JPH07507204A - システミン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シスチミン カバメントスボンサーシップ この発明は、アメリカ合衆国ナショナルサイエンスファウンデーシジンにより与 えられた付与番号ＤＣＢ　９１０４５４２に基づきアメリカ合衆国政府の支持を 受けてなされたものである。

関　連　出　願 本出願は１９９２年３月１９日に出願された米国特許出願第０７／８５５．４１ ２号の一部継続出願であり、この一部継続出願は１９９０年５月２５日出願の米 国特許出願第０７１５２８．９５６号の一部継続出願であり、且つ１９９１年５ 月２４日出願の国際出願穿旧ゴへｌ５９１１０３６８５　号の一部継続出願であ る。

発明の分野 本発明はプラント防禦メカニズムを誘発（１ｎｄｕｃｅ）するための方法及び物 質に関する。より詳しくは本発明のプロテイナーゼインヒビタ（ｉｎｈｉｂｉｔ ｏｒ）などのプラント防禦プロティンの生成を誘発する方法に関すると共に、シ スチミン（ｓｙｓｔｅｍｉｎ）やプロシスチミン（ｐｒｏｓｙｓｔｅｍｉｎ）を エンコード（記号化・暗号イレする遺伝子の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を誘 発もしくは抑制することによってプラント（植物。

苗）の捕食者、草植食動物、昆虫、病原体、ウィルスに対する抵抗力を調整する 方法にも関する。

発明の背景 農作物が捕食者（昆虫、草植食動物、病原体のこと。菌肌カビ、ウィルスを含む ）によりダメージを受けると農業の年間生産高がかなり落ち込んでしまう。

人類は作物に対するダメージを減少させるべく、多種類の化学物質を作り、それ 等を使用してきた。一過性の（一時的な）作物保護能力しか有さない化学物質が 広く使われることによって多くの環境問題が発生した。また、化学物質は次のよ うな問題点も有する。即ち、その地域の全ての有機体・生物体が無差別に処理さ れる取扱われるおそれがある。その結果、多くの有益な有機体に不必要な被害が 及んでしまう。更に、多くの化学物質は潜在的に、人間及び動物に有毒である。

作物に対するダメージを少なくしようとする試みとしては以下のようなものがあ る。即ち、抵抗力を高めるための選択的品種改良・育種・増殖・交配（ｂｒｅｅ ｄｉｎＶである。しかし、抵抗力に関する特性・習性はしばしば多くの遺伝子に よってコントロ・−ルされている。従って、所望の層性を遺伝子学的に選択する ことは非常に難しいか不可能である。抵抗力のある種族・系統においても作物生 産高が減少することは良くある。よって、草植食動物による攻撃に対するプラン トの抵抗力を改善・向上するための合成物質・組成物やプロセスが切望されてい た。

プラントは捕食者による攻撃に対応するための誘発防禦メカニズムを進化・発展 させた（Ｃ，んＲｙａｎ、　１９９０．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔ ｈｏ！、　２８＋４２５；　Ｄ、　Ｊ、Ｐｐｗｉｅｓ、　P９９０．　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５９：８７３；Ｍ、　Ｃｈｅｓｓｉｎ　ａｒｘｉ 　Ａ、　Ｅ、　Ｚｉｐｆ、　１９９０．　Ｔｈｅ　Ｂｏｔａ獅奄モ≠戟@Ｒｅｖ ｉｅｗ　５６： １９３　；　Ｄ、　Ｌ、　Ｄｒｅｙｅｒ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｃ，ＣａｊＩ＋ｐｂｅ ｌ　１．１９８７．　Ｐｌａｎｔ、　Ｃａｌ　１　ａｎｄ　dｎｖｉｒｏｎ、　 １０　：３５３）、　１つのメカニズムは、セリンプロテイナーゼインヒビタの システミック（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）統合・合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む。

上記インヒビタは、ブランント内の離れたティシュ（ｔｉｓｓｎｅ　）位置に蓄 積される。ブロテ・ｆナーゼは昆虫や微生物の消化酵素を抑えることができる（ Ｔ、　Ｒ，Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ａ、　Ｒｙａｎ、　１９７２．５ｃｉｅｎ ｃｅ　１７５ニア７６　Ｃ，Ａ、　Ｒ凾■ ｎ、　１９７８．　ＴｌＢ５３　（７）　：１４８　；Ｖ、　Ａ、　Ｈｉ　Ｉｄ ｅｒ、　Ｌ　Ｍ、　Ｒ，Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ、　Ｓ、　Ｅ、@Ｓｈｅｅｒｍｍ　 Ｒ，Ｆ、　Ｂａｒｋｅｒ。

Ｄ、　Ｂｏｕｌ　ｔｅｒ、　ｌ９８７　Ｎａｔｕｒｅ　３３０　：１６０　；Ｒ ，Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ｎａｒｖａｅｚ、　Ｇ、　ＡｎA　Ｃ，Ａ、　Ｒｙ ａｎ、　１９８９．　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｉ、　ＡｃａｃＬ　Ｓｅｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８６：９８７１ ）、プロテイナーゼインヒビタは、多くの類―属・種類から昆虫（）ｌｅｌｉｏ ｔｈｉｓ、　５ｐｃｘｉｏｐｔ、ｅｒａ、　Ｄｉａｂｉｏｔｉｅａ　ａｎｄ　Ｔ ｒｉｂｏｌｉｕｉを含む）の発育・成長・進化に対１２有害なものとなり得る（ Ｒｙａｎ　（前出）　；Ｂｒｏａｄｗａｙ　（前出）　；Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅ ｒ　（前出））。ポリペプチドの幾つかのファミリーはセリンプロテイナーゼを 抑えると説明されている。これにはクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ、ファミリー（例え ば、大豆トリプシンインヒビタ）と、ボーマン−バーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒ ｋ）ファミリー（例えば、大豆プロテイナーゼインヒビタ）と、ポテト（Ｐｏｔ ａｔｏ）Ｉおよびポテト■ファミリーと、大麦トリプシンインヒビタファミリー と、カポチャインヒビタファミリーが含まれる。

動物（昆虫や病原体を含む）によるプラントの損傷もしくは機械的ダメージは、 プロテイナーゼインヒビタ遺伝子及びプロティン合成の転写（遺伝情報の転写） を誘発するとの報告があるＵ、Ｓ、　Ｇｒａｈａｌｌ、　Ｇ、　ｌ１ａｌ　Ｉ、 　Ｇ、　Ｐｅａｒｃｅ、　Ｃ，んＲｙａｎ、　１９８６．　oｌａｎｔａ １６９：３９９）。後者の損傷−反応は、色々な種類の種（ｓｐｅｃｉｅｓ　） に関して文献に記載されている。上記種には、トマト（Ｊ、　Ｓ、　Ｇｒａｈａ ｍ、　Ｇ、　Ｐａａｒｃｅ、　Ｊ、　Ｍｅｒｒｙｖｅａｔｈｅｒ、　ＬＴｉｔａ ｎｉ、　Ｌ、　Ｅｒ１ｃｓｓｏｎ、　Ｃ，Ａ、　Ｒｙａｎ、　１９８５．　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｓ、　２６０（１１）：６５T５；Ｊ、　Ｓ、　Ｇｒａｈ ａＩＬＧ、　Ｐｅａｒｅｅ、　Ｊ、Ｍｅｒｒｙｖｅａｔｈｅｒ、　Ｋ、　Ｔｉｔ ａｎｉ、　Ｌ、Ｈ，Ｅｒ１ｅｓｓｏｎ、　Ｃ，んＲｙａｎ、　１９８５．　ＪA 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０ （ｌｉ）：６５６１）　、ポテト（Ｃ，んＲｙａｎ、　１９６８．　Ｐｌａｎｔ 　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４３＋１８８０）、アルファルファ（Ｌ　Ｅ、　Ｂｒｏｗ ｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ａ、　Ｒｙａｎ、　１９８４．　Ｂｊ　ｏｃｈｅｍｉｓｔｙ　 ２３　：３４１８　；Ｗ、　Ｅ、　Ｂ窒盾翌氏A　Ｌ　Ｔａｋｔｏ、　Ｌ　Ｔｉ ｔａｎｉ、　Ｃ，Ａ、　Ｒｙａｎ、　１９８５．阻ｃｘ：ｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ ４：２１０５）ウリ科の植物（特にカポチャ属の植物）　（Ｄ、Ｒｏｂｙ、＾＋ 　Ｔｏｐｐａｎ、　Ｍ、　Ｔ、　Ｅｓｑｕｅｒｒｅ−Ｔｕｇａｙｅ、　１９８７ ゜Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｍｏ１．@Ｐｌ、　Ｐａｔｈｏｌ、　３０；６ ４５３）及びポプラの木（Ｈ，Ｄ、　Ｂｒａｄｓｈａｖ、　Ｊ、　Ｂ、　Ｈｏｆ 　１ｉｃｋ、　Ｔ、　Ｊ、　Ｐａｒｓｏｎｓ、　Ｈ，Ｒ，ＧA　Ｃ１ａｒｋｅ、 　１９８ ９、円ａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４　；５１）が含まれる。損傷が生ず ると、損傷された葉においてだけでなく、別の離れた位置の葉においてもプロテ イナーゼインヒビタの蓄積が急速に始まる。このこと（現象）により、損傷箇所 から信号が発せら狛、植物の体中を通って伝搬されることが想像出来る。このよ うな信号の伝搬・伝送は細胞間及び細胞内流体により所々で（局所的に）取次ぎ ・媒介される。上記流体は損傷箇所や感染・汚染箇所に行き亘っている・浸透し ている（Ｇｒｅｅｎ、　Ｔ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｃ，Ａ、　Ｒｙａｐ、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　１７５ニア７ロー７７７、１９７２）か、あるいはプラントの維管縣儂管 系）を通って（介して）全身に流れている（Ｋｕｃ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｃ，Ｐｒ ｅｓｉｓｉｇ、　Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ　７６：７６７−７８４、１９８４　：Ｍ 、　Ｋｏｐｐ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｉａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９０＋２ ０８−２１６．１９９０；ａｎｃ！　k　Ｅ、　ＨａｗｘｙｎｄＪｏｓ ａｅｋ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔ ｈ、　３５；４９５−５０６．１９８９）。提案された損傷M号に は、プラント細胞壁から取られた・派生ｌまた（ｄｅｒｉｖｅｄ）ペクチンフラ グメント（ｆｒａ霞ｅｎｔｓ）　（Ｃ，Ａ、　Ｒｙａｎ　ａｎｄ　Ｅ、　Ｅ、　 Ｆａｎｎｅｒ、１９９１．　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ、　Ｐｈ凾唐奄 盾戟A蓋ｏ１．　Ｂｉｏ、　４ ２；６５１　）と、脂質（１：ｐｉｄ　）派生（ｄｅｒｉｖｅｄ　）分子である ジャスモン酸（ｊａｓｅｏｎｉｅ　ａｃｉｄ）　（Ｅ、　Ｅ、　Ｆａｒｍｅｒ　 ａｎｄ　Ｃ，人。Ｒｙａｎ、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　ＳｅｔA　Ｕ、　Ｓ、ん８７；７７１３）と、 植物ホルモンであるアブシジン酸（Ｈ，Ｐｅｎａ−Ｃｏｒｔｅｓ、　Ｊ、　Ｊ、 　５ａｎｃｈｅｚ−３ｅｒｒａｎｏ、　Ｒ，Ｍｅｒｔｅｎｓ、　Ｌ、　Ｗｉ　ｌ 　Ｉａ＋１ｔｚｅｒ、　Ｓ、　Ｐｒａｔ、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｉ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ、Ｓ、`、８６：９８５１）と、電位・ 電圧（Ｅ、　Ｄａｖｉｅｓ、　１９８７．　Ｐｌａｎｔ、　Ｃｅｌ　Ｉ　ａｎｄ 　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　１０　；６２３　；Ｊ、　Ｆ、　Ｔｈ≠奄氏A　Ｈ，Ｍ、 　Ｄｏｈｅｒｔｙ。

Ｄ、　Ｊ、　ＢｏＷｌｅｓ、　Ｄ、　Ｃ，Ｗｉ　Ｉｄｏｎ、　１９９０．　Ｐｌ ａｎｔ、　Ｃｅｌ　Ｉ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　１３；T６９）と、最近で は、 １８−アミノ酸ポリペプチド（シスチミンと呼ばれる）　（Ｇ、　Ｐｅａｒｃｅ 、　Ｄ、　５ｔｒｙｄｃａ　Ｓ。

Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｃ，Ａ、　Ｒｙａｎ、　１９９１．５ｃｉｅｎｃｅ　２５３ 　；８９５）とが含まれる。

発　明　の　開　示 本明細書に開示されているのは、（ａ）シスチミン（ｓｙｓｔｅｍｉｎ）（１８ −アミノ酸ポリペプチドプラントにおいて最初に見つけられたポリペプチドホル モン）の分離及び整理・配列、（ｂ）プロシスチミン（ｐｒｏｓｙｓｔｅｍｉｎ ）（先駆物質（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）２００アミノ酸２３ｋＤａポリペプチド） の分離及び整理・配列、（Ｃ）プロシスチミンエンコーディングｃＤＮＡ及びプ ロシスチミンｍＲＮＡエンコーディングゲラミック（ｇｅｎｏｍｉ　ｃ）ＤＮＡ の分子クローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）、（ｄ）プロシスチミン合成（ｓｙｎｔ ｂｅｓｉｓ）を抑えるアンチセンス（ａｎｔ　ｉ　５ｅｎｓｅ）ＲＮＡをエンコ ードするアンチセンスベクターの製造・構築拳構造、（ｅ）プロセブテミン（ｐ ｒｏｓｅｐｔｅｍｉｎ）もし、くはシスチミンセンス核酸を含むベクターの製造 中構造、並びに（ｆ）プラントの防禦メカニズムを強化する方法である。シスチ ミンは、損傷誘発植物防禦プロティンの合成の強力な誘発剤であることが認めら れている。

上記プロティンには、プロテイナーゼインヒビタフ７ミリのメンバが含まれる。

すなわち、インヒビタＩ　（８１００Ｄａ）のインヒビタｎ　（１２，３００Ｄ ａ）ファミリが含まれる。植物損傷箇所に適用された放射性同位元素等を用いて 印が付けられたシスチミンは素早（遠くの細胞（ティシュ）に転位−位置換えさ れる。上記遠くの細胞において、シスチミンは防禦プロティンの合成を誘発する 。シスチミンは先駆物質プロシスチミン分子において（の中で）一度だけ表現さ れ・代理され（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）、先駆物質プロティンのカルボキシル 基（の）末端洗端・終点）の近くに位置される。アンチセンスプロシスチミンＲ ＮＡを発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）植物は損傷誘発されたプロテイナーゼ インヒビタの合成・統合を著しく小さくする。センスプロシスチミンＲＮＡを発 現するトランスジェニック（ｔ　ｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物は、損傷誘発された プロテイナーゼインヒビタのレベルを上げる。マンドユーカセクスタ幼虫（Ｍａ ｎｄｕｃａｓｅｘｔａ　１ａｒｒａｅは、トランスジェニックセンストマトに用 いたとき、野生の植物に用いた場合に比べ成長体重を低くする。

本発明の核酸シーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、シスチミン、プロシステミン ポリペプチドもしくはアンチセンスＲＮＡをエンコードする能力を有する。この 核酸は、プロシスチミンｃＤＡＮもしくはゲノミックＤＮＡのヌクレオチドシー ケンスのセンス若しくはアンチセンスストランド（ｓ　ｔ　ｒａｎｄ　：螺旋構 造）を用いてハイブリッド化することができるヌクレオチドシーケンスからなる 。本発明の核酸は、プロシスチミンとシスチミンポリペプチドをエンコードする か、或いは、生体（条件）内で（ｉｎ　ｖｉｖｏ）シスチミンもしくはプロシス チミンの発現に干渉する・妨げるアンチセンスシーケンスである。本発明はシス チミン関連ポリペプチドはＲ，Ｒ，ＱＲ，Ｒ，ＰＰＲ，Ｒ，Ｒ２ＲＩ　ＰＰＲ， ＲＩ　ＱＲ，Ｒ，というアミン酸シーケンスからなる。ここでＲ１は任意のアミ ノ酸であり、Ｒ２はリジンもしくはアルギニン（もしくはその派生的）であり、 Ｑはグルタミン（もしくはその派生物）であり、Ｐはプロリン（もしくはその派 生物）である。本発明のシスチミンプロペプチドの代表例はっぎのアミノ酸シー ケンスである。

ＮＨ，−ＡＶＱＳＫＰＰＳＫＲＤＰＰＫＭＱＴＤ−ＣＯＯ一本発明のプロセス坊 法）は、植物における（おいて）防禦プロティンの合成を強化するのに有用であ る。これは、プロシスチミン核酸を植物細胞の内に導入することによって行われ る。本発明の方法は又、アンチセンス核酸を導入することにより、合成を抑える こともできる。本発明の核酸を含むトランスジェニック植物も本発明により提供 される。

図面の簡単な説明 本発明の上記態様及び多くの効果は、添付図面と共に以下の詳細な説明を参照す ることにより容易に理解されるであろう。

図１は例１に示されるように半準備（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔ　１ｖｅ）、リ バースフェーズ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣによりトマトの葉の抽 出物・エキスからのシスチミンを予備的浄化噛精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ）することを示している。

図２は例１に示された５ＣＸ−ＨＰＬＣコラムのクロマトグラフィによるシスチ ミンの実質的な浄化・精製を示している。

図３はシステミンプロペプチドのアミノ酸シーケンスを示している。

図４は、例２に示すように合成シスチミンポリペプチドを用いた場合のトマトに おける防御プロティン合成の誘発を示している（インヒビタ■（閉サークル）及 びインヒビタ■（開サークル））。

図５Ａは、損傷箇所から別の離れた植物細胞（ｔ　ｉ　ｓ　５ｕｅ）への伝送を デモンストレーションするために、＋４０で印付けられた合成シスチミンポリペ プチドで処理されたトマト葉の放射能写真。

図５Ｂは図５Ａの離れた植物細胞からリバースフェーズＨＰＬＣによって分離さ れた、Ｉ４０で印付けられた合成シスチミンを示している。

図６はプロシテミンのアミノ酸シーケンスを示している。

図７はｃＤＮＡのヌクレオチドシーケンスを示している。これはプロシスチミン を斜線からなる下線及び垂直線から成る下線によってエンコードするものである 。斜線の下線はくりかえされるシーケンスモチーフを示し、垂直線の下線は先駆 物質シーケンス内のシスチミンの位置を示している。

図８はプロシスチミン遺伝子のヌクレオチドシーケンスを示している。

図８Ａは位置１から位置２０００までのプロシスチミン遺伝子のヌクレオチドシ ーケンスを示している。

図８Ｂは位置２１０１から位置４２００までのプロシスチミン遺伝子のヌクレオ チドシーケンスを示している。

図８Ｃは位置４２０１から位置４５２６までのプロシスチミン遺伝子のヌクレオ チドシーケンスを示している。

図９Ａはプロシスチミン遺伝子の構造を示している。この遺伝子は、１０４　ｂ ｐ　５″非移動（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）区域と、４１７６　ｂｐココ−ィ ング（ｃｏｄｉｎｇ）区域と、２４６ｂｐａ−非移動区域とからなる。４１７６ 　ｂｐコーディング区域は１０イントロンによって中断・妨げられた１１エクソ ン（垂直線）からなる。シスチミンの位置はＳＹＳが付された水平線によって示 されている。

図９Ｂはプロシスチミン遺伝子のサザンプロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ ）分析を示している。トマトのゲノミックＤＮＡが葉から分離され（例６に示さ れているように）また、５μｇがＥｃｏＲＩ　（レーン１）、ＢｇＩＩＩ（レー ン２）もしくは５ｃａＩ（レーン３）によって消化・蒸解・温浸（ｄｉｇｅｓｔ ｅｄ）された。さらに、０．８％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ）上 で電気泳動にかけられた。このゲルはニック（ｎｉｃｋ）移動されたプロシスチ ミンにより厳密に調べられた・深針で探られた（ｐｒｏｂｅｄ）。

図９０は、例９に示されるように、プロシスチミン遺伝子ホモローグ（ｈωｃｌ ■ｕｅｓ　：同族体、相同物）の種分配（ｓｐｅｃｉｅｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔ ｉｏｎ）のサザンプロット分析を示している。トマト（レーン１）、ポテト（レ ーン２）、タバコ（レーン３）。

アルファルファ（レーン４）及びアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｕｐｓｉｓ）　 （レーン５）からのゲノミックＤＡＮ（５μｇ）がＥｃｏＲＩによりディジエス ト（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）され、０゜８％アガロースゲル上で電気流動にかけられ た。このゲルはニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌ　Ｉｕｌｏｓｅ　：硝酸繊 維素）上にプロットされ、ニック移動されたプロシスチミンｃＤＮＡによって厳 密に調べられた（ｐｒｏｂｅｄ）。

図１０はプロシスチミン遺伝子の構造を示している。エクソンは垂直線で示され ており、１から１１の番号が付されている。５つのエフサンの対は、１＋２゜３ ＋４．５＋６．７＋８．９＋１０である。

図１１はプロシスチミン遺伝子エクソンのシーケンスアライメントを示している 。コンセンサスシーケンス（コン：　ｃｏｎ）は、５つのエクソンシーケンスの 少なくとも３つにおいても同じ位置で起こる・生ずるベース（ｂａｓｅ）からな っている。

図１１Ａは各対の最初のエクソン（エクソン１．　３．　５．　７．　９）のシ ーケンスのアライメントを示している。

図１１Ｂは各対の第２のエクソン（エクソン２．　４．　６．　８．　１０）の シーケンスのアライメントを示している。

図１２はプロシスチミン内の３つの繰り返される（た）ポリペプチドシーケンシ のシーケンスアライメントを示している。３つのポリペプチドシーケンス（Ｒｅ ｐＡ、　ＲｅｐＢ、　ＲｅｐＣ）　（それぞれが、プロシスチミンのアミノター ミナルハーフ（ａｍｉｎ。

−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｈａｌｆ）内で一度起こる）は、ホモローブなシーケンス （Ｒｅｐ　ＺＡ、　Ｒｅｐ　２Ｂ。

Ｒｅｐ２Ｃ）（それぞれがプロシスチミンのカルボキシル基ターミナルノ１−） 内で一度起こる）内にアライメントしている。繰り返しくｒｅｐｅａｔｓ）の間 で異なるアミノ酸には下線が引かれている。各繰り返しの始め及び終わり（のと き）のアミノ酸は、プロシスチミンのアミノ酸末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）から番 号がつけられている。

図１３Ａは、プロシスチミン内の２つに分裂した２倍・二重になった（ｄｕｐｌ ｉｃａｔｅｄ）ポリペプチドシーケンスの位置を示している。ポリシスチミンは 水平バー（ｂａｒ）で示されている。また、アミノ酸残余にはアミノ末端から１ から２００までの番号がつけられている。シーケンスエレメントＲｅｐ　Ａ、　 Ｒｅｐ　Ｂ、　Ｒｅｐ　Ｃ及びこれらの繰り返しくｒｅｐｅａｔｓ）　Ｒｅｐ　 ２Ａ、　Ｒｅｐ　２Ｂ、　Ｒｅｐ　２Ｃはバー）チングされたバーにより示され ている。シスチミンはＳｙｓと付されたハツチングバーにより示されている。

図１３はプロシスチミン遺伝子内の（で）ポリペプチドの繰り返しをエンコード するシーケンスの位置を示している。エクソンは垂直バーで示されている。ポリ ペプチドの繰り返しをエコードするエクソンの部分は黒く塗られている。

図１４はエクソン３と７の３゛エンドでのイントロン境界部のシーケンス比較を 示している。エクソンシーケンスには下線が引かれている。エクソン７０３゛エ ンドのイントロンの最初の４つのベースは移動され（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）　、 ホモローブシーケンスの正確なアライメント容易にできるようにしている。ホモ ローブシーケンスはエクソン３の３′エンドと、エクソン７と８の間のイントロ ンの５゛エンドで生ずる 図１５Ａは。例７に示すように、損傷の後プロシスチミンｍＲＮＡとインヒビタ 戚ＮＡの誘発の時間的変化のノーザンプロット（Ｎｏｒｔｈｅｎｎ　ｂｌｏｔ） 分析を示す。

１５Ｂは、例８に示すように、損傷のない完全に成長した植物（トマト）のいろ いろな部分におけるプロシスチミンｍＲＮＡの分配（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ 　）のノーザンプロット分析を示している。全ＲＮＡは無損傷のトマトの次の部 分、根（Ｒ）、茎（Ｓｔ）、葉柄（ｐｔ）、１ｉ（Ｌｅ）、かく片（Ｓｅ）、花 弁・花びら（Ｐｅ）、雄しべ（シ）、雌しべ（Ｐｉ）から抽出した。

図１６ＡはトランスジェニックアンチセンスプラントＩＡから抽出した全ＲＮＡ のノーザンプロット分析を示している。例１０に示すように、レーン１はセンス プローブにより得られた結果を示し、レーン２はアンチセンスプローブにより得 られた結果を示している。

図１６Ｂは例１０で示すように損傷Ｆ１トランスジェニックアンチセンスプラン ト（白抜きのバー）及び変形・変態・形質転換処理（ｔｒａｍｓ　ｆｏｒｍ　） されない制御植物（黒いバー）におけるインタヒビタ１のレベルをグラフ化した 図。

図１６Ｃは例１０に示すように、損傷Ｆ１トランスジェニックアンチセンスプラ ント（白いバー）と非トランスフオーム制御の植物（黒いバー）におけるインヒ ビタ■のレベルをグラフ化した図。

図１７は例１１に示すように、マンデュー力セクスタ幼虫（Ｍａｎｄｕｃａ　５ ｅｘｔａ　ｆａｒｖａｅ）を用いたフィーデング（ｆｅｅｄｉｎｇ）実験の間、 制御（非トランスフオーム）とトランスジェニックトマトの無ダメージの葉から 異なる時間（時刻）に集められた全ＲＮＡ抽出物のノーザンプロット分析を示し ている。

図１８は例１１に示すように、マンデューカセクスタ幼虫のフィーディングによ って誘発された制御及びトランスシュニックトマトの無ダメージの葉におけるイ ンヒビタＩ及び■の蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　）の経時変化を示してい る。

図１９は、例１１に示すように、制御及びトランスジェニックアンチセンストマ トの葉にフィーディングをする場合の、マンデューカセクスタ幼虫の成長を示し ている。

図２０は例１１に示すように、野生トマト及びトランスジェニックトマトの葉に フィードされたマンデュー力セクスタ幼虫の幼虫体重ゲインの経時変化を示して いる。

好適実施例の詳細な説明 以下の用語や表現は次に説明する意味を有する。

「防禦（ディフェンス）プロティン」は、捕食者（例えば、草植食動物、昆虫。

菌・カビ、バクテリア、ウィルス）による植物細胞（Ａｉｓｓｕｅ）攻撃や摂食 を邪魔するプロティンを含む。防禦プロティインは捕食者の攻撃に対する植物の 抵抗力をて直接的に、もしくは先駆物質からその他の防禦用コンパウンド（化成 物、混合物１合成料）を制御することによって間接的に行われる（例えば、経路 内で酵素を誘発して防禦コンパ・ランドを合成するように作用することによって 、或いは防禦コンパウンドを合成する酸素を調整するプロティンを誘発すること によって）。

防禦プロティンの代表的な例としては次のものがある。例えば、プロテイナーゼ インヒビタ、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎｓ）、キヂナーゼ、ベータグルカ九−ゼ （β−ｇｌｕｃａｎａｓｅｓ）である。防禦コンパウンドの合成を行う（引起こ す）代標的な酵素としては、例えばキャスビーン（ｃａｓｂｅｎｅ　）シンター ゼがある。防禦コンパウンドの合成を引起こす半合性（的）経路（ｂｉｏｓｙｎ ｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ）の一部である代表的な酵素としては、例えば、 フィトアレキシン抗生物質、アルカロイドその他の有毒化学物質の合成のための 、フェニルプロペノイド及びテルペノイド経路内の酵素がある。本発明との関連 において有用なその他の捕食者防禦プロティンは勿論当業者には明らかであろう 。特に適する捕食者防禦プロティンとしては、攻撃して（る草食植動物の消化蛋 白質酵素のインヒビタ（例えば、プロテイナーゼインヒビタ）や、アンチバクテ リア（抗菌（性）、抗カビ性及び抗ウイルス性のコンパウンドその他がある。代 表的なプロテイナーゼインヒビタ防禦プロティンとしては、例えば、トリプシン インヒビタのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ファミリ、プロテイナーゼインヒビタの ボーマン・パーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ　）ファミリ、プロテイナーゼイン ヒビタのインヒビタＩファミリ、プロテイナーゼインヒビタのインヒビタ■ファ ミリ、トリプシンインヒビタの大麦ファミリ、プロテイナーゼインヒビタのカボ チャファミリがある。植物プロテイナーゼインヒビタの代表例は、国際出願ＰＣ Ｔ／［１３９１１０３６８５（米国特許出願第０７１５２８．９５６号の一部継 続出願）に開示されている。この引用により、上記２つの出願の開示内容は本明 細書に記載されていることとする。

「核酸」という言葉は、ヌクレオチド及びヌクレオシドの自然（天然）及び人造 のリニア及び連続的な（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　）アレイを意味している（例え ば、ｃＤＮＡ１ゲノミックＤＮＡ（ｇＤＮＡ　）、ｍＲＮＡ及びＲＮＡでは、オ リゴヌクレオチド。

オリゴヌクレオシド、及びその派生的・誘導体）。議論を簡単にするために、本 明細書では上記核酸は適宜、総称として構造（物）　（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ） Ｊ　、ｒブラスト」もしくは「ベクター（ｖｅｃｔｏｒｓ）　Ｊと称す。本発明 の核酸の代表例としては、バクテリアプラスミドベクター（例えば発現、コスミ ド、並びにクーロニング及びトランスフォーメイションベクター（例えば、　ｐ ＢＲ３２２、λ、Ｔｉその他）、植物ウィルスベクター（例えばモディファイド ＣａＭＶその他）、合成中人造オリゴヌクレオチド分子（例えば化学的に合成さ れたＲＮＡもしくはＤＮＡ　））がある。

「エンフードする」という表現は、例えば、当該核酸が適切なベクター（例えば 発現ベクター）内の適切な制御シーケンス（例えば促進及び強化エレメント）に リンクされており、ベクターがセル（ｃｅｌｌ）内へ導入されるときに、当該核 酸がセル内の当該プロティンの中へ転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）　、移動（ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）されることを意味する。

「ポリペプチド」はシリアル配列でリンクされた３つのもしくは４つ以上のアミ ノ酸を意味する。

「アンチセンスＤＮＡ　Ｊは、反対方向に読んだとき遺伝子の「センスストラン ド（ｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）Ｊと一致する（同族の）　（ｂｏｍｏｌｏｇｏ ｎｓ）ヌクレオチドシーケンスを有する遺伝子シーケスＤＮＡを意味する（即ち 、５−−３＝方向ではなく、３゛−５′方向へＤＮＡに読み込まれたＤＮＡ０　 ｒアンチセンスＲＮＡＪは、曲＾ヌクレオチドシーケンスを意味する。（例えば 、アンチセンスＤＮＡによってエンコードされたもの。もしくは上記アンチセン スＤＮＡと相補的に・補足的に（ｃｏａ＋ｐｌｅ１１ｅｎｔａｒｙ）合成された もの）。アンチセンスＲＮＡは、厳しい条件下でアンチセンスＤＮＡとハイブリ ット化することができる。本発明のアンチセンスＲＮＡは、転写レベルもしくは 移動レベルの一方において「目標遺伝子」の発現を抑えるのに有効である。

例えば当該核酸の転写は転写を妨げることができるアンチセンストランスクリプ ト（写し：転写された遺伝情報）を作り出すことができる。このアンチセンスト ランスクリプトは転写の開始を妨げることによって、或いは、転写ファクタを限 定・制限するように争う・競争する・戦うことによって転写を妨げる。またアン チセンストランスクリプトは「目標ＲＮＡ　Ｊの輸送（ｆｒｏｍｓｐｏｒｔ）を 妨げることもある。更に、アントセンストランスクリプトは［目標ＲＮＡＪの移 動（廿ａｎｓｌａｔｉｏｎ）を妨げることもある。

■　「センスストランド」は、ゲノミックＤＮＡからの１つの螺旋構造にされた ＤＮＡ（５ｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ）分子を意味する。これは遺伝子のポリペプ チドプロダクトへ転写且つ移動可能である。「アンチセンスストラッド」は、遺 伝子のセンスストラッドと相補的なゲノミックＤＮＡの１つのストランドＤＮＡ 分子を意味する。

「厳しい条件下でハイブリッド化できる」とは、厳しい条件下（後述する）で第 １の核酸を第２の核酸にアニール化（ａｎｎｅａ　ｌ　ｉｎｇ）することを意味 する。例えば、第１の核酸はテストサンプルであり、第２の核酸は、プロシスチ ミン遺伝子のセンスもしくはアンチセンスストランドである。第１および第２の 核酸のノｚｄブリッド化は厳しい条件下で行われる（例えば高温且つ／或いは低 塩含有で）。これは似ていないヌクレオチドシーケンスのハイブリッド化を避け る。嫌う傾向がある。６ＸＳＳＣでのハイブリッド化（水溶液中で４２℃の後に 、１×χでの洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）　（水溶液中で５５℃）を行うことを含む 適切なプロトコルが下記の例１に示されている（厳格さを制御するその他の実験 条件はＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　、　ｅｔａｌ、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ窒≠狽盾窒凵A　Ｃ。

ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ、　ＮＹ、　１９８２．　ベージ３８７−３８９；ｉｎ　 Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａ狽奄刀A　Ｍ。

１ｅｃｕｆａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｖｏｌｕｍｅ　２．@Ｃｏ１ｂ　Ｓｐｒ ｉｎｇ ｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ、、ＮＹ 、　１９８９．ページ８．４６−８．４７に記載されている）。

［フラグメントは本明細書において核酸に関して用いられるときは（例えばｃＤ ＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、すなわちｇＤＮＡ）当該核酸の一部（例えば、０工的 に構成されたもの。０工的とは例えば化学的合成（処理）による。）、あるいは 、天然プロダクト（天然のもの）を複数の片に割ったり裂いたりして（ｃｌｅａ ｖｉｎｇ）作られるもの。例えば、ヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼを 用いて制限・拘束（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）フラグメントを得る場合）を意味 する。

「合成・人造オリゴヌクレオチド」は９若しくは１０以上のヌクレオチドを有す る人工的な核酸（例、化学的に合成された核酸）を指す。

「シスチミンポリペプチド」はＲ，ＲＩ　ＱＲＩ　Ｒ２ＰＰＲ，Ｒ２Ｒ２Ｒ，Ｐ ＰＲ，Ｒ，ＱＲ，Ｒ，のアミノ酸シーケンスを有するポリペプチドを意味する。

ここで、Ｒ１は任意のアミノ酸を、Ｒ２はリジン若しくはアルギニン（若しくは その派生物・誘導体）、Ｐはプロリン（若しくはその派生物誘導体）（例：図３ のシスチミンポリペプチド。即ち、ＮＨ，−ＡＶＱＳＫＰＰＳＫ、ＲＤＰＰＫＭ ＱＴ＋１）−ＣＯＯ−）を示す。当業者であれば以下のことに気付くであろう。

即ち、突然変異（体）　（ｌｕｔａｔｉｏｎ）及び／又は進化の過程を通して、 異なる長さのポリペプチド（例えば、挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　）　、代替（ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）　、欠失Ｑ消去（ｄａＩｅｔｉｏｎ）その他によっ てそうなる）（このポリペプチドは本発明のシスチミンポリペプチドと関連があ る）が生まれてくることがある。それは以下の要因による。

（ａ）アミノ酸及び／又はヌクレオチドシーケンス相関関係・相同・ホモロジ、 （ｂ）捕食者、病原体、機械的な傷に対応・応答して遺伝子発現を調整する際の 防禦機能や作用及び／又は（Ｃ）ゲノミックＤＮＡの構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔ ｉｏｎ）　（例６に示しである）。トマトとポテトのシステミンファミリンメン バの代表例は例６から例９（後述）に示されており、植物のその他の種（ｓｐｅ ｃｉｅｓ）　、類型（ジャンル：ｇｅｎｒａ）及びファミリにおけるシステミン ファミリメンバを識別する例示的方法も例６〜例９に示されている。

「シスチミン核酸」は、シスチミンポリペプチドをエンコードすることができる 核酸のサブセットを示す。

「プロシスチミンポリペプチド」は、シスチミンポリペプチドを生じさせること ができる先駆物質ポリペプチドを意味する。代表例は、図７のｃＤＮＡ若しくは 図８Ａ、８Ｂ及び８ＣのゲノミックＤＮＡのコーディング（ｃｏｄｉｎｇ）区域 によりエンコードされたプロシスチミンポリペプチドである。プロシスチミンポ リペプチドはクリープ（ｃｌｅａｖｅ：割ったり、裂いたりすること）すること ができ（例：化学的に若しくは酵素によって）、その結果シスチミンを得ること ができる。植物の異なる種（ｓｐｅｃｉｅｓ）においてプロシスチミン遺伝子を 識別・判定する方法の例が例９に示されている。

「プロシスチミン核酸」はプロシスチミンポリペプチドをエンコードすることが できる核酸のサブセットを指す。

下に示した本発明の実施例は、シスチミン及びプロシスチミンポリペプチド、シ スチミン及びプロシスチミンｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びゲノミツクＤＮＡをエンコ ードする核酸（プロシスチミンｇＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を制御する５′調整 シーケンスを含む）に関する。本発明の核酸は低レベルで構造的に（ωｎ５ｔｉ ｔｕｔｉｖｅｌｙ）合成され、高レベルへ（の）損傷誘発プロシスチミンをエン コードすることができる（例７参町。損傷誘発及び構造的低レベルの発現は、シ スチミン遺伝子シーケンス（この最初の１０４ヌクレオチドが図８Ａに示されて いる）の５゛区域の３０００ｂｐ内の調整エレメントによりもたらされる。３０ ００ｂｐ５−区域内のプロモータ（促進剤）、強化剤及びその他の調整エレメン トは組換え（ｒｅｃｏａ＋ｂｉｎａｎｔ）プラスミド及びベクターへの挿入には 有効である（この場合、植物の遺伝子発現（即ち、プロシスチミン以外の遺伝子 ）を制御する）。プロシスチミンの５′調整エレメントにリンクされ得る遺伝子 の代表例としては、（１）保存・格納若しくは栄養学的に重要なプロティンをエ ンコードする遺伝子（例：生長力のある保存・格納プロティン、シード（ｓｅｅ ｄ）保存・格納プロティン、塊茎保存・格納プロティンその他）　、（２）その 他の植物防禦遺伝子をエンコードする遺伝子（即ち、その他のプロテイナーゼイ ンヒビタＢｔトクセン（ｔｏｘｅｎ）等）、（３）代謝及び防禦プロセス用の調 整用酵素をエンコードする遺伝子（フェニルアラニンアミン、ＨＭＧ　ＣＩＡ還 元酵素その他を含む）、（４）植物シスペンション・停止（ｓｙｓｐｅｎｓｉｏ ｎ）培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）において商業的に重要な酵素をエンコードする遺伝 子（例：プロテイナーゼ、リパーゼ等）及び（５）花の色を調整する遺伝子があ る。

代表的なシスチミンポリペプチドの浄化・精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及 び物理的特質・特徴は例１に開示されている。当業者であれば次のことに気付く であろう。

即ち、プロシスチミンポリペプチド内の親水性のアミノ酸の比較的高い割合は、 天然、組換えられた若しくは合成・人造のプロシスチミンポリペプチドを浄化す るのに用いられることがある浄化についての種々の従来の手法を示唆提案してい る（例：イオン交換クロマトグラフィ、類縁（ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラ フィ、特定イオン沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）その他）。

本明細書に開示されたプロシスチミンのアミノ酸シーケンスは、プロシスチミン 若しくはシスチミンの合成ペプチドを構成・生成するのに用いられることがある アミノ酸シーケンスを提供する。あるいは、それらは、プロシスチミンポリペプ チドの裂開（ｃ　１　ｅａｖａｇｅ）がシスチミンを自由にする・解放する・遊 離させる場所を知らせるのに用いられることもある（例：酵素の（にょる）裂開 は天然プロシスチミン若しくはキメラの（に関する）組換えプロシスチミンプロ ティンにおいて起こる。後者の場合、キメラの組換えプロシスチミンポリペプチ ドは発現システムで作られ、キメラのプロティンが浄化さね、その後、シスチミ ンが酵素にょる裂開によってキメラプロティンから解放・遊離される）。境界ア ミノ酸において（の所で）プロシスチミンポリペプチドを裂開すると、シスチミ ンが作られる。

例えば、図７のプロシスチミンをＬ　ｅ　ｕ　１７８−Ａ　ｌ　ａ　＋７９の双 方で裂開すること（例：Ｌｅｕ−Ａｌａ特定エンドペプチターゼ（ＬＡペプチタ ーゼと略される）で裂開すること）及びＡ　Ｓ　＋）　＋９６−Ａ　Ｓ　ｍ、、 ｔの双方で裂開すること）（例：Ａｓｐ−Ａｓｍ特定エンドペブチターゼ（ＤＮ ペプチドターゼと略される）で裂開すること）によってシスチミンが作られる。

ＬＡベブチターゼの代替物として、プロシスチミンポリペプチドをその他の上流 位置において適切な酵素によって裂開しても良い（ＰＩ：Ａｒｇ＋７ｑ　Ｇｌｕ 、ｓ若しくはＧ　１　ｕ、７ｓ　−Ａｓ　ｐ＋ｔｔ　）。

この場合、その次に、Ｎ末端ペプチダーゼを用いてプロダクトを連続的に裂開す る（ＬＡ残基・残余部分に至り裂開する（される）まで）。同様に、ＤＮペプチ ダーゼの代りとして、カルボキシベルチダーゼ若しくはカルボキシル基ジペプチ ダーゼを用いて、ＤＮ残基に到り裂開されるまで、カルボキシル基末端からアミ ノ酸を連続的に離すこともできる。当業者であれば次のことに気付くであろう。

即ち、適切なＬＡ特定（ＬＡ−ｓｐｅｃ　ｉ　ｆ　ｉ　ｃ）ペプチダーゼは、例 えば天然（若しくは合成・人造）ポリペプチドサブストレート（ｓｕｂｓｔｒａ ｔｅ）を用い、シスチミンの生物学上の活動、営み、行動、活性（ａｃｔｉｖｉ ｔｙ）の生産・産出を分析することによって、植物細胞（ｔｉｓｓｕｅｓ）から 分離することができる（上記サブストレートはプロシスチミン−シスチミン境界 アミノ酸シーケンスを有するもの（例：Ｌ−Ａ及びＤ−Ｎ））。その一つの例で は、組換プロシスチミンキメラプロティンが発現システム（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎｓｙｓｔｅｍ）により合成され、酵素検査におけるサブストレートとして用い られ、ＬＡ及び／又はＤＮペプチダーゼを識別して分離する。

当業者であれば次のことに気付くであろう。即ち、プロシスチミンアミノ酸シー ケンスは、ＬＡ及び／又はＤＮペプチダーゼに特有の（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏ ｒ　ＬＡ　ａｎｄｌｏｒ　ＤＮ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）プロテイナーゼインヒ ビタを構成・製造するために用いることができる。また、このようなインヒビタ はプロシスチミンからのシスチミン生成を抑えるのにも役立つことがある。従っ て、植物における防禦プロティン生成のシスチミン活動を抑えることができる。

また、当業者であれば次のことにも気付くであろう。即ち、ＬＡ及びＤＮペプチ ダーゼは強化された能力を有するように選択されることがある。これはシスチミ ンをプロシスチンミンから解放・遊離させるためである（例：大きな・多くの回 転・反転・転移（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）ナンバを有し、小さな・少ないＫｍを有し 、大きな多くのＶｍａｘを有し、若しくはフィードバック抑制に小さな・少ない 感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を有するＬＡ及びＤＮ酵素）。植物の系統・種 族（ｓｔｒａｉｎ）は、大きなＬＡ及び／又はＤＮペブチターゼ活性（ａｃｔｉ ｖｉｔｙ）を有するように選択されるか、あるいは製造される（即ちトランスジ ェニック植物）。当該植物は補食者に対する抵抗力が大きいことがある。

本発明のシスチミンポリペプチドはまた、植物細胞（ｃｅｌｌ）からシスチミン レセプタ（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を識別して分離するために用いることもできる 。当業者であれば次のことに気付くであろう。即ち、当該ポリペプチドに印をつ けることができ（例えば、放射性のラベル・標識）、光化学架橋エージェント（ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）に供給・共役させる（ｃｏｎｊｕｇａ ｔｅ）ことができる。当該結合・共役されて放射性ラベルを有したポリペプチド は細胞質（ｃｅｌｌｕｌａｒ）シスチミンレセプタにバインド（ｂｉｎｄ）Ｌ、 光化学的活動がポリペプチドとそのレセプタとの間に電子対を共有する結合（Ｃ ｏｖａｌｅｎｔ　ｂｏｎｄ）を形成する。レセプターポリペプチドのコンプレッ クス（ｃ　ｏｍｐ　ｌ　ｅ　ｘ）が細胞（ｃｅｌｌ）から抽出されるとき、それ はそのラベルによって分離され識別される（例：分子サイズは、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ及び放射能写真術（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈ）によって決定されるのが 便利である）。本発明のポリペプチドはまた、シスチミンレセプタを分離する際 、リガンド類縁（ｌｉｇａｎｄ　ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィにも用い ることができる。

本発明の実施例は、植物における防禦プロティンの合成を強化若しくは抑制する 方法を提供するものである。これは本発明の核酸を植物細胞（ｃｅｌｌ）内に導 入することによって行われる。一つの代表的な例にあっては、強化された防禦プ ロティンの作成・生成は、植物細胞（ｃｅ　ｌ　１）内の（における）構成釣書 構造性・本質的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）高レベル発現を追い立てる・駆 り立てる・操縦する（ｄｒｉｖｅ）ことができるプロモータシーケンスから下流 のベクターにプロシスチミン（若しくはシスチミン）核酸を挿入・着生（ｉｎｓ ｅｒｔ）することによって達成される。後者の場合、当該ベクターが植物細胞内 に導入されるとき、当該核酸の１つ若しくは２つ以上のコピーを含む細胞（ｃｅ ｌｌ）においてシスチミンの合成が増大・強化される。トランスジェニック植物 が植物に成長したとき、その植物は防禦プロティンの合成が増大・強化されてい ると共に、草植食動物に対する抵抗力を増大している（詳細は後述の例９におい て説明する）。

別の実施例では、本発明は植物における防禦プロティンの合成を抑える方法を提 供する。これはプロモータシーケンスから下流のベクターにプロシスチミンアン チセンス核酸を挿入・着生（ｉｎｓｅｒｔ）することによって行われる。後者の 構成が植物細胞に導入されるとき、当該核酸のコピーを１つ若しくは２つ以上含 んでいる細胞（ｃｅｌｌ）では防禦プロティンの合成が減少する。プロシスチミ ンアンチセンスベクターの代表例及び防禦プロティンの合成を抑制する方法の代 表例は後述の例１０に示されている。

本発明のアンチセンス核酸を含むトランスジェニック植物は次の場合に有効であ る。（ａ）プロシスチミン分子内に存在する他のメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏ ｒ：媒介物）を識別する場合（例：分化・区別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ ｎ）若しくは防禦プロティンの発現を誘発する可能性のある他のメディエータ） 、（ｂ）特定の植物のダメージに責任のある特定の昆虫及び／又は病原体の範囲 ・範鴫を決定・確立する場合。後者の場合、本発明のトランスジェニック植物は 、作物としての植物の生産・製造におけるシスチミン防禦メカニズムの重要性を 査定する場合に有用である。

その他の実施例では、本発明は、植物細胞内に本発明の核酸を導入し、細胞（ｃ ｅｌｌ）をカルス（（Ｈａｌｌｕｓ）に育て、さらに植物に育てることにより作 られるトランスジェニック植物を提供する。あるいはＦｌ若しくは（より）高い ハイブリッド（即ち、Ｆ２）形成するために、第２の植物を用いて本発明の方法 からトランスジェニック植物を繁殖・交配させる（ｂ　ｒ　ｅ　ｅ　ｄ）ことに より作られる。

トランスジェニック植物を提供する。本発明のトランスジェニック植物及び子孫 （ｐｒｏｇｅｎｙ）は、本発明の核酸の余分なコピーを含む植物を見つけるのに 用いることができる。また、プロシスチミンもしくはシスチミンの増大した発現 を見つけるのに用いることができる。このようなトランスジェニック植物を作り 出し、それを繁殖させてＦｌの子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を得る方法の代表的 な例が後述の例１０に示されている。

当業者であれば、シスチミンポリペプチドの発現が減少もしくは増大するように 作られた植物が元来有する農業的利点に気付くであろう。例えば、このような植 物は捕食者、昆虫、病原体、微生物、草食動物１機械的ダメージその他による攻 撃に対して大きな抵抗力を有することがある。また当業者であれば、シスチミン 活動・活性（ａｃｔｉｃｉｔｙ）をまねするもしくは誘発する化学剤（ｃｈｅｗ ＋１ｃａｌ　ａｇｅｎｔＳ）が開発されるであろうことに気付くであろう（例え ば、シスチミン活動・活性のメチルジャスモネートの誘発（ｍｅｔｈｌｙ　ｊａ ｓｍｏｎａｔｅ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ）と同じように）。

また、当業者であれば、これら化学剤が植物に噴霧されると、作物の草食動物、 病原体及び機械的ダメージに対する抵抗力を最大にすることに役立つことがわか るであろう。本発明の方法が役立つ植物の代表例は（但し、これらに限定されな いが）、トマト、ポテト、タバコ、コーン、小麦、米５　コツトン、大豆、アル ファルフ乙ナタネ（ｒａ？）、ポプラの木、松、モミの木等である。

本発明の核酸は、オリゴヌクレオチドプローブ（ｐｒｏｂｅ）としても有用であ る（例えば、プロシスチミンヌクレオチドシーケンスの一部を補足すべく構成さ れた３２Ｐ印の合成オリゴヌクレオチド）。また、制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏ ｎ）フラグメントプローブとしても有用である（例えば、プロシスチミンｃＤＮ Ａ（の）エンド印の付いた制限フラグメント）。これらは、増大したプロシスチ ミン発現及び／又はゲノミックプロダクトナンパを有する（を用いて）天然及び 変化した・　ｍυ変異した（ｍｕｔａｎｔ）系統（ｓｔｒａｉｎｔｓ）を見つけ るために、植物を選択してスクリーニング（ふるい分け：　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ）するためのノーザン及びサザンプロットにおいて有用である。このスクリーニ ングは、捕食者、草食動物、昆虫、バクテリア。

菌・カビ、ウィルス、機械的ダメージその他による攻撃に対する増大した抵抗力 を有する（を用いて）植物系統を識別するのにの役立つ。

本発明のポリペプチドは、免疫学的検定・測定に用いられることがあるモノクロ ナル（ｍｉｏｎｏｃｌｏｎａｌ　：単一細胞に由来する細胞で作られた）及びポ リクロナル（ロ）ｌｙｃｌｏｎａｌ）な抗体を誘発するのにも役立つ。これは、 植物細胞（ｔｉｓｓｕｅｓ）、抽出物及び流体におけるプロシスチミンもしくは シスチミンポリペプチドの存在もしくは量を検知するのに用いられる（例：　Ｅ 、　Ｈａｒｌｏｔ　ａｎｄ　ｄ、　Ｌａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｅｉｅｓ：ＡＩ Ｊｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇｓ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ωｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ、　Ｎ、@Ｙ、　１９８８ ）。

後者の免疫学的検定はプロシスチミンもしくはシスチミンのレベルが増大した植 物の天然及び（突然）いへ系統を識別するのに役立つことを証明する。本発明の ポリペプチドのレベルが増大している系統では、草食動物、即ち昆虫バクテリア 、カビ・菌、ウィルスによる攻撃に対する抵抗力が増大していることがある。

シスチミンは離れた葉同士における防禦遺伝子の損傷誘発可能発現を媒介する主 要ポリペプチド信号である。したがって、シスチミンは植物において見つけられ るペプチドホルモンの最初の例である。組替え（ｒｅｃｏａｂｉｍｎｔ）アンチ センス遺伝子表現構成の発現（即ち、アンチセンスプロシスチミンｃＤＮＡを含 むもの）あ、植物におけるシステミック損傷誘発防禦プロティン合成をほとんど 完全に抑制することができる。後に見つけられた事実は、シスチミンが植物にお けるシステミック信号形質導入・表現（ｔｒａｓｎｄｕｃｔｉｏｎ）システムの 絶対必要な部分（構成物）であることを証明している（これが捕食者等による攻 撃に対応して防禦プロティン合成を誘発する）。シスチミンが植物ポリペプチド ホルモンのシスチミンファミリーの中で識別された最初のメンバであることも真 実でありそうである。

シスチミンファミリのメンバが、分裂組織、花細胞（ｔｉｓｓｕｅｓ）及び植物 の果実（例ニドマドやポテト）において（おける）成長・進化中発達現象（ｄｅ ｖｅ　ｌｏｐｍｅｎｔｅｖｅｎｔｓ）を調整するだろうことも真実と思われる。

シスチミンファミリの他のメンバはそのアミノ酸もしくはプロシスチミンやシス チミンとのヌクレオチドシーケンス相同（ｈｏＩ！１ｏｌｏｇｙ）によって識別 されるか、あるいは本発明のプロシスチミンもしくはシスチミン核酸とハイブリ ッド化できる能力によって識別される（この点については、後述の例６で識別さ れたエクソンのヌクレオチドシーケンスは、その他のシステミンファミリメンバ を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブ（ｐｒｏｂｅ）として有用である ことを証明するであろう）。この場合、厳格さを緩めた条件下で本発明の核酸と ハイブリッド化できるＤＮＡもしくはＲＮＡの能力（例；　６ｘｓｓｃのハ・イ ブリッド化（水溶液中、４２℃）を行ない、次に１×ＳＳＣで洗浄（ｗａｓｈｉ ｎｇ）　（水溶液中、５５℃）を行なう適切なプロトコル）はＤＮＡもしくはＲ ＮＡがシスチミンファミリメンバを含んでいるという予備的表示（ｐｒｅｌ　１ ｍ１ｎａｒｙ　１ｎｄｉｃａｔｉｏｎ）として考えられる。ＤＮＡもしくはＲＮ Ａは次に整列・配列さね、このシーケンスはシスチミン及びプロシスチミンのシ ーケンスと比較されるｌ格さを制御するための実験条件はＭａｎｉａｔｉｓ、　 Ｔ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　ｈｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ盾Pｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇｓ、　ＮＹ、１９８２．ページ３８７−３８９やＳａｍｂｒｏｏ）ｃ、　Ｆ ｒ１ｔｓｃｈ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、舅ｏ１ｅｃｕ撃＝@Ｃ ｌｏｎｉｎｇ；Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄ ｉｔｉｏｎ、　Ｖｏｌｕｍｅ　２．ωｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ@Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ、　ＮＹ、　１９８９．ベー ジ８．　、４６−８．４７にも記載されている）。

システミンファミリメンバはアミノ酸もしくはヌクレオチドレベルにおいて（即 ち約５もしくは６以上のアミノ酸又は役１５もしくは１６以上のヌクレオチドの 範囲で）約５０％から約１００％の相同で認識される（より好ましくは約７０％ から約１００％。最も好ましくは約８０％から約１００％）。

上記の証明は、本発明の方法及び合成物の下記の代表例を参照することによって より完全に理解されるであろう。

例１ シスチミンポリペプチドの分離及び整列オリゴガラクツロニド（ｏｌｉｇｏｇａ ｌａｃｔｕｒｏｎｉｄｅｓ）は当初、損傷反応用のシステミック信号としての第 １候補と考えられていた。なぜならば、これらは伝染・感染した個所の近くの植 物細胞（ｃｅｌｌ）において抗生物質・抗生作用のあるフィトアレキシンの合成 を引出すからである（１０．１１）。オリゴガラクッロニドはペクチン低下舎降 格拳消失（ｐｅｃｔｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ）によってレリースされる。これ らはトマトの葉には見られない。さらに、α−１（アルファー１）という印を付 けられた４オリゴガラクツロニドがトマトの損傷個所に適用された（塗られた） とき、それらは動くようには見えなかった。（Ｅ、んＨ，Ｂａｙｄｏｕｎ　ａｎ ｄ　Ｓ、　Ｆｒｙ、　Ｐｌａｎｔａ　１６５．２６９１９８５）　したがって、 オリゴガラクッロニドは、植物の中で（の）信号変換・形質導入のシステミック 媒体としては多分無関係であろう（少なくとも、損傷に対するプロテイナーゼイ ンヒビタ遺伝子の誘発に関しては）。

トマトの葉から抽出物における（おいて）プロテイナーゼインヒビタ■及び■遺 伝子を誘発するシステミック信号についての研究が始められた。この研究により 、我々はトマトの葉の中にポリペプチドを認識することができた。ポリペプチド は炭水化物を有さず、若いトマトに供給されるとプロテイナーゼインヒビタアク ティビティ　（活性・活動）を誘発する。ポリペプチドは高性能液体クロマトグ ラフィを用いて浄化された（ＨＰＬＣ０後述の「物質及び方法」を参紛。ポリペ プチドの活動が誘発されたことは、若い植物の葉柄を切断し、抜取られた溶出画 分（ｅｌｕｔｅｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）をコラム（ずり柱）セパレーションか らを切断したものに３０分間（以上導入することによって検査された。植物はす ぐ水の入ったガラス瓶に移され、（Ｃ，んＲｙａｎ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ ｏｌ、　５４．３２８．１９７４）に記載されているように２４時間一定の光の 下で培養された。モして葉汁（ｌｅａｆ　ｊｕｉｃｅ）内のプロテイナーゼイン ヒビタｌ及び■の量が寒天ゲルで放射線免疫拡散性により計量された（これはイ ンヒビタＩもしくは■に対する（ラビット（ｒａｂｂｉｔ）抗血清を含んでいる （Ｃ，んＲｙａｎ、　Ａｎａ　１．　Ｂｉｏｃｈｅａ　１９．４３４．１９６７ 　；ｌ　Ｔｒａｕｔｍａｎ、　Ｌωｗａｎ、　Ｇ、　Ｗ≠■獅■秩A　Ｉｍｕ ｎｏｃｈｅｍｓｔｒｙ　８．９０１．１９７１）、　３０．０００個以上の若い トマトが２．５年以上も検査される。このプロトコルを用いると（用いて）、１ μｇより少し多いアクティブファフタ（即ち、シスチミン）が約６０ポンドのト マト葉から分離された。

トマト葉の予備的抽出の溶出・抜出しプロフィール（ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐｒｏｆ ｉｌｅ）　（図１）は複雑である。幾つかの画分はアクティビティを誘発するプ ロテイナーゼインヒビタを示しているが、１つのピーク（図１）がさらなる浄化 用（浄化対象）として選ばれた。なぜなら、それは最も高いアクティビティを有 しており、浄化から最も良い収量・収率（ｙｉｅｌｄ）を有しているからである 。

幾つかの別の浄化ステップの後（後述の「物質及び方法」を参照）、高い比活性 ・比放射能を有する大きなピークが強いカチオン交換（ＳＣＸ　：　５ｔｒｏ■ いｚｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ）　ＨＰ　Ｌ　Ｃコラム（図２）から溶出され た・抜出された。溶出された物質の性質はポリペプチドの性質と似ていた。つま り、ペプチドボンド（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｏｎｃｔｓ）に適するスペクトル区域 における吸光度、酸加水分解後のフリーアミノ酸の回復及び活性・放射能の全損 （トータルロス）、トリプシン及びその他の蛋白質分解酵素の存在における活性 ・放射能の部分損失、並びにパイシンコニック酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ　ａ ｃｉｄ）を用いての実証検査結果（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｕｌ ｔ）に関して似ていた（Ｐ、　Ｋ、　Ｓａ＋ｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｎａ ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５０．７６、１９８５）。５ＣＸ−ＨＰＬＣか■ 溶出・抜出されたバイオアクティブ（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　：生物性体）に影響 する）ピークの全アミノ酸分析（ステップ５゜「物質及び方法」）は以下のよう に決定・測定された。アクティブコンポーネントのアミノ酸シーケンス分析によ りその長さが認識され、図３のシーケンスが決定された（ＮＨ，−ＡＶＱＳＫＰ ＰＳＫＲＤＰＰＫＭＱＴＱＴＤ−ＣＯＯ−）。公知のプロティンシーケンスには 目立った類似点は何もなかった。そして、ポリペプチドは「シスチミン」と名付 けられた（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ 　ｒｅｌｅａｓｅ　２６；Ｐｅａｒｓｏｎ／Ｌｉｐｍａｎ　ＦＡＳＴＡ　ｐｒｏ ｇｒａｍ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ撃盾■凵@Ｃｏｍｐ ｕｔｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ、　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉ ｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ）。このシーケンスはパリンドローム（ｐａｒｉｎｄｒｏ ａ＋ｅ）である（ｘｘｈＢＰＰｘＢＢｘＰＰＢｘｈｘ）、ここで又は任意のアミ ノ酸残余物、ＢはＬｙｓもしくはＡｒｇｓ　ＱはＧｉｎ、ＰはＰｒｏを示す。シ スチミンシーケンスと同一のシーケンスの合成ポリペチド（後述するように準備 される「物質と方法」を参照）は、元来の（ｌａｔｉｖｅ　）ポリペプチドと同 じ保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）で０１８（ステップ２）コラムか ら溶出・抜出された。

物質（ｍｔｅｒｉａｌｓ）及び方法： 防禦プロティンのポリペプチド誘発体の浄化及び分離ステップ１：約２ｋｇのト マトの葉Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　（ｖ、ｃａｓｔｌ ａａａｒｔ）が２０日口の植物から収穫された（１７時間の照明（光）（２８℃ ）と７時間の暗やみ（１８℃）のサイクルで育てられた）。これら葉はウォーリ ングブレンダ（ｆａｒｉｎｇ　ｂｌｅｎｄｅｒ）で蒸溜水（全体積４リツトル） を用いて５分間均質化さね、４層のチーズクロス（ｃｈｅｅｓｅｃｌ　ｏｔｈ） で濾過退化された。液体はＨＣＩによってｐＨ４，５に調節され、１０分間１０ ００　ｇで遠心分離器にかけれらた。上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）がＩＯＮ 　ＮａＯＨを用いてｐＨ６゜１に調節さね、２０℃で１０分間１０．０００ｇで 遠心分離器にかけられホワットマン（Ｔｈａｔｉｌａｎ）　＃４フィルタペーパ ーで別の容器に移された（ｄｅｃａｎｔｅｄ　）　。濾液（ｆｉｌｔｒａｔｅ　 ）はＤＥＡＥセルロース上で色層分析さね、その後、反転（位）相（ｒｅｖｅｒ ｓｅｄ−ｐｈａｓｅ）　Ｃ１Ｂフラツジ、（ｆｌａｓｈ）クロマトグラフィ、セ フエイデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５ゲル濾過法、ＣＭセフェイデッ クスクロマトグラフィで色層分析される。

ＤＥＡＥセルロースコラム（ホワットマンＤ　Ｅ　５２．５．９ｃａ　ｘＬ５ｃ ａ＋）はＩＭアンモニウム重炭酸塩で平衡にされ（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ） 　、蒸溜水で徹底的に洗浄された（ｗａｃｈｅｄ）、空隙空間（ｖｏｉｄ　ｖｏ ｌｕｍｅ）に溶出している（くる）　（ｅｌｕｔｅｄ）物質が集められ４℃で一 晩保存された。保存されている溶出物にＴＦＡを滴状で加え、最終的な濃度が０ ．２％（ｖ／Ｖ）となるようにした。次に、溶液は室温で５分間２０，０００ｇ で遠心分離により浄化・不純物除去（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ）された。上清が反転 （位）相フラッシュコラム（Ｃ１８，４０μｍ＋　３ｃｍｘ２５ｃｍ）上に置か れた（このフラッシュコラムは前もって水様の水性の（ａｑｕｅｏｕｓ）０．１ ％ＴＦＡで平衡にされている）。コラムは３ｐｓｉの圧縮窒素を用いて溶出され た。サンプルが配置（セット）された後、コラムは２００ｍ１の０．１％ＴＦＡ で洗浄された。次に保持・保留された物質（ｒｅｔａｉｎｅｄ　ｍａｔｅｒｉａ ｌ）が０，１％ＴＦＡで順次、２０．４０．６０％メタノールの洗浄により溶出 された。メタノールはロータリエバポレータによって除去され、残りの液体は冷 凍さね、冷凍乾燥された。

２ｋｇの葉から、シスチミンを含む約１ｇの組物質・粗材料（ｃｒｕｄｅ　ｍｔ ｅｒｉａｌ）が得られた。この工程が１５回繰返された。２０ｍ１の水に溶かさ ＆１０Ｍアンモニウム水酸化物によりｐＨ７，８１に調節された組物質のサンプ ル（約４ｇ）がＧ２５セフエデツクスコラム（４ｃｍｘ４４ｃｍ）の上に配置さ れた。このコラムは５０ｍＭアンモニウム重炭酸塩（ｐＨ７，８）により平衡し ている。空隙空間のところで、またそのすぐ後で溶出する物質が回収されて冷凍 乾燥された。全工程を４回同じ用に行なうと、１．２５　ｇの部分的に浄化・純 粋化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）シスチミンが得られた。この１．２５Ｇは５０ ０　ｍ　ｌの水で溶されてｐＨがＬＭ　ＮａＯＨで６に調節さね、このサンプル はＣＭセファデックスコラム（２ｃｍｘ　１７ｃｍ）配置され、０．０１Ｍリン 酸カリウムＣｐＨ６）で洗浄された。活性・放射能は０Ｍセファデックスにより 保持され、２５０　ｍＭのアンモニウム十炭酸塩で溶出され、冷凍乾燥された。

このステップで得られたプロティンの全量は１９０■であった。

ステップ２ニステツプ１から回収されたアクティブフラクション（１９０ｍｇ） は、１０ｍ１Ｏ，１％ＴＦＡで溶され、５分間２０．０００　ｇで遠心分離器に かけられ、濾過され、反転相Ｃ１８コラム上で色層分析された。５マイクロリツ トルの各２ｍｌ溶出フラクションが１５４　ｍＭリン酸ナトリウ□ム（ｐＨ６， ５）で３６０マイクロリツトルに希釈されて活性・放射能を誘発するプロテイナ ーゼインヒビタ■について検査された（図１のＸ）。４つの植物がフラクション 毎に検査された。物質・材料は半準備（ｓｅｆｆｉｔ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ）反転位相Ｃ１８コラムにインジェクションされた（Ｖｙｄａｃ、　Ｈｅ５ｐｅ ｒｉａ、　ＣＡ、　Ｃｏｌｕｍｎ　２１８　ＴＰ５１０．１０ｍｍ　Ｘ　２５０ ｍａ　５−μｍ　ｂｅａｄ刀A　３００Ａ ｐｏｒｅｓ）。溶液Ａは水中で０．１％ＴＦＡから成る。溶液Ｂはアセトニトリ ル中で０゜１％ＴＦＡから成る。これらサンプルは溶液Ａにインジェクションさ ね、２分後、３０％溶液Ｂへ傾く９０分が溶出のために始まった。流量は２ｍ１ ７分で、溶出ピークは２２５ｎｍで見つけられた。生物学上の活性・放射能のい くつかのピークが見つけられた（後述）。活性・放射能の大きなピーク（図１で 黒で示されている）は、チューブ（ｔｕｂｅｓ）　４３〜４６にあった。これら はプール（ｐｏｏｌｅｄ）され乾燥冷凍された。プールされたファクション（ｆ ａｃｔｉｏｎｓ）の全プロティン含有量は、２．５ｍｇと評価された。

ステップ３；ステップ２で回収された全物質（２，５ｍｇ）は、ポリ５ＵＬＦＯ −而Ｌ　Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ　（Ｓ　ＣＸ）コラム（４，６ｍ　Ｘ　２００ ｍｍ、　５マイクロメートル。アメリカ合衆国マサチューセッツ州すウスブラウ のザＱネストグループ）上の強いカチオン交換ＨＰＬＣに晒された。この場合、 次の溶液システムを使った。溶液Ａ（５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ３，２５％ア セトニトリル）及び溶液Ｂ　（５ｍＭリン酸カリウム、５００　ｍＭ塩酸カリウ ム、２５％アセトニトリル、ｐＨ３）である。

サンプルは２ｍｌの溶液Ａで溶かさね、濾過されコラムに配置された。溶液へで ５分間洗浄された後、５０％Ｂへ傾く６０分が行なわれた（６０−ｗｉｎ　ｇｒ ａｄｉｅｎｔ　ｔ。

５０％Ｂ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ）。アクティブフラクション（チューブ３５ 〜３８）がプールさね、真空遠心分離法で体積で１ｍｌに減少された。

ステップ４；ステップ３からのプールされたフラクシヨンは１０ｍＭリン酸カリ ウム（ｐＨ６）内で反転位相Ｃｌ８ＨＰＬＣにさらされた。ベックマンウルトラ スフイア（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）イオンペアー（ｐａｉｒ ）コラム（４，６ｍｍｘ２５０　ｍｍ、ＣＸ８．５マイクロメートル）でクロマ トグラフィ（色素分析）が行なわれた。溶液Ａは１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ ６）であり、溶液Ｂは５０％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐ Ｈ６）であった。アクティブフラクション（チューブ３９〜４２）がプールさね 、最終的な体積が１ｍｌになるように真空遠心分離された。このフラクションが その前の工程（ｒｕｎ　）と同じコラムに用いられた（但し、溶液と傾きの条件 はステップ２と同じ）。このサンプルがＴＦＡでｐＨ３に調節され０．４５マイ クロメートルシリング（ｓｙｒｉｎｇｅ；スポイト、注射器）フィルターで濾過 さね、流量１ｍ１／分で色素分析された。プロティンのピークは２１２ｎｍで検 知された。アクティビティを含むフラクション（５３゜５〜５６．５分で溶出す るもの）がプールさｔＬ、１ｍｌの体積に真空遠心分離された。

ステップ５；ステップ４からのアクティブフラクションはステップ３で用いられ たのと同じコラムおよび条件でＣ３Ｘ−ＨＰＬＣに晒された（但し傾きは浅い。

即ち、コラムは０％Ｂで５分間ランされこの時１２０分間で３０％Ｂへの傾きが 開始された）。フラクション（０，５ｍ１）は図１のように希釈さね、アクティ ビティを誘発するプロテイナーゼインヒビタ！について検査された（図２のＸ） 。システムビークの生物学的なアクティブなフラクション（図２で黒で示されて いる）が集められ、アミノ酸含有量及びシーケンスについて分析された。プロフ ィールは２１０ｎｍでの吸光度により検知された。７６〜７８，５分に溶出する フラクションがプールされて、真空遠心分離により体積が１ｍｌに減少された。

ステップ６；ステップ５のフラクションはステップ２の条件の下でＣｌ８ＨＰＬ Ｃコラムの上で脱塩された。３０％溶液Ｂへ傾く６０分が採用された。アクティ ビティビークを含むフラクションが５５．０〜５８．０分で溶出され、プールさ ね、真空遠心分離法で凝集されて０．５ｍｌになった。このサンプルは約１マイ クログラムのプロティンを含んでいた（酸加水分解の後のアミノ酸含有量によっ て評価された）。このサンプルの生物学的アクティビティは、４０．０００のト マトプラントにおいてプロテイナーゼインヒビタの最大蓄積を誘発する可能性を 有していた（即ち、４０．０００区域（ｆｏｌｄ）が浄化・純化された）。この サンプルはアミノ酸分析及びシーケンス決定に用いられた。

アミノ酸分析： ５ＣＸ−ＨＰＬＣコラムから溶出されたバイオアクティブな牲体に影響を与える ）ビーク（ステップ６）が６Ｘ５０ｍｍガラスチューブによって乾燥されＨＣ１ 蒸気内で加水分解された。加水分解されたものがフェニル−１′ソチオシアン酸 塩で引出ざわ、３０ｃｍＸ０．３９ｃｍコラム（ピコタッグ、ミリボアー）　（ Ｐｉｃｏｔａｇ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で反転位相クロマトグラフィにより 分析された（製造者の提案に従って）。

アミノ酸シーケンス分析： ５ＣＸ−ＰＨＬＣコラムからのバイオアクティブビーク溶出されたアミノ酸シー ケンス（ステップ６）は確立された方法によって決定された（Ｄ、　Ｊ、　５ｔ ｒｙｄｏｎ　ｅｔａｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ　２５．９４５． １９８５；Ｂ、んＢｉｄｌｉｎｐｅｙｅｒ、　Ｓ、んＣｏｈｅｎ、　Ｔ、　ＬA 　Ｔａｒｖｉｎ、　Ｊ。

Ｃｈｒｃｍａｔｏｇｒ、　３３６．９３．１９８４）、簡単に言うと、整理・配 列（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）はベツグマンモデル８９０スピニングカツプインス トルメント（マイクロシーケンス用に構成されている）上で行なわれた（製造者 によって推薦されたもの）（但し０，１％の水が無水エブタフルオロ酪酸（ＨＦ Ｂ八）に加えられ、０．１％エタンチオールが２５％トリフルオラセティック酸 （Ｔ　Ｆ　Ａ　：　ｔｒｉｆｕｌｏｒａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）に加えられた。

フェニルチオヒダントインアミノ酸がオクタデシルシラン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ ｓｉｌａｎｅ）コラム（ＩＢＭ　Ｉｎｃ、３０ｃｍＸ０．４６ｃｍ、３ミクロン 粒子サイＡ上で反転位相色素分析によって識別された（Ｄ、　Ｊ、　５ｔｙｒｄ ｏｉ＋　ｅｔ　ａｌ、　、　（前出））に記載されたグラディエンドシステムを 用いて）。アミノ酸残余物の略号はＡ、Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ　；Ｄ、Ａｓｐ；Ｅ 、Ｇｌｕ；Ｆ、Ｐｈｅ；Ｇ、Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ　；１、Ｉ　ｌｅ　；に、Ｌｙ ｓ　；Ｌ、Ｌｅｕ；Ｍ、Ｍｅｔ　；Ｎ、Ａｓｎ；Ｐ、ｐｒｏ；Ｑ、Ｇｉｎ；Ｒ， Ａｒｇ；Ｓ、Ｓｅｒ；Ｔ、Ｔｈｒ、Ｖ、Ｖａｉ　；Ｗ、Ｔｒｐ；　；Ｙ、Ｔｙｒ ｏ 合成シスチミンポリペプチドの合成： 残余物２〜１８に対応するポリペプチド（図３）が９フルオレニルメチルクロロ フオルム酸塩（Ｆ−ｍｏｃ）固相化学現象（作用）を用いてアプライド・バイオ アクティブ・インコーホレイテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　 Ｉｎｃ、）のモデル４３１Ａシンセザイザーによって合成された（製造者のプロ トコルに従ってｐメチルベンジヒリルアミン樹脂（ｐ−ｍｅｔｈｙｌ　ｂｅｎｚ ｙｈｙｒｙｌａｍｉｎｅ　ｒｅｓｉｎ）について）ｏ　［”Ｃ３Ａ　ｌ　ａのＦ モック派生物（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）が合成され（Ｊ、　 Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｙｏｕｎｇ、　Ｓｏｌ　ｉｄ　Ｐｈａｃｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉ ｓ（ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｒｃｃ汲■盾窒пA　Ｌ　 ｅｄ。

２、１９８４）、　ｐｐ、　６７−６８）　、ポリペプチドのＮＨ２末端残余物 に加えられた。次に［１４Ｃ］Ａｌａのポリペプチドは樹脂からクリープ（ｃｌ ｅａｖｅｄ）された。放射性ペプチドがＣｌ８ＨＰＬＣによって浄化・純化され た。合成シスチミンポリペプチドの特定のアクティビティは１９．０μＣｉ／μ ｍｏｌであった。

例２ 放射性ラベル（印）が付けられたシスチミンポリペプチドのシステミック移動合 成シスチミンポリペプチド（上述）がバイオアクティビティについてテストされ た結果、それは、若いトマトプラントの切断茎に供給されるとインヒビタ！及び ■ブトティンの双方の合成及び蓄積を誘発するための元来の（ｎａｔｉｖｅ）シ スチミンポリペプチド（ステップ６に浄化・純化されたもの）として有効である ことが判った（図４）。インヒビタＩ及び■の最大蓄積の半分を作るためには、 各グラ〉ト毎に約４０エフモル（ｆＩＩｌｏｌ）のポリペプチドが必要とされる 。これは植物細胞（ｃｅｌｌ）壁から取出された既に報告されたＰＩＩＦオリゴ ガラクツロニド（ｏｌｉｇ。

ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｄｅ）誘発剤と比ベモルレベルで約１０’倍多いアクテ ィビティを示している。シスチミン合成ポリペプチドに応答するインヒビタ■及 び■の合成の調和誘発（図４）は、転写的に調整される通常の植物損傷応答と似 ている。これはポリペプチドが損傷（Ｔ、　Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ａ、　Ｒ ｙａｎ、　１９７２前出；　Ｊ、　Ｓ、Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、　、　P９ ８６前出）、オリゴサツカライド（ｏｌｉｇｏｓａｅｃｈａｒｉｄｅｓ）　（Ｐ 、Ｂ１５ｈｏｐｅｔａ１．．１９８１前出、Ｍ、　Ｗａｌｋｅｒ−８ｈｉｍｌＩ ｌＯｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８：Ｌ前出）、及びメチルジャスモナ・−テ （ｊａｓｍｏｎａｔｅ）　（Ｅ、　Ｅ、　Ｆａｒａ＋ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　 １９９０前出）によってアクティベ・−トされたのと同じ信号を変換・形質導入 経路をアクティベートすることを示唆している。

以前に報告されたオリゴガラクツロニドとは異なり、シスチミンポリペプチドは 損傷個所から離れた細胞（ｔｉｓｓｕｅｓ）に移送される。１４Ｃの印を付けら れたポリペプチドが合成され（上述、例１）、トマトプラン）・の新しい（ｆｒ ｅｓｈ）損傷個所に位置された。３０分以内に放射能は葉の全体に移動し、１〜 ２時間以内に放射能を印が付けられたシスチミンが篩部滲出部（液）においてＨ Ｐ　Ｌ　Ｃによって識別された（図５　）　（Ｒ，Ｌ　Ｋｉｎｇ　ａｎｄ　Ｊ、 　Ａ、　ＺｅｅＶａａｒｔ、円ａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５３．９６．１９７ ４■■ された方法に基づいてプラントから発現されたもの・出されたもの）。ポリペプ チドは「シスチミン」と名付けられた。それは滲出液内で動くことができるから である。

プロテイナーゼインヒビタｌ及び■用の遺伝子は葉における損傷によって誘発さ れるが、発展的に分裂細胞（組Ｗ１花の細胞（ｔｉｓｓｕｅｓ）、トマト種の果 実及びポテト塊茎において調整されている。従って、これらの発展事情はシスチ ミンもしくはシスチミンファミリーのメンバーである同様なポリペプチドによっ て媒介される場合が多いと考えられる。

図４は実験結果を示している。より詳しくは、シスチミン合成ポリペプチドが若 いトマトプラントの摘出された葉においてプロテイナーゼインヒビタＩ　（・） 及びインヒビタ■（○）の合成及び蓄積を導き入れた（誘発した）場合の実験結 果を示している。葉は合成シスチミンプロペプチド溶液で培養されプロテイナー ゼインヒビタは上述の例１に示したように検査された。各データポイントは３６ 個のトマトプラントの葉の検査から得られたものである。

例３ 分子クローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）プロシスチミンプロシスチミンｃＤＮＡは 以下のようにトマト葉ｎＲＮＡから合成された第１−主要ｃＤＮＡライブラリー をスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）することによって分離された。

ポリＡ＋ｍＲＮＡはオリゴｄＴコラムファーマシア（ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用 いてトマト葉から浄化・純化されたｃＤＮＡはスタラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成システムを用いて合成されラムダ（粒子）ＺＡＰ ベクターアーム（ａｒｍｓ）内にクローニングされた（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 。約ｇｏ、　ｏｏｏの主要ライブラリー組換型（組換えを示す固体）がスクリー ニングされた（二重プラクリフトによって（ｂｙ　ｄｕｐｌｉｃａｔｅ　ｐｌａ ｑｕｅ　１ｉｆｔｓ））。このスクリーニングは退化した・変質したオリゴヌク レオチドプローブを用いて行ない（ｒｓＰＩＪと呼ばれる）、シスチミンのカル ボキシ基末端のアミノ酸シーケンスに基づいている（即ち、ＰＰＫＭＱＴＮ、図 ６で１９０〜１９６の番号が付けられたアミノ酸。但し、Ａ　Ｓ　ｐ　Ｈｇ６コ ドンの最後のヌクレオチド残余物は除く）。スクリーニングのためのハイブリッ ド化条件は以下の通りである。６Ｘ　ＳＳＣ；ＬＸＸシンード溶液（Ｄｅｎｈａ ｒｄｔｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　；　１００　ｖイクログラム／ｍｌイースト（ ｙｅａｓｔ）　ｔ　ＲＮ　Ａ　；　０．５％ピロリン酸塩ナトリウム及び約４Ｘ １０’　ｃｐｍの３２ｐ端部ラベル（印）付きＳＰＩである。ハイブリッド化は ３７℃で３６時間行われた。フィルターは５Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ　（４ ８度で１時間）を何回か交換して施錠した。約５０個のポジティブクローンが認 識されへ第２の退化・変質したオリゴヌクレオチド（ｒＳＰ２Ｊと呼ばれる）を 用いて再びスクリーニングされた。これはシスチミンのアミノ末端に相当する（ ＡＶＱＳＫＰ、図６で１７９〜１８４の番号が付けられているアミノ酸但しＰｒ ｏ、８４コドンの最後は除く）。ハイブリッド化及び洗浄条件は、ＳＦ３の洗浄 温度が４０℃であることを除き、ＳＰＩに用いられたのと同一である。最初の（ 初期の）ポジティブクローンの中では１つだけがＳＰ２プローグへハイブリッド 化される。

プロシスチミンｃＤＮＡのフラグメント（ｒｐｓＹｓＩＪと呼ばれる）は、ブル ースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミドにサブクローニング（５ｕｂ ｃｌｏｎｅｄ）さ也ジングルストランドのＤＮＡはシクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎ ａｓｅ）　（Ｕ　Ｓ　Ｂ　；　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔａｌ、　、　ＰＮＡＳ　７３ ．５４６３．１９７７）を用いてジデオキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ）整列・配列によ ッテ双方のストランドでレスキューされて整理・配列される。ＳＦ３のポジティ ブクローンの整理・配列をすると、「プロシスチミン」と呼ばれる大きなプロテ ィンの中でシスチミンポリペプチドをエンコードしたことになる。ポリシスチミ ンｃＤＮＡはフルレングスではなく　（ｎｏｔ　ｆｕｌｉ−１ｅｎｇｔｈ）、図 ６の１２０が付けられたヌクレオチドから始まる。

ポリシスチミンｃＤＮＡは８３９Ｊ）から成り、オーブンリーディング（ｒｅａ ｄｉｎｇ）フレームが１９７アミノ酸をエンコードする。リーディングフレーム はクローンの５′端部に開いたままでいる。またノーザンプロット分析によれば シスチミンｍＲＮＡはＩＫｂの大きさであることが示されているので我々はｃＤ ＮＡが５′端部の所で約１ｏｏｂｐないと結論づけた（考えた）。完全なプロシ スチミンｍＲＮＡシーケンスはプロシスチミン遺伝子（例６において説明する） を整理・配列し転写開始箇所をマツピングする（図７、例６）ことによって連続 的に決定される。例６に記載された実験はオープンリーディングフレームの長さ を６００ベース対（２００アミノ酸のプロシスチミンプロティンをエンコードす るもの）として確立した。開始メチオニンコドンの表示は２つの条件に基づいて 作られる。即ち、メチオニンコドンまで直に５′の複数の停止（ｓｔｏｐ）コド ンの存在及び移動開始用のプラントコンセンサスシーケンスに似ている近隣シー ケンスの存在（Ｉｌ、んｈｔｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８７．　ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ　６；４３）。

例４ プロシスチミンの構造及び性質 ｃＤＮＡシーケンス（図７）に基づき、シスチミンを２３ｋＤａプロシスチミン プロテインのカルボキシ基の近くに位置させる（図７゜アミノ酸残余物１７９〜 １９６゜ヌクレオチド６３９〜６９９に相当）。プロシスチミンのアミノ酸化合 物（ＣＯｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は帯電した（ｃｈａｒｇｅｄ）アミノ酸の高いパ ーセントを含むことは通常ではない（アスパラギン酸（１０％）、グルタミン酸 （１７％）、リジン（１５％）。しかし非常に僅な疎水性アミノ１０従って、プ ロシスチミンは著しく親水性の分子である。プロシスチミンシーケンスの分析は リーダー（ｌｅａｄｅｒ）ペプチドに似ているアミノ末端における疎水区域を示 してはいない。プロシスチミンのサブセルラー（ｓｕｂ−ｓｅｌ　Ｉｕｌａｒ） 区画化の移動処理後の経路及び場所は決定されないままでいる。ＥＭＢＬ及びシ ーンパンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）のデータベースのサーチは（ｃＤＮＡ及び推移 された（ｄｅｄｕｃｅｄ）プロティン先駆物質シーケンスの双方を用いて）、リ ストされたシーケンスに対する重要なホモロジーを示してはいない。

１８アミノ酸シスチミンシーケンスは先駆物質の中でたった１度しか起らないが （カルボキシ末端の近＜）、他のシーケンスエレメントは繰返される短い（６〜 ９アミノ酸）不完全な繰返しがプロシスチミンシーケンスの中で５回起こる（図 ７のクロスハツチングアンダーライン）。この観察はプロシスチミン遺伝子の少 なくても−（が複数遺伝子重複・複製／延長・離隔（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）現象によって進化していることを示唆する。この結論は 遺伝子の構造によって支持される。

例５ プロシスチミンにおける蛋白質分解処理個所シスチミンの境界を成す（接する） 推定処理個所が図７に示されている（即ち（アミノ酸残余物１７８及び１８７　 ）　、　Ｌ　ｅ　ｕ　（１７８）及びＡ　ｓ　ｎ　（１７９）処理個所は動物プ ロホルモン先駆物質内でバイオアクティブなペプチドをフランキング（ｆｌａｎ ｋｉｎｇ）をする内部ｅ吸収蛋白質分解（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）処 理個所用のコンセンサスシーケンスには一致しない（ａｎｉｍｌ　５ｉｔｅｓ　 ｉｎ　Ｒ，Ｂ、　ｌ１ａｒｒｉｓ、　１９８９．　Ａｒｃｈ、　ＢｉｏｃｈｅＩ ＬＢｉｏｐｈｙｓ、　２７５（２）　；３１５（１９８９）。最小動物コンセン サスシーケンスは一対の塩基性（ｂａｓｉｃ）アミノ酸（これらは裂開の位置の すぐ前にある）から成る。また、二塩基性の対が１つの塩基性アミノ酸によって しばしば先行される（２つもしくは３つのアミノ酸の距離だけ離れて）。しかし ながら、動物コンセンサスシーケンスはプロシスチミンシーケンス中に一度見つ けられる（残余物１８３−１８８のところで）（図７のＬｙｓＰｒｏＰｒｏＳｅ ｒＬｙｓＡｒｇ）、これは発達・成長した・成熟した（ｍｔｕｒｅ）シスチミン ポリペプチドの一部である。システミニンのハーフライフ（ｈａｌｆ　１ｉｆｅ 　）はこの場合における別の処理によって調整されることが想像できる（例えば 、８アミノ酸カルボキシル基ターミナルポリペプチドを作出すために）。

アニマルシステムにおいては、プロホルモンはしばしば複数バイオアクティブペ プチドを作出すように処理される（Ｊ、　Ｄｏｕｇｌａｓｓ、　Ｏ，Ｃ１ｖｅｌ 　ｌｉ　ａｎｄ　Ｅ、　ｌ１ｅｒｂｅｒｔ、　１９８４、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５３　：６６５　；Ｌ、　Ｊ、　Ｊｕｎｇ　ａｎｄ　Ｒ， Ｈ，５ｃｈｅｆ　ｌｅｒ、　１９X１．５ｃｉｅｎｃｅ　２５１　；　１３３０ ）また植物のポリペプチドホルモンのシステミンファミリのメンバは同じような 処理メカニズムに従う。

例６ プロシスチミン遺伝子及びシスチミン遺伝子ファミリの構造７００、００組換え 型・組換えを示す個体（ｒｅｅｏｍｂｉｎａｎｔｓ）のプライマリライブラリが バクテリアストレイン（ｐ　２）　Ｐ　Ｌ　Ｋ−１７（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 上に培養され（ｐｉａｔｅａ）　、スクリーニングされ（二重プラクリフトによ って）にツク移動されたプロシスチミンｃＤＮＡを用いて）。ハイブリッド化は 後述のように行われた。

一つのポジティブクローンが識別され浄化・純化された。遺伝子は１８Ｋｂゲノ ミツクＤＮＡフラグメント上に位置された（それから遺伝子はブルースクリプト ブラスシドにサブクローン化される）。はとんどの遺伝子に渡る（ｓｐａｎｎｉ ｎｇ）欠失（これら欠失は一連のオーバーラツプする欠失である）がｈ■Ｂｅａ ｒ／Ｅｘｏｎｏｃｌｅａｓｅ　ｍシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて生 成された。各欠失プロダクトはブルースクリプトファージミド（ｐｈａｇｅｍｉ ｄ　）にクローン化され、これらからジングルストランドＤＮＡが整理・配列テ ンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ　）として用いるためにレスキ、　−（ｒｅｓｃ ｕｅｄ）された。遺伝子は５ｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ、　Ｓ、　Ｂ）を用いてＳａ ｎｇｅｔのジデオキシ方法によって整理・配列される。このシーケンスはカスタ ムメートのオリゴヌクレオチドプライマ（ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いて終了される 。次に、推理されたシーケンスは、カスタムメートのオリゴヌクレオチドプライ マを用いて確認された（下記の「物質及び方法」に記載されているように）。

プロシスチミン遺伝子のシーケンスは図８Ａ−８Ｃに示されている。遺伝子は１ ０４　ｂ　Ｐ　５−　非移動区域ヲ含ム４５２６　ｂ　ｐ、　４１７０ｂｐ＝ｒ −ティング（ｃｏｄｉｎｇ）区域及び２４６ｂｐ３−非移動区域から成る。シー ケンスの優れた特徴はそれが７６％Ａ（Ｔリッチ）であることである。プロシス チミン遺伝子の構造は図９Ａに示されている。サザンプロット分析は図８Ｂに示 されている。

プロシスチミン遺伝子の中で１０個のイントロンがコーディング区域を妨害・中 断する（図１０）。したがって、エクソンは小さい（そのサイズの範囲としては 、３４ｂｐ　（エクソン１）から９０ｂｐ　（エクソン１０）である）。最初の １０個のエクソンは５つの対として構成されており、一方、シスチミンをエンコ ードするシーケンスは最後の対のないエクソン上に位置されている。エクソン対 の間の関係を調べるために、我々は各対の最初のエクソン（エクソン１．　３． 　５゜７．９）のシーケンスを並べてみた。また、別個に、我々は各対の第２の エクソンのシーケンスを並べてみた（図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように）。第 １エクソングループ内のシーケンスは全て互いに一致している・同相である。こ れは第２エクソングループ内のシーケンスも同じである。２つのグループの間の 目立ったシーケンス相同関係はない。このような観察は、５つのエクソ対が、１ つの共通の祖先から連続的複写・遺伝子重複（ｄｕｐｌ　１ｃａｔｉｏｎ　）に よって生じてくることを示唆している。１つの対内の個々のエクソンは互いに一 致していないということから、遺伝子が派生してきた祖先伝来のユニット（ｕｎ ｉｔ）が、１つの対内の個々のエクソンではなくエクソン対に対応する構造であ るということが示唆される。

５つの一致するエクソン（対）のセットとは対称的に、シスチミンをエコードす るエクソン（エクソン１１）はプロシスチミン遺伝子のその他の部分と目立った シーケンス一致を示さない。この観察によりシスチミンをエンコードするエクソ ンは遺伝子の残りの部分から別に発生した（それは、残りの部分にその後加えら れる）か、あるいはシスチミンをエンコードするエクソンはその他のエクソンと 同じ先祖伝来のシーケンスから出てきたこと（しかしその後より早く進化する） が示唆される。

シスチミン遺伝子ファミリー及びプロシスチミン内の繰返されるアミノ酸シーケ ンス プロシスチミンのアミノ酸シーケンスは遺伝子のそれと同じようにかなり繰返え される。短いオリゴペプチドシーケンスパレンドローム（Ｐａ　１ｅｎｄｒｏＩ ｒｉｃ）がミ／ステミンで識別され（例１）、５−っの一致する対の各々の第１ エクソンによるエンコードされるプロシスチミン内で同じようなこと（ｓｔｍｉ ｌｎｒ　ｔｈｅｏ＋ｅ）が５回起こる。

また３つの異なったタンデム的に（ｔａｎｄｅｍｌｙ）に繰返されるポリペプチ ドエレメントがプロシスチミン内に存在することによって、プロシスチミン遺伝 子の進化についての鍵（ｃｌｕｅ）が与えられる。

タンデム的にくりかえされたエレメントはプロシスチミンのアミノ端末ハーフ（ ｈａｌｆ）内で一度起き、プロシスチミンのカルボキシ基端末ハーフ内で一度起 きる。

先駆物質のアミノ末端ハーフ内のポリペプチドエレメントにはＲｅｐ　Ａ、　Ｒ ｅｐ　Ｂ及びＲｅｐ　Ｃというラベルが付けられ、分子のカルボキシ基末端ハー フ内のそれらのくくりかえ・反復・複製（ｒｅｐｅａｔｓ）にはＲｅｐ２Ａ、　 Ｒｅｐ２Ｂ及Ｌｌ’Ｒｅｐ２Ｃというラベルが付けられる。これら繰返されるポ リペプチドエレメントのシーケンスは図１２に並べて示されている。プロシスチ ミン内の上記繰返しの位置は図１３Ａに示されでおり、またポリペプチドの繰返 し、をエンコードするＤＮＡシーケンスのプロジスチミン遺伝子内の位置は図１ ．３　Ｂに示されている。この比較から分るように、Ｒｅｐ　Ａ、　Ｒｅｐ　Ｂ 及びＲｅｐ　Ｃポリペプチドは２つのエクソン対によってエンコードされ（即ち ３＋４及び５＋６）、一方Ｒｅｐ２Ａ、　Ｒｅｐ２８及ｃＦＲｅｐ２Ｃは２つの その他のエクソン対によってンコードされる（即ち、７＋８及びｇ＋１０）。

従って、上記観察によってポリペプチドシーケンスの組（２つのエクソン対によ ってエンコードされたもの）がプロシスチミン遺伝子の進化のワンステップとし て複製されたことが示唆される。従って、プロシスチミンの先祖伝来の遺伝子は 少なくとも２つのエクソン対から成る構造のタンデム複製に従うであろうことが わかる。この結論は、シスチミン遺伝子が１つのエクソン対の連続的な複製によ って単純に進化されるというモデルを排除する。

イントロン境界線は、繰返されるＤＮＡシーケ：ノス内でシフトされることがあ る 繰返しＲｅｐ２Ａ、　Ｒｅｐ２Ｂ及び’Ｒｅｐ２Ｃがほとんど連続である場合（ 図］３Ａ）は、ポリペプチドＲｅｐ　Ａ、　Ｒｅｐ　Ｂ及びＲｅｐ　Ｃ区域の間 のアミノ酸シーケンス（これはプロシスチミンのアミノ末端ハーフ内で見つけら れた）は分子のカルボキシ基末端ハーフ内で複製されない。この観察はエクソン ７（エレメントＲｅｐＺＡをエンフードするもの）がその３′エンドにおいて截 頭されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）という事実によってほぼ説明される（即ち 工；／メントＲｃｐＡをエンコードするエクソン３のシー乞ノスに一ついて）。

同様にエクソン９（エレメントＲｅｐ２Ｃをエンコードするもの）はその５゛エ ンドで截頭される（即ぢ工Ｌ・メントＲｅｐＣをエンコードするエクソ５と比較 した場合）。

エクソン７の場合は遺伝子の短いセクションを欠失することによって生じてこな かったが存在するシ・−ゲンス内のイントロン境界線の位置をシフトすると生じ てきた。エクソン７の３′エンドの（における）イントロンジャンクシジンの回 りのシーケンスをエクソン３の３′エンドの対応するジャンクションシーケンス と比較すると、エクソン３の３′エンドに対応するシーケンスはエクソン７と８ の間の・Ｃノミ・ロンの５″エンドを構成していることがわかる。この構成はエ クソン３の延長（ｅｌｏｌｌｇａｔｉｏｎ）もしくはエクソン７の短縮によって 生ずる。同じようなプロセスがエクソン９の５′エンドの截頭においても起こる がどうかは明らかではない。

物質及び方法ニ ブライマーエクステンション（ｐｒｉｍｅｒ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）が図７に示 されたｃＤＮＡシーケンスのアンチセンスストランドのベース８２〜１１１から 成るゲル浄化・純化オリゴヌクレオチドを用いて行なわれた。全ＲＮＡは損傷の 後４時間後に若いトマトプラントから抽出されポリＡ＋ｍＲＮＡがオリゴｄＴコ ラムを用いて分離された（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）。オリゴヌクレオチドの３つの ピコモルはγ−ＡＴＰを用いて端部でラベルを付りられた（比アクティビティは ６．０００／Ｃｉ／１Ｉａ１０１　）。２Ｘ１０６Ｃｐｍのラベル付きオリゴヌ クレオチドは、１０分間８５度に加熱しその後４０ｍ　ＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６， ４）と１ｍＭ　ＥＤＴＡと０．４Ｍ　ＮａＣ１と８０％フォルムアミド（ｆｏｒ ｏａｍｉｄｅ）の溶液内で３０度で１晩ハイブリツド化することによって、４μ ｇポリＡ＋ｍＲＮＡにアニール化された。アニール化された核酸はエタノール沈 澱・凝縮さね、３０μｍの次の溶液内で再び中止・浮遊された。次の溶液とは５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）と７５ｍＭ　ＫＣＩと１０ｍＭジチオトレイ トールと３ｍＭ　ＭｇＣＩｚと５００　μＭ（７）各ｄＮＴＰと１００　ｕ　ｇ ／ｍ　１ウシ倣）（ｂ。

ｖｉｎｅ）血清アルブミンとを含む溶液である。３０ユニツトのＭ−ＭＪ、Ｖリ バーストランスクリブターゼ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と１ユニツトのＲＮａｓｅ　Ｂｌｏｃｋ　ＩＩ（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）が加えられ、反応混合物（ｍｊ、ｘｔｕｒｅ）が３７℃で９ ０分間培養された。反応の終りに、１μｍの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０ ）と１μｍのＤＮＡ５ｅ−フリーＲＮａｓｅＡ　（１０ｍｇ／ｍｌ）が反応混合 物に加えられ３７℃でさらに３０分間培養された。反応混合物はフェノールで抽 出さ汰エタノールで沈澱され４μＩＴＥバツフア（１０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｅ−Ｈ ＣＬ　（ｐＨ７，５）　、１．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０））で再停止 された（これに対し６μｌのフォルムアミドローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）バ ッファが続いて加えられた。上記バッファは８０％フォルムアミドと１０ｍＭＥ ＤＴＡ　（ｐＨ８，０）と１ｍｇ／ｍｌキシレンシアツールと１ｍｇ／ｍ＋ブロ モフェノールブルー（ｂｒｃ＋ｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）とから成る。２μ ｌの再停止されたプロダクトは６％アクリルアミド／８Ｍウレアシーケンシング ゲル（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｇｅｌ）の上で分析された。サイズスタンダード はプリマー（ｐｒｉｍｅｒ）としてプリマエクステンションオリゴヌクレオチド を用いて作られたシーケンシングプロダク！・と、テンプレートとしてプロシス チミン遺伝子の５′エンドから引出された（ｄｅｒｉｖｅｄ）ジングルストラン ドＤＮＡであった。シーケンシングは（整理・配列）はシーケナーゼ（Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅ）　（ＵＳＢ）を用いて実施された（プリマーに近いシーケンシング プロダクトを生成するための製造者の指示に続いて）。

ヤエリナ（ｍｕｎｇ　ｂａａｒ）ヌクレアーゼ分析は、プロシスチミン遺伝子の ５゛エンドに渡る（またがる）　４００　ｂｐ　Ｓｅａ　１−Ｎｄｅ　ｌを用い て実施された。Ｎｄｅｌ箇所はシスチミン遺伝子の第１エクソン内に位置する。

フラグメントのＮｄｅ１エンドは比アクティビティが６Ｘ１０６．ｃｐｍ／μｇ にエンドラベル付けされ（ｅｎｄ−１ａｂｅｌ　１ｅｄ）　、約１１０６ｃｐが プリマエクステンション実験で用いられたのと同じ４μｇのポリＡ＋ＲＮＡスト ック（ｓｔｏｃｋ　）と混合された。この混合物は乾燥され−Ｉｔ水されて粉に なり（ｄｅｓｉｅｅａｔｅｄ）　、１５μｌのハイブリッド化バッファ内に再停 止された（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ　）。混合物はミネラルオイルにより覆わわ 、６分間８２℃に加熱さね、３７℃で一晩ハイブリット化された。その後、サン プルは２００μｍの氷のように冷たいヤエリナヌクレアーゼバッファ（頷−酢酸 塩ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ）　（ｐＨ５，０）と、５０ｍＡ 塩化ナトリウムと、１ｅＭ塩化亜鉛と、５％（ｖ／ｖ　）グリセロール（ｇｌｙ ｃｅｒｏｌ）とから成る）と混合さね、これに対し１０ユニツトのヤエリナヌク レアーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が加えられた。混合物は１２０℃で３０分間 培養され、次に、フェノール：クロロフォルムの１対１（同体（資）の混合物で 抽出された。消化・蒸解・温浸（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　）プロダクトは、１μｇ のイーストｔＲＮＡと共に共沈しくｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）　、４　μ ｌ　Ｔ　Ｅバッファ＋６μＩフォルムアミドローディングバッファ内で再停止さ れた。３μｌの再停止された消化プロダクトは６％アクリルアミド／８Ｍウレア ゲル上で分析された。サイズマー・−力（ｓｉｚｅ　ｌｌ１ａｒｋｅｒｓ）は、 ジングルストランドＤＮＡ　（テンプレートとして遺伝子の５′エンドに対応す るもの）を用いて作られた。シーケンシングブリ？　（ｐｒｉｒＭ！ｒ）はＳ　 ｃ　ａ　Ｉ−Ｎｄｅｌプローブフラグメントの３′エンドでの最初の１９ベース （アンチセンスストランド）に対応（相当）する１９−ＩＩＩｅｒであった。

例７ プロシスチミン遺伝子の損傷誘発発現損傷に応答してプロテイナーゼインヒビタ 遺伝子をアクティベートする可動シグナル（ｍｏｂｉｌｅ　ｓｉｇｎａｌ）とし てのシスチミンの役割を考えているとき、我々は、プロシスチミン遺伝子そのも のが損傷誘発される可能性を調査した。ノーザンプロット分析を用いて無損傷及 び有損傷のトマトプラントの葉におけるプロシスチミンｍＲＮＡ及びインヒビタ ｌｍＲＮＡのレベルを調べた（図１５Ａ）。３２個の若いトマトツブラントが、 発芽の後３週間傷付けられた。プラントは上部葉と下部葉と小さな頂部葉（ａｐ ｉａｌ　１ｅａｆ）　とを有する。下部葉に傷が付けらｔＬ、ｍＲＮＡが、損傷 後火の時点で上部葉（無損傷）から分離された。即ち、０．　５．　１．　５． 　３．　６．　９．　１２及び２４時間である。

４つのプラントが各時点で用いられた。各時点からの全ＲＮＡ８５μｇ）は１， ４％アガロースフォルムアルデヒドゲル（ａｇａｒｏｓｅ　ｆｏｎ旧１ｄｅｈｙ ｄｅ　ｇｅｔ）上で電気泳動にかけらね、ニトロセルロース上にプロット（ｂｌ ｏｔｔｅｄ）された。このプロットは同時にニック移動されたプロシスチミン（ ｓｙｓ）及びインヒビタＩ（Ｉｎｈ−１）ｃＤＮＡｓ　（後述の「物質と方法」 を見よ）によって厳密に調べられたＣｒｏｂｅｄ）。プロシスチミンｍＲＮＡは 、傷付けられたトマトプラントの損傷のある葉及びない葉の双方において蓄積さ れることがわかった。このことは、プロシスチミンｍＲＮＡはインヒビタｌｍＲ ＮＡと同様に、システミカルに（ｓｙｓｔｅｍｉω１１ｙ）損傷誘発するという ことを実施している。プロシテミンｍＲＮＡは損傷後３〜４時間で最高レベルに 達した。一方、インヒビタｍＲＮＡは損傷後８〜１０時間でもっとも豊富であっ た。プロティナーゼインヒビタ！メツセージとは異なり（これは無損傷のトマト プラントの葉に存在しない）、低レベルのプロシスチミンｍＲＮＡかむ損傷のプ ラントの葉で検出された。葉のプロシスチミン遺伝子の低い構造性（重要な）　 （ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）発現によりシスチミンを連続供給することができ る（場合がある）。このことにより、プラントは直ちに損傷に対して応答するこ とができる。プロシスチミンｍＲＮＡの損傷誘発蓄積並びに、想像するに、無損 傷の細胞（ｔｉｓｓｕｅ）のプロシスチミン及びシスチミンは、プラントの連続 的なダメージに反応する能力を倍増することがある。したがって、昆虫の攻撃に よる連続的なダメージは、新しく合成された先駆物質からより多くの（最初の損 傷よりも）シスチミンを解放（ｌｉｂｅｒａｔｅ）するであるもその結果、攻撃 が続けば、プロテイナーゼインヒビタ合成が高いレベルで行われることになる。

プロシスチミンｍＲＮＡの蓄積の最初の速度が、損傷に対するインヒビタｌｍＲ ＮＡのそれよりも速いので（図１５Ａ）、２つの遺伝子をアクティベートする信 号変換（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）経路のいくつかの点が異なる。異なる速度 の蓄積に対しては別の信号を採用することもでき、あるいは信号変換経路は同じ 信号に応答するものでもよい（但し、異なる感度で）。

物質及び方法 ニック移動は、製造者の指示に基づいて、ＮＥＮデュポンニック移動システムを 用いて行われた。ハイブリッド化は次の条件下で行われた。即ち、５０％フォル ムアミドと、５×デンハーヅ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ　）と、５ＸＳＳＰＥと、０ ．１％ＳＤＳと、１００μｇ／ｍｏｌはぎ取り（ｓｈｅａｒｅｄ　）サーモシス パームＤＮＡと、１μｇ／ｍｌポリＡ及びニック移動ＤＮＡプローブ（特定のア クティビティのもの：約１１０９ｃｐ／μｇ）とを用いて行われた。特に記載が ない限り、プロットは１ｘＳＳＣ（０，１％ＳＤＳ、６５℃）で洗浄された。

例８ プラント全域で（へ）のプロシスチミンｍＲＮＡの分配プロシスチミンｍＲＮＡ はプラント（植物）の大気部分（空中で生長する部分）全域で見つけられるが、 根では見つけることができない（図１５Ｂ）。全（トータル）ＲＮＡは無損傷の 完全に生長したトマトプラントの次の部分から抽出された。即ち、根（Ｒ）、茎 （Ｓｔ）、葉柄（ｐｔ）、葉（Ｌｅ）、がく片（Ｓｅ）、花弁（Ｐｅ）、おしべ （Ｓｍ）　、及びめしべ（ＰＬ）である（図１５Ｂ）、各サンプルからの全ＲＮ Ａ　（５μｇ）は電気泳動にかけられ例７に示すようにプロットされた。プロッ トはニック移動プロシステムｃＤＮＡＣヒ述の例７）で厳密に調べられた［有］ ｒｏｂｅｄ）　（例７参照）。

プロシスチミンｍＲＮＡの最高構造性レベルは花の部分において見られる。その 特徴はインヒビタｌ及びインヒビタＩ［ｍＲＮＡ５の分配の特徴でもある。プロ シスチミンｍＲＮＡの一般的な分配沙なくとも地上の植物の一部において）は損 傷信号としてのシステムの提案された（ｐｒｏｐｏｓｅｄ）役割に合う（矛盾し ない）。

なぜなら、プラントの任意の空中部分の損傷はプロテイナーゼインヒビタ合成の システミックな誘発を生じさせると期待できるからである。根の部分にプロシス チミンｍＲＮＡが明らかに・全く存在しないということは驚きである。なぜなら ば、我々は根の損傷に対して、トマトの葉においてプロテイナーゼインヒビタ合 成の誘発があったことを観たからである。根は非常に低レベルのプロシスチミン ｍＲＮＡ　（検査では検出できない）を含むことは可能であり、あるいは根は異 なる損傷信号を採用して（例：異なるシスチミン遺伝子フラグメント）葉でプロ テイナーゼインヒビタ遺伝子をアクティベートすることができる。また、プロシ スチミンが葉から根（シスチミンが損傷に対して放出、解放される所）に移送さ れるということも考えられる。

プロシスチミン遺伝子同族体（物）の種（ｓｐｅｃｒｅｓ　）分配プロシスチミ ン遺伝子同族体がその他の植物種において見つけられるかを決定するために、サ ザン及びノーサンプロット分析が、損傷誘発プロテイナーゼインヒビタを有する と知られている３つの種からの全ＲＮＡとゲノミックＤＮＡについて行われた。

即ち、ポテト、ナス属のチュープロサン（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕ　 ）。

、そのバリエーション（ｖａｒ　）　、ラセットバーバンク（Ｒｕｓｓｅｔｔ　 Ｂｕｒｂａｎｋ　）　（Ｃ。

んＲｙａｎ、　１９８６．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４３．１８８０　 ）　、タバコ、タバコ属のタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　） 　、そのバリエーション、キサンチ（Ｘａｎｔｈｉ）　（Ｇ、Ｐ　ｅ　ａ　ｒ　 ｃ　ｅ０組織標本・プレパラートになる）、アルファルファ、メディカーゴサテ ィヴアαｅｄｉｃａｇｏ　５ａｔｉｖａ　）　、そのバリエーション、ヴアーネ ｖ　（Ｖｅｒｎｅｍａ　）　（１ｆ、Ｅ、Ｂｒ（至）及びＣ０んＲｙａｎ、　１ ９８４．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３　：３４１８　；ｆ、　Ｅ、　Ｂ ｒｏｗｎ、　Ｋ、　Ｔａｋ奄潤A　ａｎｔ、　Ｃ，んＲｙａ ｎ、　１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４：２１０５　）　ｏ管理・ 制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、１つの種から（アラビドプシスタリアナ（Ａｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）　、そのバリエーション、コロンビア （Ｃｏｌｕｍｂｉａ）　）　（これが損傷誘発プロティナーゼインヒビタを有す ることは知られていない）。

プロシスチミン遺伝子同族体の種分配のサザンプロット分析が図９０に示されて いる。トマト（図９Ｃ，レーン１）、ポテト（図９Ｃ，レーン２）、タバコ（図 ９Ｃ，レーン３）、アルファルファ（図９Ｃ，レーン４）及びアラビドプシス（ 図９Ｃ，レーン５）からのゲノミックＤＮＡ　（５μｇ）がＥｃｏＲｌにより消 化−蒸解（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）された。制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　）フラ グメントは０．　８％アガロース（ａｇａｒｏｓｅ　）ゲル上で電気泳動によっ て分離された。そして、プロシスチミンのフラグメントは、ニトロセルローゼに プロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）　Ｌ、ニック移動プロシスチミンｃＤＮＡ によって厳密に調べることによって可視化された。ブッロトはほどほどに厳しい 条件下で５５℃で洗浄された。分析された４つの植物種の中で、プロシスチミン 遺伝子の同族体がポテト（４つの種の中で最もトマトに近いもの）においてのみ 、はどほどに厳しい条件下で識別された。ポテトｍＲＮＡ種も識別された（それ はトマトプロシスチミンｃＤＮＡにハイブリット化され、トマトプロシスチミン ｍＲＮＡと共に同時・共同移動した）。タバコ、アルファルファ及びアラビドプ シスの遺伝子のヌクレオチドシーケンスは、トマト遺伝子のそれからある程度分 岐したであろう。ある程度とは、それが、厳しい条件下でのトマトプロシスチミ ンｃＤＮＡとのハイブリット化によってはもはや検出できる範囲をいう。この理 解は、同族体は大幅に小さくなったハイブリッド化及び洗浄条件では検出できな かったという事実によって裏付けられる。その他の植物遺伝子からの抽出物の分 析によって、シスチミン遺伝子ファミリのメンバの進化及び分配に関して新たな 知識・事実が得られるであろう。

例１０ プロシスチミン遺伝子のアンチセンス抑制・抑止プロシスチミン遺伝子プロダク トがシステミック信号変換において重要な役割を有している（結果として、トマ ト葉においてプロテイナーゼインヒビタ遺伝子が発現されることとなるようなも の）かを決定・判定するために、プロシスチミンアンチセンスＤＮＡが作られ、 トマトプラントを変形・形質転換（廿ａｎｓｆａｎｎ）するのに用いられた。キ メラ（空想的な）アンチセンスＤＮＡはプロシスチミンｃＤＮＡから構成され（ アンチセンス３′〜５′方向で）（構造性ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御の下 に）、バイナリ（ｂｉｎａｒｙ）ベクターｐＧＡ６４３に挿入された。

物質及び方法： 特定のストランドを有する放射性ラベルの付いたＲＮＡプローブが製造者の指示 に基づいて、Ｔ３及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い てシスチミンｃＤＮＡから作られた。

アンチセンスＤＮＡ構造体がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）　Ｌ　Ｂ　Ａ４４０４に変形され、組替えバクテ リアがトマト（の）バリエーションであるベターボーイ（Ｂｅｔｔｅｒ　Ｂｏｙ ）を変形するのに用いられた。第１注要）トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆ ｏｒｍａｎｔｓ）の制御物として、トマトプラントはバイナリベクターのみで変 形された。１８個のアンチセンスプラントと２１個の制御物が再生成された。変 形されたプラントが土壌に移されてから３週間後に、各プラントの下部（ｊ５） 葉が集中的に傷付けらね、損傷誘発ブロティナーゼインヒビタ■及び■のレベル が、２４時間後、上部坊）葉から出る汁において判定された（Ｃ，Ａ、　Ｒｙａ ｎ、　１９６７、　Ａｒｕｉｌ、　Ｂｉｏｃｂ５．１９　：　４３４　；Ｒ，Ｔ ｒａｕｔ財ｔＬ　Ｍ、　（ｂｗｎ、　ＧA　Ｇ、　Ｗａｇｎｅｒ、　１９７１゜ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　計９０１）。どのプラントも損傷の前に自己 の葉においてインヒビタＩもしくは■を作ることはなかった。アンチセンス遺伝 子を含む１８個のプラントの中で、１１個のプラントが、１２６．７＋／−１８ ，６ｕ　ｇ／ｍ　１葉汁（ｌｅａｆ　ｊｕｉｃｅ）の平均制御レベルの４０％よ り低いところでインヒビタｌを作り、１６４．７＋／１８．６μｇ／ｍ１葉汁の 平均制御レベルの３０％より低いところでインヒビタ■を作った。

図１６Ａは複数のアンチセンスプラトの１つ（ＩＡＡで示されている）から分離 された全ＲＮＡのノーザンブロツト分析を示している。この場合、特定のセンス 及びアンチセンスを有するジングルストランドＲＮＡプローブが用いられた。

全ＲＮＡ　（５μｇ）の２つのサンプルが電気泳動にかけら也上述のようにプロ ットされた。サンプルは、センス（図１６Ａのレーン１）及びアンチセンス（図 １６Ａのレーン２）プロシスチミンｍＲＮＡに特定の放射性ラベル付ＲＮＡプロ ーブを用いて別々に厳格に調べた吐記例６〜８参照）。

損傷実験において、プラント（ＩＡＡ）の離れている葉は損傷に対し、インヒビ タ■を４２μｇ／ｍ１葉汁において、インヒビタ■を４１μｇ／ｍ１葉汁におい て現わした。アンチセンスＲＮＡは約１，７キロベース（ｋｉｌｏｂａｓｅｓ） におけるバンド（ｂａｎｄ）として現われた（図１６Ａのレーン２）（プロシス チミンｍＲＮＡのｌｋｂと比較される）（図１６Ａのレーン１）。サザンプロッ ト分析は、プラント（ＩＡＡ）がアンチセンス構成物の１つのコピーを有してい ることを示した。

この結論はプラント（ＩＡＡ）を自己施肥（ｓｅｌｆ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｉｎｇ ）　Ｌ、サザンブｏ−７ト分析によって２８Ｆ１プロジエニ（子孫）　（ｐｒｏ ｇｅｎｙ）を分析することによって確認された。７つ（４分の１）の２８Ｆ１プ ロジエニはアンチセンス構成（物）を受継がなかった。この実験は、アンチセン ス構成がＦ１世代では安定的に受継がれていることも実証した。

アンチセンス表現型・個体群（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）がアンチセンス構成と共に 分離されたことを実証するために、２８個のＦ１プラントの離れている葉におけ るインヒビタ１及びＨのレベルが、損傷前及び損傷後の２４時間経過したときに 計測された。図１６ＢはプロティナーゼインヒビタＩの損傷誘発蓄積をグラフ化 したものであり、図’１６Ｃはブロティナーゼインヒビタ■の損傷誘発蓄積を示 したものである。これらの図は、Ｆ１アインチセンスプラント（白いバー）と変 形されていない（ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）制御（預ｔｒｏｌｓ）　（黒い バー）の離れた葉についての蓄積を示す。アンチセンスプラントＩＡ４は自己施 肥さイ＼３週間の若さのＦ１子孫０ｒｏｇｅｎｙ）の離れた葉における損傷誘発 ブロティナーゼインヒビタＩ及び■の量がラジアル免疫拡散（法）検査（ｖａｄ ｉａｌ　ｉｍｍｕｎｃｘｉｉｆｆｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙＸ後述）によって計測 された。プラントは下部葉と下部葉と小ざな頂部葉を有する。下部葉は損傷さ！ に２４時間後に汁（ｊｕｉｃｅ）が上部の無損傷葉からしぼりだされ（ｅｘｐｒ ｅｓｓｅｄ）、検査された。インヒビタｌの量は２８個のＦ１プラントにおいて 計測され、一方、インヒビタ■のレベルは２８個のＦ１プラントの内の２７個に おいて計測された。

３０個の変形されていないトマトプラントの制御グループ、そのバリエーション であるベターボ・−イ（ｖａｒ、　Ｂｅｔｔｅｒ　Ｂｏｙ）も損傷さね、インヒ ビタｌ及び■の量が計測された。インヒイタプロテインは、６つの無損傷アンチ センスプラント及び６つの無損傷制御プラントの葉からしぼり出された汁の中に は検出されなかった。

アンチセンスプラントの３／４（即ち、アンチセンス構成を受継いでいるもの） は損傷に対して弱く反応する（変形されていないプラントの制御ボピュレーシタ ン（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　）に比べて）（図１６Ｂ及び１６ ＣＭ）、構成を受継がないプラントは、変形されていない制御プラントと同じプ ロテイナーゼインヒビタレベルを発生した（作った）。

２８個のＦ１アンチセンスプラントの中の６個において、離れた葉でのインヒビ タ１合成は９７．２＋／−４，７μｇ／＋＋１の平均制御レベルの１５％未満で あった。一方、インヒビタ■は離れた葉では検出できなかった（１２２．３＋／ −７，２μｇ／＋＋１）の平均制御レベル）。６個の最低（最小）反応Ｆ１プラ ントのサザンプロット分析は、これらプラントがアンチセンス構成の２つのコピ ーを受継いでいることを示唆する（しかし、この結論は、プラントを自己施肥し て、Ｆ２子孫は全くプロテイナーゼインヒビタを作らないということを実証する ことによって確認されなければならない）（制御プラントと同じレベルで損傷を 受けた場合の応答・反応としてプロテイナーゼインヒビタを作らないという意） ５これら実験は、トマトにおけるアンチセンスプロシスチミンｍＲＮＡの発現が 、損傷に対するプロテイナーゼインヒビタ合成のシステミックな誘発を抑制・阻 止していることを示す。アンチセンスプロシスチミンｍＲＮＡはプロシスチミン の効率的生成を（したがって、可動システミック損傷信号シスチミンの効率的生 成を）防止することが推理できる。

物質及び方法： プロシスチミンｃＤＮＡの７４７ｂｐフラグメントがｐＳＹＳｌからＢａｍＨＩ −Ｈｉｎｄｌ［Ｉフラグメントとして摘出された。ＢａｍＨｌの場所はｃＤＮＡ の５゛エンドの近くのブルースクリプトポリリンカ（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）中 である。一方、ＨｉｎｄｎＩの場所はｃＤＮＡ中であり、図７において８５９が 付けられたヌクレオチドの所である。したがってアンチセンスｃＤＮＡフラグメ ントは全てのプロシスチミンｍＲＮＡシーケンス（但し、エンコーディング区域 の最初の７ｐｂを除（）と、全ての５゛非移動区域と、３−非移動区域の最後の ９２ｂｐとを含む。ｃＤＮＡ７ラグメントは、構造性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖ ｅ）　Ｃａ　ＭＶ　３５　Ｓプロモータの制御の下に位置された。これは、フラ グメントをクローニングして（アンチセンス３′〜５−オリエンテーションにお いて）、バイナリベクタｐ　Ｇ　Ａ６４３のポリリンカ（Ｂｇｌｎ及びＨｉｎｄ ｌＩ［によって消化（ｄｉｇｅｓｔｅｄ　）されたもの）にすることによって行 われる。アンチセンス構成はアグロバクテリウム（ＡｇｒＯｈａｃｔｅｒｉｕｍ ）ストレインＬ　Ｂ　Ａ４４０４に変形され、組替えバクテリアはトマトのバリ エーションであるベータボーイを変形するのに用いられた。

トマトシード（ｓｅｅｄｓ）のバリエーションであるベターボーイは、トウィー ン（Ｔｖｅｅｎ）２０を２つもしくは３滴（ｄｒｏｐｓ）以上含むクロロツクス （Ｃｈ　Ｉｏｒｏｘ）の１５％（ｖ／ｖ）溶液に１５分間浸すことによって滅（ 殺）菌された。これらシードは蒸溜水で４回洗浄され、次のものを含む媒介（体 ）・媒質（ｍｅｄｉｕａ＋　）上で二重にされた・対にされた（ｇｅｍｉｎａｔ ｅｄ）　ａ次のものとは、ＭＳ塩（４，３ｔ／Ｌ）　、アガロース（６ｇ／Ｌ） 及びチアミン（１ｍｇ／Ｌ）　（ｐＨ５，８）である。二重にされるべきプラン トは１６時間日光（２８℃）で育成された。シードの８０％が二重になった。７ 〜１０日後、最初の本当の葉が現われたとき、子葉がシード（ｓｅｅｄｉｎｇ） から取除かれ、エッヂ長が０．２〜０．５ｃｍの立方体となるようにカットされ た。細胞立方体（ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｂｅｓ）は、暗所（２５℃）で２日間タバ コフィーダ（ｆｅｅｄｅｒ）プレートに（で）予め調整された（ｐｒｅｃｏｎｄ ｉｔｉｏｎｅｄ）。タバコフィーダプレートは次のものを含む媒質（体）にタバ コ（ＮＴ−１）制御細胞（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｅｌｌ）を二次培養（ｓｕ ｂｅｕｌｔｕｒｅ）することによって準備された。次のものとは、ＭＳ塩（４， ３ｔ／Ｌ）と、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）　（３０ｇ／Ｌ）と、イノシトー ル（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）　（０，１ｔ／Ｌ）と、チアミン（ｌｑ／Ｌ）と、２． ４−Ｄ　（０，２ｍｇＡ）と、Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４（０，１８ｇ／Ｌ）（ｐＨ５， ８）である。細胞（ｃｅｌｌｓ）は暗所（２５℃）で４日間培養された。細胞は ０．７％アガロースを含む同じ媒体（質）に培養され（ｐｌａｔｅｄ）、その後 、以前と同じ条件でさらに２日間培養された。トマト子葉はホワットマンＮｏ、 　４フイルターペーパー（タバコフィーダプレート媒体に浸され、タバコフィー ダプレートの上に置かれたもの）の上に置かれた。

予め調整された細胞（ｔｉｓｓｕｅ）は２０ゲージニードルによって孔あけさね 、アグロバクテリウムによって感染（ｉｎｆｅｃｔｅｄ　）される（細胞（ｔｉ ｓｓｕｅ）を３０分間１５ｍＬの発芽媒体（１０８セル／ｍＬを含む）に浸すこ とによって）。細胞（ｔｉｓｓｕｅ）は殺菌したフィルターペーパーを用いてプ ロット（ｂｌｏｔｔｅｄ）されて乾燥さね、タバコフィーダプレート上でさらに ２日間暗所（２５℃）で培養された。次に細胞（ｔｉｓｓｕｅ）は発芽媒体（質 ）の中で３回洗浄された（３回目の洗浄は０．５ｇ／’Ｌのセフォタキシム（Ｃ ｅｆｏｔａｘｉｍｅ）を含む）。細胞（ｔｆｓｓｕｅ　）は殺菌したフィルタペ ーパーを用いてプロット（ｂｌｏｔｔｅｄ）され乾燥され、次のものを含むシュ ーテイング媒体（ｓｈｏｏｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）の上に置かれた。次のもの とは、ＭＳ塩（４，３ｇＡ）と、チアミン（１０ｍｇＡ）と、ニコチン酸（１ｍ ｇ／Ｌ）と、ピリドキシン（１ｍｇ／Ｌ）と、イノシトール（１００ｍ　ｇ／　 Ｌ）　、スクロース（３０ｇ／Ｔ−）と、ＢＡＰ（２，５ｍ／ｇＬ）と、ＩＡＡ 　（１ｍｇ／Ｌ）と、セフォタキシム（２５０μｇ／Ｌ）と、カーペニシリン（ ５００ｍｇＡ）と、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）と、０．７％（Ｗ／Ｖ）ア ガロースである。エクスプラント（ｅｘｐｌａｎｔｓ・外植片）は栽培・培養（ ｃｕｌｔｕｒｅ）の最初の３日間の後、及びその後１週間毎に移された。一旦カ ルス（Ｃａｌｌｕｓ）成長が観察されると（３回目の植継ぎ・二次培養（ｓｕｂ ｃｕｌｔｕｒｅ）の後）、エクスプラントはシューテイング媒体（成長媒体）に 移さね、そこからＩＡＡ及びＢＡＰが取除かね、ゼアチン（２ｍｇ／Ｌ）が加え られた。一旦若枝（ｓｈｏｏｔｓ）が２〜３インチの高さになると、若枝はルー ティング（ｒｏｏｔｉｎｇ）媒体（根付媒体）に移される（ルーティング媒体は ＢＡＰにおいてシューテイング媒体と異なる）。

セフォタキシム及びカーペニシリンはなかった。バンコマイシン（０，５ｇ／Ｌ ）が加えられた。スクロース（２０ｇ／Ｌ）　、カナマイシン（２０ｍｇ／Ｌ） 及びＩＡＡ（０，０５ｍｇ／　Ｌ　）の濃度は低くなっていた。

例１１ トランスジェニックプラントにフィード（ｆｅｅｄ）　したマンデューカセクス タ幼虫に対する成長の影響 全ＲＮＡ摘出物（異なる時に制御（変形されていないもの）及びトランスジェニ ックトマトプラントの無ダメージの葉から集められた）のノーザンプロット分析 は、マンデューカセクスタ幼虫を用いて（た）、フィーディング実験中に行われ た。プラントは約１８インチの高さを有し、また２〜３本の主茎（ｍａｉｎ　ｓ ｔｅｍｓ）を有していた。各サンプルからの全ＲＮＡは電気泳動によって分離さ ね、ニトロセルロースベーパーにプロットされ、ニック移動】２Ｐ−プロシスチ ミンｃＤＮＡを用いて（と共に）プローブされた（ｐｒｏｂｅｄ）　：厳格に調 べられた・深針で探られた）。結果が図１７に示されている。

制御及びトランスジェニックアンチセンストマトプラントの無ダメージ葉におけ るインヒビタ！及び■プロティンの蓄積（マンデューカセクスタ幼虫へのフィー ディングによって誘発されたもの）が計測された。葉汁はモルタル・すり鉢（■ ｏｒｔａｒ）及び乳棒（ｐｅｓｔｌｅ）を用いてしぼり出さね、ラジアル免疫拡 散検査法（Ｒｙａｎ。

１９６７）によって検査された。図１８に示されるように、トランスジェニック アンチセンストマトプラントでは、インヒビタ■及び■プロティンの双方の蓄積 が減少していた。図１８において、Ａはトランスジェニックアンチセンスプラン ト、Ｃは天然（野生）タイプのプラント、ＰＩはインヒビタｌ５ＰＩはインヒビ タ■を示す。

マンデューカセクスタ幼虫の成長（制御及びトランスジェニックアンチセンスト マトプラントにフィーディングされた場合の）が計測された。１０個の最初の令 幼虫（ｉｎｓｔａｒ　１ａｒｖａｅ）が６個の制御（天然タイ力及びトランスジ ェニックプラントの各々の上にランダムに置かれ、取除か右、検量・重量測定さ れた（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）。制御プラントにフィード（ｆｅｅｄ）された幼虫は １４日目（毎）に検量さね、トランスジェニックアンチセンスプラントにフィー ドされた要求は１０日及び１４日口（毎）に検量された。図１９に示されるよう に、トランスジェニックアンチセンスプラントにフィードした幼虫の成長体重（ ｇｒｏｗｔｈ　ｗｅｉｇｈｔ）は、天然タイプのプラントにフィードした幼虫の 体重に比べ重たくなっていた。図１７中の値は、３つの異なるプラント実験の平 均値であり、統計的に重要なものを示している。　ＣａＭＶプロモータによって 追いたてられた（ｄｒｉｖｅｎ）プロシスチミン遺伝子を有するトランスジェニ ックプラント佳記例１０）が作られた。プロシスチミン遺伝子はアンチンセンス 遺伝子と本質的に同じである（ＭｃＧｕｒｌ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ５５．１５７０−１５７３）　（但し、プロシスチミンｃＤＮＡはセンス方向（ ｏｒｉｅｎｔａｔｆｏｎ）にあることを除いて）。マンデューカセクスタ幼虫は 制御（天然タイプ）及びトランスジェニックセンストマトプラントの葉にフィー ドされた。制御葉はインヒビタＩ又は■をほとんどもしくは全く含んでいなかっ た。プロシスチミンを発現するトランスジェニックプラントの葉は約３００μ／ ｇティシュインヒビタＩと約２００μ／ｇティシュインヒビタ■を含んでいた。

図２０に示されるように、制御葉にフィードした幼虫の体重は、トランスジェニ ックセンス葉にフィードした幼虫よりも早い速度で増加した。

当業者であれば上記の説明から次のことが理解できるであろう。即ち、本発明の 上位概念は色々な形態・態様で具現化することができる。したがって１１本発明 は上記において特定の例について説明されてきたが、本発明の真の範囲は上記例 に限定されるべきものではない。なぜなら、本明細書及び以下の請求の範囲を理 解すれば、その他の変形・修正等が当業者には明らかになるからである。

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３１、１．５ｃｈｅｃｈｔｅｒ　ａｎｄ＾、　Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　２７＋@１５７（１９６７ ）。

３２、　Ｓ、Ｏ，Ｒｏｇｅｒｓ　ａｎｄ　Ａ、Ｊ、Ｂｅｎｄｉｃｈ、Ｐｌａｎｔ 　ＩＩｏｌ、Ｂｏｌ、５．６９（１９８５）。

シーケンスリスト （１）一般情報： （ｉ）出願人：ライアン，シー，工一：マクガール，ビー，エフ；ビアス．ジー ，エル （ｉｉ）発明の名称：「システミン」 （ｉｉｔ　）シーケンスの数；４ （１ｖ）郵送住所 （Ａ）名宛人．クリステンセン，オコナー，ジランソン・アンド・カインドネス （Ｂ）ストリート：フィフス・アヴエニュー１４２０パシフィック・ファースト ・センター２８００（Ｃ）シティー：シアトル （Ｄ）州：ワシントン （ＥＪ国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：９８１０１−２３４７（Ｖ）コンピューター・リーダブル・フ ォーム（Ａ）ミディアムタイプ：ディスケット−５．２５インチ、１．２Ｍｂス トレージ （Ｂ）コンピューター；ＩＢＭ　ＰＣ／３８６　コンパチブル（Ｃ）オベレイテ ィング　システム：ＭＳ−ＤＯＳ　４．０１（Ｄ）ソフトウエア：ワード・フォ ー・ウィンドウズーｔ（ｖｉ　）現出願データ （Ａ＞出願番号：なし ＜Ｂ）出願日：１９９２年３月１９日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ　）前出願データ （Ａ）出願番号：なし （Ｂ）出願日二なし （ｖｌｉｉ）弁理士／代理人情報 （Ａ）氏名：サンズモ，ジョーン，エス（Ｂ）登録番号：　３４４４６ （Ｃ）１１照１号＝ＷＳＬＩＲ−１−６１７１ＮＸ）通信情報 （Ａ）電話：１−２０６−６８２−８１００；１−２０６−２２４−０７２７　 （直通》（Ｂ）ＦＡＸ：　１−２０６−２２４−０７７９（Ｃ）テレックス＋４ ９３８０２３ （２）シーケンス　ＩＤＮｏ．１用の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリスティ ックス（Ａ）長さ：２００アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：リニア （１１）分子タイプ：ポリペプチド （Ａ）ディスクリプシッンニ１口システミン　＃１−＃２００　；システミン　 ＃１７９−１９６； 図６−７ （ｉｘ）シーケンスディスクリアション：シーケンス　ＩＤＮｏ．１：Ｍｅｔ　 ａｌｖ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　＾ｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　 １ｙＩ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　（ｉｌ■ １　５　１０　Ｉｓ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ２０　２５　３Ｇ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ＾ｓｏ　Ｔｈｒ　Ｉ ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ＾『９＾ｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ 　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　ＰｒｏＬＹＳ　Ｈｅｔ　ＧＩＩＪ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｕ　Ｇｌ）ｌ　ＧＩＶ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　ＬＶＳ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ｌｉ ｅ　Ｖａｔ　Ｇ撃■ ６５　．７０　７５　８０ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　［Ｉｅ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　ｌｌｅ　 Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ＾Ｂ　Ａｓｐ＾ｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ 　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　ＬｙｓｔＧｏ　１０５　１１０ ＧｌｕＬｙｓＩｔｓＶａｌＧｌｕＬｙｓＧｌｕＴｈｒＰｒｏＳｅｒＧｌｎＡＳＩ Ｉ＋１１１１ＡｓｎＡｓｎＬｙｓＩｔｓ　１２Ｇ　１２５ ＧｌｙＭｐ　Ａｓｐ＾ｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ 　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｎｅｔ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ１４５　１５０　１５５　＋６０ ＾１ａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　｛Ｉｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　ｌｉｅ　Ｖａｔ＾ｒｇ　Ｇｌｕ１６５１γ０１７５ ＾ｓｐＬｅｕ＾ｌａＶａｔＧｉｎＳｅｒＬｙｓＰｒｏＰｒｏＳｅｒＬｙｓＡｒｇ ＾ｓｐＰｒｏＰｒｏＬｙｓＭｅｔ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ＾ＳＤ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌ ｙｓ　Ｌｓｕ１９５　．　２００ （２）シーケンス　ＩＤＮｏ．２用の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリステイ ックス（Ａ）長さ＝９５１ベース （Ｂｌタイプ：核酸 （Ｃ）ストランド；シングル （Ｄ）トボロジイ：リニア （■）分子タイ７：ｃＤＮＡ （Ａ）ディスクリプション：プ口システミン　ｃＤＮＡ；＃ｌ０５でＡＴＧを開 始 （１ｘ｝シーケンスディスクリプション：シーケンス　ＩＤＮｏ．２ＡＡＡ＾Ｔ ＴＡ＾＾Ｔ　ＴＴＧＡＴ＾ＴＴＴＧ　ＧＴＴＴ＾＾ＣＴＣＧ　ＡＴＴＴＴＣＣＡ ＴＧ　ＡＡＣＡＣＣＣＴＴ＾　ＧＴＧ八ＴＧＡＧsＡ　６０ ｒＡ丁＾ＡＡＧＣ丁ＣＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＡＴ＾ＡＡＣＴＡ ＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣ＾■１２０ＡＴＧ＾丁＾丁ＣＡ ＾＾ＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧ＾ＴＧＡＣＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＧ ＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＣＣ＾ＴＧ１１１O ＾ＧＡＡＧＧＱＡＧＧ　ＡＱ＾ＴＧＡＡ＾＾ＧＧ＾＾＾＾緑■＾＾ＴＴＧＡ＾＾ ＾＾ＧＡ　ＱＡＣＴＣＣＡＴＣＣ　ＣＡＡＧ＾■＾ＴＣＡ　Q４０ 丁ＧＧＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡｒＡＴＧＴＡＡＡＧＧＡ（ｉＡＡＡ ＡＴＴＧＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＴＡＴＡＴＣＣＣ３６O ＾ＧＧＴＧＧ丁＾ＴＧＴＧＡＧＡＡ＾＾ＴＴＡＴ＾Ｇ丁ＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣ ＴＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＴＣ＾＾ＡＡＣＣＴＣＣＡ丁６６０ＣＡＡＡＧＣＧＴＧ ＾ＴＣＣ丁ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＡ＾ＴＡＡＡＣ丁ＣＴ ＾ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡ７２０ＡＡＡＴ丁ＡＡＴＡＡＡｒＡＡＡＡＡＡ ＴＴＡＴＡＡｎＣＡＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＴｒＣｒＧＡＡＴｎＧ ＴＣＴＣ７８０ＣＣＧｎＡＧＡＡＡＡＧＩＡＡＣＴＴＣＡＡ＾ＴＡＡＡＴＡｎＴ ＧＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧ丁＾丁■丁ＴＣ＾＾＾ＧＴＧＴＡＡＴｒ８４０丁ＧＧＴ 丁＾ＴＴＧＴ＾ＣＴＴＴＣ＾ＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴｒ＾ＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧ Ｔ＾ＣＴｒ（Ｊ＾ＩＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴｅ９００ＴＴ丁ＴＧＧＣＴＴ＾■丁Ｔ ＡＴＡＩＡＡＴ＾ＩＡＡＡＴ＾＾＾＾＾＾■＾Ａ＾ＴＡ＾＾■＾ＴＣＴＡＡＡＧ ＾■９５１（２）シーケンス　ＩＤＮｏ．３用の情報（ｉ）シーケンスキャラク タリスティックス＜Ａ）長さ：ｌ８アミノ酸 ＜Ｂｌタイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：リニア （Ｉ１）分子タイプ：ベアチド （Ａ）ディスクリプション：システミン；図３（１ｘ》シーゲンスディスクリア ション：シーケンス　ＩＤＮｏ．３Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 ＞ｌｅｔ　Ｇｉ氏@Ｔｈｒ＾ｓｐ ＋　５　ｔｏ　＋ｓ ｛２｝シーゲンス　ＩＤＮｏ．４用の情報（】）シーケンスキャラクタリスティ ックス（Ａｌ長さ：４５２６ベース （Ｂ）タイプ，核酸 （Ｄ）トボロジイ：リニア （１１〉分子タイプ：ＤＮＡ （Ａ）ディスクリプシジン：システミンゲノミックＤＮＡｕ図８Ａ−図８０ （１ｘ）シーケンスディスクリプション：シーケンス　ＩＤＮｏ．４＾＾ＧＡＡ ＡＡ＾＾＾　＾ＴＡｒ＾ｎＡ＾丁　ＴＴＴＴＡ＾ＴＣＡＴ　ＧＧＴＡＴＴＡＴＣ Ｃ　ＴＣＣＡＧＧＡＧ＾Ｔ　ＧＡＣＡＴＧＣＡＡf　３００ ｒＴＴｃＡＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＡＣＡＡＴ＾＾ＴＴ＾ＴＧＴ ＴＴＴＧ丁＾ＡＡＧＣＡＡ＾■＾＾＾ＡＴ＾＾ＴＡＡ６００ＣＡＴ＾＾ＴＡＴＴ ＴＴＡＴＣＧＴ＾ＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴＴ＾丁ＴＴＡＧＡＴＡＴＴ Ｔ＾ＧＡＴＴ＾ＴＧＡｒＴ丁ＧＣ６６０ＴＴＴ＾ＡＴＴ＾■＾ＣＴＴＴＴＴＴＡ ＡＡ　Ｃ＾ＴＧＡＴＡＡＡＩ　ＴＡＴＴＴＣＴＧＩＴ　ＡＧＡＣ＾ＴＴＴＴＣ　 ＧＡＩＴＣＡＴＴＴs　７２０ ＴＴＴＴ丁ＴＴ＾Ｃ＾＾ＡＡＡＴＴ（ｉＴ＾■丁ＴＧＣ丁ＣＴＣＡ＾＾ＣＧｎＴ ＾ＣＴ＾ＧＴＴＡＧＨ＾＾ＧＴ丁＾＾ＣＴ＾丁＾Ｃ７８０ＡＡ＾＾■＾ＴＧＴＣ ＾ＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴ＾■＾ＣＡＴＣＡＧＧＣＴＣＭＴＴＡ＾＾ＡＣ ＾■＾ＴＴＧＧＡＧ＾丁＾Ｔ８４０ＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＧ＾ＴＴＣＡＴＴ＾ ＾ＣＡＣＴ＾ＡＴＧＴＧ丁＾■＾ＧＴＴ＾ＧＡＭ＾ＴＧＴＧＡ＾＾丁＾ＴＴＴＣ Ａ＾＾９００ＴＧＧＴＴ＾ＡＣｒＴＴＴＣＴＧ丁＾■＾＾ＴＴＧＡＣ＾ＴＴｒＧ ＡＡＡＣＴＡＴＡＴＧＴＴＴ＾ＡＴＴ＾丁＾＾ＣＡＡＡＣＣＧＴＡ９６０ＡＴＣ ＡＡＡｒ（ＪＴＣＡＡＡＴＡＡＭｒＴＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴ＾ＡＧ ＧＡＧＣＴ＾■Ｃ＾＾ＴＡＴ＾ＴＴ＾ＧＣＴ１０２０ＣＴＴＣＴＴＧＡＴＴＣＡ ＡＣＴＴＡ丁ＴＴＡＣＣＧＴＴＡＴ＾ＡＴＴＡＡＡ丁Ａ＾ＴＧＡＣ丁ＣＧＴＴＡ ＡＴＴＱＡＴＴ丁ＡＡＴＴ１０１P０ ＴＴＴＴｒＡＣＴＣＡＣＧＴＧＡＡ＾丁Ｇ＾ＴＴｒ＾＾ＴＣＡＡＣＴＣ＾ＴＴＴ ＾ＥＬＣＣＣＴＴ＾ＴＴＴ＾ＣＱ＾ＣＴＣＡＴＧＴ１１４０ＡＧＡＡＴＡＡＴＧ ＴＴＣＴＴＴＡＴＡＣＴＴＧ丁＾■＾ＣＡＡＴＴＴ＾ＣＴＣＧＧＡＴ＾ＴｒＴＴ ＴＴＴＴ＾＾ＡＴＴＴＴＴｒＴＴ１２０O ＴＡＴＧｎＴ＾＾Ｉ１＾ＡＡＴ＾ＣＴ＾ＴＴＡＡＡＡＩＧＡＡＧ＾＾ＡＴ＾■１ ＾ＴＴＴ＾ＴＡＡＴＴＧＡＡＧ＾＾丁＾ＴＴＧＡＡ１２６０ＴＴＴＴＴＴ丁ＴＣ ＣＡＴＣＡＡＡ＾丁ＴＴＡＣＡＧＧＧＡＧＧ＾ＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡ＾＾ ＾丁＾ＡＴＴＧＡ＾＾ＡＡＧＡＧ１３２O ＡＣ丁ＣＣＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧ＾ＴＡＣＣＡＴＣ ＴＣＴＴＣ＾■＾ＴＧ丁ＴＴＴＡＡＧｒ＾丁ＴＴ＾＾１３８O ＴＴＴＴＴＴｒＣＡＡ　ＴＣＴＴｎＴｒＴＴ　ＴＴＣＴＣＡｒＣｎ　ＣｒＴＡＩ 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Ｍｅｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ工１ａ　Ｌｙｓ　Ａ ｊｎ　Ｉ、ｙｓ　ＧＬｙ　Ａｇｐ　Ａａｐ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ１　５　１０　Ｌ５ Ｇユｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉａｕ　Ｈｉｓ　Ｈｉｇ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＧｌｕ　！Ｊ３／！ ｌ　ＩＩｓＩｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈ’ｌ：　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｎ　Ａｓｐ工１＠Ａｇｎ　Ａａｎ　Ｌ凾■P Ａｓｐ　ＴｈｒＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａ ｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　）Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ 　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　エエｅ　Ｖａｌ　Ｇｌ■ ＬｙｇＧｌｕ　ＴｈｒＡｒｇ　５ｅｒＧｉｎＴｙｒ工１ｅ工工ｅ　Ｌｙｓ工１ｅ 　ＧｌｕＧｌｙＪＬ；ｐＡｓｐＡｓｐＪｕａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ 　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃ；ｌｕ　Ｇｌｕ　ＴＹ ’ｌｌ”　Ｇｌｕ@Ｌｙｓ ｍｏｏ　１０５　１１０ Ｇｍｕ　ＬＩＹＳ工１ｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈ１：　Ｐｒｏ 　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ｋ９工１ａ　Ａｓｎ　Ｊｕ＋ｎ　Ｌｙｓ：ユ５　：ｈ２０　 １２５ Ｇユｙ　ＡＳｐ　ＡＳｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌ’ｆ９ 　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓ■ ’３０　１３５　工４０ ＡＳｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｇｐ　工ｌｅ　 Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｈｅｗ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ１４５　１５０　１ ５５、　１６０ Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃ１０Ｇｌ ｕ　Ｌｙｓ工１ｅ工１ａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ１６５　：Ｌ７０　Ｌ７Ｓ ｕｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＬｙｓｌＢｏ　１Ｂ５　１９ ０ ＭｅセＧｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＦＩＧＬ７Ｒ Ｅ　６ ■　小　Ｃ■　■　■１ ■　、　ｉΦ　門ψ　色Ｇ　硝り　―０哨　−ψ　−ＩＮ　ＩＮ臂　ＮＩＣＭの 　！−ｅｌ　５　！　ロ０　０　ｔ５　ｅｌ　％Ｄ（：１　％０１　ヘ　ロヘ　 ？ヤ　ロＩ５　リＣ １５％　Ｘ　ｅａｔ　Ｌｌ’ｌ　りｌハ　ＱＩＬＩ’ｌ　ｃｈ　Ｃｈ　６％　＋ ７１さ〜　ＰＦ１’ＩＰ　の１　１Φ　−ト　−の！−−一　−一　ψ−１’− ｒ＋ａｌｌ　の口ψ　ロ１　ロψ　ロ％ｏ　ｅψ　ｅ　６　ロ　ロ〜ロ　ロＮ　 ？で　ロ１　９口　へ　ロ　マ　ロｏｏ０００　０　ｏ　ロ　ロ　。

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ＩＫＢ ｋｂｐ　１　２　３　ｋｂｐ　１　２　３　４　５２＞　― １．４）−− 二臣匹孟ｇ、＋、２Ｅ−；巨＝ジＰ、Ｌｇ口。

損傷後の時間 ０　０．５１，５　３　６　９　１２　２４Ｒｔ　Ｓｔ　Ｐｔ　Ｌｅ　Ｓｅ　Ｐ ｅ　Ｓｍ　Ｐｉ：ｈ　、ｊ、５Ｂ。

Ｋｂ　１　２ インヒビタ１　（μｍ／ｍｌ汁） ＦＩＧＵＲＥ　１６Ｂ Ｏ−２５２５−５０５０−１００１００−１５０１５０−２００インヒビタＩｔ 　（ｕ　ｇ／ｍ　＋汁）ＦＩＧＵＲＥ届Ｃ 制御アンチセンス ０　６　１２　０　６　１２　口数 ＦＴＧＵＲＥ２０ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　、庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０ ２　Ｃ９２８２−４Ｂ（７２）発明者　マクガール、バリー、エフアメリカ合衆 国　ワシントン州　プルマンティラー・サウスイースト　６３５　アパートメン ト３ Ｉ

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．シーケンスＩＤＮｏ．２に実質的に示されたヌクレオチドシーケンスから成 る核酸。
2. ２．請求項１のシーケンスと実質的に相補的なヌクレオチドシーケンスから成る 核酸。
3. ３．シーケンスＩＤＮｏ．２の残余物Ｎｏ．６３９から６９２までのヌクレオチ ドシーケンスをさらに有する、請求項１の核酸。
4. ４．合成オリゴヌクレオチドをさらに有する、請求項１の核酸。
5. ５．プロモーターヌクレオチドシーケンスに操作的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）にリ ンクされた請求項１の核酸シーケンスから成る組換え核酸ベクタ。
6. ６．請求項１の核酸によりエンコードされたポリペプチド。
7. ７．アンチセンスＲＮＡをエンコードすることができる請求項１の核酸。
8. ８．プロモーターヌクレオチドシーケンスに操作的に（ｏｐｏｒａｂｌｙ）にリ ンクされた請求項２の核酸シーケンスから成る粗換え核酸ベクタ。
9. ９．シーケンスＩＤＮｏ．４に実質的に示されたヌクレオチドシーケンスから成 る核酸。
10. １０．請求項９のシーケンスと実質的に相補的なヌクレオチドシーケンスから成 る核酸。
11. １１．合成オリゴヌクレオチドをさらに有する、請求項９の核酸。
12. １２．シーケンスＩＤＮｏ．１に実質的に示されたアミノ酸シーケンスを有する ポリペプチド。
13. １３．シーケンスＩＤＮｏ．３に実質的に示されたアミノ酸シーケンスを有する ポリペプチド。
14. １４．Ｒ１は任意のアミノ酸であり、Ｒ２はリジンあるいはアルギニンであり、 Ｑはグルタミン、Ｐはプロリンであるとき、アミノ酸シーケンスＲ１Ｒ１ＱＲ１ Ｒ２ＰＰＲ１Ｒ２Ｒ２Ｒ１ＰＰＲ２Ｒ１ＱＲ１Ｒ１から成るポリペプチド。
15. １５．ポリペプチドがアミノ酸シーケンスＮＨ３−ＡＶＱＳＫＰＰＳＫＲＤＰＰ ＫＭＱＴＤ−ＣＯＯ−から成る請求項１４のポリペプチド。
16. １６．請求項２の核酸シーケンスをプラントセルに導入しセルをプラントに生長 させることから成る、プラントにおける防御プロテインの合成を妨げる方法。
17. １７．請求項１６の方法もしくは請求項１６のプラントを第２のプラントで交配 （ｈｒｅｅｄｉｎｇ）することにより作られるトランスジェニックプラント。
18. １８．システミンまたはプロシステミンをエンコードする組換え核酸から成るト ランスジェニックプラント。
19. １９．トマト、ポテト、タバコ、アルファルファ、ナタネ、大豆、トウモロコシ 、米、小麦、大麦、綿、ポプラ、松及びモミから実質的に成るグループから選択 されたプラントをさらに有する、請求項１８のトランスジェニックプラント。
20. ２０．プラントの防御プロテインの生成を促進するポリペプチドホルモンのため のコーディングを行う核酸をプラントに導入するステップから成る、プラントの 防御メカニズムを強化する方法。
21. ２１．ポリペプチドホルモンがシステミンである請求項２０の方法。
22. ２２．実質的に純粋なシステミン転写。
23. ２３．請求項２２の転写のためのＤＮＡテンプレートシーケンス。
24. ２４．請求項２２のテンプレートシーケンスと実質的に相補的なＤＮＡシーケン ス。
25. ２５．請求項２２の転写から移動されたアミノ酸シーケンス。
26. ２６．転写が生体内起源（ｉｎｖｉｖｏｏｒｉｇｉｎ）ではない請求項２２の転 写。
27. ２７．ポリペプチドホルモンのためのコーディングを行う組換え核酸を導入する ステップから成るプラント中のポリペプチドホルモンのレベルを高める方法。
28. ２８．ポリペプチドホルモンがシステミンである請求項２７の方法。