JPH07508402A - 新規な分泌蛋白であるｆ−スポンディンのクローニング，発現および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 この出願の全体を通して、括弧内に種々の刊行物が参照される。これら刊行物の 開示は、本発明の属する技術の状態をより完全に記述するために、全体としてこ の出願に組み込まれる。これら参照文献の完全な目録引用は、配列表および請求 の範囲の直前の明細書末尾に記載されている。

を椎動物神経系の初期の発生は、特定の神経細胞タイプの同一性および成長する 軸索の経路を決定する局部的な細胞相互作用によって制御される。胚神経系内で 分化する第一細胞タイプの一つはフロアプレート（ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔｅ）　 、即ち、神経管の腹側中線（ｖｅｎｔｒａｌ　ｍ１ｄｌｉｎｅ）に位置する上皮 細胞の小群である（Ｓｃｈｏｅｎｗｏｌｌ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、１９９０）　 ｏフロアプレートの分化は、を索からの局部的な、おそらくは接触依存性の信号 によって誘導される（図１）　（ｖａｎ　Ｓｌ＋ａａｔｅｎ　ｅｌ　ａｌ、、１ ９８８：Ｐｌａｃｘｅｋ　ｅｊ　ａｌ、、１９９０；　Ｈａｌｌａ　ｅｌ　ａｌ 、、１９９１）　ｏフロアプレートに由来する信号は、神経管における細胞密度 の制御および軸索の案内に関係している（図１）　（ｌｅｓｓｅｌｌ　ａｎｄ　 Ｄｏｄｄ。

＋９９１）。

フロアプレートが神経管における細胞密度およびパターンを制御する分極性信号 の供給源であるとの証拠は、ひな鳥の胚での実験において、宿主胚の神経管の後 に移植されたフロアプレート細胞が、追加の異所性の運動性ニューロンを伴い、 また細胞特異的な抗原マーカーによって定義される他の腹側神経タイプを伴うこ とによって与えられる（Ｙａｍａｄｘ　ｅｊ　ｉｔ、。

１９９１；　Ｐｌａｃｘｅｋ　ｅｌ　ａｌ、、１９９１　）　、逆に、を索を除 去することによってフロアプレートの分化を妨害すると、運動性ニューロンおよ び他の腹側ニューロンを欠失したを髄の形成が導かれる。これら移植実験は、腹 側を髄（ｖｅｎｌｒｉ　５ｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ）中に存在する神経細胞タイプ の同一性およびパターンを確立する際に、フロアプレートが中心的役割を有する ことを示唆する。フロアプレートは又、おそらくは形態発生的に活性なレチノイ ドの放出によって、ひな２Ｑの翼芽に移植されたときに四肢の分極活性を有して いる（Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）。

を髄ニューロンの同一性が確立された後、フロアプレートは、を髄の腹側中線に 向けて及びこれを横切って軸索の成長を促進する、遠距離的および局部的な案内 キュー（ｇｕｉｄｘｎｃｃｃｕｅｓ）を提供するように見える。第一に、フロア プレートは、イン・ビトロにおいて、文運ニューロンの軸索成長を配向させｉす る拡散可能な化学誘引物質を分泌しく図１　）　（Ｔ＊ｓｓｉｓｒ−Ｌａｖｉｇ ｎｅｅｌ　ａｌ、、１９８８；　Ｐｌａｃｕｋ　ｅｆ　！＋。１９９０ａ；　Ｔ ｔｓｓｌｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ　ａｎｄ　Ｐｌａｃｘｅｋ、　１９９１）　、イ ン−ビトロにおけるこれら軸索のフロアプレートへの回帰を説明し得る（Ｗｅｂ ｅｒ、　１９３８；Ｐｌａｃｚｅｋ　ｅｌ　ａｌ、、１９９０ｂ；　Ｂｏｖｏｌ ｅｎｆａ　ａｎｄ　Ｄｏｄｄ、１９９１：　Ｙａｇｉｎｕｍａ　ａｎｄ　Ｏｐｐ ｅｎｈｅｉｍ、　１９９１）　ｏ第二に、フロアプレートは、文運軸索が腹側中 線を横切った直後に生じる軌道の変化（横切る方向から長手方向面へ）に寄与し 得る（図１）　（Ｂｏｌｔ＜７　ａｎｄＳｉｌｖｅｒ、１９８７．Ｄｏｄｄ　ｅ ｊ　ａｌ、、１９８８．Ｂｏｖｏｌｅｎｌａ　ａｎｄ　Ｄｏｄｄ。

＋９９０）。この提案を支持するものとして、胚発生の間にフロアプレートの欠 失をもたらすマウスおよびゼブラフィッシュの遺伝子的突然変異によって、を髄 の中線での文運軸索の経路発見にエラーか導かれる（Ｂｏｖｏｌｅｎｌａ　ａｎ ｄ　Ｄｏｄｄ、１９９１：Ｂｅ＋ｎｈａ＋ｄｔ　ａｎｄ　Ｋｕｗａｄａ、１９９ ０）　ｏ第三に、フロアプレートは、免疫グロブリンスーパーファミリーの糖蛋 白の発現を調節することにより（Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、、］９８８；　５ｃｈ ａｃｈｎｕ　ｅｌ　ａｌ、、１９９０；Ｆｕ＋ｌｅｙ　ｅｌ　ａｌ、、１９９０ 　）　、文運軸索がを髄の中線を横切った後に生じる文運軸索の繊維束収縮を促 進し得る（ｌｌｏｌｌｅｙ　ａｎｄＳ＋ｌｅ＋、１９８７）。を椎動物の神経発 生におけるフロアプレートの特殊な役割は、胚ショウジヨウバエおよびＣ，エレ ガンスｔｃ、　ｅｌｅｇａｎｃｅｌの中枢神経系の中線における細胞が神経のパ ターンニッグ及び軸索案内に関係している点において、非を椎動物の器官におけ るそれと類似している（Ｋｌａｍｂｌ　ｅｌ　ａｌ、。

１９９１：　Ｎａｍｂｕ　ｅｌ　ａｌ、、］９９］；　Ｈｅｄｇｃｃｏｃｋ　ａ ｎｄ　Ｂａ１ｌ、１９９０　）。

初期の神経発生の際におけるフロアプレートの多様な機能を媒介し得る分子を同 定するために、減法ハイブリダイゼーション（ｓｕｂｌ＋＝Ｃｌ１ｖｅ　ｈｙｂ ＋＋ｄｉｘａｌｉｏｎ）技術を用いて、フロアプレートに選択的に発現されるｃ ＤＮＡクローンを単離した。

この明細書中では、胚発生の際に後期フロアプレート（ｒａｔｅｆｌｏｏｒｐｌ ａｔｅ）によって高レベルで発現される、新規な分泌蛋白であるＦ−スポンディ ン（Ｆ−ｉｐａｎｄｉｎ）をコードするｃＤＮＡクローンの特徴付けか記述され る。Ｆ−スポンディンの予想アミノ酸配列によって、この蛋白が、細胞付着およ び軸索の伸長に関係するトロンポスポンディン（Ｉｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ）および他の蛋白中に存在するドメインに類似したドメインを含むことが明らか になった。イン−ビトロ試験によって、Ｆ−スポンディンは神経細胞の付着およ び軸索の伸長を促進することが示され、フロアプレートによる該蛋白の分泌がＣ ＮＳ発生における軸索の成長および案内に寄与することが示唆される。

〔発明の概要〕

本発明は、Ｆ−スポンディンをコードする、単離されたを椎動物核酸分子を提供 する。この単離された核酸はｃ　ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。この単離され たを椎動物核酸は、ヒト、ラット、ニワトリ又はツメガエルから誘導され得る。

本発明は又、Ｆ−スポンディンをコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と 特異的にハイブリダイズできる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子を含む 核酸プローブを提供する。この核酸プローブはＤＮＡまたはＲＡＮであり得る。

本発明は、Ｆ−スボンディン核酸分子を得るための方法を提供する。一つの実施 例においては、減法ハイブリダイゼーションによって、ラットのＦ−スポンディ ン遺伝子が単離される。他の実施例においては、ラットＦ−スボンディンブロー ブを用いてニワトリｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ニ ワトリのＦ−スポンディン遺伝子が単離される。更に別の実施例においては、ツ メガエルＦ−スポンディンも単離される。

本発明は更に、Ｆ−スポンディンの生物学的活性を有するポリペプチドを製造す るための宿主ベクター系を提供する。

単離されたを推動物ドースポンディン核酸分子は、ＲＮＡ転写のプロモータに連 結され、次いでプラスミドに連結される。

適切な宿主は、使用されるプロモータ及びプラスミドのタイプに応じて、バクテ リア細胞、昆虫細胞または動物細胞である。本発明は又、Ｆ−スポンディンの生 物学的活性を有するポリペプチドの製造方法であって、選択された宿主ベクター 系を、前記ポリペプチドの産生およびこうして産生されたポリペプチドの回収を 可能にする適切な条件下で増殖させることを具備した方法を提供する。

本発明は更に、精製されたを推動物ドースポンディンを提供する。このような精 製されたＦ−スポンディンは、軸索の付着および伸長に有用であろう。本発明は 、神経細胞をマトリックスに付着させる方法であって、該マトリックスを、神経 細胞および該細胞のマトリックスへの付着を起こさせるのに有効な濃度の精製さ れたＦ−スポンディンに接触させることを具備した方法を提供する。本発明は更 に、神経細胞の成長を刺激する方法であって、神経細胞を、神経細胞を刺激する のに有効な濃度の精製されたＦ−スポンディンに接触させることを具備した方法 を提供する。本発明は、対象中において神経細胞を再生する方法であって、該対 象に対して、対象中で神経細胞を再生するのに有効な濃度の精製されたＦ−スポ ンディンを投与することを具備した方法を提供する。最後に、本発明は神経細胞 の成長を刺激するための薬剤組成物であって、薬剤的に許容され得るキャリアと 、神経細胞の成長を刺激するのに有効な濃度の精製されたＦ−スボンディンとを 含有する組成物を提供する。

〔図面の簡単な説明〕

図１＝初期のを髄発生の際の、フロアプレートの誘導および提案された機能を示 す図である。詳細は本文を参照されたい。

図２：フロアプレートに特異的なｃＤＮＡクローンの同定に用いられる減法ハイ ブリダイゼーション・プロトコールの模式図である。詳細は本文を参照されたい 。

図３：Ｆ−スポンディンｍＲＮＡの発現。全細胞性ＲＮＡまたはポリ（Ａ）　Ｒ ＮＡが異なった組織から単離され、１％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲル上 で分離され、ナイロン膜にプロットされた。このプロットは、ランダムプライミ ングによりラベルされた、Ｆ−スポンディンの３−非コーディング領域に由来す るＣＤＮＡプローブで分析された。

Ａ、Ｅ１３後部を髄および成体肝臓と比較した、Ｅ１３（胎齢１３日）フロアプ レートにおけるＦ−スポンディンｍ　ＲＮ　Ａの優先的発現。４．５ｋｂ及び４ ．７ｋｂの二つの転写物がフロアプレートＲＮＡ中に検出された。

Ｂ、ＫＭＣＡ（神経細胞付着分子）ｍＲＮＡは、Ｅ１３フロアプレート、後部を 髄およびＰＯ（生後り日）の脳において、略等しいレベルで発現される。

Ｃ，Ｆ−スポンディンは、成体腎臓および脳の全ＲＮＡのプロット中に検出され るが、成体肝臓または座骨神経には検出されない。

図４：Ｆ−スポンディンｃＤＮＡの制限地図。矢印は翻訳の方向を示す。制限部 位はｃＤＮＡの上に示されている。

図５：Ｆ−スポンディンのｃＤＮＡおよび予想アミノ酸配列 Ａ；ｃＤＮＡから決定された、ラットドースポンディンのヌクレオチド配列およ びアミノ酸配列。アミノ酸の番号は最初のメチオニンから始まっている。下線を 付したＮＨ２末端残基は推定シグナル配列を示している。Ｎ−結合グリコシル化 の可能な部位は二重線で示されている。

Ｂ；予想されるＦ−スポンディンアミノ酸配列の疎水性分析。プロットは、Ｗｙ ｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｌｌｌｅ（１９８２）に与えられているパラメータを 用いて形成された。蛋白図６　カルボキシ末端ドメインドースポンデイン及び他 の蛋白におけるトロンポスポンディン１型繰返しに対する相同性。

Ａ、Ｆ−スポンディンのドメイン構造を示す模式図。黒く塗り漬したホックスは シグナル配列である。斜線を付したボックスは、トロンホスポンディン〕型繰返 しくＴＳＲｓ）である。

Ｂ、Ｆ−スポンディンにおける６つの繰り返しモチーフ（該蛋白の残基４４０〜 ８０７を占める）を並べて比較した図。夫々の繰り返しにおける最初および最後 のアミノ酸の位置が左側に示されている。各繰返しの上の数字は残基の位置を示 す。４つ以上の同一の残基が存在する位置はボックスで囲んである。

Ｃ；保存されたＦ−スポンデインモチーフを、トロンポスポンディン１１　トロ ンポスポンディン■、形質胞体す−カムスポルーイテ（ｐｌａｓｍｏｄｉａｌ　 ｃ：ｒｃｕｍｓｐｏｒｏ。

ｉｔｅ　；ｃｓ）蛋白の領域■、トロンポスボンデイン関連の無名蛋白（ＴＲＡ Ｐ）　、ブロック−ジン、並びに補体蛋白Ｃ６，Ｃ７，Ｃ８ａ及びＣ９のＮ末端 領域およびＣ末端領域に見られる保存されたＴＳＲｓとの比較。図の右側の数字 は、ＴＳＲドメインの全数に比例したＶＴＣＧ配列を含むＴＳＲドメインの数字 を示す。

図７１発生中のを髄におけるＦ−スポンデインｍＲＮＡの局在。

Ａ；アンチセンスＲＮＡプローブを用いたｉｎ　５ｉｌｕ！ｓイブリダイゼーン ヨンによる、胎齢１０日のう・ント胎児の後部におけるＦ−スポンデインｍ　Ｒ Ｎ　Ａの局在を示すオートラジオグラフ。神経管の腹側中線で、又おそらくは神 経管の下にあるアクンヤル中胚葉中に、強いハイブリダイゼーシヨンが検出され る。

Ｂ；ジゴキンゲニンでラベルされたアンチセンスプローブを用いた、Ｅｌｌ（胎 齢１１０）ラット胎児ハイブリダイゼーション組織化学によるホールマウント（ ｖｈｏｌｗ　ｍｏｕｎｔ）　ｉｎ　５ｉｌｕ　Ｆ−スボンディンｍＲＮＡの局在 。中脳、後胴およびを髄のフロアプレート（矢印の頭）にハイブリダイゼーショ ンが検出される。

Ｃ，Ｅ１２　（胎齢１２日）のラットを髄におけるＦ−スポンディンの局在を示 す明視野顕微鏡写真。フロアプレートは強くラベルされる。

Ｄ；フロアプレートにおける強いラベリングに加えて、腹側角に低レベルのハイ ブリダイゼーションがあることを示す、同じ断面の暗視野顕微鏡写真。ハイブリ ダイゼーションは腹側ルートにも検出される。

Ｅ、ＥｌＢを髄のフロアプレートおよび腹側脳室領域か高１ノヘルのＦ−スポン ディンｍ　ＲＮ　Ａを発現することを示す暗視野顕微鏡写真。

Ｆ、Ｆ−スポンディンのレベルがフロアプレート及び腹側脳室の領域で未だ高い ことを示す、ＥｌＢ（胎齢１６０）のを髄の明視野顕微鏡写真。

Ｇ、ＥｌＢにより、を髄の腹側および中間の領域にも顕著なハイブリダイゼーシ ョンが検出されることを示す、明視野顕微鏡写真。

Ｈ，Ｆ−スポンディンの均一な分布を示す暗視野顕微鏡写真。

スケールバー：　Ａ−１００ｕｍ　；　Ｂ＝３５０　ｕｍ　；Ｃ＝　８０　ｕｍ 　；　Ｅ＝１００　μｍ　；Ｆ＝１７０　μｍ　；　Ｇ−１７０ｕｍ　：Ｈ＝　 １２０　ｕ　ｍ。

図８：Ｆ−スポンディンｍｙｃはＣＯＳ細胞によって分泌され、細胞表面に結合 する。

Ａ、Ｆ−スポンディンｃＤＮＡ内の独特なＮｃｏ１部位または５ｐｅ１部位に連 結された、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子の１０アミノ酸領域位をコードするオリゴヌレオ チドの挿入位置。

Ｂ　；　ｐＦＰ５ｍｙＳＳｐＦＰ５ｍｙＮでトランスフェクトされたＣＯ５細胞 、並びにｍＯｋトランスフェクトされた細胞に４０時間晒すことより得られた馴 らし培地の免疫沈殿。両構築物は１１．６ｋＤａに単一の蛋白バンドを生じた。

Ｃ；トランスフェクトされたｃｏｓ細胞の小群を示す位相コントラスト顕微鏡写 真。

Ｄ；細胞表面におけるＦ−スポンディン０１ＦＣの局在を示す免疫蛍光顕微鏡写 真。免疫活性は、細胞−基質接触よりも、細胞−細胞接触において遥かに高いレ ベルで検出される。

スケースバー：Ｃ，Ｄ＝２０μｍ 図９：Ｆ−スボンディン町０は、イン・ビトロにおいて、ＤＲＧニューロンから の軸索の伸長を促進する。トランスフェクトされたＣＯ８細胞上清から得たＦ− スポンディン町０蛋白はアフィニティー精製され、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（８−２ ５％）および銀染色によって分析された。（Ａ）二つの染色されたバンドが観察 され、これらはＦ−スポンディンのグリコジル化の相違を反映しているかもしれ ない。Ｅ１４ラット後根伸根神経ら単離された神経細胞は、Ｆ−スポンディン（ Ｂ）、ｃｏｓ細胞馴らし培地（Ｃ）またはＢＳＡ　（図示せず）の基質に１４時 間プレートされ、固定され、ＭＡｂ・３Ａ　１０テラベルされ、間接免疫蛍光に よって可視化された。（Ｄ）各ＭＡｂ・３Ａ１０陽性神経の最も長い軸索の長さ を測定した（或いは、軸索が見られないときはＯｍｍとして記録した）。

μｍでの所定の長さの軸索（横軸）よりも長いニューロンのパーセンテージ（縦 軸）がプロットされた。５回の実験で同様の結果が得られた。Ｄに示したプロッ トには、非束生軸索のみが含められた。ＢおよびＣにおけるスケールバーは１０ ０μｍである。

図１０　Ｆ−スポンディンは、後部を髄細胞（ｄ＋ｏｓａｌ　ｓｐｉ口ａｔ　ｃ ｏｒｄ　ｃｅｌｌｓ）の付着を促進する。Ｅ１３後部を髄細胞の単一の細胞懸濁 液（１０６細胞／３５ｍｍ皿）を、Ｆ−スポンデインｍｙｃ基質（Ａ、Ｂ）、Ｇ ＳＡ基質（Ｃ）およびヘパリン存在下（１ｍｇ／ｍｌ）のＦ−スポンデインｍｙ ｃ基質（Ｄ）に１時間プレートした。次いて、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、固定化 し、計数した。

Ｅ；異なった旦のＦ−スポンディンｍｙｃ基質に対する、投与墓に依存したＥ１ Ｂ後部を髄細胞の付着を示すボックスプロット。夫々のボックスプロットは異な る１０のフィールドからの細胞計数を示す。３回の別々の実験において同様の結 果が得られた。

Ｆ：異なった濃度のヘパリンおよび硫酸コンドロイチンの存在下における、Ｅ１ Ｂ後部を髄細胞のＦスボンディンｍｙｃへの付着の阻害を示すボツクスブロ・ノ ド。

硫酸コンドロイチン及びヘノマリンの全濃度にお（１で、阻害は有、意である（ ｐ＜０．００１　；試験）スケールバー：Ａ、Ｃ，Ｄｘ２００　ｕｍ。

Ｂ＝５０μｍ ボックスプロット；太線でマークした中点およびド・ソトで示した平均を有する ポピユレーションの５０％を囲んたボックス。このデータの範囲は、線の範囲に よって示される。夫々のプロ・ソトは、３回の同様の実験の内の１つからの１０ 回のｐｊ定を表している。

〔発明の詳細な説明〕

本発明は、Ｆ−スポンデインをコードする、単離されたを椎動物核酸分子を提供 する。ここで用（λるＦ−スポンデインの語は、Ｆ−スポンデインによって提供 される生物学的ン古性をもった何れのアミノ酸配列、ポリペプチドまた（！蛋白 をも包含する。

本発明の一実施例において、上記の単離された核酸分子１ｔＤＮＡである。本発 明の他の実施例にお０て、上記の単離された核酸分子はｃＤＮＡまたはＲＮＡで ある。本発明の好ましい実施例において、この単離された核酸分子は、配列表（ 配列認識番号９，１１および１３）に示されたｃＤＮＡである。

本発明は又、Ｆ−スポンディンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコード するが、発現型の変化を生じないようなりＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。或い は、本発明は又、本発明のＤＮＡおよびｃＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡお よびｃＤＮＡを包含する。ハイブリダイゼーション法は当業者に周知である。

本発明のＤＮＡ分子は又、−以上のアミノ酸残基の同一性または位置の点で天然 形と異なり（該蛋白について特定された全ての残基よりも少ない残基を含む欠失 類縁体、特定の一以上の残基が他の残基に置き代わった置換類縁体、および−以 上のアミノ酸残基が該ポリペプチドの末端または中間に付加された付加類縁体） 、且つ天然形の幾つかのまたは全ての性質を共有しているポリペプチド類縁体、 抗原性ポリペプチドのフラグメントまたは誘導体を包含する。これらの配列には 次のものか含まれる。即ち、選択された非削乳類宿主による発現のために「好ま しい」コドンの組み込み；制限エンドヌクレアゼ酵素による開裂のための部位の 付与；容易に発現されるベクターの構築を容易にする、追加的な開始、終始また は中間のＤＮＡ配列の付与である。

ここに記載され、権利請求されているＤＮＡ分子は、それらが該ポリペプチドの アミノ酸配列に関して提供する情報のために有用であり、また種々の組換え技術 により該ポリペプチドを大規模合成するための生成物として有用である。この分 子は、新しいクローニングベクター及び発現ベクター、形質転換され且つトラン スフェクトされた前核および真核宿主細胞、並びに該ポリペプチド及び関連生成 物を発現できるこの様な宿主細胞を培養増殖させるための新規かつ有用な方法を 生み出すために有用である。

更に、この単離された核酸分子は、神経発生を研究するためのプローブを開発す るために有用である。

Ｆ−スポンディンは種々のを椎動物によって産生され得る。

一つの実施例においては、ラットのＦ−スポンデイン核酸が単離される。ラット ドースポンディンのｃＤＮＡの制限地図が図４に示されている。ラットドースポ ンディンのＸｈｏｌ−Ｄ　ｒ　ａ　１フラグメントが、Ｆ−スポンディンｃＤＮ Ａから切り出された。Ｘｈｏ１部位はＴ４ＤＮＡポリメラーゼて鈍端化され、Ｂ 　ｇ　１２　＋、１ンカー（１２量体）が連結された。このフラグメントはｐ　 Ｂｌｕｅｓｃ＋ｉｐｌ　ＳＫ　（ストラタジーン社）のＢａｍＨ１部位中にサブ クローン化された。該遺伝子の５′末端は、Ｔ３プロモータの近傍に位置付けら れた。こうして得られたラットドースポンディンをコードするプラスミド（ｐＦ Ｐ５／ＫＳ）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条 約の規定に従って、１９９２年３月１９日に、アメリカ合衆国メリーランド州２ ０８５２０ツクウィル・１２３０１パークローンドライブのアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。このプラスミドｐＦＰ ５／ＫＳには、ＡＴＣＣ受付番号７５２１５が付与された。

他の実施例では、ひな鳥Ｆ−スポンデインｃＤＮＡが単離された（配列認識番号 〕１）。その翻訳はヌクレオチド位置１３６で開始される。更なる実施例では、 部分的なツメガエルＦ−スポンディンが単離された（配列認識番号１３）。

この出願を通して、特定のヌクレオチドへの言及は、該核酸のコーディグ鎖上に 存在するヌクレオチドに対するものである。この明細書を通して、特定のヌクレ オチドを指定するために以下の標準的な略号が用いられる。

Ｃ＝ントシン、Ａ−アデノシン Ｔ＝チミジン、Ｇ−グアノシン 例示のみの目的で、ラットにおけるＦ−スボンデインを単離して特徴付けするた めに、出願人は減法ハイブリダイゼーンヨン技術を用いた。同様の減法ノ＼イブ リダイゼーンヨン技術は、異なったを椎動物におけるＦ−スポンデイン遺伝子を 単離および特徴付けするために適用することかできる。

或いは、Ｆ−スポンデイン遺伝子は、う・ｙｈＦ−スポンディン遺伝子から作製 したプローブを用いて単離してもよい。

ニワトりおよびツメガエルの相同性Ｆ−スポンデイン遺伝子は、出願人によって 最近クローン化された。これらの遺伝子は極めて保存されており、アミノ酸レベ ルでは９０％の相同性を有し、核酸レベルでは約７０％の相同性を有している。

このニワトリ遺伝子は、胎児を髄ｃＤＮＡライブラリーを低い厳格さてスクリー ニングすることによって単離されたか、ツメガエルＦ−スポンデイン遺伝子は、 全胎児ｃＤＮＡライブラリーを低い厳格さてスクリーニングすることによって単 離された。両者共、ラットドースボンデインのコーディング領域に由来するプロ ーブを用いた。

ヒトドースポンディン遺伝子に関しては、う・ノド及びヒトは何れも吐乳類であ るから、う・ソトとヒトとの間の相同性の種度はむしろ大きいと思われる。この ようなりローニッグのためには、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（クローンテ ・ンク社から入手可能）およびヒト・ゲノムライブラリーを用０ることができる 。ヒト・ライブラリーの１夏製されたフィルターが、ラットドースポンディンか ら誘導され、放射能ラベルされたプローブを用いてスクリーニングされ得る。複 数の種の間のＦ−スポンデインの相同性は全コーディング領域１こ亘っているか ら、該プローブはコーディング領域を包含しし）でよい。ヒト・ライブラリーを 含むフィルターは、低０厳格さて該プローブと／＼イブリダイズされ（Ｓａｍｂ ＋ｏｏｋ　ｅｌ　ａｌ、、　１９８９）、陽性クローンは更に、当業者に周知の ＤＮＡ配列決定技術によって分析されるであろう。

本発明は、Ｆ−スポンデインをコードする核酸分子の配列内に含まれる配列（例 えば、図５および配列認識番号９１こ示される配列内に含まれるコーディング配 列）と特異的１こ／＼イブリダイズできる、少なくとも１５ヌクレオチド′の核 酸分子を含む核酸プローブを提供する。ここて用０る「特異的（こ）λイブリダ イズする」の用語は、核酸分子かそれ自身の配列１こ対して相補的な核酸配列を 認識して、相補的な塩基対間の７に素結合を介して二重螺旋セグメントを形成す る、核酸分子の能力を意味する。核酸プローブ技術は当業者に周知であり、彼等 は、この様なプローブは長さかが極めて大きく変化し得るること、並びにプロー ブの検出を容易にするために放射性同位元素または蛍光色素のような検出ラベル で標識され得ることを容易に承認するであろう。ＤＮＡプローブ分子は、当該技 術において周知の方法を用いて、Ｆ−スボンディンをコードするＤＮＡ分子をプ ラスミド又はバクテリオファージのような適切なベクター中に挿入し、続いて適 切なバクテリア宿主細胞中に形質転換し、形質転換されたバクテリア宿主細胞中 で１夏製し、ＤＮＡプローブを回収することによって製造され得る。或いは、プ ローブはＤＮＡ合成機で化学的に生成され得る。

このプローブは、この遺伝子を発現する組織を捜し出すための「ｉｎ　５ｉｌｕ 　Ｊハイブリダイゼーションのために、或いは種々の生物学的組織における該遺 伝子またはそのｍＲＮＡの存在を調べる他のハイブリダイゼーション試験のため に有用である。

また、上記の単離された核酸分子を含むベクターも提供される。適切なベクター にはプラスミドまたはウィルスが含まれるが、これらに限定されるものではない 。これらのベクターは適切な宿主細胞中に形質転換され、Ｆ−スボンディンの生 物学的活性をもったポリペプチドを製造するための宿主細胞ベクター系を形成す る。

本発明は更に、上記の単離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子であって、宿主細胞 かバクテリア細胞（例えばＥ、ｃｏｌｉ）、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞およ び動物細胞からなる群から選ばれるＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を提供する。適切 な動物細胞にはＶｅｔｏ細胞、ＢｔＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞および種 々の一次咄乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、発現されたＦ−スポンディン蛋白を同定し、精製する方法を提供する 。まず、ｍｙＣエピトープがＦ−スインディン蛋白中に導入された。ｍｙｃスポ ンディンを有するこのＦ−スポンディンは発現ベクターに連結され得る。このよ うなベクターは、細胞をトランスフェクトするために用いられ、該細胞中のＦ− スポンディンの分布は、導入されたｍｙｃエピトープに反応することが知られて いるｍｙｃ抗体を前記トランスフェクトされた細胞（ｍｙｃエピトープを有する Ｆ−スポンディンを発現している）と反応させることによって検出することかで きる。このｍｙｃエピトープの利点を用いれば、Ｆ−スポンディンは該ｍｙｃエ ピトープに結合する抗体アフィニティーカラムによって精製され得る。

一つの実施例において、ｍｙＣエピトープはラットドースポンディンのＮｃｏ１ 部位に導入される。その後、ラットドースポンディンのｓｍａｌ　（１２５）　 、Ｄｒａ　（２７３１）フラグメントが単離された。Ｂｇ１２リンカ−が付加さ れ、該フラグメントはｐｃＤＮＡ−ｎｅｏ　（イン・ビトロジーン社）の１３ａ ｍＨ１部位にサブクローン化された。該遺伝子の５′末端は、Ｔ７ＲＮＡプロモ ータの近くに位置付けられる。得られたプラスミド（ｐｃＦＰ５．ｍｙｎ）は、 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の規定に従って 、１９９２年３月１９日に、アメリカ合衆国メリ・−ランド州２０．８５２０ツ クウイル・１２３０１パークローンドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。このプラスミドｐｃＦＰ５、ｍｙｎ には、ＡＴＣＣ受付番号７５２１６が付与された。

上記では、Ｆ−スポンディンを同定および精製するためにｍｙｃエピトープを使 用したが、ｍｙｃエピトープのみに限定されるものと解釈されてはならない。特 異的な抗体に関連した、当業者に周知の他のエピトープも同様に用いることがで きる。

本発明によれば、Ｆ−スポンディンの完全な蛋白の配列もまた提供される（配列 認識番号１．０，１．２）。一つの実施例においては、完全なラットピースポン ディン蛋白の配列が開示される（配列認識番号１０）。他の実施例においては、 完全なニワトリピースポンディン蛋白の配列が提供される（配列認識番号１２） 。更に別の実施例においては、部分的なツメガエルＦ−スポンディン蛋白の配列 もまた提供される（配列認識番号１４）。

本発明によれば、更に、精製されたＦ−スポンデインポリペプチドが提供される 。ここで用いる「精製されたＦ−スポンディン」の用語は、単離された天然に存 在するＦ−スポンディンまたは蛋白（天然物から精製され、或いは一次構造、二 次構造、三次構造および翻訳後の修飾が天然物と同じになるように製造されたも の）、並びに一致した一次構造（即ち、アミノ酸残基の連続的な配列）を有する 天然には存在しないポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドには、誘 導体または類縁体が含まれる。

このようなＦ−スポンディンは、軸索の付着および伸長のために有用であろう。

従って、本発明はまた、神経細胞をマトリックスに付着させる方法であって、該 マトリックスを、神経細胞および該細胞のマトリックスへの付着を起こさせるの に有効な濃度の精製されたＦ−スポンデインに接触させることを具備した方法を 提供する。

この様な濃度を決定する方法は、当業者に周知である。Ｆ−スポンディンの濃度 の影響は、前記マトリックスおよび神経細胞似たいして、異なった濃度の精製Ｆ −スポンデインを使用することによって決定され得る。１ｉり記マトリックスと 神経細胞との付着か観察される濃度が、有効濃度である。

本発明は更に、神経細胞の成長を刺激する方法であって、神経細胞を、神経細胞 を刺激するのに有効な濃度の精製されたＦ−スポンディンに接触させることを具 備した方法を提供する。

本発明は又、対象中において神経細胞を再生する方法であって、該対象に対して 、対象において神経細胞を再生するのに有効な濃度の精製されたＦ−スポンデイ ンを投与することを具備した方法を提供する。

最後に、本発明は神経細胞の成長を刺激するための薬剤組成物であって、薬剤的 に許容され得るキャリアと、神経細胞の成長を刺激するのに釘効な濃度の精製さ れたＦ−スポンデインとを含有する組成物を提供する。

本発明の目的において、「薬剤的に許容され得るキャリア」とは、何れかの標準 的な薬剤担体（ｐｂａｒｍｊｃｅｕｌｉｃａｌ　ｙｅｈｉｃｌｅ）を意味する。

当該技術において周知の適切な担体の例には、燐酸緩衝生理食塩水溶液、ポリソ ーブ（Ｐｏｌｙ＋ｏ＋ｂ）　８０を含有する燐酸緩衝生理食塩水、水、浦／水エ マルジョンのようなエマルジョンおよび種々のタイプの湿潤剤が含まれるが、こ れらに限定されるものではない。

本発明は、以下に述べる実験の詳細を熟読することによって、より深く理解され るであろう。しかし、以下で議論される具体的な方法および結果は、後述の請求 範囲により完全な形で記載される本発明の単なる例示に過ぎないことを、当業者 は容易に承認するであろう。

〔実験の詳細〕

く実験手法〉 ライブラリーの構築およびスクリーニング胎児日齢（Ｅ）１３のフロアプレート および後部を髄ポリ（Ａ）＋選択ＲＮＡがら、指向性のｃＤＮＡライブラリー（ ｄｉｒｅｃｌｉｏｎａｌ　（ＤＮＡ　ｌｉｂ＋ａ＋ｉｃ＋）が、ラムダＺＡＰＩ Ｉ　（Ｓｌ用ａｇｅｎｅ社）中に構築された。このｃＤＮＡ挿入物の５′末端は Ｔ３・ＲＮＡポリメラーゼプロモータの下流側に位置付けられ、また３″末端は Ｔ７・ＲＮＡポリメラーゼプロモータの下流側に位置付けられた。プレート溶菌 法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｌ　ａｔ、、＋９８９）を使用して、このライブラリ ーからＤＮＡが調製された。該ＤＮＡはＸｈｏｌによって直線化され、Ｔ３φＲ ＮＡポリメラーゼ（Ｓｆ＋ａｌａｇｅｎｓ社）によってＲＮＡが転写された。こ の後部を髄ライブラリー由来のＲＮＡは、ＵＴＰで１：１０に希釈されたＵＴＰ ビオチン（Ｃｌｏｎｔｅｃ社）の存在下で転写された。第−鎖ｃＤＮＡが、オリ ゴｄＴ−Ｘｈｏｌリンカ−（ＳＩｒａｌａｇｅｎｅ社）を使用して、Ｔ３フロア プレートＲＮＡから転写された。

第−鎖フロアプレー１−ｃＤＮＡと、後部Ｔ３ビオチン化ＲＮＡとの間の溶液ハ イブリダイゼーションが、５ａｖｅ　ａｎｄ　Ｓｔ。

Ｊｏｈｎ　（１９８８）が記載したようにして行なわれた。約１μｇのＣＤＮＡ が、３０倍モル過剰のＲＮＡとハイブリダイズされた。核酸を、５０ｍＭ−ＨＥ ＰＥＳ　（ｐＨ７，６）、０．２％ＳＤＳ、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、５００ｍＭ−Ｎ ａＣ１を含むハイブリダイゼーション緩衝液１０ｕｌ中に溶解し、６８℃でイン キュベートした。これらの条件下において、１００よりも大きいＣｏＴ値か１号 られだ。このハイブリダイゼーション混合物を、ＳＤＳを合釘しないハイブリダ イゼーション緩衝液で６０μｌに希釈し、１０μｇストレプトアビジインを添加 した。ｃＤＮＡ／ビオチンＲＮＡのハイブリッドを、フェノール・クロロフォル ム抽出により除去した。残留した一本鎖ｃＤＮＡを単離し、上記のようにして、 ３００倍過剰のビオチン化ＲＮＡとハイブリダイズさせた。−回目のハイブリダ イゼーションでは最初に用いたｃＤＮＡの約１０％が回収され、二回目のハイブ リダイゼーションでは約１５−２０％が回収された。

この減じられたｃＤＮＡは、オリゴｄＴ−Ｘｈｏｌリンカ−プライマーおよびＳ 　Ｋプライマ（ＳＩｔａｌＢｅｎｅ社）を使用して、２０サイクルのＰＣＲ反応 に供された。このＰＣＲ反応の生成物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌによって切１ 折し、セファクリルＳ−３００スピンカラムＣＰｂａｒｎａｃｉａ社）によッテ 、プライマーおよびフランキング配列を除去した。この挿入物を、ラムダＺＡＰ ＩＩのアーム中にクローン化した。

減じられたフロアプレートライブラリーの１反型フィルターを、フロアプレート および後部を肺由来の放射綿様１識された第−鎖ｃＤＮＡてスクリーニングした 。Ｉｏｏｎｇのｍ　ＲＮ　Ａを、５０ｍＭ−Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ８，３）　、 ］ＯｍＭ・ＭｇＣ］、。

１５０　ｍＭ−ＫＣＩ、１．０　ｍＭ・ｄＧＴＰ、１．０　ｍＭ−ｄＴＴＰ、１ ００　ｔｔ　Ｃｉ　［”Ｐ］　ｄＡＴＰ　（３（１（］（Ｉｃ　ｉ／ｍｍｏ　ｌ 　）、ＩＣｌＣｌ　；ｔｃ　ｉ　［”Ｐ］　ｄＣＴＰ　（３００ＣＩＣｉ／ｍｍ ｏ　Ｉ）　、１１）Ｃ１ｍｇ／ｍｌオリゴｄＴ、］ＯｍＭ　＃ＤＴＴ、１０単位 のＲＮａｓｉｎ（？ｏｍｅｇａ社）、２０単位のＭｕｌＶ逆転写酵素（ＢＲＬ社 ）中において、３７℃で３０分間インキュベートした。４Ｘ１０３　。

の組換ファージをブレーティングし、スクリーニングした。

ハイブリダイゼーションおよび洗浄は高い厳格さで行なわれた（Ｓａｒａｂｔｏ ｏｋ　ｅｌ　ａｌ、　１９８９　）　ｏフロアプレートｃＤＮＡプローブは、２ ４のファージと選択的にハイブリダイズした。交差ハイブリダイゼーション分析 によって、これらはＦＰ２゜ＦＰ５．ＦＰ２４と命名される三つの異なるｃＤＮ Ａに相当することか明らかとなった。ｉｎ　ｔｉｆｕハイブリダイゼーションに よって、を髄での発現パターンが決定された。ＦＰ２およびＦＰ５はフロアプレ ー１・で選択的に発現されたのに対して、ＦＰ２４はフロアプレート、ルートプ レートおよびを髄の脳室領域で発現された。フロアプレートに富むライブラリー 及びフロアプレートライブラリーとを、フロアプレートで選択的に発現される（ ＭｃＫａｎｎａ　＆　Ｃｏｈｅｎ、　１９８９）　Ｆ　Ｐ　２、ＦＰ５およびＦ Ｐ３５でスクリーニングすることによって決定された富化濃縮の程度は、約５０ 倍である。

ＲＮＡ　トランスファー分を斤 ＲＮＡ−Ａｚｏｌ法（Ｂｉｏｌｅｘ　Ｌａｂｏ＋ａｔｏ＋ｉ！ｓ社）を使用して 、種々の組織から全ＲＮＡを調整し、次いでオリゴ（ｄＴ）セルロースマトリッ クスを通過させることにより、ｐｏｌｙ（Ａ、　）＋含む転写物を濃縮した。Ｒ ＮＡ　）ランスファーは、丁ｂｏｍａｓ　［１９８０）によって記載されたよう にして行なった。ランダムブライミング（Ｆｒｅｉｎｂｅｒｇａｎｄ　Ｖｏｇｅ ｌｓｔｅｉｎ、１９８４）によってプローブをラベルし、標準の条件下でハイブ リダイズし　ノこ。

ＤＮＡのシーケンシングおよび分析 ｃＤＮＡ挿入物は、Ｂｌｕｅｓｃ＋ｉｐｌプラスミド（Ｓｌ＋ａｆａｇｅｎｅ社 ）として直接切出された。該挿入物のヌクレオチド配列は、二本鎖および一本鎖 ＤＮＡの両方をＴ７・ＤＮＡポリメラーゼ（商品名５ｅｑｕｔｎａｓｅ　；合衆 国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の鋳型として用い、ディデオキシ・チェインタ ーミネーションｉ　（ＳａｎｇｅＩｅ＋　ａｌ、　１９７７　）によって決定さ れた。全コード領域のヌクレオチド配列は、両方の鎖をシーケンシングすること により決定された。配列は、ＭａｃＶｅｃｌｏｔ　（ＩＢＩ）プログラムを使用 して、アップル社のマソキントソシュコンピュータ上で組み立てらＩｎ　５ｉｆ ｕハイブリダイセーシヨンは、以前に報告されたようにして（Ｗｉｌｋｉｎｓｏ ｎ　ｅｌ　ａｔ、、１９８７）　、Ｔ３又はＴ７−ＲＮＡポリメラーゼに誘導さ れた、Ｆスポンデインの３′未翻訳領域（ｎ　ｔ　３３５９−４０２９　）もし くはＴＳＲｓの３′未翻訳領域（ｎ　ｔ　１５４５−２６２６　）を含む［”Ｓ Ｊ　ＵＴＰて杼識された一本鎖アンチセンスＲＮＡプローブを使用して行なわれ た。露出時間は、４から１４０の範囲であった。センスプローブを対照として使 用した。

ホールマウント（ｗｈｏｌｅ　ｍｏｕｎｔ）　Ｉｎ　５ｉｌｕハイブリダイゼー シヨンのために、Ｅｌｌラットの胎児を０．１Ｍ−ＭｏＰＳ、２ｍＭ−ＥＧＴＡ 、１ｍＭ−ＭｇＳＯ４，３，７％ホルムアルデヒド中で２時間固定した。Ｉｎ　 ５ｉｌｕハイブリダイゼーシヨンは、下記の若干の改変を加えたが、本質的には ｇａｒｌａｎｄ（＋９９１）による記載のようにして行なった。即ち、ハイブリ ダイゼーション混合物に添加する前に、抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂｏｅｈ＋ｉｎ Ｂ＋　ｔＪａｎｎｈｔｉ社）をＥ１４ラットのアセトン粉末（１％）　（Ｈａｒ ｌｏｔおよびＬｉｎｅ、１９８８）に予め吸収させた。色素産生反応を１−２時 間行なった。

ＤＮＡ構築物 次のようにして、ｍｙｃエピトープが導入された。配列：５−−ＣＴＡＧＣＧＡ Ｃ；ＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＣＡ−３′　（配 列認識番号１）、及び５−−ＣＴＡＧＴＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＡＴ ＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧ−１”　（配列認識番号２）を有する二つの部分的 相補性のオリゴヌクレオチドをアニールして、５ｐｅ１部位に隣接したＣ−ｍ） ７ＣプロトオンコジーンエピトープＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ　（配列認識番号３） をコードしている二本鎖ＤＮＡ断片を得た。該断片をＦ−スポンディンのユニー クな５ｐｅ１部位（ｎ　ｔ　１３６５）にクローン化した。

同じエピトープを、オリゴヌクレオチド：　５−−ＣＡＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡ ＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＣＧ−３Ｍ配列認識呑号４）、および５ −−ＣＡＴＧＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣ；ＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣ ＴＣＣ−３−（配列認識番号５）を使用して、Ｎｃｏ１部位（ｎ　ｔ　１５７５ ）にも導入した。この結合されたＦ−スポンデインＤＮＡを、発現ベクターｐＭ Ｔ２１　（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｌｉｌｖｌｅ社から提供された）もしくは ｐ　ｃ　ＤＮＡ　−１（ｉｎ　ｖｉｌ＋ｏｇｅｎ社）中にサブクローン化した。

ｃｏｓ細胞トランスフェクション ＣＯＳ細胞は、ＤＥＡＥデキストラン法によって、次のようにトランスフェクト された。集密度８０％の一晩培養物が、１００　ｍｍの培養皿あたり５μｇのＤ ＮＡでトランスフェクトされた［２５０　μｇ／ｍ　１のＤＥＡＥデキストラン （Ｐｈａｍａｃｉａ社）、１００　ｍＭφＴｒ　ｉ　ｓ　（ｐ）ｉ７１　）中、 ＤＭＥＭ中］。６時間後、細胞を洗浄し、ＤＭＥＭＩＯ％牛血清、０．１ｍＭク ロロキニン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社）中で２．５時間インキュベートし、続いてＤ　 Ｍ　Ｅ　Ｍ　ｌ　Ｏ％牛血消中で一晩インキユベートした。

Ｆ−スポンデインを単離するために、細胞は、培地をＯＰＴｌ−ＭＥＭ（ＢＲＬ ）に変えて４８時間インキュベートされた。

Ｃｏｓ細胞の代謝的標識化および免疫沈殿トランスフェクトされたＣＯＳ細胞を 、メチオニンを含まないＤＭＥＭ　（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯ社）中で予備インキュ ベートした。

３７°Ｃて１時間インキュベートした後、２５０ｕｃｉ／ｍｌの［”Ｓ］　メチ オニン（Ｎ　Ｅ　Ｎ）を添加し、細胞を更に３時間インキュベートした。この培 地を採集し、抗−ｍｙｃ抗体（ＭＡｂ・９Ｅ１０）と共に１時間インキュベート した。免疫１夏合体か、固定化されたスタフィロコッカス・アウレウスを用いて 一時間沈殿された。ペレットは、１×サンプル緩衝液で懸濁させるｍｊに、ＰＢ Ｓで三回洗浄された。免疫沈殿された３５Ｓ標識蛋白は、１０％ポリアクリルア ミド・ゲル上で電気泳動した後に可視化された。

免疫細胞化学 ｃ−ｍｙｃエピトープに結合されたＦ−スポンデインが、ＭＡｂ　・９Ｅ　１０ 　（Ｅｖａｎ　ｅｌ　ａｌ、、１９８５　）で検出された。蛍光化されたアイソ タイプ特異的な第二抗体（Ｂｏｅｈ「ｉｎｇｕ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社：ヤギ抗マ ウスＩｇＧ）を、希釈率１　：　１００で使用した。免疫蛍光標識化（Ｄｏｄｄ 　ａｎｄ　Ｊｅｔｓｅｌｌ、１９８５）のために、培養物をＬｉ５を用いて２２ °Ｃで１回洗浄し、次に２２℃で３０分間、第一抗体と共にインキュベートした 。次に、培養物をＬｉ５−１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で二回洗浄し、Ｌｉ５− １％ＮＧＳ中に希釈されたＦ　ＩＴＣ結合イソタイプ特異的二次抗体と共に、２ ２°Ｃで３０分間インキュベートした。培養物を二回洗浄し、０．２Ｍリン酸緩 衝液（Ｐ　Ｂ）中の４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定化し、０．１２Ｍ −ＰＢで濯ぎ、０．２Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ　Ｈ９，０）、グリセロール（１： 　１）中で０，０５％のパラフェニレンジアミン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社）中でカバ ーグラスをかけた。エビ蛍光（ｅｐｉｌｌｕｏ＋ｅｓｃｅｎｃｅ）下において、 培養物はツアイス社のアクジオプラン（＾ｘｉｏｐｌｘｎ）顕微鏡上で観察され た。

細胞培養 胎児日齢（Ｅ）１Ｂのラットからを髄を切除し、これを４°ＣのＬｉ５培地に入 れた。を髄の後部領域を切除し、８ｍｇ／ｍｌのグルコースを補給したＣ　ａ　 ”／Ｍ　ｇ　２＋を含まない改良必須培地（Ｓ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ）　（Ｇｉｂｃｏ 社）中において、０．０５トリプンン（Ｇｉｂｃｏ社）と共に２０分間インキュ ベートした。

次に、組織をＳ−ＭＥＭで洗浄し、粉砕して単一の細胞懸濁を得た。を髄細胞を 、適切な基質上の３５ｍｍ組織培養皿にプレートし、Ｎ３添加物（Ｆ　１２−Ｎ ５）　（Ｒｏｍｉｉｉｎ　ｅｌ　ｍｌ、。

１９８２）を補給したＨａｍのＥ１２培地（Ｇｉｂｃｏ社）中において、５％の 二酸化炭素で湿潤させた３７℃のインキュベータ内で、１０６細胞／皿の密度に まで増殖させた。後部ルート神経節をＥｌＢのラットから切除し、上記記載のよ うにして処理した。細胞を０．１トリプシンと共にインキュベートし、１００　 ｎ　ｇのＮＧＦを補給したＦ１２−Ｎ３と共に４Ｘ１．０’／皿の密度でプレー トした。

神経突起の伸長分析 ５Ｘ１０１０ｃｏｓ細胞にｐＦＰ５ｍｙＮをトランスフェクトし、馴し培地を採 集した。Ｆ−スポンデイン１′′を、モノクローナル抗−ｍｙｃ　（９Ｅ１０） のアフィニテイカラムで精製した。アフィニティー精製ｔ、たＦ−スポンデイン ｆｆ１ｙｅ（２０μｌ／ｍｌ）を、ニトロセルロース（Ｌｅｍｍｏｎ　ｅｌ　ａ ｔ、。

１９８９　）に吸収させた。対照として、親ＣＯＳ細胞でコンディショニングし た培地を同じカラムで精製し、ニトロセルロース上での基（として使用した。次 いで、このニトロセルロースは、ハックグラウンドの神経突起伸長を更に制御す る、子牛血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）でブロックされた。

Ｅ１４後部ルート神経節（ＤＲＧ）ニューロンを、固定化された蛋白基質上に２ 〜ｌ０ＸＩＯ’細胞／３５＋ｎ＋ｎ組織培養皿（Ｎｕｎｃ、３５ｍｍ径）の密度 でプレートし、１４時間増殖させた。次に、培養物を４％のパラフォルムアルデ ヒド中で固定化し、０．１％Ｔ＋１ｔｏｎ　Ｘ−１００で透過性とした後、神経 繊維に結合した蛋白を認識して微小神経突起のマーカとして働くＭＡ　ｂ　・３ Ａ　１０　（Ｆｕｒｌｅｙ　ｅｌ　ａｌ、、　１９９０　；　ＤｅｖｅｌｏｐＩ ｌｌｅｎｔａｌ　５ｌｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂ＋ｉｄｏｍａ　Ｂａｎｋから入手可能 ）を用いて染色した。

神経細胞体および神経突起は、間接的免疫蛍光によって、ツアイス社のＡｘｉｏ ｐｌａｎ顕微鏡で可視化された。神経突起の長さは、体幹（ｓｏｍａ）　（３Ａ 　１０蛍光で明瞭に示される）の縁から一番長い神経突起の先端までの距離とし てＪｌｌ＋定される。神経突起の長さは、神経突起の全長が明瞭に確認された場 合にのみ測定された。蛋白質て波頂された各領域（３−４ｍｍ’）内において、 約２５の神経突起が測定可能であった。

付着分析 分離されたＥ１Ｂ後部髄細胞を、固定化された蛋白質基質上に、１０６細胞／３ ５ｍｍ組織培養皿（Ｎｕｎｃ、３５ｍｍ径）の密度でプレートした。１時間後、 培養物をｐＰＢＳで２回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド中で固定化した。

細胞をツアイス社のＡｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いて４００倍の拡大率でカウン トした。各実験において、独立した１０個の計測がなされた。フロアプレー）・ は、を椎動物神経系の発達における細胞パターンおよび軸策成長の制御に関与す ると考えられる過渡的神経細胞である。

く実験結果〉 細胞分析によって、フロアプレートは、を髄の胎児発達段階において幾つかの特 異化された信号機能を持っていることがわかった。フロアプレートから誘導され る信号は、蛋白質（そのｍＲＮＡがフロアプレートに限定されて存在するかある いはフロアプレートに高度に富化されている蛋白質）によってコードされている ようだ。このような分子を確認するために、減法ハイブリダイゼーション技術を 用いて、胎児日齢（Ｅ）１Ｂのラット胎児（図２および実験手法参照）中で、フ ロアプレートによって発現されるが後部を髄によっては発現されないｃＤＮＡク ローンが単離された。このスクリーニングで同定された、ＦＰ５と命名されたｃ ＤＮＡの一つクローンは、Ｅ１３ラットのフロアプレート（図３Ａ）に由来する ポリ（Ａ）＋選択ＲＮＡ中の４．５ｋｂおよび４．７ｋｂの二つの主な転写物と ハイブリダイズする、０．５ｋｂの挿入物を含んでいた。同じ二つの転写物に対 する非常に弱いハイブリダイセーションか、Ｅ　１．３後部を髄（図３Ａ）およ び出生後年（Ｑｅ（Ｐ）０の脳（図３Ｃ）由来のＲＮＡ中で検出されたが、成人 肝臓および１稗蔵（図３ＡＳＣ）由来のＲＮＡとのノ＼イブリダイセーションは 見られなかった。Ｅ１３ラットを髄中におけるＦＰ５転写物の発現の特異性は、 ｉｎ　１ｉｌｕ　／Ｓイブリダイセーンヨン組織化学で確認された。このハイブ リダイゼーション組織化学は、ＦＰ５・ｍＲＮＡかフロアプレートでは非常に多 く発現されるか、Ｅ１Ｂラットのを髄（下記参照）の後部領域では検出できなな いことを示している。これらの研究は、ＦＰ５の転写物かフロアプレートに高度 に富化濃縮されていることを示唆している。

ＦＰ５クローンからの該０．５ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を用いて、Ｅ１３ラットの フロアプレートｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、幾つか の追加のｃ　ＤＮＡクローンを確認した。そのうちで、クローンＦＰ５−９は、 ４ｋｂの挿入物を含んでいた。ＦＰ５−９のｃＤＮＡは、従来の翻訳開始配列（ Ｋｏｘａｋ、１９８４　）に関連したヌクレオチド２２６のメチオニンコドンで 始まり、ヌクレオチド２６４６　（図５Ａ）の停止コドンＴＧＡで終わる単一の 長い読み取り枠を含んでいる。推定翻訳開始部分の上流には、枠内メチオニンコ ドンは見られない。また、３つの読取り伜の全てにおいて、開始部位の配列５′ は停止コドンを含んでいる。別々に単離された他の幾つかのＦＰ５・ｃＤＮＡサ ブクーロン（全コード領域に亘っている）をシーケンスしたところ、読取り枠の ヌクレオチド配列に何等かの相違が存在することは明らかにされなかった。

読取り伜ＦＰ５−９の翻訳によって、９０．７６６ダルトンの分子伝を有する８ ０７アミノ酸の蛋白と、一致したシグナル蛋白切断部位（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ 、＋９８５＋を何するＮ末端の疎水性り一夕配列（図５Ａ、配列認識番号９）か 予測される。他には疎水性残基の長い伸張部か観察されないから、この蛋白は膜 通過ドメインを持っていないことが示唆される。ＦＰ５−９のアミノ末端ドメイ ンは、咄乳類のサブステイリジン様切断酵素（Ｓｔｅｉｎｅ＋、　１９９１）に よる蛋白分解プロセッシング部位となる、纏まった塩基性残基領域（残基１３８ −１４２　）を含んでいる。

更に、予測蛋白には、三つのＮ−結合グリコシル化部位（図５Ａ）が含まれてい る。これらの特徴を総合すると、ＦＰ５−９のｃＤＮＡは分泌性蛋白をコードし ていることが示唆さ細胞と基質との接着分子の構造的特質を有するＦＰ５−９で コードされる蛋白の推定アミノ酸配列分析によって、アミノ酸配列が二つの主要 ドメイン（図６）に分離され得ることが示される。４４０残基のＮ　Ｈ２末端ド メインは、１０のシスティン残見を含み、遺伝子バンクのデータベースの他の蛋 白とは全く配列の相同性を示さない。この蛋白のＣ００Ｈ末端は残Ｍ４４１−８ ０７に亘っており、保存されたンステイン残基、トリプトファン残基およびアル ギニン残基（図６８．Ｃ）に基づいて並ばせ得る、長さ５５−５９アミノ酸のド メインの６回の繰り返しを含んでいる。

同様のドメインか、少数の蛋白質に存在している（Ｐａｌｌｈｙ、１９８８；　 Ｓａ＋ｉｌｈ　ｅｌ　ａｌ、、１９９１）　。特に、トロンホスホンテイジン１ およびＩＩ遺伝子によってコードされる接着性糖蛋白（Ｌａｗｌｅｒおよび１ｉ ｙｎｅ５　１９８６：　Ｂｏ＋ｎ５ｌｅｉｎ　ｅｌ　ａｔ、、１９９］）は、各 々、トロンポスポンディン・Ｉ型すピート（ＴＳＲｓ）と命名されたこれらドメ インの３つを有している（Ｌａｗｌｅｒ　ａｎｄＤｙｎｅｓ、１９８６）　（図 ６０）。二つのＴＳＲｓは、択一的な補体カスケードの蛋白Ｃ６−Ｃ９中に見ら れる。一つは、各蛋白のＮＨ２末端ドメインにあり、一つはＣ０ＯＨ末端にある （ｔｌａｅｌｌｉｇｅｒ　ｅｌ　ａｌ、、１９８９；　Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ 、、１９９１　）　ｏ更に、補体結合蛋白であるプロパージン（ｐｒｏｐｚ＋ｄ ｉｎ）には、蛋白の８０％を構成する６つのＴＳＲｓが含まれる（Ｇｏｕｏｄｉ ｓ　ｘｎｄＲｅｉｄ、１９８８）。これらのを椎動物蛋白に加え、ＴＳＲの中芯 部は、マラリア性の環状スポロゾイト（ｃｉ＋ｃｕ＋ｎ５ｐｏ＋ｏｚｏｉｌｔ） （ＣＳ）の領域■および他の形質胞体蛋白（図６Ｃ）　（Ｒｉｃｈｅｌ　ａｌ、 、１９９０；　Ｒｏｂｉｏｎ　ｅｌ　ａｌ、、１９８８）と類似しており、これ は寄生性感染の初期段階において、マラリア性スポロゾイトと宿主細胞との結合 を仲介しているように思われる（　Ｄｘｎｕｅｔ　ａｌ、、　１９８４）　ｏ最 後に、二つのＴＳＲｓはＣ，ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｕｎｃ−５に存在しており、 これは、ニューロンのサブセットにおいて軸策の誘導を調整すると思われる（Ｈ ＋ｄＢｃｏｃｋｅｌ　ａｔ、、１９９０；　Ｃｕ１ｏｌｌｉ　ｅｌ　ａｌ、、１ ９９１）　、　ＦＰ５−９によってコードされる蛋白のＴＳＲｓ中におけるンス チンおよびトリプトファン残基の構成は、Ｃ６−Ｃ９補体蛋白のＮＨ，末端ＴＳ Ｒｓにおける該構成と類似していない（図６Ｂ）。しかしなから、ＦＰ５−９に おけるＴＳＲｓの中心領域（残基１４−１９）は、トロンポスポンディン、プロ パージンおよびマラリア性Ｃ８蛋白のＴＳＲｓ中心領域と殆ど類似している（図 ６Ｂ）。我々は、フロアプレートにおけるの高度の発現レベル（下記参照）と、 ＴＳＲｓの存在とを反映させて、ＦＰ５−９遺伝子をＦ−スポンデインと名付け た。

トロンポスポンディン中のＴＳＲｓは、様々な異なる細胞タイプの接着を促進す る（Ｐ＋ａｌｅ＋　ｅｌ　ａｌ、、）。同様に、プラスモデイウムｖｉｖａｘ　 Ｃ５蛋白のＴＳＲ中心領域は、ｉｎ　ｖｉｌｒ。

において、ヒト造血細胞系の付着を促進する（Ｒｉｃｈ　ｅｌ　ａｌ、。

＋９９０　）。この共通したモチーフ内に含まれるアミノ酸配列ＶＴＣＣは、Ｃ ８蛋白の細胞接着特質に決定的に重要である。

ＶＴＣＧ配列（配列認識る号６）は、細胞接着を促進するトロンポスポンディン の二つのＴＳＲｓにも存在する（Ｐ＋ａｌｅ＋ｅｔ　ａｌ、、）。驚くべきこと に、Ｆ−スポンデインの第４ＴＳＲにはＶＴＣＧが存在し、またＦ−スポンデイ ンの第２および第３ＴＳＲｓは、単一の保存性置換によって変化する配列（ｖｓ ｃｃ、配列認識参５シフ、ＡＴＣＧ配列認識呑号８）を含んでいる（図６Ｂ）。

これらの所見は、Ｆ−スボンデインのＴＳＲｓが細胞接着を媒介する可能性があ る事を示している。ＶＴＣＧ配列を含んだ細胞接着および認２に関係する他の蛋 白を遺伝子バンクのデータベースでサーチすることにより、Ｖ−ＣＡＭＩ　（ｔ ｌｅｓｓｉｏｎ　ｅｌ　ａｌ、１９９＋）およびＶＬＡ４インテグリンａサブユ ニット（Ｔａｋａｄａ　ｅｌ　ａｌ、、１９８９　）を確認した。

Ｆ−スポンデインの推定アミノ酸配列の分析によって、該蛋白の機能的特質に貢 献するかもしれない幾つかの他の構造的特質か明らかになった。第５および第６ ＴＳＲｓの間に挿入された荷電領域には、細胞外７トリックス糖蛋白であるＳ− ラミニン（Ｈｕｎｔｅｒ　ｅｌ　ａｌ、、１９８９ａ、ｂ）において、神経細胞 接着部位として機能することか分かっている配列ＬＲＥか含まれている。Ｆ−ス ポンデインの第１、第３、第５および第６番目のＴＳＲｓは、蛋白とヘパリンお よび他の硫酸グリコリルアミノグリカン（Ｃａ＋ｄｉｎおよびＷｅｉｎｌ＋ａｕ ｂ、１９８９　）との結合に関わる塩基性残基群を含んでいる。また、Ｆ−スポ ンデインの第１、第４、および第５呑月のＴＳＲｓは、毛様体ニューロトロフィ ック因子（ＣＮＴＦ）　、白血病阻害因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）　、インターロイキン 類（Ｉ　Ｌ　ｓ）　２〜７　（ｌａｚａｎ。

１９９０；　Ｄａｖｉｔ、ｅｌ　ａｌ、、１９９］；　ＰｘｔｌｈＬ　１９９０ ）等の、幾っがの成長因子および分化因子のための受容体に見られる変異フィブ ロネクチン１１１型の繰り返し中に存在するｗｓｘｗｓ配列（図６Ｂ）をも含ん でいる。ＩＬ２受容体において、この部位の変異は膜通過信号を阻害するが、こ のｗｓｘｗｓモチーフの機能は不明である（Ｍｉｙａｒａｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、 １９９１）。

Ｆ−スポンデインｍＲＮＡの発現パターンＥ１Ｂ胎児のノーザレンプロット分析 は、Ｆ−スボンディンが、後部を髄よりもフロアプレートにおいて、より大量に 発現されることを示している。ラット胎児の発生段階におけるＦ−スポンディン のｍＲＮＡを、ｉｎ　５ｉｌｕハイブリダイゼーシヨンで局在化することによっ て、Ｆ−スボンディンの分布についてのもっと詳しい情報が得られる。Ｆ−スポ ンディンのｍＲＮＡは当初、Ｅｌｏ、５において、将来は中脳、後胴およびを髄 となるレベルにある、神経管の腹側中心線に位置する細胞中で検出された（図７ ）。この段階において、神経管の腹側中心線にある細胞は、フロアプレート分化 の抗原マーカーは検出されなかったが、フロアプレートに誘導される化学誘引活 性を獲得していた（Ｐｌａｃｘｅｋ、ｓ＋　ａｔ、、１９９０ｃｌ。

従って、Ｆ−スポンデイン・ｍＲＮＡの発現は、フロアプレートの分化の初期分 子マーカーを提供する。

Ｆ−スポンデイン・ｍＲＮＡの発現は、Ｅｌｌ−Ｅ１２）ロアプレートにおいて は高レベルが維持されたが（図７Ｂ）、この段階のを髄および後部の他の領域は 、検出不可能なハイブリダイゼーションレベルを示している。Ｅ１２−Ｅ１３の 場合は、低レベルのｍＲＮＡが腹側角で検出されるが、後部角では、依然として 検出可能なｍＲＮＡは存在しない（図７Ｃ，Ｄ）。加えて、フロアプレートの直 ぐ上の腹側脳室では大量のＦ−スポンデイン・ｍＲＮＡの発現を開始するのに対 して（図７）、を髄の腹側半分の脳室域における細胞へのハイブリダイゼーショ ンは検出できない（図７Ｅ）。このように、Ｆ−スポンデイン・ｍＲＮＡの発現 によって、後部（背側）を髄と腹側を髄における脳室領域細胞間での分子的差異 が明らかになった。最近の研究は、腹側脳室領域が、オリゴデンドロサイトおよ びアストロサイトの前駆細胞の源泉部位であることを示唆している。これら前駆 細胞は横方向および背部側に移動し、を髄の残りを形成する（Ｍｉｌｌｅｒ、１ ９９１）。

Ｆ−スポンデイン・ｍＲＮＡのレベルは、Ｅ１６において、フロアプレートおよ び腹側脳室域では高レベルか維持され、また、この段階までにを髄の腹側および 中間領域の細胞で、著しいハイブリダイゼーションが検出された（図７Ｆ、、Ｇ ）。

ＰＯまでに、フロアプレートのＦ−スポンデイン・ｍＲＮＡのレベルは減少し、 またを髄の他の細胞とのハイブリダイゼーションが増加する結果、Ｆ−スポンデ イン・ｍＲＮＡの均一な発現がもたらされる（図７Ｈ）。Ｆ−スポンデイン・ｍ ＲＮＡはまた、Ｅｌｌ−Ｅ１６の後部および中脳のフロアプレートで優先的発現 するか、胎児の後期段階（表示せず）ては脳中に広く発現されることになる。

胎児のＣＮＳ中におけるＦ−スポンデインの発現に加え、ＥｌｌからＥ１２に進 むにつれて、ハイブリダイゼーションは又、周囲の突出した感覚および運動神経 技に関連して検出される（図７Ｄ）。末梢神経技との関連は、Ｆ−スポンデイン ・ｍＲＮＡかンユワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌｓ）で発現することを示 唆している。末梢神経技に関連したＦ−スポンデイン・ｍＲＮＡの発現はＥ１６ までは続くが、衝の段階は減少して、ＰＯまでには末梢神経で検出されるハイブ リダイゼーションは少ないか全く見られなくなる（図３Ｃ）。これらの結果は、 中枢神経および末梢神経の軸策の初期成長期に亘って、Ｆ−スポンデイン・ｍＲ ＮＡはフロアプレートでより優先的に発現され、末梢神経細胞（多分シュワン細 胞）での発現は低レベルであるとの証拠を提供している。

Ｆ−スポンデイン・ｍＲＮＡは、神経系以外でも発現される。特に、を髄の腹側 中線の下にある中胚葉細胞は、Ｅｌｌから、低レベルのＦ−スポンデイン・ｍＲ ＮＡを発現する（図７Ｄ）。更に、胎児およびＰＯの腎臓（図３０）、肺および 濃縮軟骨（図示せず）は、Ｆ−スポンデイン。ｍＲＮＡを発現する。ＣＮＳ、肺 および腎臓におけるにおけるｍＲＮＡの発現は、出生後および成人においても持 続する（図示せ吐乳類細胞で発現されたときのＦ−スポンデイン蛋白び細胞局在 化を決定するために、二つのエピトープを結合した誘導体（Ｆ−スポンデインｌ ″ｙｅ　）を作製した。これらの夫々（よ、ＭＡｂ＃９Ｅ１０　（Ｅｖａｎ　ｅ ｌ　ａｌ、１９８５）　（図８Ａ）ｉ：よって検出し得るヒトｃ−ｍｙｃプロト オンコジーン由来の１０アミノ酸挿入物を含んでいる。Ｆ−スポンデインｍｙｃ をコートするｃＤＮＡは吐乳類発現ベクターにクローンされ、ｃｏｓ細胞にトラ ンスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞によってコンディショニング された培地中にＦ−スポンデイン・Ｙ゛が存在するかどうかを調べるために、Ｃ ＯＳ細胞を３５８メチオニンで３−４時間ラベリングし、放出された蛋白をＭＡ ｂ・９Ｅ］０て免疫沈殿した。二つの異なるＦ−スポンデイン″ｙ′構築物でト ランスフェクトされたＣＯＳ細胞力１らの免疫沈殿物は、疑似トランスフェクト 細胞（図８Ｂ）：こは存在しない一１１６１ｃＤａの単一１＜／ドを表した。ｃ ｏｓ細胞から抽出される蛋白質の免疫沈殿によって、培地から回収されるＦ−ス ポンデインの曾は細胞に関連した量と等し０ことか示された。従って、ＣＯ５細 胞は、合成されたＦ−スポンデイン゛ｙ′の殆との分画を分泌している。他のｍ ｙｃエピトープ結合蛋白（例えは、ショウジヨウｌく工の皺なし蛋白）は、ＣＯ Ｓ細胞によって合成されるが、培地中では検出されない（Ｋ、Ｂａ５ｌｅ＋、Ｐ ｅｒｓｏｎ２１　ｃｏ＋ｎｍｕｎｉｃａｌｉｏｎ　）　。これ（よ、１名地中の Ｆ−スポンデイン′″ｙ°か損傷細胞からの漏出によるものでないことを示唆し ている。このように、これらｉｎ　ｖｉｌ＋。

条件下では、Ｆ−スポンデイン″Ｙ゛は細胞から分泌される。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されたＦ−スポンデインの見掛けの分子Ｍ（−１ １６ｋＤａ）は、アミノ酸配列から子７１１１１された分子ｆｉｔ（−９０ｋＤ ａ）よりもかなり大きい。分子量におけるこの差異は、部分的には、中核蛋白の グリコジル化に由来するのかもしれない。

また、トランスフエフＩ・されたＣＯＳ細胞におけるＦ−スポンデイン“ｙｏの 細胞局在化は、免疫化学によっても決定される。高度の免疫反応性は、Ｆ−スポ ンデイン゛ｙ°構築物の何れについても、細胞の表面に関係している（図８Ｃ， Ｄ）。

ｌ・ランスフェクトされていないＣＯＳ細胞の表面では、免疫活性は検出されな かった（表示せず）。Ｆ−スポンデインにか膜貫通領域かなく、且つ多数のヘパ リン付着部位か存在することは、Ｆ−スポンデイン′″−の細胞表面との関連に は、分泌された蛋白と細胞表面もしくは細胞外マトリックスとの結合か含まれる ことを示唆している。その裏付けとして、トランスフェクトされたｃｏｓ細胞か ら除去された培地中に存在するＦ−スポンデインｍｙｃか、ｉｎ　ｖｉｌ＋ｏに おいて、トランスフェクトされていないＣＯＳ細胞の表面に結合することか観察 された。

Ｆ−スポンデインの構造的特質は、その分泌および細胞表面への結合と相俟って 、Ｆ−スポンデインか神経細胞の接着および軸策の成長を促進することかできる という可能性を生じさせる。Ｆ−スポンデインはフロアプレー１・て高濃度で発 現するので、フロアプレートに向けて及びこれを横切って突出する変速ニューロ ン集団を取り込む、後部を髄細胞の接着および成長に対するＦ−スポンデインの 影響を調べた。更ニ、末梢神経におけるＦ−スポンデイン・ｍＲＮＡの発現は、 後部ルート神経節（ＤＲＧ）ニューロンがＦ−スポンデイン上に接着し、軸重を 伸長させるのではないかということを示唆する。

Ｆ−スポンデインｍｙｃ蛋白は、ＭＡｂ・９Ｅ１０アフイニテイカラム上で、ト ランスフェクトされたＣＯＳ細胞に接触させた培地から精製され（図９Ａ）、ニ トロセルロース基質上に固定化された（Ｌｅｍｍｏｎ　ｅｌ　ａｌ、、１９８９ 　）　ｏ　Ｆ−スポンデイン１′かＥ１４・ＤＲＧのニューロンの成長を促進す る能力を、トランスフェクトされていないＣＯＳ細胞から分泌され且つＭＡｂ・ ９Ｅ１０アフイニテイ精製された蛋白およびＢＳＡの能力と比較した。Ｅ　ＨＳ ラミニンにおけるＤＲＧニューロンの成長が、陽性対照として用いられた。８０ ％を超えるＤＲＧニューロンか軸重をＦ−スポンデイン上に伸長させ（図９Ｂ、 Ｄ）だ。Ｆ−スポンデイン上に伸長したＤＲＧ輔索軸索さは、ラミニン上に伸長 した軸重の長さく図示せず）と類似しており、親ｃｏｓ細胞蛋白上およびＢＳＡ 上に伸長した軸重の長さく図９Ｃ，Ｄの）よりもかなり長かった。同様の結果か 、Ｆ−スポンデイン１゛の両バージョンで１与られた（図示せず）。更に、１８ 時間後にＦ−スポンデイン″ｙ。

基質に接着したＤＲＧのニューロンの数は、ＢＳＡおよび親親ｃｏｓ細胞蛋白に 接着したニューロンの数よりも約３倍多く、ラミニン上に接着したニューロンの 数に類似していたポンディンがＤＲＧニューロンの接着を促進し、軸重を伸長さ せることができるという証拠を提供する。末梢の神経細胞によるｉｎ　ｖｉｖｏ でのＦ−スポンデインの発現は、多くの感覚ニューロンが末梢に突起を伸ばす前 に起こるから、末梢の神経系おける感覚軸重の発達の増大に貢献することができ るであろう。

後部を髄細胞の接着および成長を促進する、Ｆ−スボンデイン”ｙ゛の能力も調 べられた。我々は、後部を髄細胞もＦ−スポンデイン１′に良く接着することを 発見した。６０分以内（図１０Ａ、、Ｅ）において、Ｆ−スポンデインに接着し ている細胞の数は、トランスフェクトされていないＣＯＳ細胞から分泌され且つ ＭＡｂ・９Ｅ１０アフイニテイ精製された蛋白、またはＢＳＡに接着している細 胞の数よりも、１〇−１５倍多かった（図１０Ｃ，Ｅ）。接着細胞の６０％を越 す大多数は、Ｎ　ＣＡ　Ｍのポリシアル酸側鎖をＭＡｂ・５Ａ５で検出すること によって決定されるニューロンである（図示せず；Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ｘｌ、、１ ９８８；　Ｋａｒａｇｏｇｅｏｓ　ｅｌ　ａｌ、、１９９１参照）。

更に、多くの接着性を髄神経は、この期間内に短い軸重を伸長させた（図１０Ｂ ）。Ｆ−スポンデインがを髄軸重の成長を促進するか否かを更に調べるために、 １Ｉｌｙｉｌｒｏで１８時間後に、接着性を髄ニューロンの軸重の長さを決定し た。Ｆ−スポンデイン上でのを髄軸重の長さは、１８時間までに長くなった；し かじ、精製されたｃｏｓ細胞蛋白上およびＢＳＡ上での軸重の伸長もかなり増大 し、Ｆ−スポンデイン・ｙ°上の軸重の伸長に対して検出できるほどの相違はな かった。従って、Ｆ−スポンデインがを髄ニューロンの接着のみならず軸重の伸 長をも促すか否かについては未だ不明である。

ＴＳＲｓまたはこれら繰り返しから誘導されるペプチドに対する種々の細胞系の 接着は、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃ。

ｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）および他の硫酸化糖複合体によって阻害されるこ とが示されている（Ｒｏｂｅｒｌｓ、１９８８：　Ｂｓ＋ｎ１ｉｅｌｄ　ａｎｄ 　５ａｎｄｃ＋ｓｏｎ、１９９０：　Ｐ＋ａｔｅ＋　ｅｌ　ａｌ、、１９９１　 ）　ｏ更に、ヘパリン硫酸プロテオグリカンがトロンポスポンディン細胞表面受 容体として作用することが示唆されている（Ｒｏｌｌ　ｃｌ　ｘｌ、、１９８４ ；Ｓｕｎ　ｅｌ　ａｌ、、１９８９：　Ｂｅ＋ｎ１ｉｅｌｄおよび５ａｎｄｅｒ ｓｏｎ、１９９０　）。

従って、神経細胞とＦ−スポンデインとの相互作用は、可溶性グリコサミノグリ カンの添加によって阻害され得る脂性がある。後部を髄ニューロンのＦ−スポン デインに対する接着は、ヘパリン、デキストラン硫酸（表示せず）によって著し く阻害され、それより低い程度でコンドロイチン硫酸によって阻害されることか 分かった（図１０Ｄ、Ｆ）。を髄細胞と全ての接着性基質との相互作用における 非特異的阻害を制御するために、フィブロネクチンに良く接着するを髄二二〜ロ ンを決定し、それらの接着は、Ｆ−スポンデインに対する接貴ヲブロソクするヘ パリンの濃度によって顕著には影響されないことを発見した（図示せず）。ヘパ リンもまた、ＤＲＧニューロンのＦ−スポンデインに対するの接着をバックグラ ウンドレベルにまで減少させた（図示せず）。ＤＲＧからの軸重の成長も又、グ リコサミノグリカンの添加によってブロックされるか否かを決定することは不可 能であった。何故なら、ヘパリンは、Ｆ−スポンデイン上で２−３時間静置され たＤＲＧニューロンに添加されたときでも、Ｆ−スポンデイン基質から実質的に 全てのニューロンを脱離させるからである。

く実験の考察〉 フロアプレート細胞は、発生途中の神経系の腹側の中線に位置し、神経細胞認識 の制御および発生途中の軸重の誘導に関連すると思われてきた（Ｊ＋ｓ＋ｅｌｌ およびＤｏｄｄ、１９９１）　、フロアプレートのこの機能に寄与し得る遺伝子 を確認するために、減法ハイブリデイゼーションテクニックを使用して、新規蛋 白質（Ｆ−スポンデイン）をコードしているｃＤＮＡクローンを単離した。Ｆ− スポンデイン・ｍＲＮＡは、軸重が最初に伸長する期間にわたって、発生途中の フロアプレートで高レベルで発現し、胎児を髄の別の領域では低レベルまたは検 出不可能なレベルで発現した。Ｆ−スポンデインの予測される構造は、その生物 化学的特質と相俟って、該蛋白が細胞接着および軸重の成長を仲介する別の蛋白 質との相同性を有する分泌性糖蛋白であることを示している。Ｆ−スボンデイン は、ｉｎ　ｖｉｌ＋ｏにおいて、胎児ニューロンからの軸重の接着および成長を 促進する。これのことは、Ｆ−スボンデインがを髄の腹側中線における文運軸重 および末梢部の感覚軸重の成長および誘導に寄与しているかもしれないことを示 唆している。

Ｆ−スボンデインの局在 幾つかの証拠によって、Ｆ−スボンデイン蛋白は細胞外マトリックスに結合し得 ることが示唆される。第一に、Ｆ−スポンデインは、他の分泌性蛋白においてグ リコサミノグリカン結合ドメインとして作用する塩基性残基からなる幾つかの群 を有している。第二に、Ｆ−スポンデインはＣＯＳ細胞のトランスフェクト体の 表面に結合している。第三に、殆ど全部が６ＴＳＲｓによって構成されている補 体結合蛋白であるプロパージンが、硫酸化糖；夏合体と結合することが分かって いる（Ｂｏｉｌ　ｅｌ　ａｌ、、１９９０　）。

Ｆ−スポンデイン・ｍＲＮＡの分布が胎児神経系に限られていることは、神経細 胞接着および軸策の成長を促進する他の分泌性糖蛋白の分布とは対照的である。

例えば、Ｆ−スボンデイン＃ｍＲＮＡの発現は、ｌ・ロンポスポンディンＩの発 現（０−３ｈｅａ、　およびＤｉｘｉｌ、１９８８；　０″５ｈｅａ　ｅｌ　ａ ｔ、、１９９０）、および胎児の中枢神経系で広く発現されると思われるテナシ ン／サイトタクチンの発現（ＷｅｈｒｌｅおよびＣｈｉｅｆ、１９９０）よりも 更に限定されている。同様に、ラミニンおよびフィブロネクチンは、発生中の末 梢神経系の多（の領域で発現する（Ｓａｎｅｓ　ｅｌ　ａｌ、、１９９０）　ｏ 神経系発生の間にその分布が限られている一つの糖蛋白は、ラミニンＢ鎖の同型 であるＳ−ラミニンである（Ｂｕｎｌｅ＋　ｅｌ　ａｌ、、１９８９ａ）。

Ｆ−スポンデインのＴＳＲｓは、神経細胞の接着および軸重の伸長の原因であり 得る 神経細胞接着および軸策の伸長を仲介するＦ−スポンデインのドメインについて は、幾つかの間接的な証拠によってＴＳＲｓの関連が示唆されているが、未だマ ツピングされていない。第一に、ＴＲ３ｓを含むトロンポスポンディンの蛋白質 分解断片がメラノーマ細胞の接着を促進し、またＴＲＳ　ｓドメインに対する抗 体は細胞接着を阻止するＣＰ目ｔｅｒ　ｅｆ　１１、、＋９９１）。第二に、天 然の）・ロンボスポンディン及びＴＲＳドメインを含む１４０ｋＤａの蛋白分解 断片の両者とも、中枢および末梢神経から軸重が成長するのをｉｎ　ｖｉｌ＋ｏ で促進する（Ｏｔｔｕｈｏｕｔおよび）ｌｉｇｇｉｎｓ、１９９０；　０ｓｔｅ ＋ｈｏｕｔ　ｅｌ　ａｌ、。

１９９２：　Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ　ｅｌ　ａｌ、、１９９１；　Ｏ−５ｈｒａ 　ｅｌ　ａｌ、、１９９１　）。

更に、ＴＳＲドメインに対する抗体は、トロンポスボンデイン上での軸重の成長 を阻止する（０＋ｌｅ＋ｈｏｕｌおよび旧ｇｇｉｎｓ。

１９９０：　ＯｓＨ＋ｈｏｕｌ　ｅｌ　ａｌ、、１９９２）　ｏ第三に、マラリ ア原虫Ｃ８蛋白（ＴＳＲｓの中核ドメインを含んでいる）もまた、広範な醋乳類 細胞の接着を促進する（Ｒｉｃｈ　ｅｌ　ｇｌ、、１９９０）。

Ｃ３蛋白の接着性は、ＶＴＣＧ配列にマツピングされてきた（Ｒｉｃｈ　ｅｌ　 ａｌ、、１９９０）　。加えて、トロンポスポンディンのＴＳＲｓに由来する二 つのペプチド（メラノーマ細胞に対する付着可能因子）はＶＴＣＧ配列を含んで いるが、この配列を含まない第三のＴＳＲ山来のペプチドは接着性ではない（Ｐ ＋ａｔｅ＋　ｅｌ　ａｌ、、１９９１　）　。従って、Ｆ−スポンデインの第４ ＴＳＲ中にＶＴＣＧが存在することによって、このドメインがＦ−スポンデイン の接着性に関わっていることが示唆される。にもかかわらず、Ｆ−スポンデイン 内の別のドメインも、神経細胞接着または軸重の成長にかかわっているようだ。

例えば、Ｆ−スポンデインの第５と第６番目のＴＳＰ−１繰り返しの間に挿入さ れている領域に、Ｓ−ラミニンの神経付着性をもたらすＬＲＥ配列が含まれてい る（Ｈｕｎｌｐｒ　ｐｉ　ａｌ、。

１９８９ｂ）。

神経細胞がＦ−スポンデインに接着し、Ｆ−スポンデイン上に軸策を伸長できる ことは、この蛋白に対する神経受容体があることを示唆する。後部を髄細胞およ びＤＲＧニューロンのＦ−スポンデインへの接着かヘパリンによって阻害される ことは、プロテオグリカンが神経のＦ−スポンデイン受容体を構成するか、また は受容体作用を調整し得ることを示唆する。

Ｆ−スポンデイン及びｌ−ｏンボスポンデイン中にＴＳＲｓが保存されているこ とは、トロンポスポンディンＴＳＲドメインの受容体が、関連するＦ−スポンデ インのドメインと相互作用し得る可能性を提示する。トロンポスポンディンのＴ ＳＲｓが細胞受容体の３つの異なるクラスと相互作用できるという証拠かある（ Ｆ＋２ｚｉｅ＋　１９９］）。第一に、トロンポスポンディン、並びにＴＳＲの 中核領域由来のＶＴＣＧを含むペプチドは、多くの細胞タイプに存在している８ ８ｋＤａの脱糖蛋白であるＧＰＩＶまたはＣＤ３６と結合することができる（Ａ ｓｃｈｅｆ　ａｌ、、１９９１）、２９９２　）　。第二に、トロンポスポンデ ィンは、硫酸化ヘパリンプロテオグリカンシンデカン等の硫酸化度合糖質と結合 できる（Ｒｏｂｅ＋ｔｓ、１９８８．Ｓｕｎ　Ｎ　ａｔ、、１９８９：　）ｌｏ ｆｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９３９：　Ｂｅ＋ｓｌ＋ｅｄ　ａｎｄ　５ａｎｄｅ＋ｓ ｏｎ、１９９０）。

また、トロンホスポンディンおよびマラリア原虫Ｃ８蛋白のＴＳＲドメインに由 来するＶＴＣＧを含むペプチドと細胞との接着は、ヘパリンおよび他のゲルコサ ミノグリカンによって阻害され得る（Ｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０；　Ｐ ｒａｌｅｒ　Ｃｌ　ａｌ、、１９９１；　Ｒｉｃｈｅｔ　ａｌ、、１９９１）　 ｏ第三に、インテグリンに対する抗体は、トロンポスポンディン上での軸重の成 長を阻止する（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ　ｅｌ　ａｔ、、１９９１　）　ｏ　）Ｏ ンボスポンデインのＴＳＲドメインに対する抗体は、トロンポスポンディン上の 軸重の成長を阻止するから（Ｏｉｌｅ＋ｈｏｕｌおよびＨｉｇｇｉｎｓ、１９９ ０；　０ｓｌｅ＋ｈｏｕｌ　Ｎ　ｘｉ、、１９９２）　、ＴＳＲｓ内の配列は神 経インテグリンと相互作用することか可能である。

神経発生におけるＦ−スポンデインの可能な機能胎児の神経系において、Ｆ−ス ポンデインは、を髄発生の幾つかの局面に関わっている上皮細胞群、即ちフロア プレートで最も顕著に発現する。フロアプレートを生じる中線神経プレート細胞 は、神経管が閉じる間に、目覚ましい細胞の形態変化を受ける。従って、Ｆ−ス ポンデインの可能な一つの機能は、胎児のを髄の形成過程においてフロアプレー トの完全性を維持している、フロアプレート細胞間の接着相互作用を媒介する二 とであろう。Ｆ−スポンデイン・ｍＲＮＡのフロアプレート細胞中ての発現は、 フロアプレートが、化学誘引す生の（Ｔｅ＋＋ｉｅ＋−Ｌａｖｉｇｎｅ　ｅｌ　 ａｌ、、１９８８；　Ｐｌｘｃｘｅｋ　ｅｔ　ｘｉ、。

１９９０２　）および接触性の（Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８　）文運軸 重誘導において役割を果たすことが示唆されている時点で最も高い。ＣＯＳ細胞 から分ｌ必される組ＩＦ−スポンデインｍｙｃは、フロアプレート由来の化学的 誘引物質か、後部を椎の移植片から変速軸重の成長を促進する能力（Ｋｌａｒ、 Ｐｌａｃｕｋ、　Ｔｅ５ｓｉ？ｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、　Ｄｏｄｄ　ａｎｄ　ｌｅ ｓ＋ｅｌｌ、未公開所見）に似ていないことがわかる。これによって、Ｆ−スポ ンディンは、変速軸重のフロアプレートへの長距離の案内において、少なくとも 化学誘引性を介して関わるのもでないことが示唆される。

軸重が化学誘導性案内キューの影響を受けてを髄の腹側中線に達すると、Ｆ−ス ポンディンは、変速軸重の接触依存性誘導に関与し得るであろう。交通ニューロ ンの成長錐体は、フロアプレート細胞の基底表面とその下にある基底ラミナの間 で成長することによって中線と交差する（ｋｕｗａｄａ　ｃｌ　ａｌ、。

１９９０：　Ｙａｇｉｎｕｍａ　ｅｌ　ａｌ、、１９９１　）　。７ｏアフレ− ）ニよ一＋テ分泌されるＦ−スボンディンは、フロアブｌ／−）細胞の＝底表面 またはその下の基底ラミナと結合して高レベルで蓄積され、これによってフロア プレートおよび側方感覚上皮の接着性に差異を生み出すのであろう。変速軸重の 成長錐体はＦ−スポンデインに優先的に接着して、フロアプレー１・および側方 感覚上皮の境界において軌道を変化するように刺激され得る。また、Ｆ−スポン ディンは、交通成長コーンが他の中線案内キューに反応するように、その特質変 化を誘発させるよいうな活性な信号機能を有しているということも可能である。

幾つかの蛋白は、を髄発生のこの段階でフロアプレート細胞に選択的に発現され （Ｄｏｄｄ　ａｎｄ　Ｊｅｓｓｅｌｌ、１９８８．Ｃｈｕａｎｇ　ａｎｄＬａｇ ｅｎａｕｒ、１９９０　）　、中線での変速軸重の案内に貢献するキューを与え 得るであろう。

Ｆ−スポンディン・ｍＲＮＡはまた、運動および感覚軸策がその末梢ターゲット に対して突出する期間であるＥｌｌがらＢ１６においては、末梢神経系における 細胞（おそらくシュワン細胞）によっても発現される。末梢神経における非神経 細胞は、発生期の軸策の成長を促進できるラミニンおよびフィブロネクチンを含 む、様々な細胞外マトリックス糖蛋白を分泌することが知られている。抗体阻害 研究によって、末梢神経基質において神経の成長を行なう別の分子が存在してい るとの証拠が提供されている（Ｔｕｌｌｌｅ　ｅｆ　ａｌ、、１９８９　）。

組換Ｆ−スポンディンが、ｉｎ　ｖＮｒｏにおいて胎児の感覚ニューロンの成長 を促進できる能力を有することは、該蛋白が末梢神経の非神経細胞によって分泌 され、ｉｎ　ｖｉｖｏでの感覚軸策の初期成長に寄与し肖るであろうことを示唆 している。

以上を総合すると、本研究は、’＋ｎ　ｖｉｖｏにおける神経細胞の接着および 軸策成長における可能な役割を持った新規な分泌性蛋白としての、Ｆ−スポンデ ィンを同定した。天然のＦ−スポンディンを認識する抗体を開発することは、神 経系内における該蛋白の局在の決定、並びにその機能のより詳細な評価において 重要となるであろう。

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Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２λｊ３１７４０−１７４５゜コ、　Ｂａｚａｎ、Ｊ 、Ｆ、（１９９０）　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　 ５ｕｐｅｒｆａｒｏｉｌｙ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８７：６９３４−６９３８゜４、　Ｂｅｒ ｎｆｉｅｌｄ、　Ｍ、　ａｎｄ　５ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ｄ、（１９９０） 　５ｙｎｄｅａｈ、　ａｄｅｖｅｌｏｐｍａｎｔａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ 　ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｅｏｑｌｙｃａ、ｎｔｈａｔ　ｂｉｎｄ ｓ　１！ＸｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆ ａｃｔｏｒｓ。

Ｐｈ１ｌｏｓ、　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄ、　工：１７１−１８ ６゜５、　Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ、Ｒ，Ｒ，ａｎｄ　Ｘｕｗａｄａ、Ｊ、Ｙ、　（ ユ９９０）　Ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔｅａｂｌａｔｉｏｎｓ　１ｎｄｕｃｅｓ　ａ ｘｏｎａｌ　ｐａｔｈｆｉｎｄｉｎｇｓ　ｅｒｒｏｒｓ　ｂｙｓｐｉｎａｌ　ｅ ｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｅｍ ｂｒｙｏ。

Ｓａｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ａｂｓｔ、、ｌｊ：ｌコク＋２゜６、　Ｂｏｒｎｓ ｔｅｘｎ、Ｐ、、Ｏ’Ｒ，０１１ｒｋ＋’！＋　Ｋ−ｒ　ＷｌｋＳｔｒＯｍ、Ｙ Ｃｌ　Ｗｏｌｆｆ。

Ｆ、Ｗ、、Ｋａｔｚ、Ｒ，、Ｌｉ、Ｐ、ａｎｄ　Ｄｉｘｉｔ、Ｖ、Ｍ−（１９９ １）　Ａｓｅｃｏｎｄ、　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｔｈｒｏｍｌ）Ｏ５ｐＯｎｄｌ ｎ　（ｉｅｎｅ　（Ｔｈｂｓ２）　ｅｘｘｓｔｓｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｇ ｅｎｏｍｅ、’　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ　ｐ狐：１２Ｂ２１−４２８２４ ゜７、　Ｂｏｖｏｌｅｎｔａ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｄｏｄｄ、　Ｊ、　［１９９） 　Ｇｕｉｄａｎｃｅ　ｏｆＣＯｍｍｌＳＳｕｒａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｅｓ 　ａｔ　ｔｈｅ　ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅｅｍｂｒｙｏｎｉｅ　 ｒａｔ　５ｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ、Ｉ）ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　、１旦２．：４ ３５−４４１゜８、　Ｂｏｖｏｌｅｎｔａ、Ｐ、ａｎｄ　Ｄｏｄｄ、Ｊ、　（１ ９り１）　Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ　ｏｆｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅ ｒ＋ｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｘｏｎ　ｇｕｉｄａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅｓｐ ｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｌａｃｋｉｎｇ　ａ 　ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔａ：Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｄａｎｆｏｒｔｈ’ｓ　 ５ｈｏｒｔ−ｔａｉｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎ。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　４ユニ６２５−６コ９．９、　Ｃａｒｄｉｎ、Ａ、Ｄ 、ａｎｄ　Ｗｅｉｒ＋ｔｒａｕｂ、Ｈ，Ｊ、Ｒ，（ｘ９ｓｑ）　Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒｚｃｄｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙ ｃａｎ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ。

ターｅｒｘｏｓｃ１ｅｒｏｓｉｓ　ｉ：２１．−３２゜ｎａｕｒｉｔａ　ｏｕｔ ｇｒｏｗｔｈ、　Ｄａｙ、　Ｂｉｏｌ、　１１２：２１９−２３２゜ｘｘ、Ｃｕ １ｏｔｔｉ、　Ｊ、Ｇ、、　５ｐｅｎｃｅ、　Ａ、、　Ｚｈｏｕ、　Ｙ、、　５ ｃｏｔｔ、工、。

Ｌａｕｇｎ−Ｈａｇａｓｔａｉｊｎ、　Ｃ，、５ｔａｒｎ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｈ ｅｄｇｅｃｏｃｋ、　Ｅ。

（１９９１）　Ｔｈｅ　ｕｎｃ−５ａｘｏｎ　ｇｕｉｄａｎｃａ　ｇａｎｇ　ｏ ｆ’　Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓ　ｈａｓｆｅａｔｕｒａｓ　ｏｆ　ａ　ｃａｌｌ　ａ ｄｈａｓｉｏｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、　Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

よよ旦：１２２ａ。

ユ２．　Ｄａｍｅ、Ｊ、Ｂ−、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ、Ｌ、、ＭｃＣｕｔｃｈａ ｎ、Ｔ、Ｔ、、Ｗａｂａｒ。

Ｊ、Ｌ、、　Ｗｒｉｔｚ、　Ｒ，Ａ、、　Ｈｏｃｋｍａｙｅｒ、　Ｗ、Ｔ、、　 Ｍａｌｏｙ、　Ｗ、Ｌ−。

Ｈａｙｎｅｓ、　Ｊ、Ｄ、、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、工、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、 　Ｄ、、　５ａｎｄｅｒｓ。

Ｇ、Ｓ、、　Ｒｅｄｄｙ、　Ｅ、Ｐ、、　Ｄｉｇｇｓ、　Ｃ，Ｌ、　ａｎｄ　Ｍ ｉｌｌａｒ、　Ｌ、Ｈ。

（１９８４）　５ｔｒｕｃｔｕｒａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎ ｇ　ｔｈｅ１ｍｌ＋ＬＬｌｎＯｄＯｍｌｎａｎ？−５ｕｒｆａｃａ　ａｎｔｌ（ Ｊｅｎ　Ｏｎ　ｔｈｅ　５ｐＯｒＯＺＯｉｔｅ　ｏｆｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｍａ ｌａｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔｅ　ｐｌａｓｍｏｄｉｕｘ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ 。

５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌ匝：５９３−５９９゜１コ、　Ｄａｖｉｓ、Ｓ、、ＡｌｃＬ ｒｉｃｈ、　Ｔ、Ｈ，、Ｖａｌｅｎｚｕｇｌａ、　Ｄ、に、、Ｈａｎｇ。

Ｖ、Ｖ−、Ｆｕｒｔｈ、　Ｍ、Ｅ−、５ｑｕｉｎｔｏ、　Ｓ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｙ ａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ。

Ｇ−Ｄ、（１，９９１）　Ｔｈｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ｃｉ、１ｉａｒ ｙ　ｎａｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　＝１：５９− ６３゜１４、Ｄｏｄｄ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｔ、Ｍ　（１９８５）　 Ｌａｃｔｏｓｅｒｉｅｓｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　５ｐｅｃｉｆｙ　５ｕｂ ｓｅｔｓ　ｏｆ　ｄｏｒｓａｌ　ｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｎｓ　 ａｎｄ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｄｏｒ ｓａｌ　ｈｏｒｎ　ｏｆ　ｒａｔ　５ｐｉｎａｌ　ｃａｒｄ、　Ｊ、　Ｎｅｕｒ ｏｓｃｉ、　、ｊ：３２７Ｂ　−１５、Ｄｏｄｄ、　Ｊ、　ａｎｄ　ＪｅＳＳｅ ｌｌ、　Ｔ、Ｍ　（１９８１１）　Ａｘｏｎ　ｇｕｉｄａｎｃａ　ａｎｄｔｈｅ 　ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ　ｏｆ　ｎａｕｒｏｎａｌ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ　 １ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　ｋ徨：６９２−６９９゜１６ 、Ｄｏｄｄ、　Ｊ、、　Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｓ、Ｂ、、　Ｋａｒａｇｏｇｏｅｓ、 　Ｄ、、　Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｋ。

ａｎｄ　Ｊｅｓｓｅｌｌ、　Ｔ、Ｍ、　（１９８Ｊ　５ｐａｔｉａｌ　ｒｅｇｕ ｌａｔｉｏｎ　ｏｆａｘ口ｎａｌ　ｇｌｙｃｏｐｒｏセａｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ　ｏｎ　５ｕｂｓｅｔｓ　ｏｆｅユｂｒ−７ｏｎＩＣ５ｐｉｎａｌ　ｎｅ ｕｒｏｎｓ、Ｎｅｕｒｏｎ　ｌ：１０５−１１６゜１７、ＥＶａｎ、　Ｇ、ニー ｚ　Ｌｅｗｉｓ、　Ｇ、に、、　Ｒａｍ５ａｙ、　Ｇ、、　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｊ 、Ｍ。

（１−９８５）　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｚｏｎｏｃｉｏｎａｌ　ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｃ−ｍｙｃ　ｐｒｏｔｏ −ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｐｒｏａｕｃｔ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂユロよ、　互：コ６１０〜コロ１６゜ｉｌｌ！、　Ｆａｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ 、ａｎｄ　Ｖｏｌｇａｌｓｔａｎ、Ｂ、（１９８コ）　Ａ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ　ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ＤＮＡ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅ ｎｄｏｎｕｃｌａａｓａｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｔｏ　ｈｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉ ｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈａｍ。

ｌユニ：６−１３゜ １９、　Ｆｒａｚｘａｒ、　Ｗ、Ａ、　（１９９１）、　τｈｒ口ｍｂｏｓｐｏ ｎｄｉｎｓ、　ＣｕｒｒａｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｃａ１１．Ｂｉｏ工ｏ ｃｎ　ユニ７９２−７９９゜２０、Ｆｕｒｌｅｙ、　Ａ、Ｊ、、　Ｍｏｒｔｏｎ 、　Ｓ、Ｂ、、　Ｍａｎａｌｏ、　Ｄ、、　Ｋａｒａｇｏｇｅｏｓ。

Ｃａ１ｌ　、Ｑ：１５７−１７０゜ ２Ｌ　Ｇｏｕｎｄｉｓ、Ｄ、ａｎｄ　Ｒａ１ｄ、に−Ｂ、Ｍ、（工９８８）Ｐｒ ｏｐｅｒｄｉｎ、ｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌ　ｃｏｍｐｌａｍａｎｔ　ｃｏｍｐｏ ｎｅｎｔｓ、ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ａｎｄｔｈｅ　ｃｉｒｅｕｍｓｐ ｏｒｏｚｏｉｔｅ　ｐｒｏセｓｉｎ　ｏｆ　ｍａｌａｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔｅ ｓｃｏｎｔａｉｎ　５１ｍ１ｌａｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｍｏｔｉｆｓ、　Ｎａ ｔｕｒｅ　Ｌ匝：６２−６５゜ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔａｒｉｚ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｉｘｔｈ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆ　ｔｈｅ　ｈ ｕｍａｎ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｗｈｏｌｅ　ｍｏｕｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｘｅｎｏ ｐｕｓ　ｅｍｂｒｙｏｓ。

ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ｉｎ 　Ｃ−Ｅｌｅｇａｎｓ。

Ｎｅｕｒｏｎ　２：６１−８５゜ ２７、Ｈａｄｇｅｃｏｃｋ、Ｅ、Ｍ、ａｎｄ　Ｈａ工ｌ、Ｄ、Ｈ，（１９９０） Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　１ｎｔｈａ　ｎａｕｒ口ｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｎｅｍ ａｔｏｄａｓ、　ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ　ａｎｄｃｈｏｒｄａｔａｓ、Ｓｅｍ１ ｎａｒ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　ｊ、：１５９−１７２゜２Ｂ、Ｈｅ５ｓｉ ｏｎ、Ｃ，、Ｔｉｚａｒｄ、Ｒ，、Ｖａｓｓａｌｌｏ、Ｃ，、５ｃｈｉｆｆａｒ 。

Ｓ、Ｂ、、Ｇｏｆｆ、Ｄ、、Ｍｏｙ、Ｐ、、Ｃｈ、１−Ｒｏｓｓｏ、Ｇ、、Ｌｕ ｈｏｗｓｋｙｊ。

Ｓ、、Ｌｏｂｂ、Ｒ，ａｎｄ　０ｓｂｏｒｎ、Ｌ、（１９９１）Ｃｌｏｎｉｎｇ 　ｏｆ　ａｎａｌｔａｒｎａｔａ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｃａｌ ｌ　ａｄｈａｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａ−４（ＶＣＡＭｌ）、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈａｍ、　タ坦：６６８２−６６８５゜２９、　Ｈｏ１ｌａｙ、Ｊ、ａ ｎｄ　５ｉｌｖｅｒ、Ｊ、（ｌ夕８７）　Ｇｒｏｗｔｈ　ｐａｔｔａｒｎ　ｏｆ ｐｉ口ｎａｅｒｉｎｇ　ｃｈｉｃｋ　５ｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ａｘｏｎｓ、Ｄ ｅｖｌ、Ｂｉｏｌ。

１ｚユニ３７５−３８８− ３ｏ、Ｈｏ１ｄｔ、Ｇ、Ｄ、、Ｋａｅｓｂｅｒｇ、Ｐ、Ｒ，、Ｅｒ５ｈｌｅｒ、 Ｗ、Ｂ、、Ｅｓｋｏ。

Ｊ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｍｏ５ｈｅｒ、　Ｄ−Ｆ、（１９８９）　Ｃｈｉｎｅｓｅ　 ｈａｍｓｔａｒ　ｏｖａｒｙｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　 ｐｌａｔａｌｅｔ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　１ｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　 ｏｎ　ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｈｅｐａｒａｎ　５ｕｌｆａｔｅｂｉｎｄ　 ５ｕｌｆａｔａｄ　ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 。

ａｎｄ　Ｊｅｓｓａｌｌ、Ｔ、Ｍ、（１９９１）　Ｄｅｖ＠ｌｏｐｍｅｎｔａｌ 　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ａｘｏｎａｌ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔａｉ ｎ　ＴｋＧ（：　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｃａ ｎｔｒａｌ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　Ｑヱ聾ｒｏ、Ｄ ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　−λ：６１−６７゜３６、Ｋｌａｍｂｔ、ｃ、ＬＪａｃ ｏｂｓ、　Ｊ、Ｒ，ａｎｄ　Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｃ，Ｓ、（１９９１）Ｔｈｅ　ｍ Ｗｌｉｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖ ｏｕｓｓｙｓｔａｍ：　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａ ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃａｌｌｆａｔｅ、　ｃａｌｌ　ｚｉｇｒａｔｉｏｎ　 ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｅ　ｑｕｉｄａｎｃａ、　Ｃａ１ｌム：８０１− ８１５゜ ３’７．　Ｘｏｚａｋ、　Ｍ、　（１９８４）　Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ　ａｎ ｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｆｒｏｍ 　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｌａセ１ｏｎａｌ　５ｔａｒｔ　５ｉｔｅｉｎ　ｅｕｋａ ｒｙｏｔｉｃ　ｍＲＮ八、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ、１ｚ：８５７−８７ ２゜’！８．　Ｋｕｗａｄａ、Ｊ、Ｙ、、ＢｅｒｒＭａｒｄｔ、Ｒ，Ｒ，ａｎｄ 　Ｎｇｕｙｅｎ、Ｎ、（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　５ｐｉｎａ ｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｒａｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅｚａｂｒａｆｉｓｈ 　ｅｍｂｒｙｏ、Ｊ、ＣＯｍｐ、Ｎｅｕｒａｌ、　瓜＝６１７−６２８゜３９、 Ｋｙｔａ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌａ、　Ｒ，Ｆ、（１９Ｂ２）　Ａ 　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ４０、Ｌａｗｌａｒ、Ｊ、ａｎｄ　Ｈｙｎｅｓ、 ’Ｒ，Ｏ，（１９８６）Ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒａ　ｏｆｈｕｍａｎ　ｔｈｒ ｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ、　ａｎ　ａｄｈｅｓｉｖｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ ｎ　ｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔａｓ 　ａｎｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｗｉｔｈｓｅｖｅｒａｌ　ｃｌｉｆｆｅｒａ ｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

ユニλ：１６３５−１６４８゜ ４１、Ｌｅｍｍｏｎ、Ｖ、、Ｆａｒｒ、に、Ｌ、ａｎｄ　Ｌａｇｅｎａｕｒ、Ｃ ，（１９８９）ＬＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｘｏｎ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ　ｏｃ ｃｕｒｓ　ｖｉａ　ａ　ｈｏＩｎｏｐｈＬｌｌｃｂｉｎｉｄｎｇ　ｍｅｃｈａｎ ｉｓｍ、Ｎｅｕｒｏｎ　λ二１５９７−１６０３゜４２、ＭｃＫａｎｎａ、Ｊ、 λ、ａｎｄ　Ｃｏｈ’ｅｎ、Ｓ、（１９８９°）Ｔｈｅ　ＥＧＦ　ｒｅｃｅｐｔ ｏｒｋｉｎａｓｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｐ３５　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｌｏｏｒ　 ｐユａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅｉＩｎｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ　ｇｌｉａｌ　ｐｒ ｅｃｕｒｓｏｒ　ｃａｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅｄｅＶｅｌｏｐｌｎｑ　ｒａｔ　５ ｐｉｎａｌ　Ｃ０ｒＣ１，ｓｏｃ、Ｎｅｕｒｏ、ＳＣニー　Ａｂｓｔ。

ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　’ＷＳ　ｍｏｔｉｆ’　ｃｏｍｍｏｎ　ｔｏ　ＩＬ−２ａ ｎｄ　ｏｔｈｅｒＣＹｔＯｋｌｎｅ　ｒａｃａｐｔｏｒｓ　ｉｓ　ａｓｓｅｎｔ ユａｌ　ｆｏｒ　ｌｉｇａｒ＋ｄ　ｂｉｎｄｉｎｇａｎｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒ ａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｔｈｅ　ＥＦｍ、ＯＪｏｕｒｎａｌ　貝：３ｉ９１− ４５、Ｎａｍｂｕ、：ｆ、只、、Ｌａｗｉｓ、Ｊ、Ｏ，、Ｗｈａｒｔｏｎ、Ｘ− λ、ａｎｄ　Ｃｒａｗｌ。

Ｓ、Ｔ、　（１９９１）　Ｔｈｅ　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｓｉｎｇｌａ−ｍｉ ｎｄｅｄ　ｇ＠ｎａｅｎｃｏｄａｓ　ａ　ｈａｌｉｘ−１ｏｏｐ−ｈａｌｉｘ　 ｐｒｏｔａｉｎ　ｔｈａｔ　ａｃｔｓ　ａｓ　ａｍａｓｔｅｒ　ｒｅｇｕｌａｔ ｏｒ　ｏｆ　ＣＮＳ　ｍ１ｄｌｉｎａ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃａ１１６７ ：１１５７；１１６７゜ ４６、Ｎｅｕｇｅｂａｕａｒ、に、Ｍ、、Ｅｍｍｅｔｔ、Ｃ，Ｊ、、Ｖｔｎｓｔ ｒｏｍ、に、Ａ、ａｎｄＲａｉｃｈａｒｃｉｔ、　Ｌ、Ｆ、　（１９９１）　Ｖ ｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　ａｎｄｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｐｒｏｍｏｔａ 　ｒａｔｉｎａｌ　ｎｅｕｒｉｔａ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ：Ｄａｖａｌｏｐｍｅ ｎｔａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｏｌａ　ｏｆ　ｉｎｔａｇｒｉｎ ｓ。

Ｎａｕｒｏｎ　ｊ：３４５−コ５８゜ ４７、　０’５ｈｅａ、Ｋ、ｓ、ａｎｄ　Ｄｉｘｉｔ、Ｖ、Ｍ＋（１９８８）　 ｔＪｎｉｑｕａｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈａ　ｅｘｔｒａｃａｌｌ ｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　 ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｍｏｕｓａ　ａｍｂｒｙｏ、Ｊ。

Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、工Ωヱ：２７３７−２７４８゜４８、　０’５ｈｅａ、　 Ｋ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒ、　１．Ｓ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｄｉｘ ｉｔ、　Ｖ、Ｍ。

（１９９０）Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｒｏｍｂｏ ｓｐｏｎｄｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅｈｉｓｔｏｇｅｎａｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａ ｒａｂａｌｌａｒ　ｃｏｒｔｅｘ、　Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

、１１Ω：１２７５−１２８３゜ ４９、　０’５ｈｅａ、Ｋ、Ｓ−、Ｌｉｕ、Ｌ−Ｈ−Ｊ、ａｎｄ　Ｄｉｘｉｔ、 Ｖ、Ｍ、（１９’ｌ）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ａｎｄ　ａ　１４０　ｋ ｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｐｒｏｍｏｔａａｄｈｅｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｅｕｒｉ ｔａ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ　ｆｒｏｍ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｅｎｔｒａｌ　ａ ｎｄ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｎｄ　ｆｒｏｍ　ＰＣｌ３　 ｃｅｌｌｓ。

Ｎａｕｒｏｎヱ：２］１−２３７゜ ５０、　０ｓｔｅｒｈｏｕｔ、　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　１（ｉｇｇｉｎｓ、　Ｄ、 　（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ａｘｏｎａ ｌ　ｇｒｏｗｔｈ工ｎ　ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃｎｅｕｒｏｎｓ、Ｓｏｃ、Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉ、入ｂｓｔ、ｌ旦：３１２゜５１　０ｓｔａｒｈｏｕｔ、　Ｄ、Ｊ 、、　Ｆｒａｚｉｅｒ、　Ｗ、Ａ、　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎ、　Ｄ、（１９９２ ）Ｔｈｒｃｌｌｎｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｐｒｏｍｏｔａｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏ ｕｔｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｎｅｕｒｏｎｓｆｒａｍ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｐｈｅｒ ａｌ　ａｎｄ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、　工ｎ　Ｐｒａｓｓ。

５２−　ＰａｔｊｈＹ、　Ｌ、（１９９０）　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ａ　ｄ ｏｍａｉｎ　ｃｆ　ｔｈｅ　ｑｌ：ＯＷｔｈｈｏｒｎｏｎ／ｐｒｏｌａｃｔｉｎ 　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆａｍｉｌｙ　ｗｉｔｈ　ｔｙｐａ　エエ工ｍｏｄｕｌｅ ｓ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｎａｃｔｉｎ、Ｃａ１ｌ　１２．よ：１コー１４゜５コ、 　Ｐａｔｔｈｙ、Ｌ、　（１９８Ｂ）　Ｄａｔａｃｔｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｔ　 ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｏｆｍｏｓａｉｃ　ｐｒｏｔａｉｎｓ、　Ａｎａｌｙｓ ｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　８１！ｑｕｅｎｃｅ！ｉ　ｏｆｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕ工 ｉｎ、　ｔＴｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｃｏｍｐｏ ｎｅｎｔｓＣ９，Ｃ８ａｌｐｈａ　ａｎｄ　Ｃ８ｂｅｔａ、ｖｉｔｒｏｎａｃｔ ｉｎ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ ａｉｎ　ＰＣ−１，Ｊ、　Ｍｏｌ’、　Ｂｉｏｌ。

瓜：６８９−６９６゜ ５４、Ｐｅｒｋｉｎｓ、Ｓ、Ｊ、、　Ｎａａｌｉｓ、　Ａ、Ｓ、、　Ｈａｒｉｓ 、Ｐ、工、、　Ｃｈａｐｍａｎ。

ｒ：ｒ、、Ｇｏｕｎｄｉｓ、Ｄ、ａｎｄ　Ｒａ１ｄ、Ｋ、Ｂ、Ｍ、（１９８９） 　５ｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｃａｓｃａｄｅｓａｎｄ　ｒｅｌａｔａｄ　ｐ ｒｏｔａｉｎｓ：　Ａ　５ｔｕｄｙ　ｂｙ　ｆｏｕｒｉｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｎ ｎｓｉｎｆｒａｒｅｄ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　旦ニア１７６−７１８２゜５５、Ｐｌａｃｚｅｋ、Ｍ、、Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌ ａｖｉｇｎｅ、Ｍ、、Ｊｅｓｓａｌｌ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄＤｏｄｄ、Ｊ、（１９９ ０ａ）Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｕｒａｌ　ａｘｏｎｓ　 １ｎｖｉｔｒｏ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ａ　ｆ’１ｏｏｒ　ｐｌａｔ ｅ　ｄｅｒｉｖｅｄｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 　Ｌ工：１９−３０゜５６、Ｐｌａｃｚｅｋ、Ｍｌ、Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉ ｇｎｅ、Ｍ、、Ｙａｍａｄａ、Ｔ、。

Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄ　Ｄｏｄｄ、Ｊ、（１９９０ｂ）Ｔｈｅ　ｇｕ ｉｄａｎｃｅ　ｏｆｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ａｘｏｎｓ　ｂｙ　ｄｉｆｆｕｓｉ ｂｌｅ　ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ　ｊ５：２７９−９８８゜５ ７、Ｐｌａｃｚｅｋ、　Ｍ、、　Ｔｅｓｓｉａｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、　Ｍ、、　 Ｙａｍａｄａ、　Ｔ、。

Ｊｅｓｓａｌｌ、　Ｔ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｄｏｄｄ、　Ｊ、　（１９９０ｃ）　Ｍ ｅｓｏｄｅｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｃａｌｌ　１ｄｅｎ ｔｉｔｙ：　ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｎｏ ｔｏｃｈｏｒｄ、５ｃｉｅｎｃｅ　−曵：９８５−９８８゜５８、Ｐｌａｃｚａ ｋ、Ｍ、、Ｙａｍａｄａ、Ｔ、、Ｔｅｓｓｉａｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｍ、。

Ｊｅｓｓａｌｌ、Ｔ、Ｍ、、Ｄｏｄｄ、Ｊ、　（１９９１）　Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ｏｆ　ｄｏｒｓ。

ｖｅｎｔｒａｌ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｉｎ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｎｅｕｒａｌ 　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｏｌａｒｉｚｉｎ ｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉａｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌｏｏｒｐｌａｔｅ、Ｄｅｖｅｌ ｏｐｍｅｎｔ　（Ｉｎ　Ｐｒａｓｓ）。

５９、Ｐｒａｔａｒ、Ｃ，Ａ、、Ｐｌｏｔｋｉｎ、Ｊ、、Ｊａｙｓ、Ｄ＋ａｎｄ 　Ｆｒａｚｉｅｒ。

Ｗ、Ａ、　（１９９１）　Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ−１ｉｋｅ　ｔｙｐｅ　 Ｘ　ｒｅｐａａｔｓ　ｏｆ　ａｈｕｉａｎ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｃ ｏｎｔａｉｎ　ａ　ｃｅｌｌ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　５ｉｔｅ。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１λ：１０コ１−１０４０゜６０、Ｒｉｃｈ、　Ｋ 、Ａ、、　Ｇｅｏｒｇｅ、　Ｆ、Ｗ、、　Ｌａｗ、　Ｊ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｍａｒ ｔｉｎ、　Ｗ、Ｊ。

（１９９０）　Ｃｅ１ｌ−ａｄｈｅｓｉｖａ　ｍｏｔｉｆ　ｉｎ　ｒｅｇｉｏｎ 　エエ　ｏｆ　ｍａ工ａｒｉａｌｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔａ　ｐｒｏｔ ｅｉｎ、　５ｃｉａｎｃａ　ｚ生立：１５７４−１５７７゜６１　Ｒｉｃｈ、Ｋ 、λ、、Ｈｉｎｔｏｎ、Ｄ、Ｒ，ａｎｄ　Ｂｌａｎｋｓ、Ｊ、Ｂ、（１９９１） Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｍｏｕｓａ　ｒａｔｉｎ ａｌ　ａｎｄ　１ｅｎｓｃａｌｌｓ　ｔｏ　ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｍｏ ｎ　ｔｏ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ａｎｄｍａｌａｒｉａｌ　ｐｒロｔ ｅ工ｎｓ、　Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　−５：４４１ａ。

６２、Ｒｏｂａｒｔｓ、　Ｄ、Ｄ、　（１９８８）工ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　 ｏｆ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｗｉｔｈ　５ｕｌｆａｔａｄ　ｇｌｙｃｏ ｌｉｐｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔａｏｇｌｙｃａｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｍｅｌ ａｎｏｍａ　ｃａａｌｓ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　観：６７Ｂ５−６ ７９３゜６コ＋　Ｒｏｂｓｏｎ、　Ｋ、Ｊ、Ｈ−、Ｈａｌ−１，Ｊ、Ｒ，Ｓ、、 　Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、　ＬＷ、。

Ｈａｒｒｉｓ、Ｔ、Ｊ、Ｒ，、Ｍａｒｓｈ、Ｋ、、Ｎｅｗｂｏｌｄ、Ｃ，工、、 Ｔａｔａ。

Ｖ、Ｅ、、Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ、Ｄ、Ｊ、　（１９８８）　Ａ　ｈｉｇｈｌｙ 　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｒ ｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ、　ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ　ａｎｄｉｎ　ｐｒｏｔＬａｉ ｎｓ　ｆｒｏｍ　５ｐｏｒｏｚｏｉｔａｓ　ａｎｄ　ｂｌｏｏｄ　ｓｔａｇｅｓ 　ｏｆ　ａｈｕｍａｎ　ｍａｌａｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔａ、Ｎａｔｕｒ＠Σ匝 ニア９−８２゜６４、Ｒｏｍｉｊｉｎ、ＨｌＪ、、Ｇａｂｅｔｓ、Ａ、Ｍ、Ｍ、 Ｃ，、Ｍｕｄ、Ｍ、Ｔ、ａｎｄＷａｌｔａｒ、Ｐ、Ｓ、（１９８２）Ｎｅｒｖｅ 　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ、ｓｙｎａｐｔｏｇａｎｅｓｉｓａｎｄ　ｂｉｏｅｌａｃ ｔｒｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｒａｔａ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒ ｔｅｘｔｉｓｓｕａ　ｃｕｌｔｕｒａｄ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ、ｃｈｅ ｍｉｃａｌｌｙ　ｄａｆｉｎａｄｍｅｄｉｕｍ、Ｄａｖｌ、Ｂｒａｉｎ、Ｒａｓ 、ｌ：５ａ３−５８９゜６５、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、（１９８９）Ｍｏｌａｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙＰｒａｓｓ。

６６、　５ａｎｅｓ、　Ｊ、ｒ、、　Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、、　Ｂｕｔｋｏｗ ｓｋｉ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ。

Ｄ、Ｄ、９１９９０）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎａｉｔｙ　ｏ ｆ　ｂａｓａｌｌａｍｉｎａａ：　工ｓｏｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｌａｍｉｎｉｎ　 ａｎｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｒＶ　ａｔ　ｔｈｅｎａｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ　 ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｌｓｅｗｈｅｒｅ、Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

」ユニ１６８５−１６９９゜ ６７、Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ 、Ｒ，（１９８８）　ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔ ａｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ヱ４：５４６コ。

６ａ、　５ｃｈａｃｈｎｅｒ、Ｍ、、Ａｎｔｏｎｉｃｅｋ、　Ｈ，、Ｆａｈｒｉ ｇ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ。

（１９９０）　Ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｃａｌｌ　ａｄｈｅｓ ｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ。

Ｉｎ　Ｍｏｒｐｈｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ　（ａｄｓ−Ｇ 、Ｍ＋　Ｅｄｅｌｍａｎ。

Ｂ、Ａ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ａｎｄ　Ｊ、Ｐ、Ｔｈ１ｅｒｙ）　Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｌａｙ　ａｎｄＳｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、４４３−４６８゜６９ 、５ｉｖｅ、　Ｈ，Ｌ、　ａｎｄ　Ｊｏｈｎ、　Ｔ、Ｓ、　（１９８日）　入　 ｓｉｍｐｌａｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔａｃｈ ｎｉｑｕａ　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌａ　ｂｌｏｔ ｉｎ　ａｎｄ　ｐｈ＠ｎｏｌ　ａｘｔｒａｃｔｉｏｎ。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、ｉ：１０９３７゜７０、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｘ、Ｆ 、、　Ｎｏ１ａｎ、　Ｋ、Ｆ、、　Ｒａ１ｄ、　Ｘ、Ｂ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｐ＠ｒ ｋｉｎｓ。

Ｓ、Ｊ、（１９９１）　Ｎｅｕｔｒｏｎ　ａｎｄ　Ｘ−ｒａｙ　ｓｃａｔｔａｒ ｉｎｇ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆｔｈａ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｐ ｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｐａｒｄｉｎ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａｎａｎａｌｙｓｉｓ　 ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｒ＠ｐｅａｔ、　Ｂｉｏｃｈ＠ ｍ１ｓｔｒｙ３０：８０００−８０００８゜ ７１、５ｔａｉｎｅｒ、Ｄ、Ｆ、（１９９１１Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｎｖ ｅｒｔａｓａｓ　ｒｅｖａａｌｅｄａｔ　１ａｓｔ、ｃｕｒｒａｎｔ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　１：コ７５−３７７゜７２、Ｓｕｎ、Ｘ、、Ｍｏ５ｈｅｒ、Ｄ、Ｆ、ａ ｎｄ　Ｒａｐｒａｅｇｅｒ、Ａ、（１９８９）１（ｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔ ｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｅｐｉｔｈａｌｉａｌ　ｃａｌ ｌｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　ｔｏ　廿ｚｏｍｂｏｓｐｏｎｄ ｉｎ、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

（１９８９）　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　 ａ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｏｆＶＬＡ−４：　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ 　ｉｎｔａｇｒｉｎｓ　ａｎｄ　ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅｃａｌｌ−ｃａｌｌ　ａ ｃｌｈｅｓｉｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＥＫＢＯＪ−旦：１３６１−１：１６１ ３゜７４、Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｍ、ａｎｄ　Ｐａｃｚｅｋ、Ｍ、 （１９９１）　Ｔａｒｇｅｔａｔｔｒａｃｔｉｏｎ：　ａｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐ ｉｎｇ　ａｘｏｎｓ　ｇｕｉｄｅｄ　ｂｙｃｈｅｍｏｔｒｏｐｉｓｍ？　Ｔｒｅ ｎｄｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌ丘：３ｏコー３１０゜７５、Ｔａ ５ｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｑｎｅ、　Ｍ、、Ｐｌａｃｚｅｋ、　Ｍ、、　Ｌｕｍ５ｄ ｅｎ、　Ａ、Ｇ、Ｓ−。

Ｄｏｄｄ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊｅｓｓａｌｌ、Ｔ、Ｍ、（１９８８）　Ｃｈｅｍｏｔ ｒｏｐｉｃｇｕｉｄａｎｃｅ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ａｘｏｎｓ　ｉｎ 　ｔｈｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔａｍ 、Ｎａｔｕｒｅ　３３５ニア１５−７７８゜７６、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、　（ １９８コ）　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＲＮ入 ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｏｒ　ｄｏｔｔａｄ　ｏｎｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌ ｕｌｏｓｅ　ｐａｐａｒ。

Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１００＋２５５−２６６゜７７、Ｔｕｔｔｌｅ、Ｒ ，，５ａｎｄｒｏｃｋ、入、Ｗ、ａｎｄ　Ｍａｔｔｈｅｗ、Ｗ、Ｄ、（１９８９ ）ｙｌｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ、Ｄｅｖ、Ｎａｕｒｏｓｃｉ、ｌｌ：２ Ｂ９−２９９゜７Ｂ、ｖａｎ　５ｔｒａａｔａｎ、Ｈ，Ｗ、Ｍ、、Ｈｅｋ３ｃｉ ｎｑ、Ｊ、Ｗ、Ｍ、、Ｗｉａｒｔｚ−Ｈｏｅｓｓａｌｓ、Ｅ、Ｌ、、Ｔｈｏｒｓ 、Ｆ、ａｎｄ　Ｄｒ′ｕｋｋａｒ、Ｊ、（１９８８）Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ　ｏｎ　ｔｈａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ａｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔａ　ａｒｅａ　ｉｎ　ｔｈａ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｕ ｂａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋａｍｂｒｙｏ、Ａｎａｔ、Ｅｍｂｒｙｏｌ、Ｌ ヱヱ：３１７−３２４゜７９、　ｖｏｎ　Ｈａｉｊｉｎｅ、Ｇ、（１９８５）　 Ｓｉｇｎａｌ　５ａｑｕｅｎｃａｓ：　ｔｈ＠　１１ｍ１ｔｓｏｆｖａｒｉａｔ ｉ口ｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ口１０ｍ：９９（０５−８ｏ、Ｗａｇｎａｒ、　Ｍ、 、　Ｔｈａｌｌａｒ、　Ｃ，、Ｊｅｓｓｅｌｌ、　Ｔ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｅｉｃｈ ａｌａ。

Ｇ、　（１９９０）　Ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｒａ ｔｉｎｏｉｄ　５ｙｎｔｈａｓｉｓｂｙ　ｔｈｅ　ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔａ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　ｎａｕｒａｌ　ｔｕｂｅ、　Ｎａｔｕｒｅ３４５：８１９−８２２ ゜ ８Ｌ　Ｗｅｂｅｒ、　入、（１９３Ｂ）　Ｃｒｏｉｓｓａｎｃｅ　ｄｅ　ｆｉｂ ｒａｓ　ｎａｒｖｅｕｓｅｓｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌａｓ　１ｏｒｓ　ｄａ　１ ｅｓｉｏｎ　ｄａ　ｌａ　ｍｏｅｌｌａ　ｅｐｉｎｉａｒａｃｈｅｚ　ｄａ　ｊ ａｕｎｅｓ　ｅｍｂｒｙｏｎｓ　ｄａ　ｐｏｕｌｅｔ、　Ｂｉｏｍｏｒｐｈｏｓ ｉｓ１＝コ０−３５゜ ８２、　Ｗｅｈｒｌａ、Ｂ、ａｎｄ　Ｃｈｉｑｅｔ　に−（１９９０）　Ｔａｎ ａｓｃｉｎ　ｉｓａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ　ａｌｏｎｇ　ｄａｖｅｌｏｐｉｎｑ 　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｎｅｒｖｅｓ　ａｎｄａｌｌｏｗｓ　ｎａｕｒｉセｅ 　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、　Ｄａｖｅｌｏｐｍａｎｔ＝Ａ：４ ０１−４１５゜ ８３、Ｗｉｌｌｃｉｎｓｏｎ、Ｄ、Ｇ、、Ｂａ１ｌｅｓ、Ｊ、Ａ、、Ｃｈａｍｐ ｉｏｎ、Ｊ、Ｅ、ａｎｄＭｃＭａｈｏｎ、　Ａ、Ｐ、　（１９８７）入ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅｄａｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｆ ｒｏｍ　８　ｔｏ　１０　ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｃｏｉｔｕｍ　ｄｅｔｅｃｔｓ ｃｈａｎｇａｓ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　ａｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｌｏｂｉｎ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ旦９：４９３−５００゜８４、Ｙａｇｉｎｕｍａ、　Ｈ ，、Ｈｏｍｍａ、’　Ｓ、、　Ｋｕｎｚｉ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｏｐｐｅｎｈｅｉ ｍ。

Ｒ，Ｗ、（１９９１）　Ｐａｔｈｆｉｎｄｉｎｇ　ｂｙ　ｇｒｏ硝上ｅｏｎａｓ 　ｏｆｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ　１ｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃ ｈｉｃｋ　ｅｍｂｒｙｏ　５ｐｉｎａｌｃｏｒｄ：　ａ　ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　 ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｍ１ｅｒｏｐｓｃｏｐｉｃ　５ｔｕｄｙ、　Ｊ。

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（２）配シリ認識舌号１つのためのＲ１＋１１（ｘｌ）配列の記載　配列認識番 号］９：１１＠Ａｍｐ　ｅｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌ４ｕ　Ｓ＠ｒ　ＧＬｕ　Ｔｒｐ　Ｓ ｉｒ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｓｅｘ：　Ｃ１ｕ　Ｃｙｓ　＾ａｎ　Ｌｙｅユ５１０ｉ ｓ ５ａｒ　Ｃｙｍ　Ｃ１ｙ　Ｌｙ＋＋　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　１４ｓｔ　Ｉｌｅ　Ａｒ ｇτｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｃ１K Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＰＭ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｐｒ口　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　入ｚｑ　Ｌｙｖ　ＬｙｓＣＹｍ　Ａｒｇ　Ａ１ １　人ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　入ｒ９（工１）配列の記載　配列認詭番 号２０；Ｐｒｏ　Ｇ工ｎ　Ｃｙ＠　入ｒｇ　Ｍｅｔ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　 Ｔｈｒ　＾ｌａ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　丁ｈｒ　Ｌｙｓｌ　５　１ ０　１ｓ Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｘｌｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　入ｒｇ　 ？ｙｒ　Ｍ＠セ　丁ｈｔ　Ｖａｎ　Ｌｙ纒　Ｌｙｓ　λｒ９Ｐｈ＠　Ｌｙｓ　５ ｅｒ　５ａｒ　Ｇｌｒ＋　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｓｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　 Ｌｙｅ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　工１ｅ　λｒX コ５　４０　４５ Ａｌａ　Ｃｙｔｉ　入ａｎ　Ｖａｌ　）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　Ｃ７ｍＦｉｇｕｒｅ　 ２ 富化されたｃＤＮＡライブラリー ｄ−１−とと一−ｔり一？ 貝 Ｆｉｇｕｒｅ　７Ａ　Ｆｉｇｕｒｅ　７８　Ｆｉｇｕｒｅ　７ＣＦｉｇｕｒｅ　 ７ｏ　Ｆｉｇｕｒｅ　７Ｅ工　工 ｚ　ｚ Ｆｉｇｕｒｅ　９Ｄ 軸索の長さくミクロン） Ｆｉｇｕｒｅ　１０Ａ　Ｆｉｇｕｒｅ　１０８Ｆ１０８Ｆｉ　１００　Ｆｉｇｕ ｒｅ　１０ＤＦｉｇｕｒｅ　１０日 〜内 Ｅ−スボンデイノ Ｆｉｇｕｒｅ　１０Ｆ 硫酸コンドロイチン　ヘパリン フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、 ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、　ＬＬＪ、　ＭＣ，ＮＬ、 ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　Ｇ Ｎ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、ＦＩ。

ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，ＮＺ 、ＰＬ、Ｒ○、　ＲＬ７．　ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳＩ （７２）発明者　クラ−、アビフ アメリカ合衆国、ニューヨーク州　１０４６３、ブロンクス、アパートメント　 １２０４、ネザーランド・アベニュー　２６００

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｆ−スポンディンをコードする、単離された脊椎動物核酸分子。
2. ２．前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の単離された背椎動物拡散分子。
3. ３．前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項２に記載の単離された脊椎動物拡散分 子。
4. ４．前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の単離された脊椎動物拡散分子。
5. ５．請求項１に記載の単離されたヒト核酸分子。
6. ６．請求項１に記載の単離されたラット核酸分子。
7. ７．請求項１に記載の単離されたニワトリ核酸分子。
8. ８．請求項１に記載の単離されたツメガエル核酸分子。
9. ９．請求項１の核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズする ことができる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子を含む核酸プローブ。
10. １０．前記核酸がＤＮＡである、請求項９に記載の核酸プローブ。
11. １１．前記核酸がＲＮＡである、請求項９に記載の核酸プローブ。
12. １２．ＲＮＡ転写のプロモータに作用的に連結されている、請求項１に記載の単 離された核酸分子。
13. １３．請求項１の単離された核酸分子を有するベクター。
14. １４．前記核酸分子がプラスミドに連結されている、請求項１３に記載のベクタ ー。
15. １５．Ｆ−スポンディンの生物学的活性を有するポリペプチドを製造するための 宿主ベクター系であって、適切な宿主中に請求項１３のベクターを有する宿主ベ クター系。
16. １６．前記適切な宿主がバクテリア細胞、昆虫細胞または動物細胞である、請求 項１５に記載の宿主ベクター系。
17. １７．Ｆ−スポンディンの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法で あって、請求項１５の宿主ベクター系を、前記ポリペプチドの産生およびこうし て産生されたポリペプチドの回収を可能とする条件下で増殖させることを具備し た方法。
18. １８．精製された脊椎動物Ｆ−スポンディンポリペプチド。
19. １９．請求項１の単離された脊椎動物核酸分子によってコードされるポリペプチ ド。
20. ２０．神経細胞をマトリックスに付着させる方法であって、該マトリックスを、 神経細胞および該細胞のマトリックスヘの付着を起こさせるのに有効な濃度の精 製されたＦ−スポンディンに接触させることを具備した方法。
21. ２１．神経細胞の成長を刺激する方法であって、神経細胞を、該神経細胞を刺激 するのに有効な濃度の精製されたＦ−スポンディンに接触させることを具備した 方法。
22. ２２．対象中において神経細胞を再生する方法であって、該対象に対して、対象 中で神経細胞を再生するのに有効な濃度の精製されたＦ−スポンディンを投与す ることを具備した方法。
23. ２３．神経細胞の成長を刺激するための薬剤組成物であって、薬剤的に許容され 得るキャリアと、神経細胞の成長を刺激するのに有効な濃度の精製されたＦ−ス ポンディンとを含有する組成物。