JPH07507810A - 内植可能なカプセル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内植可能なカプセル 本発明は物質の封入技術分野に関する。さらに正確には、本発明の目的は選択的 に透過可能な膜によって封入される物質により構成されるカプセルにある。

多年に亘り、封入分野ではかなりの進歩かなされている。事実、封入は、カプセ ルの種類と大きさを選ぶことにより、解放速度論と共に、活性成分が解放される 前の時間を決定できる遅効性薬剤の生産への応用を見出している。

封入技術は、ランゲルハンス島等、細胞や細胞群の移植分野に特に応用される。

ランゲルハンス島の内植は、インシュリン生産の不足を和らげるため糖尿病患者 に行なわれる。島が予備封入なしに人体に内植される場合、拒否反応抑制処置に も拘らず拒絶の危険性が高い。そのため、その内植前に島を封入することが好ま しく、それにより抗原バリアを構成するシェルか島のまわりに形成され、種々の 起源の島、特に、豚の島か使用される。

使用されるカプセルは免疫系の要素を透過できないが、血液中のグルコース濃度 に応じて分泌されるインシュリンと共に島に栄養分を与えるのに必要な所要養分 を透過できるシェルを持たねはならない。さらにまた、カプセルは生物学的適合 性で、内植の部位を形成する組織中で不都合な反応を生じてはならない。

生物材料でカプセルを製造する技術状態で種々の方法か提案されている。

そこで、１９８８年に発行された、“ジャーナル　オブ・バイオメディカル・マ テリアル・リサーチ”の第２２巻１０６１−１０７０頁に“生存細胞周囲のマイ クロ封入媒体のその場での重合化“と題するシュブイ・ギン・バケイとジュカソ ウの論文では、生存細胞のためのマイクロ封入方法が記載されている。この方法 によれば、被封入細胞はアガローズ溶液中に入れられ、パラフィン油て押出され る。この押出しは、内部に細胞がアガローズの懸濁液中に見られるシリンジ針に よって行われる。この側自身は、パラフィン油が押し込められている、わずかに 大径の毛管内に配置される。パラフィン油の送出はアガローズのレベルより高い レベルに維持される。毛管の端部で、ボールが４°Ｃに冷却されたパラフィン油 洛中に注入されてボールを急速ゲル化する。

ここで得られたボールはつぎに、重合可能な溶液によって第二の被覆操作を受け る。ボールはポリエチレン毛管中に吸引される。Ｔ部分はこの管に接続されモノ マー溶液をそこに導入しくアクリルアミド３０％とビスアクリルアミド１．　５ ％）、それに増感剤と触媒反応体か添加される。ついで、管は、内部に高圧水銀 灯を配置した照射室を通過し重合を開始させる。製造されたボールはその後、保 存媒体を自存する溜めに捕集される。

それてもなお、このような手順は多くの欠点、特に、２つのかなり分化した段階 と不連続であるという欠点かある。

さらにまた、重合反応は封入細胞にとって毒性の危険か高く、ある数のポリマー 溶液にのみ適用できる。

従って、本発明の目的は、内部で封入物質がその生存性と、その機能能力を保持 する内植可能（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ　）なカプセルにある。

本発明の他の目的は、生物学的適合が可能で、内植部位を形成する組織に拒絶反 応を生しない内植可能なカプセルにある。

この目的を達成するため、本発明の対象は、アクリロニトリルと、メタリルスル ホネートナトリウムのヒドロゲルにより構成される外シェルと、 封入物質よりなる内コアとを含むことを特徴とする内植可能なカプセルにある。

本発明は、特別の尺度を付けないで発明の態様を略示する図面を参照して述べる 以下の説明を読むとさらに容易に理解される。

図１は、本発明の装置全体の線図である。

図２は、図１の枠部分の拡大図である。

図３は、発明による方法の第１工程を示す。

図４は、発明による方法の第２工程を示す。

図５は、発明による方法の第３工程を示す。

図６は、本発明の製品により得られたテストの結果を示す。

図１に示す装置は、溜め２に存在する、封入される物質を送る毛管ｌを備える。

この毛管ｌは、溜め５から発するキャリア流体を移動させる管４との交差部３を 含む。ここで２つの管の簡単な接点として示される交差部３は、実際には、管ｌ に存在する被封入物質の軸方向押出しと、管４に存在するキャリア流体の環状同 時押出し用の装置により構成される。ついて管ｌは、溜め８からポリマー溶液か 管７によって送られる、実質的に円すい形のノズル６の中央部分に現わる。円す い形ノズル６は短かいくびれダクト９へ延び、このダクト自身は、くびれダクト ９の反対側端部か溜め１１に存在する液体表面と同じ高さになっている低温管！ その中味の温度を低下させる。溜め２．　５．　８の中味は、それぞれ管路１４ ，１５．１６によって送られる圧縮空気による圧力によってそれぞれ管１．　４ ．　７内を循環される。装置１７により各溜め用の制御される空気が供給され、 それらの圧力、従って管１．　４．　７内の流量を制御できる。

因２に示すように、毛管ｌは、円すい形ノズル６内に通ずる端部にテーバ壁１８ を有する。この壁１８は、開き角がαである円すい形ノズルから距離ｄに位置し ている。押出しポリマー溶液の量、従って形成のカプセルの厚みを変化させる毛 管！の移動度のため、距離ｄはノズル６内で変化する。

管１．　４．　７．　９．　１０の組は、その内部を循環する種々流体に対し不 活性である疎液性材料により形成される。これは、例えば、半透明と０う利点を 有するポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）である。

被封入物質は異なる種類である。例えば、溶液（例えば、インシュリン）または 懸濁液の形式で溜め２内に存在する（薬剤等の）生物学的活性を有する物質を封 入てき：また、バクテリア、ＲＩＮ細胞、肝細胞、膵臓β細胞、ランゲルハンス 島、赤血球、Ｌ９２９細胞（マウス線維芽細胞等）、細胞生存に適する媒体の懸 濁液中の細胞または細胞群を封入できる。

封入に使用されるポリマー溶液は、 アクリロニトリルと、アニオン基を有するオレフィン系不飽和コモノマーとのコ ポリマーと、 特に、ＮＮ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ ｏ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはプロピレンカーボネート（ＰＣ） 等適当な溶剤と、 水性塩溶液等非溶剤どを含む。

溶液を構成する要素各々の個々の割合は、特に、その透過性に関するかぎり、カ ブセルンエルに期待される特性により変化する。

容器５に存在するキャリア流体は被封入物質の流れを分割するのに使用される。

この目的のため、ポリマー溶液に存在するポリマーまたはコポリマーと凝固しな い非溶剤疎水流体を選び、この流体は被封入物質を攻撃してはならず：その性質 は、一方で被封入物質と、他方でポリマー溶液との界面か１を人に適合される湿 水性を有するように選ばれる。

特に、ポリマー溶液かアクリロニトリルコポリマーを含む場合、本発明の目的に 適するキャリア流体の一例は部分的にヒドロキシル化したポリツメチルシロキサ ン油により構成され、ヒドロキシル化度は所望の親水度により規制され、親水度 が大きいほと、被封入物質のセグメントサイズか大きくなる。

キャリア流体の粘度は、所望の流量とともに被封入物質のセグメントサイズに適 合されねはならない。事実、すへてのことか等しいのであれば、キャリア流体の 枯関か増加するに伴い、被封入物質のセグメントサイズは、せん断力も増大する ので、減少する。

溜めＩＩに存在する液体は、ポリマー溶液に含まれる溶剤を非溶剤と交換する液 体である。この操作により、被封入物質のまわりに、非熱可逆ゲル状態のシェル を得ることができる。使用される非溶剤の選択は押出しポリマー溶液の性質に左 右される。ポリマー溶液に存在するポリマーまたはコポリマーを沈殿するボテン シャルか異なる２つの液体を含む浴を使用できるのか有利である。従って、例え ば、溜めＩＩにｒＴ在する浴は、強弁溶剤により構成される下相と、軟非溶剤に より構成される上相とにより構成される。

強弁溶剤を、！味する非溶剤は、凝固剤として使用されると、接触すると溶液を 早急に沈殿する。一方、軟非溶剤は溶液をきわめてゆっくり沈殿する。

軟非溶剤により構成される」二相の使用により、カプセルを変形させないで強弁 溶剤に４通できる。

使用される強弁溶剤か水溶液である場合には、ポリマー溶液の溶剤を水と代える と、良好な生物学的適合性を得るのに好ましいヒドロゲルが形成される。

上記装置の操作は以下の通りである。

管路１５から進入する空気による圧力によって、キャリア流体は溜め５から循環 される。空気圧は装置１７により制御されて適当な流量を得る。管路ｌ内のキャ リア流体の流れをノズル６の方へ助長し、溜め２の方へ流れないようにするため 、交差部３と溜め２の間部分上に管ｌを固定しまたはこの管部分に圧力上昇を生 ずることができる。

キャリア流体か溜め１１に達すると、装置１７が作動して、溜め８に圧縮空気を 送り、ポリマー溶液の流れを、管７を介しノズル６に発生させる。次に距ｌａｄ をノズル６内の管１を上下に変位させて調節しカプセルのシェルの厚みを調節す るようにする。次に、装置１７が作動して被封入物質を管ｌ内で循環させる。溜 め２．　５．　８内の空気圧は、被封入物質、キャリア流体およびポリマー溶液 にとって望ましい流量に従って制御される。

キャリア流体のく粘度とともに）流れは、被封入物質のセグメントサイズを調整 し、キャリア流体の一定流量にとって、被封入物質の流量は被封入物質の２つの セグメント間に存在するすき間を調整し、流れが増大すればするはと、２セグメ ント間のすき間は小さくなる。ついで、ノズル６によるポリマー溶液の送り流れ を調節して、被封入物質の各セグメントのポリマー溶液滴を形成する。

図３に示すように、被封入物質の流れとポリマー溶液との間に同期化か得られる と、管ｌの端部のテーパ壁１８の存在により、ポリマー溶液が、被封入物質に続 きくびれダクト９（図４）の内側に落下する滴として押出される。チャネル９の 長さは、細長い滴か生ずるように選ばれる。

滴の細長形状はその後回転しん臓形状（図５）となる滴にとして好ましく、チャ ネル９から現われると、大きい横断面積を有する管１０に入る。管１０内での滴 と被封入物質の進行中、それら互いの親和力によりキャリア流体を除去させ、被 封入物にポリマー溶液を塗布する。

この塗布を容易にするため、（図３に示すように）被封入物質のセグメントが管 ｌの端部に達するまさにその瞬間に形成されたポリマー溶液滴か壁１８から離れ るようにポリマー溶液の流れを調節することかでき、これにより、被封入物質を 、そのｉ＆塗布操作を促進するポリマー溶液と直ちに接触させることかできる。

本発明の特長によれば、形成されるカプセルはそのｉＬ管１０内での流れ中に、 エチレングリコール等冷却液か循環する二重シェル１２により主として構成され る冷却装置によって冷却される。冷却液は形成されるカプセルの流れ方向と向流 、て循環する。

温度を低）すると、被１１人物を、ポリマー溶液に存在する溶剤のありうる存置 効果より保護する。また、形成されたカプセルの、溜め■１の非溶剤中への通過 を変質なしに促進する。

温度が、ポリマー溶液のゲル化温度以下になるまで冷却か行われるのて有利であ る。従って被封入物質を被覆するシェルは溶解状態から熱可逆ゲル状態へ変化す る。この熱可逆ゲル段階への変化により、溶剤と溜め１１に存在する非溶剤との 交換工程ｉ＆、構造か均質で表面か完全に円滑な不可逆ゲルを得ることかでき、 それ（こよって、構造かフィンブｊ（ｆｉｎｇｅｒ）てもスキン（ｓｋｉ口）て もない、カプセルを包絡する膜か得られる。

熱可逆シェルの状態から溶解状態へ変化し、また溶剤／非溶剤交換のありうる発 熱性向を補償することになる、カプセルの突然の再加熱を回避するように、溜め １１の浴は周囲温度より低い温度に有利に維持される。

溶剤／非溶剤交換操作後、シェルか非熱可逆ゲルにより形成されるカプセルか得 られる。これらカプセルは、洗浄されてから使用前に適当な媒体中に保存される 。

上記の他、壁かアクリロニ］・リルと、メタリルスルホ不−１−すトリウムとの ヒドロゲルにより構成される中空ファイバ形式のマクロカプセルを製造てきる。

これらマクロカプセルは、被封入物質と、アクリロニトリルとメタリルスルホ不 −１・すトリウムとのコポリマーと、塩化ナトリウムと、ジメチルスルホキシド とを含むポリマー溶液との同時押出しにより製造され、同時押出し後に、周囲温 度での沈殿浴における凝固工程か行われる。寿られたファイバは肉厚か１００μ ｍで内径か４５０μｍである。

便± ＮａＣｌを０９％とアルブミンを１％を存する水溶液中の懸濁液にＲＩＮ細胞を 封入することに決める。ＲＩＮ細胞は、アルギニンで刺激されるとインシュリン を分泌できる腫瘍マウス細胞である。

使用される封入装置において、毛管１と４は、内径が０．７ミリ、外径か１゜１ ミリで断面が円形のポリテトラフルオロエチレン管により構成される。くびれダ クト９の長さは３ミリ、内径は０．９ミリである。冷却管ＩＯは、内径かＬＩＥ す、外径か１．７ミリで長さが３５センチの管により構成される。溜め８内の空 気圧を変化させてポリマー溶液の流量を正確に調節するため、ポリマー溶液を送 る直径か５ミリ未満の管７か選ばれる。円すい形ノズル６の開き角度ａは約４５ °で、テーパ壁の端部１８とノズル６間の距離は約０．２ミリである。

使用されるキャリア流体は、粘度が３　ｃＰｏでヒドロキシル基が１７０ｐｐｍ のシリコーンオイル７８％と、粘度が３，５００ｃＰｏてヒドロキシル基が１１ ０１０ｐｐのシリコーンオイル１７％と、ヘキサデカン５９６とにより構成され る混合物である。

得られた混合物は３０６　ｐｐｍのヒドロキシル量よりなり、その粘度は２７ｃ Ｐ。

てあり、０．３０ｍ１／分の流量て管４内を循環する。

ポリマー溶液は、アクリロニトリルとす１−リウムメタリルスルホネートとのコ ポリマー６％と、９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムの水溶液３９６と、ジメチルスルホ キット９１％とより構成される。

この溶液のゲル化温度の約９°Ｃに設定される。

ノズル６にポリマー溶液を送る速度は０．０７ｍ１／分である。

ａ度か約１０＠細胞／ｍｌの塩水中の懸濁液中のＲＩＮ細胞により構成される被 封入物質は０．０１ｍ１／分の流量で管１内を循環する。溜め２．　５．　８は 周囲温度である。

同時押出は２４°Ｃで行われる。管ＩＯの冷却は、冷却装置から現われる設定点 温度が１°Ｃであるエチレングリコ／水混合物の二重シェルＩ２に向流れでの循 環により行われる。

溜め１１の浴は、９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムの水溶液により構成される下相と、 エタノール７０体積％と、ブタノール４％と、イソプロパツール１％と、数滴の メチレンブルーか添加される水２５％とにより構成される混合物により形成され る小量の上相とを含む。浴は７ａｌ温度である。

これら２相間の界面は、カプセルを変質させずに貫通を促進するアルコール濃度 勾配を有する。

得られたカプセルは、外径が約８００μｍと９００μｍの間の完全球形である。

シェルは半透明で一定厚みは１００μｍである。

これは、水８６％と、アクリロニトリルとメタリルスルホネートナトリウムとの コポリマー１４％よりなるヒドロゲルにより構成される。

９ｇ／ＬのＮａＣ１水溶液で洗浄後、子牛の胎児の血清を１０％含むＲＰＭＩ培 養にカプセルを入れる。１９日後、顕微鏡による観察では、カプセル内のＲＩＮ 細胞は増加していることを示す。

アルギニンによる刺激テストでは、封入ＲＩＮ細胞の機能を示す。実際には、１ ５〜２７をウェルに入れる。培養媒体をクレブス（ｋｒｅｂｓ）溶液と代える。

第１基準培養が得られ、インツユリンの基礎レート（ｂａｓａｌ　ｒａｔｅ）を 知ることができる。ついで、この溶液を、アルギニンとテオフィリンを含む“刺 激性”クレブス溶液と代える。ｌＯのウェルで実験を行う。各ウェルのインシュ リン投与の結果を図６に示し、カプセルか刺激されるとインシュリン分泌が見ら れる。

結論として、ＲＩＮ細胞は生存しており、シェルか養分に、アルギニンにまたイ ンツユリンに透過するカプセル内で機能している。

例２ この場合、被封入物質は、４００１／ｍｌのインシュリン溶液により構成される 。

作業の操作温度とともに、ポリマー溶液と、溶剤／非溶剤交換の浴との配合、お よび封入装置は例１と同しである。

キャリア流体は、ここては、粘度が７５０ｃＰｏてヒドロキシル基２，５００ｐ −であるシリコーンオイル１７％と、粘度が３　ｃＰｏてヒドロキシル基１７０ ｐ−であるシリコーンオイル８３％とにより構成される混合物であるう得られた 混合物は、ヒドロキシル基約５７０　ｐｐｍを含み、その粘度は！３，４ｃＰｏ である。

循環流量はつぎの通りである： インシュリン溶液：　０．　００８ｍｌ／分オイル：　０．　４７ｍｌ／分 ポリマー溶液：０．０６ｍ１／分 得られたカプセルは完全な球形であり、厚みが一定で約１００μｍの半透明シェ ルを存し、外径は約８００μｍと９００μｍの間である。

例３ ここで、被封入物質は、９ｇ／ＬのＮａＣ１水溶液中の懸濁液におけるランゲル ハンス島により構成される。

ポリマー溶液と、キャリア流体と溶剤／非溶剤交換液体との組成物は例２と同し である。

循環速度はつぎの通りである。

島の懸濁液：　Ｏ，ＯＩ　９ｍｌ／分 オイル：　０．　３６６ｍｌ／分 ポリマー溶液：　０．　０５３ｍｌ／分島とポリマー溶液との同時押出は周囲温 度で行われる。

冷却装置１３の出口での冷却液の設定点温度は一６℃である。溶剤／非溶剤交換 の浴の温度は５°Ｃから１５°Ｃへ変化する。

得られたカプセルは、完全な球体で、これは、アクリロニトリルとメタリルスル ホネートとのヒドロゲルにより構成される半透明シェルにより覆われる塩水中の 懸濁液におけるランゲルハンス島により構成されるコアを有する。カプセルの外 径は８００μｍと９００μｍの間である。カプセルの厚みは約１００μｍである 。

カプセルは、子牛の胎児の血清１０％を含む（ＲＰＭＩ）培養媒体に保存される 。

例４ この例では、バクテリア（大腸菌）の封入はトリブカセ・ツヤ（Ｔｒｙｐｃａｓ ｅ−Ｓｏｊａ　：　ＴＳ）培養媒体における懸濁液で得られた。

封入条件は、下記の流量を除き、例１と同じである。

バクテリアの懸濁液では：０．ＯＩ４５ｍｌ／分オイルでは：０．４７ｍ１／分 ポリマー溶液では＋０．０６ｍ１／分 得られたカプセルは、バクテリアの懸濁液により構成される直径が６５０μｍの コアを覆うシェルにより形成される完全な球体である。それらは３７℃のＴＳ培 養媒体で培養される。

培養媒体で２４時間後、つぎに８時間後のカプセルの観察では、シェルを破裂せ ずにバクテリアの増加を示している。

例５ マイクロカプセルは、例１に記載された方法による生理学的液体を充てんして製 造され、入植部位についてのそれらの生物学的適合性を検到する。

カプセルはその後、ラットの皮下組織に内植される。３週間後、カプセルか凝集 し、除核てきる器官構造を形成することを観察する。カプセル周囲の組織反応を 検査すると、２ケ月後に観察された細胞層の厚みは、３ケ月後に観察された厚み と比−＼てかなりの減少を示し、これは、カプセルに（１着するマクロファージ 層の消失と、炎症反応中断たに形成される結合組織の後退の結果である。

さらにまた、カプセル間で自由となった空間は２ケ月後、交換にとって好ましい 毛管系によって横切られている。６ケ月後に行った観察では、繊維厚は２ケ月後 の観察と同してあった。

カプセルはまた、ラットの腹膜腔に内値し、その反応は皮下組織て観察された反 応と同様であった。

例６ 中空ファイバは、島の懸濁液と、アクリロニトリルとメタリルスルホネートナト リウムとのコポリマー１０％と９ｇ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液５％とジメチル スルホキッド８５％とより構成されるポリマー溶液との同時押出しによりランゲ ルハンス島を充てんして製造される。

同時押出しは、直径か約３３０μｍで、８４５μｍの環状外ダクトにより包囲さ れる内ダクトを備える（２つのダクト間の肉厚は１３０μｍ）スチールダイによ り行われる。

ａ懸濁液とポリマー溶液の押出速度はそれぞれ０．１６ｍ１／分、３　ｍｌ／分 である。

ダイは、周ＶＢ温度で９ｇ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液により構成される沈殿剤 浴上的２０ｃｍに位置する。ダイから現れ出ると、同時押出ファイバは沈殿浴に 落ち込んで凝固される。ファイバ壁は、水８０％と、アクリロニトリルとメタリ ルスルホネートナトリウムとのコポリマー２０％とよりなるヒドロゲルにより構 成例６により得られたファイバはラットの皮下組織にそして腹膜腔に内植された 。

観察された組織反応を例５に記載された組織反応と比較すると、ここでも内植２ ケ月後安定している。

さらにまた、内植３週間後に腹膜腔から外植されたファイバを培養してから刺激 した。

試験後、インツユリンの分泌増大により刺激グルコース溶液に応答する能力を示 すファイバもあった。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇｕｒｅ３ ＦＩＣ’ｕｒｅ　＝− こフ 基礎クレブス　刺激アルギニン４００ｍＭ十テオフィリン５ｍＭ フロントページの続き （７２）発明者　オニジェル、シリ フランス国エフ−９４８００ヴイルジュイフ。

リュ　ルイスーミシエル　１４ （７２）発明者　ミュスカ、エリク フランス国エフ−６９１００ヴイルルバン。

クル　エミルーゾラ、３５４

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．アクリロニトリルと、メタリルスルホネートナトリウムとのヒドロゲルによ り構成される外シェルと、 封入物質から成る内コアとを含むことを特徴とする内植可能なカプセル。
2. ２．カプセルは８００μｍと９００μｍ間より実質的になる直径を有する球形で あり、シェルは実質的に１００μｍに等しい一定厚みを有することを特徴とする 請求の範囲第１項記載の内植可能なカプセル。
3. ３．コアはランゲルハンス島または膵臓β細胞から選択される物質を含むことを 特徴とする請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の内植可能なカプセ ル。
4. ４．シェルは、インシュリンを、及び、被封入物質により要求される栄養分を透 過できることを特徴とする請求の範囲第３項記載の内植可能なカプセル。
5. ５．コアは肝細胞を含むことを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載 の内植可能なカプセル。
6. ６．シェルは水を少なくとも８０％含有することを特徴とする前記各請求の範囲 の内の１つに記載のな内植可能なカプセル。