）に記載されたようにして、試薬の添加、所定のインキュベーン、相分 離（ｐｈａｓｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）、洗浄および粒子が結合したフルオレ セイン化（Ｉｌｕｏ＋ｅｓｃｅｉｎｅｄ）第二抗体の測定がプログラム可能であ るロボット化スクリーンマシン（登録商標）　（ｒｏｂｏｆｉｃ　５ｃｒｅｅｎ 　ＭａｃｈｉｎｅＴＭ）器具（アイディイーエックスエックス（ＩＤＥＸＸ）製 、ポートランド、エムイー（Ｐｏｒｌｌａｎｄ、Ｍｅ）、アメリカ合衆国）によ って行った。

２００μｌのＢＳＡ　［グレードＶ１シグマ　ケミカルコーポレーション（Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製、セントルイス、エムオー（ｓｔ、Ｌｏ ｕｉｓ、　Ｍｏ）　、アメリカ合衆国、１０％のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ　；４ ０ｇ　ＮａＣ１、Ｉｇ　ＫＣＩ、Ｉｇ　ＫＨ２ＰＯ４，５，７５ｇ　Ｎａ２　Ｈ ＰＯ４，０゜５ｇ　ＣａＣ１，０，５ｇ　ＭｇＣｌ２１５リットル蒸留水、ｐＨ ７，２）］を４００μｍの（５％ストック；アイディイーエックスエックス（Ｉ ＤＥＸＸ）製）のカルボキシル化ポリスチレンビーズ（直径０．７５ｘｔｍ）上 に共有結合（１００ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルア ミノプロピル）−カルボジイミド）した。次に、１．０％オボアルブミンーＰＢ Ｓに溶解した１０％　ツイーン２０を遮断剤として用いた。０．１％オボアルブ ミンーＰＢＳに溶解した１％までの濃度のツイーン２０を遮断剤として用いても よい。繰り返し洗浄した後、ビーズを１％　ツイーン２Ｏ−ＰＢＳ中で貯蔵した 。９力月にわたり、ビーズの活性は変化せずに残った。オボアルブミンはシグマ （Ｓｉｇｍａ）より得た。

２０μ】の試験血清希釈液（１：　１００〜１：１．０ＯＯ）を、２０μｍの１ ：２０の希釈ＢＳＡ被覆微小球（初１ｔ１２，５％重曾／容積）を含むマイクロ ウェルに添加した。

１０プレートまでを、相分離（ｐｈａｓｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）、洗浄およ びアフィニティ精製された（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ）市販のＢＳ Ａをａまないフルオレセイン−複合体形成（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊ ａｄａｌｅｄ）ヤキ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭの添加（１００ｎｇ／ウェ ル）（Ｆｃ−断片に特異的、）くイオカン（ＢｉｏＣａｎ）製、ミッンサーガ、 オンタリオ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、０ｎｔａ＋ｉｏ］、カナダ）がプログラ ムされたスクリーンマシンｔｓｃｒｅｅｎ　Ｍａｃｈｉｎｅｉ中に挿入した。短 時間（１分間）インキュベーション、相分離及び低い（５ｍ　ｍ　Ｈｇ　）真空 圧で洗浄処理することによって、血清タンパク質の乾燥及び沈殿を防止した。読 み込む前に、ウェルを１分間真空乾燥し、蛍光発光（４７２１５１２ｎｍ）を、 ウェルの底面の濃縮された粒子ケーキ（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｃａｋｅ）から高真 空下で読んだ。

このシステムの速度論は公表されている（ドラシュ（Ｄｏｓｃｈ）ら（１９８８ 年）上記）。本発明者らは、１人の作業者当たり１器具当たり１日で３，０００ 個までのサンプルを繰り返し測定した。

糖尿病患者からの血清の検量された貯溜を各プレートにおいて標準物質として用 いた。この標準物質は、１μｍ当たり１２．３キロ蛍光単位（Ｋ　ｆ　Ｕ）のＩ ｇＧ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体さらに、４．２ＫｆＵ／μｍのＩｇＡ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体４ ，０ＫｆＵ／μｍのＩｇＭ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体んでいた。抗ＢＳＡアッセイは１． Ｏ（ＩｇＧ、ＩｇＡ）及び１０、　０　（Ｉ　ｇＭ）　ｎ　ｇ／ｍ　１の感受性 を有しており、アッセイ内−およびアッセイ間の変動係数はそれぞれ８．９％及 び９，８％であった。ＢＳＡ　（オボアルブミンではない）の添加は、用量に依 存して抗体の結合を遮断した。７９人の正常な小児の平均＋２５Ｄを超える抗Ｂ ＳＡ抗体濃度を置ヒ昇した（ｅｌｅｖａｊｅｄ）　Ｊと規定した。

データ分析：抗体濃度は、標準血清貯溜に対するキロ蛍光単位／μｌとして表現 した。カイ二乗の統計学、分散のパラメトリック　ワン−ウェイ分析（ｐａｒａ ｍｒｆｒｉｃ　ｏｎｅ−ｖｔａｌａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ） 　、および一般的に分布した値に関してはステニープントの非対を一試験（Ｈｕ ｄｅｎｔ’ｓ　ｕｎｐａｉｒｅｄ　１−ｔｅｓｔ）を用いて結果を分析した。抗 ＢＳＡ濃度の分布は各イソタイプでは正常であった。ゆがんだ分布の場合には、 マンーホイットニーーユー試験（Ｍａｎｎ−ＷｈＮｎｅ７−１ｌ　ｊｔｓｊ）及 びスパーマンの順位相関（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ　ｒａｎｋ　ｃｏｒｒｅｌａｔ ｉｏｎ）試験を用いた（ｒ　）。診断後の抗ＢＳＡ抗体濃度を対試験（ｐａｉｒ ｅｄ　１ｅｓｔ）を用いて評価した。

抗ＢＳＡ抗体：糖尿病患者の血清１ｇＧ抗ＢＳＡ抗体濃度は、正常な小児の値に 比べてかなり高く　（図１）、平均濃度はほとんど７倍高かった（表１、Ｐ＜０ ．００１、表２）。糖尿病患者及び正常な小児は主要なウシのミルクタンパク質 であるカゼイン及びβ−ラクトグロブリンに対するＩｇＧ抗体の血清濃度が等し かった（表１）ため、糖尿病患者の上昇した血清ＩｇＧ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体濃度養 面での抗原（ｎｕｆｒｉｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ）に対する一般的な免疫 反応を反映するものではなかった。

ＩｇＡ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体均血清濃度は、正常な小児に比べて糖尿病患者の方が高 かった（Ｐ＜０．００１、表１）が、値はオーバーラツプしていた（図１）。２ ／３の糖尿病患者（および２人の正常な小児）の濃度が上昇していた（Ｐｒｏ、 ００１、表２）。若い年齢の糖尿病患者には一致していることであるが、ＩｇＡ 抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体する患者は抗体濃度の低い患者に比べて年齢が高かった（１０ ゜１±３．４歳対６．０±４．６歳；ｐ＜ｏ、０００１）。

糖尿病患者のＩｇＭ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体均血清濃度は、正常な小児に比べて若干低 かった（Ｐ＜０．０５、表１）。

８％の正常な小児が濃度が」１昇していたのに比べて、１％未満の患者が濃度が 上昇していた（Ｐ＜０．０１、表２、図１）。

糖尿病患者または正常な小児はＩｇＤ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体しておらず、任意に選択 した患者の部分集団では、ＩｇＥ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体出されなかった。

低い濃度の（主にＩｇＭ）抗ＢＳＡ抗体が糖尿病の及び正常な小児の両方で検出 されたが、高い濃度のＩｇＧ及びＩｇＡ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体尿病の小児のみで観察 された。後者の発見によって、ＢＳＡに特異的な免疫反応とインスリン依存性糖 尿病の臨床学的な発症との間に密接な（１００％の）関係があることが示された 。糖尿病患者のＢＳＡに対する活性、抗原由来の免疫反応と一致することである が、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗ＢＳＡ濃度の間にはかなりの相関関係があった（「５＝ ０．７７；Ｐくｏ、ｏｏｏｌ）。

寿命の長いＩｇＧ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体濃度断後３がら４力月たった糖尿病患者内に 残ったが、寿命の短いＩｇＡ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体濃度り低かった（Ｐｒｏ、００１ 、表３）。

診断から１から２年たった後研究した４４人の患者では、３タイプすべての抗Ｂ ＳＡ抗体濃度がより低くなっており（Ｐ＜０．００１）　、はとんどの患者で正 常な値に達していたＣＩ　ｇＧ　：　２７人の患者、ＩｇＡ：４３人の患者、表 ２）。これらの結果はβ細胞ｐ６９１３．１４による抗原の刺激の減少と一致し ている。

特異性の研究＝４４人の糖尿病の小児と４４人の正常な小児からの血清を用いて さらに研究を行った。ウシのミルクカゼイン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）製）及びβ −ラクトグロブリン（ジグ？（Ｓｉｇｍａ）製）に対するＩｇＧ抗体を、ＢＳＡ で記載したのと同様にして被覆した微小球を用いて測定した。

ＡＢＢＯＳペプチド（ＢＳＡ配列配列位置１御２〜１６８相同性のある領域を天 然の配列中には存在しないＣ末端システィン残基を用いて合成し、Ｃ末端のシス ティンはビオチン化した。ドラシュ（Ｄｏｓｃｈｌ　ら（１　９８８年）上記に よって記載されたようにして、カルボキシル化されたポリスチレン微小球にカッ プリングされたストレプトアビジン（Ｓ＋ｒｅｐａｖｉｄｉｎ）　にビオチン化 ペプチドを結合することによって、固相Ａ　Ｂ　Ｂ　Ｏ　Ｓ　（ｓｏｌｉｄ　ｐ ｈａｓｅ　ＡＢＢＯＳ）及び固相ＡＢＲＡ　Ｓ　（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　Ａ ＢＲＡＳ）を調製した。２０μｍ　（０．５％ｗ／ｖ）のＡＢＢＯＳ−またはＡ ＢＲＡＳ＝複合体形成（ｃｏｎｊｕｇａ＋ｙｅｄ）微小球を最終的な容積を０． ３または３ｍｌにして３μｍの患者若しくは正常な血清と混合した。４℃で１５ 分間インキュベーションした後、混合物を遠心し、２０Ａｌｌの上清を残存する 抗ＢＳＡ抗体の測定に使用した。

抗ＡＢＢＯ３抗体．固相ＡＢＤＯＳペプチドに血清をさらす前（図２、黒いバー ）およびさらした後（白いバー）の抗ＢＳＡ抗体の測定を行い、ＢＳＡのＡＢＢ Ｏ３領域に特異的に結合する抗ＢＳＡ抗体の割合を１ｉｌ１１定した。

高い、適度な及び比較的低い抗ＢＳＡ濃度および全体の゛■也均に近い平均値を ｒイする４４人の糖尿病患者からの血清を用いて、上記研究を行った（図２、１ ７人の代表的なサンプル）。ＩｇＧ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体濃度血清がＡＢＢＯＳペプ チドと反応した後２／３（３０〜７０％の範囲）減少した。同様にして、多くの 割合のＩｇＡ及びＩｇＭ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体３〜７１％）がＡＢＢＯＳに特異的で あり（表３）、これから２％未満のＢＳＡ分子を表わしている上記の短い配列に 関するきびしい偏見（ｓｅｖｅｒｅ　ｂｉａｓ）が示された。ＡＢＲＡＳペプチ ドと共に血清をインキュベーションすることによって除去された抗ＢＳＡ抗体量 は正常なアッセイ偏差以内であった（〜１０％）。

診断後の抗ＢＳＡ抗体濃度は、ＡＢＢＯＳに特異的な抗体の消失によって減少し 始めた（９０％、ｐ＜ｏ．ｏｏ。

１）。診断後１から２年たつと、研究した４４人の患者のうち７人の患者が、Ａ ＢＢＯＳペプチドに特異性を有する抗ＢＳＡ抗体を何しているのみであり、４４ 人のうち１７人の患者が若干抗ＢＳＡｅ度が上昇していた。抗ＢＳＡ濃度か最も 高かった１７人の正常な小児の血清サンプルについて、固相ＡＢＢＯＳペプチド と共に血清をインキュベーションした後同様にして研究した。抗ＢＳＡ抗体濃度 は吸収された血清中でかなり減少し、２血清サンプルのみがそれぞれ検出可能な ＩｇＧまたはＩｇＡ抗ＡＢＢＯＳ抗体を念むのみてあった。３００人のトロント の成人血液ドナーでは、ＩｇＧ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体濃度囲及び平均が７９人の正常 なフィンランドの小児のものと同様であり（表３）、ＩｇＧ抗ＡＢＢＯ３抗体は サンプルの３％で見付かった。

抗ＢＳＡ抗体および疾患マーカー：抗ＢＳＡまたは抗ＡＢＢＯ５抗体濃度および 疾患の発症の重症度（血中グルコース、ＨｂＡｌ、血清Ｃ−ペプチド濃度）、診 断前の症状の期間、または糖尿病性ケトン症若しくは酸性症の重症度との間には 同等関係は認められなかった。特異性、濃度および抗体のイソタイプの分布は多 様な（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）及び単純な（ｓｉｍｐｌｅｘ）家系でも同様であっ た。

診断時に７８％の患者は島細胞抗体が陽性であり、５８％が捕体結合島細胞自己 抗体を有しており、４７％がインスリン自己抗体を有していた。抗ＢＳＡ濃度、 イソタイプの多様性または特異性のいずれもが島細胞−若しくはインスリン−自 己抗体の存在または不存在に関連していなかった。

ＨＬＡ−ＤＲ３／４若しくは−Ｄｗ３／４に異種接合の小児は、初期に、このよ うなハブロタイブの組合わせに陰性の小児と比較するとより重症な糖尿病（より 高い血中グルコース及びＨｂＡ、およびより低い血清Ｃ−ペプチド濃度）を示す が、インスリン−及び島細胞−自己抗体の頻度または濃度は両方のハロタイプの グループで等しかった。

ＢＳＡ／ＡＢＢＯ８抗体の濃度は、ＨＬＡ−ＤＲ３／４若しくは−ＤＷ３／４を 有するまたは持たない糖尿病の小児のうちで、さらにはＨＬＡ−ＤＲ３／ｘ、− ＤＲ４／ｘ及び−Ｄ　ｗ　４　／　ｘを１するものの中では同等であった（ｃｏ ｍｐａｒａｂｌｅ）。

また、固相ＡＢＢＯ３を用いて、固相ＢＳＡ　（ＢＳＡ被覆微小球）を使用して 上記したのと同様にして、血清抗ＡＢＢＯ３抗体をアッセイした。

ＢＳＡ及びＡＢＢＯ３の両方を結合したモノクローナル抗体（抗Ｂ　Ｓ　Ａ／Ａ 　Ｂ　Ｂ　ＯＳ抗体）を、新たに糖尿病であると診断された患者のニブスティン −バーウィルスを形質転換した８９２８球から得た（２４）。モノクローナル抗 体、さらにはポリクローナルなラットの抗ＡＢＢＯ３抗血清（１９）はインスリ ン及び島細胞自己抗体に対して陰性の反応を示した。これに対して、それぞれ、 １０００及び１００μｇまでのＢＳＡまたはＡＢＢＯＳペプチドを添加しても、 すべての１５人の試験した糖尿病患者の血清における島細胞抗体およびインスリ ン自己抗体に関するアッセイ結果は変わらなかった。

実施例２−ＰＣＦＩＡおよびＥＬ　Ｉ　ＳＡの比較患者：５０人のフィンランド の糖尿病の小児（男性２２人、平均上標準偏差年齢　６．２±４，５歳、範囲　 ０゜９〜１５．５歳）が、比較アッセイのために、実施例１の患名母集団から任 意抽出され、そして彼らはＢＳＡ抗体の代表的範囲の上昇レベルを含むものであ った（図３Ａ）。

サンプルは、糖尿病の診断の際に採取され、そして選択された血清は、ＥＩＡに よって分析するためにフィンランド国の研究所へ暗号を付して（ｃｏｄｅｄ）送 り返された。コントロールの被験者は、１７９人の年齢および性別が一致した糖 尿病に罹っていないフィンランドの小児たちであった（男性９８人、平均上標準 偏差年齢　６．２±３．６歳、範囲　０．９〜１５．９歳）。

患者およびコントロールの血清中の抗ＢＳＡ抗体を実施例１に記載されたのと同 様にしてＴ’ＣＦＩＡにより測定した。

糖尿病の小児の一集団の（陽性）標準血清貯溜が用いられ、そしてすべてのプレ ートにおいて標準曲線が準備された（図３Ｂ）。競合実験によって、ＢＳＡに関 して充分な特異性が示された。遊離したＢＳＡは用量に依存して抗体の結合を遮 断するが、オボアルブミンまたはツイーン２０またはこれらの組み合わせは抗体 を置換することができなかったく図３Ｄ）、結果は、１２，３００Ｋｆｕ／ｍｌ ＩｇＧ−および４，２００Ｋｆｕ／ｍｌ　ＩｇＡ−抗ＢＳＡ抗体を含む標準物質 から導き出された器具の増大（ｇａｉｎ）Ｃ５ｘ）　、血清希釈およびアツセイ 容積に基づいてキロ蛍光単位（ＫｆＵ）／μｍとして表わされる。蛍光発光エネ ルギーの直線性により、値は正常に分布した。上昇した抗体レベルはコントロー ル被験者の平均レベル＋２８Ｄを超えるものとして規定した。

酵素結合イムノソルヘント検定法（：ＥＬＩＳＡ）上記に述べたようなＩ’ＣＦ ＩＡにより検定された血清サンプルハまた、タイニオら（Ｔａｉｎｉｏ　ｅｔ　 ａｔ）　（２５）　ｌこより修飾された既知の三層固相法である、抗ＢＳＡ抗体 （こ関する酵素結ａイムノソルヘント技術によって測定されｔ二。

このノブ法は、ポリスチレン製マイクロストリ・ンプウエルｔｐｏｋ４！１Ｂｅ ｎｅ　Ｍｉｃ＋ｏＮｒｉｐ　ｗｅｌｌ）　（ラボシステムス（Ｌａｂｓｙｓ＋ｅ ｍｉ）製、ヘルシンキ、フィンランド）を用い、これを１０当り３プレート（６ ６個のサンプル）まで操作できる自動ＥＩＡ分析器（オート−イーアイニー　Ｉ 　Ｉ　（Ａｕｔｏ−ＥＩＡｌｌ）、ラボシステムス（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓｌ製 、ヘルシンキ、フィンランド）において操作した。プレートを、０．１モル／Ｉ ＰＢｓ−５モル／Ｉ　ＮａＮ３　（ｐＨ７，４）中で２μｇ／ｍｌ　（１００μ １）ＢＳＡ　（Ａ−４３７８、シグマＩＳ　ｉ　ｇｍａｉ製）で、１晩室温にて 被覆した。ＰＢＳ−ＮａＮ３で洗浄した後、ウェルを１％ゼラチン−ＰＢＳ−Ｎ ａＮ３で３７℃で１時間飽和し、使用するまで＋４℃で貯蔵した。

血清サンプルを、０．０５％　ツイーン２０中で調製された０、５％ゼラチン　 ＰＢＳ　ＮａＮ３で１＝４０に希釈した。血清希釈物１００μｍの３つのレプリ ケートをプレート付けし、そのうち２つは被覆されたウェルに、１つは被覆され ていないウェルに付けられた。３７°Ｃで６０分間インキュベートした後、ウェ ルを洗浄（４回）した。希釈アルカリホスファターゼ複合体形成抗ヒトＩｇＧ− または−ＩｇＡ（カタログ番号＋　６７８０６および６７８０８　。

オリオン　ダイアゴノステイ力（Ｏｒｉｏｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）製、ニ スポー（Ｅｓｐｏｏ）　、フィンランド）を添加し、６０分間インキユヘーした 後、前記したように４回洗浄した。基質［ＤＥＡ　（Ｎ−Ｎ−ジエチルアニリン ）−バッファ中のｐＮＰＰ　（ｐ−二トロフェニルホスフエート）２ｍｇ／ｍｌ コを４５分間インキュベートした後、反応を１モル／Ｉ　ＮａＯＨで停止した。

被覆されていないウェルにおける吸光度（光学密度４０５ｎｍ）を、試験値から 引いた。　アッセイのアッセイ内およびアッセイ間の偏差は、それぞれ９゜３％ および１５．８％であった。血清アッセイに関して、ＢＳＡ抗体陽性標準物質の 連続希釈がそれぞれのプレート」二で行われ（図３Ｃ）、結果を標準血清の結合 の割合（％）として表わした。ＩｇＧおよびＩｇＡ双方に関する値は、対数変換 にもかかわらずゆがんだものであるため、陽性の限界はコントロール被験者の値 の９０パーセントで設定された。この限界は、許容できる特異性での最も高い感 受性を与えるものとして、一連のカットオフ値の試験の後選択されｔ：。ＩｇＧ に関し標準物質の３．９％、またＩｇＡに関し標準物質の１４．２％の吸光度を 有する血清は陽性であるとみなした。

統計学的分析 統計学的分析を、正規分布関数の場合において、交差図表作成、カイ二乗の統計 学およびステニープントの非対ｔ−試験（Ｓｌｕｄｅｎｌ’＋　ｕｎｐａｉ＋ｅ ｄ　１−ｔｅｓｔ）を用いて行なった。

ＥＩＡによって得られたＢＳＡ抗体レベルの分布は変換にもかかわらずゆがんだ ものであったので、糖尿病の小児およびコントロールの小児間の相違は、マンー ホイットニーー１−試験ｆＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−υ１ｅｓｔ）によって評 価された。

マンーホイットニーーユー試験（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ　ｔｅｓｔ）お よびスパーマンの順位相関（Ｓｐｅａｖｉｎ’ｓ　ｒａｎｋ　ｃｏｒｒｅｌａｔ ｉｏｎ）試験を用いて、ＥＩＡとＰＣＦＩＡとの間の抗体レベルを比較した。ア ッセイの感応性および特異性が測定され、結果をカイ二乗の統計学での交差図表 作成によって評価した。結果は平均±ＳＥＭとして表される。

糖尿病の小児からの４０個の血清は上昇したＩｇＧ抗ＢＣＦＩＡ ＳＡ　抗体の範囲を含んでいた；しかしながら、ＥＩＡによってはわずか２５％ が陽性とされたのみであった（表４、ｐ＜０．０００１）。一方、コントロール 被験者のＩｇＧ抗ＢＳＡＥＩＡ抗体は、ＰＣＦ　ＩＡによって検出されるものよ り高い頻度で１１昇した（表４、ｐ＜Ｑ、ｏｏ。

２）。ＰＣＦＩＡおよびＥＩＡにおいて、糖尿病の小児においてＩｇＡ抗Ｂ抗Ｂ 抗Ａ抗体昇したものは、それぞれ５０％および４２％（ｐ＝ＮＳ）であったが、 コントロールの小児のわずか３．３％および１０％がＰＣＦＩＡおよびＥＩＡに おいてそれぞれ陽性であった（表４、ｐ＜Ｑ、。

１）。これらの結果から、ＥＩＡではなくＰＣＦＩＡの方がタイプ１の糖尿病の 小児における疾患関連ＢＳＡ抗体を選択的に検知することが示された。これに対 して、ＥＩＡは、一般的な母集団でより一般に行われる抗体の検知には好ましい 。いずれの方法もすべてのＢＳＡ抗体を検知できるものではなかった。

糖尿病の小児におけるＢＳＡ抗体レベルを図４に示す。

ＰＣＦＩＡによってｉｉ［ｌＪ定した場合には、糖尿病の小児とコントロールの 小児との間にＩｇＧ−およびＩｇＡ−抗ＢＳＡ抗体の両方のレベルに顕著な相違 が現れた（ｐ＜ｏ、０００１およびｐ＜０．００１）。これに対して、Ｉ　ｇＧ −抗ＢＳ　Ａ　Ｅ　Ｉ　Ａ抗体のレベルは、糖尿病の小児とコントロールの小児 とではおおよそ同様であった。ＩｇＡ−抗ＢＳＡＥＩＡ抗体は糖尿病の小児にお いてより高いものであったが、その差異（ｐ＜０．０１）はＰＣＦＩＡ　（ｐ＜ ０．００１）におけるものよりも顕著なものではなかった。これらの知見は、Ｐ ＣＦＩＡにより検知された抗体のサブセットにおける定量的相違を示唆するもの であり、この相違は糖尿病の小児とコントロールの小児とを識別するものである 。

個々のＩ’ＣＦ　ＩＡおよびＥＩＡの値を、糖尿病の小児およびコントロールの 小児に関して図５において比較する。

影線を付された範囲は、陰性であるとみなされるレベルを示すものである（上記 参照）。ＰＣＦＩＡとＥＩＡとの間の相関性は非常に乏しかった（−０，０５≦ ｒ　≦０．２８．０．０９≦ｐ≦０．１）。糖尿病の患者では、血清の１部分集 団（ＩｇＧ：〜２０％およびＩｇＡ：〜３２％）のみが、双方のアッセイにおい て比較的低いないし高い抗Ｂ　Ｓ　Ａ　値を示した、すなわち相関性を示した。

さらに、コントロールの被験者のなかで、わずか１つのＩｇＡサンプル（０，３ ％）のみが双方のアッセイで陽性であった。

コントロール血〆ｈにおけるＢＳＡ−抗体は、ＰＣＦＩＡにおけるよりもＥＩＡ においかなり頻繁に結合しくＩｇＧ：ｐ＜０．００２およびＩｇＡ：ｐ＜０．０ １、表４）、■ｇＧ＝またはＩｇＡ−抗ＢＳＡＥＩＡに対して陽性の１８個のコ ントロールの被験者うち、たった１つがＰＣＦＩＡによって陽性であった。これ に対して、ＰＣＦＩＡによって検出された４つのＩｇＧ陽性のおよび６つのＩｇ Ａ陽性のコントロール血清のうち、わずか１つのみがＥＩＡによって陽性であっ た（図５）。したがって、はとんどの疾患関連ＢＳＡ抗体はＰＣＦＩＡによって のみ検出されｔ；。疾患関連１ｇＧ抗ＢＳＡ抗体の検出におけるＰＣＦＩＡの感 度は、ＥＩＡと比較した場合優れたものであり（１００％対２５％、表５；ｐ＜ ０．０００１）、疾患特異性はＰＣＦＩＡＯ方がより高いものであった（表５； ｐ＜０．０２）。

ＩｇＡイソタイプアッセイに関しては、結果は疾患感応性については同等であっ たが、ＥＩＡではアッセイの特異性が犠牲にされた（ｐ　＜　０．　０５）。こ れらの知見から、ＰＣＦＩＡおよびＥＩＡは、ＢＳＡ抗体の様々なサブセットを 重複なしに（ＩｇＧ）あるいはわずかの重複（ＩｇＡ）をもって差別的に検出す るものであることが示唆される。

ＥＩＡで検出された抗体は、タイプ１の糖尿病と関連しないが、一般的な母集団 では共通して見い出される。

表　５ 表　抗ＢＳＡ抗体検出時のＰＣＦＩＡおよびＥＩＡの感受性および特異性ＰＣＦ ＩＡ　ＥＩＡ　Ｐ　ＰＣＦＩＡ　ＥＩＡ　Ｐより一般的に入手可能なＥＩＡとＰ ＣＦＩＡアッセイ法を比較するために、本発明者らは両者の技術を使用して多（ のサンプルを分析した。この比較によって、ＰＣＦＩＡによってほとんど排他的 に検出された糖尿病関連抗ＢＳＡ分子による相違は曖昧でないことが明かとなっ た。糖尿病の小児の陽性の応答のレベルおよび頻度は両方とも、ＥＩＡよりもＰ ＣＦＩＡにおいてより顕著であった。患者およびコントロールの被験者に対する ＥＩＡの抗体レベルの広範な広がりによって、グループ間において重要な重なり を生じ、相違を統計的に無意味なものとした。大部分のサンプルは、ＥＩＡの検 出限界以下であり、これによって試験した両イソタイプの測定をかなりゆがんだ ものとした。

ＰＣＦＩＡは、糖尿病の患者のＢＳＡ抗体を検出し、糖尿病でない小児は数人が 陽性であるのみであった。これに対して、ＥＩＡにおいて病気と関連した抗体の 割合は少なく、糖尿病でない被験者でもしばしばレベルが上昇した。

１８コントロール中でたた１だけがＰＣＦＩＡによってもＩｇＧ−またはＩｇＡ −抗Ｂ　Ｓ　Ａ　ＥＩＡが上昇して陽性であり、いずれかの方法で検出された抗 体サブセット（ｓｕｂｓｅｔ）間では明らかに１分できた。興味あることに、１ つの上昇したＩｇＧおよびＩｇＡ値が同じ血清サンプルを用いて両者の方法で検 出されたことから、宿主が食用ＢＳＡに対する一般的な免疫応答に利用された抗 体種の選択性を決定することが示唆される。

ＢＳＡ分子は６０８アミノ酸からなり、配列がヒト血清アルブミンと異なる種々 の領域がある。それらの１つは、ＡＢＢＯ３（ブレＢＳＡ位置１５３−１６９　 （１９））である。

実施例１から明らかなように、糖尿病の小児においてＰＣＦＩＡで検出された大 部分の糖尿病関連抗体はこのエピトープに関するものであり、それに対して糖尿 病でないコントロールの被験者においては、３９６未満のドナーがＡＢＢＯ３を 認識でき、はとんどのエピトープが相違する。ＡＢＢＯ３のエピトープが（β− 細胞）自己抗原、ｐ６９［１，３］、と免疫学的に交叉反応性であるので、一般 白ｔな母集団におけるこのエピトープの免疫抗原性が乏しいことは驚くべきには あたらず、糖尿病母集団を明らかに同定するものである。本発明者らは、この原 理的な相違を糖尿病の患者における経口（または粘膜）耐性の発達の遅延と結び 付いた糖尿病関連ＭＨＣクラスＩＩ分子によるＡＢＢＯ８の有効な抗原位と結び 付けた（１４．１３）：すなわち、後者に関する本発明者らの焦点は、糖尿病の 危険性（ＤＱβ　非−Ａ　Ｓ　Ｐ　５７）の単一の最も高いマーカーが、ＩｇＡ 欠陥に対する疑い、即ち粘膜免疫の調節の異常性、をもマークするという報告に よって誘発された（２６）。

ＢＳＡなどの抗原は高いおよび低い親和抗体の広範なスペクトルを誘導できる種 々のエピトープをｈ゛する。本発明者らの結果は、ＥＩＡにより検出されたイン スリン自己抗体（ＩＡＡ）は病気関連性が薄く、さらに流用放射性結合検定法Ｃ ＲＩ　Ａ）に比較して予言性の低い値であるという観７１１１１（２８−３０） に非常に懐占的である。ＥＩＡは、本研究で得られた結果に類似して、低感受性 および許容できないはと高い比率の虚偽の陽性によって特徴付けられる（２７） 。ＥＩＡは高結合能を有する低親和性ＩＡＡを主に検出し、ＲＩＡは高親和性、 低結合能およびＩＡＡの強力な病気関連サブセットを検出する（３ｏ）。同じこ とは、エピトープに対する受入れ易さがＥＩＡと相違するＰＣＦＩＡなとの流用 アッセイにも適用できる。同じエピトープは、異なる結合方法によりＰＣＦＩＡ およびＥＩＡにおいて利用できない。病気関連エピトープは、ＥＩＡプレートに 結合しても、用いることはできない（３１）。他方、ＥＩＡプレート表面上の過 剰の接着性抗原は、健常な血液ドナーにおけるＩＡＡに関して報告されたように 、高結合能を酊する非病気関連、低親和性抗体の結合を片寄らせる（３２）。

２つのアッセイシステム間の相関関係の著しい欠如は、平均的な抗体親和力での 漸近的な相違をあまり示唆していないが、検出された抗体量が絶対的に相違する ことを示す。

抗原ドライブ（超）免疫応答［ａｎｌｉｇｅｎ　ｄｒｉｖｅ　（ｈｌｐｅｒ−） 　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｌの成熟によって、高親和性ばかりでなく高 速結合連動を有する免疫グロブリンを好む抗体レパートリ−が得られ（３３）、 すなわち、抗体は高いオンオフ（ｏｎＯ（１）抗原結合速度および、例えば病原 体の素早いオプソニン作用及び抗体の再−利用に必要である放出によって特徴付 けられる。本発明賃らは、抗原−複合体形成微小球の大きな表面積、抗Ｉ３九の その後の接近し易さおよびＰＣＦ　ＩＡの高速力学（１分の結合間開）全ての組 み合わせによって高いオンオフ結合速度を有する抗体の選択的な検出が可能とな る。ここで提供された意見は、目的とする抗原と結合できる全ての可能な免疫グ ロブリンレパートリ−を必ずしもカバーしない血清検定方法の臨床的な価値の重 要性を強調するものである。

実施例３　ＰＣＦＩＡによる症状発現前のＩＤＤＭの検出患者および症例：本研 究におけるサンプルは、数年間にわたりＩＤＤＭ（ｒ標題の症例」）であると新 たに診断された小児の全血縁の９０％以上を含む、実施例１で使用された血液サ ンプルのサブセットとして得られた（この研究は継続中である）。血液サンプル を、後者の診断時および６〜１２力月毎に標題の症例の子孫から採取した。７０ ０家族以上が登録され、標題の症例の１９子孫が今までのところ糖尿病になった 。本発明者らのサンプルは、１１人の糖尿病になった人々のサブセットおよび健 康と思われる１００人の子孫を示すものである（これらの少なくとも１〜２人は 糖尿病に変換すると予想される）。これらすべての小児のうち、１〜６サンプル を上記間隔で採取して使用した。

血清１ｇＧ抗ＢＳＡ抗体レベルは、実施例１に記載したのと同様にして測定され た。

結果を、表６及び７に列挙する。

表６は、各被験者から採取されたまさに最初（すなわち、「標題の症例」である と診断された際）のサンプル中に存在するＩｇＧ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体レベルすもの である。糖尿病は、これらの小児において１〜５年後に生じた。表７は、標題の 症例に対する１００人の健康な子孫がら任意に選択されたサブセットにおけるＩ ｇＧ抗Ｂ抗Ｂ抗Ａ抗体レベルすものである。

表　６ 傘　標題の症例の１００人の健常な子孫の任意の部分集団表　７ 表　７　続き 実施例４　ＢＳＡ−感作ＩＤＤＭ関連Ｔリンパ球の検出患者；静脈血液サンプル は、最近ＩＤＤＭになった患者および健常なコントロールからインフォームド　 コンセントを経て採取した。Ｔリンパ球は血液サンプルから調製され、ＢＳＡお よびＢＳＡの種々の合成ペプチド断片に応答するＴ細胞増殖を、血清を含まない 培地を代わりに使用する以外、ドラシュら（Ｄｏｓｃｈｌ　らの方法と同様にし て検定した。

合成ペプチドは、ファルマシア　ペプチド　シンセサイザー（Ｐｈａ＋ｍａｃｉ ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｅ＋）　（ファルマシアリミテッド（ Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ　ＬＴＤ）製、モントリオール、ケベック（Ｍｏｎｔｒｅａ ｌ、　Ｑｕｅｂｅｃ））を用いて製造業省の勧めにしたがって製造し、既知のＨ ＰＬＣ技術によって精製した。

次の合成ペプチドを用いた： Ａ　Ｂ　Ｂ　ＯＳ　：　ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａａｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙ ｇ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌ ｕ−１１ｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−−Ａ　Ｂ　ＲＡ　Ｓ　：　ａｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ −Ａｓｎ−４ｒｏ−Ｔｈｒ−３ｅ＋−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｃ７ｓ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ −Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２ＣＳ　２ ２７０　：　ａｃ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−＾５ｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ −Ｎｌ２（ＹＡＮＫＹＧＶ） ＣＳ　２２６８　＋　ａｃ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ −Ｎｌ２（ＫＦＷＧＫＹ） ＣＳ　２２６７　：　ａｃ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ−Ｌｙ＋−Ｎｌ２ （ＥＦＫＡＤＥＫＫ） ＣＳ　２２４０　：　ａｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ−ｖａｌ−Ｌｅｕ簡潔にいうと、ヘパリン化した血液を血清を角まなｌ 、ＳＨＬ　／　１　）５地で１；１に希釈し、単核細胞をフィコール−７１イパ クーグラシエント（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　ｇ＋ａｄｉｅｎｔｓ）で精 製上ＨＬ／１中で洗浄腰カウントし、２×１０５を容量２００μＩ　ＨＬ／１の ９６ウエルのマイクロカルチャー　プレー）・（ｍｉｃ＋ｏｃｕｌｌｕ＋ｅ　ｐ ｌａｔｅｌに加えた。コントロールの培養液は、ｐａｎ−Ｔ細胞ミトゲンフィト へマグルチニン（ｌＡｌｇ）を追加するかまたは全く追加しな力）つｔ二。

ＢＳＡ　（０，０１〜１０μｇ）またはその他のテストタンパク質、または０． １〜１　ｔｔ　ｇの合成ペプチドを３連で培養液に加えた。培養液を空気中で５ ％濃度のＣＯ２の湿潤した雰囲気下で３７°Ｃにおいて８〜１０日間インキュベ ー・　３ トシた後、１１ｔｃｌ　ＨＴｄＲと共に６時間ノぐルスしｔ二（ｐｕｌｓｅ）。

さらに、細胞を自動／’％−ベスターで収集し、力ｎえたチミジンをンンチレー ション　カウンターで測定した。

または、ＣＣＦＡなどのＴ細胞の活性化の測定若しくはＩＬ２産生などの測定も 同様に用いてもよい。ここに示した全てのデータは上記した標準的なＴｄＲ添加 法を用いた。

ＩＤＤＭ患者から得られた結果を表８に示し、正常のコントロールからの結果を 表９に示す。

すべてのデータは、ＰＨＡで誘導された値に対する増殖性応答として表わす（［ ｃｐｍ実験／ｃｐｍＰＨＡ）＊１００コ。陽性反応は、非刺激細胞における平均 応答＋２ＳＤとして規定した。コントロール以外のすべての患者が、少なくとも ＢＳＡまたはＡＢＢＯ８，通常両方、および試験した際には、この条件における 最小Ｔ細胞刺激ペプチドであるＣ８２２６７に対して陽性の反応を示した。小さ い反応がＣ３２２６８では見られることもあったが、Ｃ３２２７０またはＣ３２ ２４０では見られなかった。

表　８ 表　９ 表　９　続き ＩＤＤＭ患者は、ペプチドＣ８２２６７を特異的に認識し該ペプチドに応答して 増殖する感作されたＴリンパ球を何することが分かったが、正常なコントロール はこのような感作されたＴリンパ球を持たない。現在入手できる指示薬によって 評価される症状発現前のＩＤＤＭを有する被験者は、ＩＤＤＭの患者と同じ応答 を示した。

抗ＡＢＢＯ８および抗ＢＳＡ免疫性の予測力が確立されたので、本発明者らは、 開始しさらに最後のβ細胞が死ぬ参考文献 Ｌ　Ｅｌｌｉｏｔｔ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｒａｄｄｙ　Ｓ、Ｎ、、　Ｂｉｂｂｙ、　 Ｎ、Ｊ、、　Ｋｉｄａ、　Ｋ。

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Ｎ、に、、Ｆ’ｕうｉｔａ、Ｋ、、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｈ，、（１９８７）、 ＤｉａｂａｔｅｓＲｅｓ　６：　６７−６９゜ １０、Ｙｏｋｏｔａ、　Ａ、、　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、　Ｙ、、　Ｕｅｄａ、　 Ｙ、　ａｔ　ａｌ、　（１９９０）Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒａｓ、Ｃ１１ｎ、Ｐｒ ａｃ、９：　２１１−２１７゜１１．５ａｖｉｌａｈｔｉ、　Ｅ、、　Ａｋｅｒ ｂｌｏｍ、　Ｈ，に、、　Ｔａ１ｎｉｏ、　Ｖ−Ｍ、。

Ｋｏｓｋｉｍｉｅｓ、　Ｓ、、　（１９８８）、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅｓ、 　７：　１３７−１４０゜１２、Ｐｏｃｅｃｃｏ、　Ｍ、　Ｎ１ｃｏｌｏｓｏ、 　Ｆ、、　Ｔｏｎｉｎｉ、　Ｇ、、　Ｐｒａｓａｎｉ、　Ｇ、。

Ｍａｒｉｎｏｎｉ、　Ｓ、　（１９９１）、　Ｈｏｒｎ、　Ｒａｓ、、　ｐ、　 ６７゜１３、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｔｒｉｎｋ、　Ｂ、、　Ｄａｎａｍ ａｎ、　Ｄ、、　Ｄｏｓｃｈ、　Ｈ−Ｍ、。

Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｂ、Ｈ，、（１９９１）、　Ａｎｎ、　Ｍａｄ、　２）： 　４４７−４５２゜１４、Ｄｏｓｃｈ、　Ｈ−Ｍ、、　Ｋａｒｊａｌａｉｎａｎ 、　Ｊ、、　Ｍｏｒｋｏｗｓｋｙ、　Ｊ、、　Ｍａｒｔｉｎ。

Ｊ、Ｍ、、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｂ、Ｈ，、（１９９２）、　Ｎｕｔｒｉｔｉ ｏｎａｌ　ｔｒｉｇｇｅｒｓｏｆ　ＩＤＤＭ、工ｎ：　Ｌｅｖｙ−Ｍａｒｓｈａ ｌｌ、　Ｃ，、ｃｚｅｒｎｉｃｈｏｗ、　Ｐ、　（ａｄｓ）Ｐａｄｉａｔｒｉｃ 　ａｎｄ　Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　Ｋａｒｇａ ｒ：Ｂａ５ａ１．ｐ、２０２−２１７゜ １５、　Ｐｉｌｃｈａｒ、（’、Ｃ，，Ｄｉｃｋｅｎｓ、Ｋ、、Ｅｌｌｉｏｔｔ 、Ｒ，Ｂ、、（１９９１）。

Ｄｉａｂａｔｅｓ　Ｒ＠ｓ、　Ｃ１１ｎ、　Ｐｒａｃｔ、１４　（Ｓｕｐｐｌ、 　ｌ）：　８２Ａ。

１６、　Ｋａｒｊａｌａｉｎａｎ、Ｊ、に、、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　１９９０；　 コ９：　１１４４−５０゜１７、Ｋａｒｊａｌａｉｎａｎ、　：１．、　Ｋｎｉ ｐ、　Ｍ、、　Ｍｕｓｔｏｎａｎ、　Ａ、、　Ｊ＆ａｒｂｌｏｍ。

Ｈ，に、、Ｄｉａｂａｔａｓ、１９８８；　３１：　１２９−１３３゜１Ｂ、Ｋ ａｒｊａｌａｉｎａｎ、　Ｊ、、　Ｋｎｉｐ、　Ｍ、、　Ｍｕｓｔｏｎａｎ、　 Ａ、、工１ｏｎａｎ、　Ｊ、。

入ｋａｒｂｌｏｍ、Ｈ，に、、Ｄｉａｂ＠ｔａｓ、１９８６；　コ５：　６２０ −２．。

１９、ｃｌａｒｕｍ、　Ｍ、、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｅｌ、！（、、Ｍａｒｔ ｉｎ、　Ｊ、Ｍ、、（１９８９）。

Ｄｉａｂａｔａｓ　Ｒａｓ、１０：　１０３−１０７゜２１、Ｄｏｓｃｈ、　Ｇ −Ｍ、　Ｌａｗ、　Ｐ、、　にｕｅｒｉｎ、　Ｄ、、　Ｌａａｄ＠ｒ、　Ｊ、Ｓ 、。

（１９８８）　、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　 ｃｏｎｃａｎｔｒａｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ ｙ　（ＰＣＦ工Ａ）　：　Ｎｏｖａｌ　ａｌｔａｒｎａｔｉｖａｓｔｏ　ＥＬ工 ＳＡ　ａｎｄ　Ｒ工Ａ、　Ｉｎ：　Ｇａｍｂａｌａ　Ｐ−Ｌ　（＠ｄ）　Ｐｒｏ ｃａ＠ｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　１９８７　Ｐａｎｄａｘ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 　ｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌ＠Ｃｏｎｃａｎｔｒａｔｉｏｎ　Ｆｌｕｏｒａｓｃ＠ｎ ｃｅ工ｍｍｕｎｏａ！１Ｓａｙ、　ａａｘｔａｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ｐｐ、５−２２゜２２、Ｄｏｓｃｈ、Ｈ− Ｍ、、Ｌａｗ、Ｐ、、Ｈｕｉ、Ｍ、Ｆ、、Ｈｌｂｉ、Ｔ、、Ｃｈａｕｎｇ。

Ｒ，に、、（１，９９０）、工ｎｔ、ニーｕｎｏ：Ｌ　２　（Ｓａｐｔ、１９９ ０）：　８３：ｌ−８４８゜２３、　Ｃｈａｕｎｇ、Ｒ，に、、Ｄｏｓｃｈ、Ｈ −Ｍ、、（１９９１）、Ｊ、Ｂｏｉｌ、Ｃｈ＠ｍ。

２６６（１４）：　８６６７−８６７０゜２４、ＭａｃＫａｎｚｉｅ、　Ｔ、、 　Ｄｏｓｃｈ、　Ｈ−Ｍ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、１９８９；　１６９：４ ０７−３０゜ ２５、Ｔａ１ｎｉｏ、　Ｖ、Ｍ、、　５ａｖｉｌａｈｔｉ、Ｅ、、　Ａｒｊｏｍ ａａ、　Ｐ、。

ＳａｌｍｅｎｐｅｒＪ　Ｌ、、　Ｐｅｒｈｅｅｎｔｕｐａ、　Ｊ、、Ｓｉｉｍａ ｓ、　Ｍ、、（１９８８）。

Ａｃｔａ、Ｐａａｄｉａｔｒ、５ｃａｎｄ、７７：　８０７−８１゜２６、　０ １ｅｒｕｐ、　Ｏ，、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｃ，工、Ｅ、、　Ｈａｍａｒｓｔｒｅｉｍ 、　Ｌ、（１９９０）。

Ｎａｔｕｒｅ　３２’７：　２８９−２９０゜２７、Ｃａｕｄｗｅｌｌ、Ｊ、、 ５ｔｏｊａｎｏｖｓｋｉ、Ｃ，、Ｃｏｌｍａ、Ｐ、（１９９１）。

Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒａｓ、Ｃ１１ｎ、Ｐｒａｃｔ、１４　（Ｓｕｐｐｌ、ｌ） ：　８９Ａ。

２Ｂ、Ｋｕｇｌｉｎ、　Ｂ、、　Ｋｏｌｂ、　Ｈ，、Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ、　Ｃ ，、Ｍａｃｌａｒａｎ、　Ｎ、に、。

ＬＱｒｒＬｍａｒｋ、人、、Ｐａｌｍａｒ、Ｊ、Ｐ、、（１９９０）、Ｄｉａｂ ａｔｏｌｏｇｉａ　３３：６３Ｂ−６３９゜ ２９、Ｌｅｖｙ−Ｍａｒｃｈａｌ、　Ｃ，、Ｂｒ１ｄａｌ、　Ｍ、Ｐ、、５ｏｄ ｏｙｅｚ−Ｇｏｆｆａｕｘ、Ｆ。

ａｔ　ａｌ、、（１９９１）、Ｄｉａｂａｔｅｓ　Ｃａｒｅ　１４　（、ｆｆａ ｎ）：　６１−６：ｌ。

コＯ，Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ、Ｇ、Ｊ、、Ｐａｌｍａｒ、Ｊ、Ｐ、、Ｋｕｇｌｉｎ 、Ｂ、、Ｋｏｌｂ、Ｈ，。

（１９９２）、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｃｔａｂ　７４ ：　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ。

コ１．　５ｏｄｏｙａｚ−Ｇｏｆｆａｕｘ、Ｆ、、Ｋｏｃｈ、Ｍ、、Ｄｏｚｉｏ 、Ｎ、。

Ｂｒａｎｄａｎｂｕｒｇ、　Ｄ、、　５ｏｄｏｙｅｚ、　Ｊ−Ｃ，、（１９８Ｂ ）、　Ｄｉａｂａｔｏｌｏｇｉａコ１：　６９４−７０２゜ ３２、　５ｏｄｏｙｅｚ、　Ｊ−Ｃ，、５ｏｄｏｙｅｚ−Ｇｏｆｆａｕｘ、　Ｆ 、、　Ｋｏｃｈ、　Ｍ、。

Ｂｏｕｉｌｌｅｎｎａ、　Ｃ，、Ｆｒａｎｅｏｉｓ−Ｇｅｒａｒｄ、　Ｃ，、Ｂ ｏｓｉ、　Ｅ、。

（１９９０）、　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　３３＝　７１９−７２５゜３３、 Ｆｏｏｔｅ、　Ｊ、、　Ｍｉｌｓｔａｉｎ、　Ｃ，、（１９９１）、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３５２：　５３ｏ−５３２゜ 抗−ＢＳＡ、ＩｇＧ　（ＫｆＵ／μｅ）図　Ｉ　Ａ ｒｇＡ　ｔＮ−ＢＳＡ　（ＫｆＴＪ　／　ｐｅＪ図　Ｉ　Ｂ ＩｇＭ　抗−ＢＳＡ　（ＫｆｌＪ　／　ｐｅ）被験者（Ｎ　＝　１７） 図　２　Ａ 被験音（Ｎ　：　１７） 図　２　Ｂ 彼　駐　者　（Ｎ　＝　１７１ ′２　２　Ｃ ２，０４，０６，０８，０１０，０１２，０１４，０１６，０１Ｂ、ＯＩｇＧ− 抗−ＢＳＡ　（ＫｆＩＪ　／　ｐｅ）図　３　Ａ ６００　２００　７０　２５　Ｂ　２．７　０．９　０．３　０．１希　釈　（ ＸＩＯ３） 図　３Ｂ 希　釈　（×１０３） 図　３　ｃ 希　釈（×１０３） 図　３　Ｄ ρＣＦＩＡ 図　３　Ｅ リガンドの添加隈（１ｇ） 図　３　Ｆ 口ｌ＾ ＰＣＦＩＡ　（ＫｆＵ　／　Ｊｕｌ　）ＩｇＡ：　糖尿病、の者 ０１　２３４５６７Ｂ ＰＣＦＩＡ　（ＫｆＵ　／　Ｊｕｌ　）ＩｇＧ：　：ｌ　、）。−１゜ ＰＣＦＩＡ　（ＫｆＵ　７１ｍ） ０　０．５　１　２　３　４ ＰＣＦＩＡ　（ＫｆＵ　７１ｍ） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｄ　７０５５−２Ｊ３３１５６４　Ｚ　７０５５−２Ｊ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ， ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ Ｉ （７２）発明者　口ビンソン、プライアン　ホワードカナダ国　エム４ダブリニ ー　２テイー４（７２）発明者　マーチン、ジュリオ　マリオカナダ国　エム２ ジエー　２ダブリユー６オンタリオ州　ライロウディル　セネ力ヒル　ドライブ 　６２１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物から血清サンプルを得、粒子の結合した食用タンパク質若しくはそ の断片を抗原として用いた粒子濃度蛍光イムノアッセイによって血清中の食用タ ンパク質若しくはその断片に対する抗体レベルを測定することからなる哺乳動物 の自己免疫疾患または症状発現前の自己免疫疾患の検出方法。
2. ２．哺乳動物から血清サンプルを得、粒子の結合したウシ血清アルブミン若しく はその断片を抗原として用いた粒子濃度蛍光イムノアッセイによって血清中のウ シ血清アルブミン若しくはその断片に対する抗体レベルを測定することからなる 哺乳動物の症状発現前のインスリン依存性真性糖尿病の検出方法。
3. ３．哺乳動物から血清サンプルを得、粒子の結合したウシ血清アルブミン若しく はその断片を抗原として用いた粒子濃度蛍光イムノアッセイによって血清中のウ シ血清アルブミン若しくはその断片に対する抗体レベルを測定することからなる 哺乳動物のインスリン依存性真性糖尿病の検出方法。
4. ４．哺乳動物からＴリンパ球を得、食用タンパク質若しくはその断片に対する該 リンパ球の増殖反応を測定することからなる哺乳動物の自己免疫疾患または症状 発現前の自己免疫疾患の検出方法。
5. ５．哺乳動物からＴリンパ球を得；Ｔリンパ球をウシ血清アルブミン若しくはそ の有効な断片と接触させ；Ｔリンパ球の増殖反応を測定することからなる哺乳動 物の症状発現前のインスリン依存性真性糖尿病の検出方法。
6. ６．以下のアミノ酸配列及びその類似体の１つを有するペプチド； （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 （ｇ）【配列があります】および （ｈ）【配列があります】
7. ７．請求の範囲第６項に記載のアミノ酸配列の１をエンコードする核酸配列から なる単離されたＤＮＡ。
8. ８．ヒトの感作されたＴリンパ球を減少または除去する細胞毒性を有する化合物 に連結した請求の範囲第６項に記載のペプチドの使用。
9. ９．哺乳動物からＴリンパ球を得；Ｔリンパ球をウシ血清アルブミン若しくはそ の有効な断片と接触させ；さらにＴリンパ球の増殖反応を測定することからなる 哺乳動物のインスリン依存性真性糖尿病の検出方法。
10. １０．ウシ血清アルブミン断片がアミノ酸配列ＦＫＡＤＥＫＫＦＷＧＫＹＬＹＥ ＩＡＲＲを有するペプチドまたはその有効な類似体である、請求の範囲第５項に 記載の方法。
11. １１．ウシ血清アルブミン断片がアミノ酸配列ＥＦＫＡＤＥＫＫを有するペプチ ドまたはその有効な類似体である、請求の範囲第５項に記載の方法。
12. １２．ウシ血清アルブミン断片がアミノ酸配列ＦＫＡＤＥＫＫＦＷＧＫＹＬＹＥ ＩＡＲＲを行するペプチドまたはその行動な類似体である、請求の範囲第９項に 記載の方法。
13. １３．ウシ血清アルブミン断片がアミノ酸配列ＥＦＫＡＤＥＫＫを侍するペプチ ドまたはその有効な類似体である、請求の範囲第９項に記載の方法。