JPH07502526A - 水性媒体中の全メルカプタン，還元型グルタチオン（ｇｓｈ）およびｇｓｈ以外のメルカプタンの分光測光アッセイ法，該方法を行うための試薬およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水性媒体中の全メルカプタン、還元型グルタチオン（Ｇ　Ｓ　Ｈ）およびＧＳＨ 以外のメルカプタンの分光測光アッセイ法、該方法を行うための試薬およびキッ ト本発明は、とりわけ生物学的媒体中のメルカプタンおよび還元型グルタチオン のアッセイ法に関する。

本発明の主題は、さらに詳しくは、水性媒体、とりわけ生物学的媒体中の全メル カプタン、還元型グルタチオン（ｒＧＳＨＪと略す）および引き算によりＧＳＨ 以外のメルカプタンの分光測光アッセイ法、該方法を行うための試薬およびセッ トまたはキットである。

あらゆる細胞に存在する化合物であるグルタチオンは、その多（の生化学的機能 のため、生理学的観点から重要な分子である（文献１）。従って、その濃度の変 動、とりわけ通常の細胞内レベル（１〜１０ｍＭ）からの減少は実質的な疾患を 引き起こし得る。それゆえ、信頼性があり簡便で感度が高くしかもこの生化学的 パラメータに特異的なＧＳＨのアッセイ法が必要とされている。

ＧＳＨをアッセイするために多くの方法が存在することは、これら方法が満足の いくものではないことを示唆している（文献２）。

一般にメルカプタンを測定するための公知方法、およびとりわけＧＳＨを測定す るための公知方法は、メルカプタンの２つの主要な化学的性質（還元力および核 力）のいずれか一方を活用するものであり、それゆえ以下に分類されるニーメル カプタンの還元力を用いる方法：これら方法はＧＳＨに特異的なものではないた め、ＧＳＨをアッセイするためクロマトグラフィー精製工程を必要とし、場合に よりたとえばグルタチオンリダクターゼなどのカップリング酵素の存在を必要と する（文献３）；および−メルカプタンの核力を用いる方法 これら方法は、グルタチオントランスフェラーゼを用いまたは用いることなく、 ハロゲン化誘導体（たとえば、ジニトロハロベンゼンまたはモノハロバイマン（ ｍｏｎｏｈａｌｏｂｉｍａｎｅ）タイプ）の置換に基づいている。これら方法も 、酵素の不在下ではＧＳＨに特異的ではな（、ＧＳＨのアッセイを行うにはクロ マトグラフィー分離工程を必要とする。

場合場合に依存して、検出法は分光測光タイプ、分光蛍光タイプ（文献４）また は電気化学タイプ（文献５）によるものである。

以下の明細書では、検出法としてＵＶ／可視吸光分光測光または分光蛍光を用い た方法に限定するものとする。

メルカプタンの還元力を用いた方法は、以下の反応機構（グルタチオンの場合） に従って、チオール−ジスルフィド交換に基づいている：２ＧＳ−＋　Ｒ３５Ｒ →　Ｇ５５Ｇ　＋　２ＲＳ−最も広（知られた方法では、エルマン試薬を用いる （文献６および７）。４１２ｎｍでの発色団の生成に基づ（この方法は、それほ ど複雑ではないが、光およびｐＨに対するエルマン試薬の不安定性（加水分解） 、および放出される発色団の自動酸化のために参照測定を行う必要があり、この ため該試験を繁雑にしている。これらすべてのために、大量の試料の臨床生物学 に使用できな４）試薬となっている。

エルマン試薬のセレン化同族体が合成され、メルカプタンのアッセイに用いられ ている（文献８）。このものはエルマン試薬に比べてアルカリ加水分解に対する 抵抗性が大きいが、他の点ではエルマン試薬と同じ不都合を有する。

最後に、ピリジンジスルフィドの使用について言及する必要がある（文献９）。

一般に、チオール−ジスルフィド交換のための試薬はＧＳＨの特異的アッセイに 用いることはできない。

メルカプタンの核力に基づく方法は請求電子試薬への付加能を活用する。す１− クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）または２．４−ジニトロ−１− フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）タイプのこれら試薬は、アルカリｐＨでチオール 基に特異的ではない。これら試薬にはＧＳＨｌ−ランスフェラーゼなどの酵素の 存在を必要とし、さらにこれら試薬は該酵素の活性を測定するために用いられる 。これら試薬の感度が低いことは、これら方法の主要な不都合の一つである。

さらに、これら試薬の非酵素的反応性はＯではなく、そのためＧＳＨに対して完 全に特異的なアッセイではないものにしている。この不都合を克服するため、多 くの方法は反応生成物のクロマトグラフィー分離に基づいている。たとえば、リ ード（ＲＥＥＤ）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（文献１０およ び１１）が挙げられ、この方法では、アミンの誘導体の生成または誘導体化（Ｄ ＮＦＢ・サンガー試薬による）をＳ−カルボキンメチル化と組み合わせたもので あるが、時間がかかり、実行するのが繁雑である。

２°モノハロバイマン（文献１２）。

これら化合物は、たとえばアミンなどのチオール基以外の核基と反応し得る。

これら化合物もまた、他のメルカプタンの存在下でＧＳＨに対して特異的ではな い　そのため、この場合もまたクロマトグラフィー分離工程を方法の中に組み入 れる必要がある。にもかかわらず、この方法は、存在するメルカプタンの網羅的 なプロフィールを得ることが可能である。しかしながら、試薬および反応生成物 の光感受性のため使用に際して注意が必要であり、そのためこのアッセイ法は繁 雑である。

さらに、８またはそれ以下のｐＨでのモノクロロパイマンのゆっくりとした動力 学のため、中性付近のｐＨでのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの生化学 的特異性を活用することが可能である。この試薬は完全な細胞中にゆっくりと浸 透し、該細胞内で該試薬は酵素およびその基質（Ｇ　Ｓ　Ｈ）と反応し、それゆ えフローサイトメトリーによるアッセイが可能となる（文献１３）。モノブロモ トリメチルアンモニオバイマン誘導体（文献１４）は、それ自体としては、水に 対す、る高い溶解度という利点を有し、伝導検出を行うことができるが、後者は 標準化するのが困難である。

一般的に、その利点がいかなるものであろうとも、これら方法のほとんどは洗練 されたクロマトグラフィー分離を必要とし、大量の試料の迅速な分析を行うには 時間がかかりすぎる。

これら化合物は、上記試薬に比べて特異性が低（、その感度もどちらかといえば 平均的なものであるかまたはある場合には劣ってさえいる。これら化合物は一般 に光に対して不安定であり、付加生成物と類似した吸光特性のためにクロマトグ ラフィー分離を行う必要がある。

４°マレイミド誘導体： これら化合物の特異性は上記試薬に比べて良（ない。その感度は、付加生成物が 蛍光である場合にのみ良好である。

後者の方法の主要な不都合は、すでに存在する吸収の減少をモニターするので、 新たな吸収の増加をモニターする場合に比べて信頼性に劣り一層細心の注意を要 することである。

５°活性化求電子、二重結合を有する試薬（ミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）アクセ プター）：これら試薬としては以下のものが挙げられるニー窒素含有または酸素 化求核化合物とは非常にゆっくりと反応するが硫黄含有求核化合物とは一層迅速 に反応するエノン（文献１５）；その特異性はチオール基に対して絶対的なもの ではない；その感度は、それ自体としては、考慮する試薬に従って変動する：こ れら試薬は一般に、上記試薬と同じ主要な不都合を有する； −遅い試薬であり、水性媒体にはそれほど可溶性ではなく、一般にメルカプタン のＳＨ基のブロッキング、とりわけグルタチオンのＳＨ基のブロッキングに用い られるが（文献１６）、そのアッセイには用いられないビニルピリジン。

最後に、方法の複雑さ、および一般にチオール基に限定されグルタチオンに関し ては存在しない特異性のために日常的なアッセイには適していない２つのタイプ の蛍光試薬について言及する必要がある。これら試薬は、−蛍光イツインドール 誘導体を生成するにはチオール基および第一級アミンの存在を必要とするオルト −フタル酸アルデヒド；および−長い反応時間と９．５のアルカリｐＨを必要と する、ベンゾキサ−１，３−ジアゾール誘導体、とりわけ７−クロロ−２−ベン ゾキサ−１，３−ジアゾール−４−スルホネート（ＳＢＤ−ＣＩ）および７−フ ルオロ−２−ペンゾキサ−１．３−シフソール−４−スルホネート（ＳＢＤ−Ｆ ）　（文献１９および２０）。

本発明の目的は、 一混在するメルカプタンの存在下でＧＳＨの特異的なアッセイを行うことが可能 であり、迅速である、すなわち媒体中のメルカプタンとの全反応時間が作業条件 下で１５分未満である、粗製の試料中、とりわけ生物学的試料中のメルカプタン に特異的な発色試薬ニ ー単一の試料で第一工程で全メルカプタンのアッセイを、第二工程で還元型ＧＳ Ｈのアッセイを可能とし、以下の３つの生理学的パラメータを決定する該試薬の 使用方法： ＊全メルカプタンの量 ＊ＧＳＨの量 ＊引き算により、ＧＳＨとは異なるメルカプタンの量を提供することにより、一 般にメルカプタン、およびとりわけＧＳＨをアッセイするための公知法の不都合 を克服することにある。

本発明の目的は、とりわけ、大量の試料の日常的なアッセイに適合した還元型Ｇ ＳＨの測定ちための簡便で迅速な方法を開発することにあり、該方法は、＊その 吸収が最もしばしば可視領域にあり、その吸光度の測定に特別の分光測光計を要 しない発色団の生成： ＊終点アッセイであって動力学アッセイではな（；＊短いインキュベーション時 間：たとえば３０分未満；＊アッセイ期間の間のチオール基の自動酸化のリスク を排除し得る作業条件を特徴とする。

これら目的は本発明によって達成することができる。本発明は、これら態様の一 つに従って、水性試料、とりわけ生物学的試料中のメルカプタンのアッセイ法で あって、該試料中に存在するすべてのメルカプタンと一般式（■）。

（式中、 Ｒｌ　＝アルキル（炭素数１〜６）、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、フェニル またはｏ、ｐ−ジニトロフェニル： Ｒ−水素またはメチル； Ｒ３＝水素、Ｆ、ＣＩ、ＢｒＳ　ＩまたはＳＣＮ；Ｒ４＝水素、Ｆ、Ｃｌ５ＮＯ ｚ＊たはＣＦｓ：ＲＳ　＝水素、Ｎ０ｘｔたはＣ１： Ｒ６＝水素、Ｆ、ＣＩ、ＣＦ３＊たはＮＯｚ：Ｒ７＝水素、ＯＨ１ベンジルオキ シまたはＮｏ、。

Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は同時に水素を表さない、Ｙ＝フルオライド、クロ ライド、ブロマイド、ヨーダイト、メチルサルフェート、フルオロスルホネート 、ホスフェート、テトラフルオロポレートまたはトシレート）に対応するキパニ ウムタイプの化合物から選ばれる試薬との間での発色団置換生成物の形成から本 質的になることを特徴とする。

上記一般式（Ｉ）の化合物は、公知方法により、とりわけ以下のようにして市販 の化合物から調製することができる。

フルオロキノリニウムタイプの誘導体は、対応するジアゾニウム塩（それ自体、 市販の化合物から調製される）に対するンーマン反応により得られる。

一般式（Ｉ）の化合物の合成の最終工程のための一般手順は、以下のようにして 行う。

たとえばアセトニトリルなどの有機溶媒（１０容量）中に溶解したキノリン誘導 体（１ミリモル）に、１００Ｃにてたとえばメチルヨーダイトなどの純粋な形態 または１容量のアセトニトリル中のトリメチルオキソニウムテトラフルオロポレ ート（２ミリモル）などの有機溶媒中の溶液の形態のアルキル化剤を加える。反 応媒体を３０分から２時間撹拌する。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をｔｅｒｔ −ブチルメチルエーテル（１容量）中に取り、ついで排出し、洗浄し、真空乾燥 させる。

必要なら、水／アセトニトリル混合物で溶出するシリカカラム（Ｃ８，５μｍ） 上の分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により生成物を精製する 。最後に凍結乾燥すると、２０〜８９％の間の非最適収率にて所望の生成物を得 ることが可能となる。

適当なら、アルキル化は、所望の最終生成物に従い、還流下でメチルヨーダイト 中で、または還流下でアセトン中のメチルサルフェートにより、またはたとえば グライムなどの有機溶媒中のメチルフルオロスルホネートにより行う。

一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６およびＲ７が前記と同じであり；−Ｒ ２＝水素； −Ｒ４＝水素、ＦＳＣｌまたはＣＦ３ニーＲ５＝水素またはＣＩ。

−Ｙ＝フルオライド、クロライド、ブロマイド、メチルサルフェート、フルオロ スルホネート、ホスフェート、テトラフルオロポレートまたはトシレート、−Ｒ ’＝Ｆ、Ｃｌ５ＢｒまたはＩである場合は、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５，Ｒ６およびＲ７ は同時にＨを表さない。

−Ｒ’＝ＦまたはＣＩである場合は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同時 にＨを表さないニ ーＲｓ＝ｃ　ｌテｔ）ル場合１；！、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲフは同時 にＨを表さないニーＲ’＝ＦまたはＣＩである場合は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ およびＲ７は同時にＨを表さないニ ーＲ’＝Ｒ’＝ＣＩである場合は、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は同時にＨを表 さない；−Ｒ’＝ＣＩまたはＲ７＝ＯＨである場合は、Ｙはメチルサルフェート を表さないである化合物は、新規であり、本発明の主題の一つを構成する。

他の態様に従い、本発明は、水性試料、とりわけ生物学的試料中の還元型グルタ チオン（Ｇ　Ｓ　Ｈ）のアッセイ法であって、本質的に下記工程・１、該試料中 に存在するすべてのメルカプタンと上記一般式（Ｉ）の化合物から選ばれる試薬 との間で発色団置換生成物を生成させ：ついで２、ＧＳＨと該試薬との間で工程 １において生成した発色団置換生成物から発色団チオンを特異的に生成させるた めに、反応媒体のｐＨを１２．８〜１３．８の値とする からなることを特徴とする方法を提供する。

それゆえ、本発明による還元型グルタチオンアッセイの原理は、以下の２つの連 続的な化学工程からなる戦略に基づいているニーまず、以下の反応式に従い、試 料中に存在するすべてのメルカプタン（Ｒ３Ｈ）（とりわけ、還元型グルタチオ ン（Ｇ　Ｓ　Ｈ）を含む）と上記試薬（ｒＢＸＴ試薬」と称する）の一つとの間 で置換生成物（以下、「付加物」と称する）を生成させ：Ｒ８Ｈ＋　ＢＸＴｔｉ Ｃ薬　→　Ｒ８−ＢＸＴ（発色団１）一ついで、使用したＢＩＴ試薬に従って媒 体を１２．８〜１３．８のｐＨのアルカリ性にした後、以下の反応式に従い、Ｇ ＳＨとＢＩＴ試薬とから生成した付加物ＧＳ−ＢＸＴに特異的な発色団チオンの β−説離反応による生成：この方法は、分光測光手段により、以下を決定するこ とができる：＊第一の段階において、試料中に存在する全メルカプタン（ＲＳ　 Ｈ）の量；＊第二の段階において、同試料中に存在する還元型グルタチオン（Ｇ ＳＨ）の量；および ＊引き算により、還元型グルタチオンとは異なるメルカプタンの量。

それゆえ、この方法は、単一の試料により３つのパラメータを得ることを可能と する。

本発明によるアッセイ法の新規さは、ＢＸＴ試薬と試料中に存在する全メルカプ タンとの間での発色団付加物の生成の第一工程、およびアルカリ性にした後、付 加物ＧＳＨ／ＢＩＴ試薬に特異的な発色団チオンの生成の第二工程からなる戦略 に基づ（点にある。

それゆえ、記載した試薬および方法を使用すれば、二重発色測定により、水性媒 体中の一般にメルカプタンの全量、とりわけＧＳＨの全量を単一の試料で測定す ることが可能となる。この新規な方法の実行の簡便さは、従前に記載された分光 測光法に比べて非常に優れている。本明細書に記載したＧＳＨの発色アッセイ法 は、酵素試薬の不在下で完全に特異的なものとしては最初のものである。

それゆえ、この新規なアッセイ法は、アッセイまたは診断キットの製造のため、 一般に生物学的研究のため、とりわけ臨床化学のための新規手段を構成し、適用 面が挙げられる。

試料としては、とりわけ、赤血球、血漿、血小板、および一般にメルカプタンと りわけＧＳＨを含有するあらゆる試料、とりわけ生物学的試料が挙げられる。

有利な態様に従い、本発明の主題は、水性試料、とりわけ生物学的試料中の全メ ルカプタンのアッセイ法であって、本質的に以下の工程：１、ｐＨ７，０〜７， ５の範囲に緩衝したアッセイすべき試料に、水または水に相溶性の溶媒中の一般 式（１）のＢＩＴ試薬のストック溶液のアリコートを過剰量で加え、 ２、かくして得られた反応媒体を均質にし、３、少なくとも５分間インキュベー トし、４、ＢＸＴ試薬と試料中に存在するメルカプタンとの間で生成した置換生 成物すなわち付加物の吸光度を分光測光計により測定し、ついで５、以下の式・ ［全メルカプタン］　＝　（Ａ／εｍＸｄ）ＸＤ（式中 −Ａは測定した吸光度を表す、 一εｍは使用したＢＸＴ試薬に特異的なモル吸光係数を表す（１９モル−’、ｃ ｍ−’で表す）、 −ｄはキュベツトの長さを表す（ｃｍで表す）、および−りは希釈の係数を表す ） に従い、試料中に存在する全メルカプタンの濃度をモル／リットルにて決定する からなることを特徴とする方法である。

他の有利な態様に従い、本発明の主題は、水性媒体、とりわけ生物学的試料中の 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のアッセイ法であって、本質的に以下の工程・１ 、ｐＨ７，０〜７．５の範囲に緩衝したアッセイすべき試料に、水または水に相 溶性の溶媒中の一般式（１）のＢＩＴ試薬のストック溶液のアリコートを過剰量 で加え、 ２、かくして得られた反応媒体を均質にし、３、少な（とも５分間インキュベー トし、４、選択したＢＸＴ試薬に従い、１２．８〜１３．８の範囲の値に混合物 のｐＨを調節し、 ５、少な（とも１５分間インキュベートし、６、とりわけ付加物ＧＳＨ−ＢＸＴ 試薬がらβ−説離により生成した発色団チオンの吸光度を分光測光計により測定 し、７、以下の式。

［ＧＳＨ］　＝　（Ａ’／εｍ　ｘ　ｄ）　Ｘ　Ｄ（式中。

−Ａ’は測定した吸光度を表す、 一εｍは使用したＢＩＴ試薬に特異的なモル吸光係数を表す（１１モル−’、ｃ ｍ−’で表す）、 −ｄはキュベツトの長さを表す（ｃｍで表す）、および−Ｄは希釈の係数を表す ） に従い、試料中に存在するＧＳＨの濃度をモル／リットルにて決定するからなる ことを特徴とする方法である。

本発明のさらに有利な態様に従い、試料中に存在する還元型グルタチオンとは異 なるメルカプタンの濃度を、上記２つの方法に従って測定した濃度を引き算する ことにより、すなわち、以下の式： ［ＧＳＨとは異なるメルカプタン］＝［全メルカプタン］　−［ＧＳＨ］を用い て測定する。

それゆえ、一般式（１）の新規試薬による水性試料、とりわけ生物学的試料中の 全メルカプタン、還元型グルタチオンおよびＧ　Ｓ　Ｈ以外のメルカプタンのア ッセイ法は、この新規方法を構成する２つの反応でそれぞれ生成される新規発色 団１および２の生成の分光測光測定に基づいている。

これら決定を行うのに使用可能な一般法を、以下にさらに詳細に説明する。

全メルカプタンのアッセイ 反応媒体は、］、ｍＭジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を含有する 、たとえば５０ｍＭリン酸緩衝液などのｐＨ７，０〜７．５の緩衝液からなる。

考慮する緩衝液の性質に従い、室温で水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加するこ とによりｐＨを所望の値に調節することができる。選択した作業温度（たとえば ２５℃）は、インキュベーションおよび測定期間の間、一定（±３°Ｃ）に保持 しなければならない。緩衝液および試薬溶液の調製および保存は０〜４℃で行わ なければならない。これら条件下でこれら溶液は３力月間安定である。ＢＸＴ試 薬の濃度／メルカプタンの推定濃度の比は、短い反応時間を確保するため、１０ またはそれ以上でなければならず、一般に１０００を越えない。

反応の開始は、水または水相溶性の有機溶媒（たとえばエタノール、アセトニト リル、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドなど）中のＢＩＴ試薬 のストック溶液のアリコートを、たとえばアッセイすべき試料を入れた分光測光 計のキュベツトに添加することにより行う。最終容量（たとえば１ｍ１）は、測 定ごとに変えてはならない。

溶液を均質にし選択した作業温度にて５〜１０分間インキュベートした後、付加 物の波長にて吸光度を測定する：たとえば、本発明による化合物ＢＸＴＯ３０１ ５（以下の実験項目の実施例１に記載）とＧＳＨとの間の付加物の場合は３５６ ｎｍにて。

下記表Ｉには、−例として、試薬ＢＸＴＯ３０１５と多くの生理学的メルカプタ ンとで得られ生化学または臨床化学に用いることの可能な分光測光データを示す 。

表■ アルカリ化の前後における試薬ＢＸＴＯ３０１５と幾つかのメルカプタンとの間 の反応により得られた発色団に関するスペクトルデータアルカリ化前　アルカリ 化浚 １）レヵプタン　ＢＩＴＯ３０１５の付加物廊献（膓）、　−社（−１゜ ｏａｆｌ、ｍｏｌ＊”、ｃ＋ｍ’Ｊ　ｏａｌＬ＋１１ｏｌ＠”、ｅｍ”）ｏｒ、 −ヘニン５　ミ７　ｘｓ４．ｔｇｏｏａ　付加物＋３５８．１５０００Ｈ−７セ チル−１−＞２９４＞　３５８，１５０００　氷解物＋３２Ｌ１０５０Ｇメルカ ７’）Ｘりｙ＊−ト３６２．１５０ＱＯ水解物１３２９．１０８００シスナイ、 　３５２．１１１５００　付加物＋　３５６，１８４０Ｏｈモノスｆイン３５２ ．工５０００　付加物＋　３５６．１４０ＯＯ２−メル力ブトヒリノン３４Ｓ、 １４５０ｏ　水解物＋３２７．Ｌ３０００ノエチルノチオヵルＪ４ｆｉ　＋　ト ２フ９，１ユｏｏｏ　水解物＋３２９，１０４００カフ）　フ＋）　ル３５９， １４０００　水解物１３２！、１０３００＋１−β−Ｄ−り）Ｌｔ：２−２　３ ４１．１４０００　水解物＋３２９．１０フ００ノステイングリノ７　３５０， １ｇｏｏｏ　付加物＋　３！５．１３０００）　ｘ　ノｆイＡ　Ａ　３５９，１ ６０００　氷解物＋　３２９．１１０００つ／血消アルブミ７　（２３４５，１ ２５ＱＯ（會＠１（＊）付加物の０．５当量のみが生成（文献２１参照）（＊＊ ）吸収スペクトルはアルカリ化前に得られたものと類似。

全メルカプタンの定量は、上記のようにして行う。

アッセイの感度は、ある種の生理学的に重要なメルカプタンに対する検量系列か ら決定した。アッセイの感度は、たとえばＧＳＨの場合、添付の図１を調べると 明らかなように、試薬ＢＸＴＯ３０１５を用いて０．０１７ＡＵ、　１．μモル ー１に等しい。

図１は、メルカプタンのマイクロ濃度の関数としての、それぞれ試薬ＢＸＴＯ３ ０１５とＧＳＨ，Ｎ−アセチルシスティン、システィンおよびシステイニルグリ シンとの間で生成した付加物の３５６ｎｍにおける吸光度の変動を示す。

吸光度はこの濃度の関数として直線状に変化すること、およびＧＳＨについては アッセイの感度が０．０１７ＡＵ、１．μモルー１に等しいことが観察できる。

還元型グルタチオンのアッセイ： 上記全メルカプタンのアッセイに使用したのと同じ反応混合物を還元型グルタチ オンのアッセイにも使用する。この混合物に、たとえば水酸化ナトリウムの３０ に溶液などの濃いアルカリ性溶液を選択した作業温度、たとえば２５℃で添加す ることによりｐＨ値を１３．５に調節する。これら同じ条件下で１５〜２０分間 インキュベートした後、ＧＳＨとＢＸＴ試薬との間の付加物のβ−説離による単 一生成物の吸光度を、考慮するＢＸＴ試薬について定めた波長、たとえば試薬Ｂ ＸＴ０３０１５については４００ｎｍで測定する。下記表■は、本発明の幾つか の試薬およびＧＳＨで得られた分光測光データを示す。

表■ アルカリ化の前後における、ＧＳＨと幾つかのＢＩＴ試薬（ｖＲ創製法下記実験 項目に記載）との間の反応により得られた発色団についてのスペクトルデータア ルカリ化前　アルカリ化後 Ｂ酊　試薬　付加物　チオン Ｎｏ、　ｋＩｘ（＋ｍｌ　ｋＩｘ（ｎｍｌ　ｋＭｘ（ｎｍ＋ａｍｆ１．１１１ｏ ｌ”、ｃ＋ａ−Ｃ＋ａｌｌ＋ａｏｌ”、ａｍ”ｌ　ｇｍｆｌ、シー”、ｃ＋ｎ内 １１Ｘ’Ｔ　０３０１５　３１５　３５６　４００（実施例１　）　１８０００ 　ｕｏｏｏ　１４７００ＢＸ？　Ｑ３ＱＬ６　３２Ｌ　コ３９　、３１１１（実 施例２　）、　１２０００　１５０００　ｚｇｏｏ。

！ＩｒＴ　０３０３４　３１９　３４６　３８！１（実施例３）　９０００　ｘ ｓｏｏｏ　１ａｏｏ。

ＢＸＴ　０３０６５　３２６　３４３　３９３（実施例５　）　９０００　１７ ０００　２００００１１ｆｆ　０３０ｇ９　３１２　４１４　５２０（ｇｉｌｌ ｌ１９　）　５４００　ｇｄｏｏ　２５００アツセイの感度はＧＳＨ濃度の標準 範囲から決定され、添付の図３に示すように、たとえば試薬ＢＸＴＯ３０１５ｉ ：つぃｒは０．０１０ＡＵ、１．μ％ルー’に等しい。

図２は、アルカリ化前における、ＧＳＨと試薬ＢＸＴＯ３０１５との間で生成し た付加物の３５６ｎｍにおける吸光度または光学密度（０，Ｄ、　）の変動をＧ ＳＨの濃度（マイクロモル）の関数として示す。

吸光度はＧＳＨ濃度の関数として直線状に変化することが観察される。この図は また、アッセイの感度をも示している。

図３は、アルカリ化後における、付加物ＧＳＨ／ＢＸＴＯ３０１５試薬がら生成 するチオンの４００ｎｍにおける吸光度または光学密度（０，Ｄ、）の変動をＧ ＳＨＩ！度の関数として示す。

吸光度はＧＳＨ濃度の関数として直線状に変化することが観察される。この図ハ マタ、アッセイの感度をも示している。

本発明の主題はまた、試薬として本質的に一般式（Ｉ）で示される化合物を含む ことを特徴とする、上記本発明の方法を実行するためのセットまたはキットであ る。

本発明を以下の実験項目に示す実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明は これらに限られるものではない。

撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、２．１５ ミリモルの４−クロロ−７−トリフルオロメチルキノリン（アルドリッチ）を撹 拌しなからアセトニトリル（５ｍｌ）中に溶解する。１０℃にてアセトニトリル （４ｍｌ）中のトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート（ランカスター ）（４，３０ミリモル）の溶液を１ｏ分間かけて加える。撹拌を１時間続広溶媒 を真空下で蒸発させる。得られた粗製の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル （５０ｍｌ）中に取り、排水し、２時間真空乾燥させる。

粗製の生成物を、アセトニトリル−水混合物（２０／８０）で溶出するカラム（ Ｃ，，５ｕｍ、Ｌ＝２５０ｍｍ、ＩＤ＝１０．５ｍｍ）上の分取ＨＰＬＣにより 精製する。凍結乾燥後、所望の生成物（１，７ミリモル）を得る。

収率ニア７％ 物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２，ＣＤ３ＣＯＣＤ３）：ＣＨ３−Ｎ”＋５．ＯＯｐ ｐｍ　（ｓ、３Ｈ）；Ｈａ：８．４５ｐｐｍ　（ｄｄ、ＬＨ１Ｊ＝１．９〜９． ５Ｈｚ）；Ｈ３：８．６０ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨＳＪ＝７．１４Ｈｚ）；Ｈｓ：　 ８．９５ｐｐｍ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝９．５０Ｈｚ）：Ｈｓ：　９．１０ｐｐｍ　 （ｓ。

ＬＨ）：Ｈｚ：９．７０１）ｐｍ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ）＊ＭＳ・（ ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオン：Ｍ”：２４６陰イオン：Ｍ−：８ ７ ＦＡＢ＝高速原子衝撃 Ｎ０ＢＡ＝メタ−ニトロベンジルアルコール＊元素分析値。

計算値（％）：　Ｃ＝３９．６　：Ｈ＝２．４　；Ｎ＝４．２　、ＣＩ＝１０． ６実測値（％）・Ｃ＝３９．４　：Ｈ＝２．２　；Ｎ＝４．Ｏ；ＣＩ＝１０．２ 撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、２．０ミ リモルの４−クロロ−２−メチルキノリン（アルドリッチ）を撹拌しなからアセ トニトリル（５ｍｌ）中に溶解する。１０℃にてアセトニトリル（４ｍｌ）中の トリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート（ランカスター）（４，０ミリ モル）の溶液を１０分間かけて加える。撹拌を１時間続け、溶媒を真空下で蒸発 させる。得られた粗製の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５０ｍｌ）中 に取り、排水し、２時間真空乾燥させる。

粗製の生成物を、アセトニトリル−水混合物（２０／８０）で溶出するカラム（ Ｃａ、５μｍ、Ｌ＝２５０ｍｍ、ＩＤ＝１０．５ｍｍ）上の分取ＨＰＬＣにより 精製する。凍結乾燥後、所望の生成物（０，８ミリモノりを得る。

収率・３８％ 物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２ＳＣＤ３ＣＯＣＤ３）：ＣＨ３：　３．２ｐｐｍ　 （ｓ、３Ｈ）：ＣＨ３−Ｎ”：４．７０ｐｐｍ　（ｓ、３Ｈ）；Ｈｙ：８．１０ ＋）Ｉ）ｍ　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝８〜６．５Ｈｚ）；Ｈｓ：　８．３０ｐｐｍ（ ｄｄ、ＬＨ，Ｊ−８〜６．５Ｈｚ）；Ｈ３：　８．４０ｐｐｍ　（ｓ、ＩＨ）： Ｈａ：８．６０ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝８Ｈｚ）：Ｈｓ：８．７０ｐｐｍ　（ ｄ、ＩＨ，Ｊ＝８Ｈｚ） ＊ＭＳ　：　（ＦＡＢ、　グ’）セロ−ルーＮ０ＢＡ）　陽イオン：Ｍ”：　１ ９２陰イオン：Ｍ−・８７ ＊元素分析値： 計算値（％）２０士４７．２　；Ｈ＝３．９　：Ｎ＝５．Ｏ；Ｃ１＝１２．７実 測値（％）：Ｃ＝４７．３；Ｈ＝３．９：Ｎ＝４．９；ＣＩ＝１３．０撹拌装置 および温度計を備えた１００ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、３、１７　ミリ モルの４−クロロキノリン（アルドリッチ）を撹拌しなからアセトニトリル（１ ０ｍｌ）中に溶解する。室温にてアセトニトリル（４ｍｌ）中のトリメチルオキ ソニウムテトラフルオロボレート（ランカスター）（６，３０ミリモル）の溶液 を１０分間かけて加える。撹拌を３０分間続け、溶媒を真空下で蒸発させる。

得られた粗製の残渣を２−プロパツール（１０ｍｌ）中に取り、１０分間撹拌す る。

得られた沈殿を濾過し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５０ｍｌ）で洗浄し 、排水し、２時間真空乾燥させる。

ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／２−プロパツール混合物（１／１）から再結 晶させた後、所望の生成物（１，５ミリモル）を得る。収率：８４％物理特性。

＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ　１ＣＤ３ＣＯＣＤｓ）：ＣＨ３Ｎ’：　４．４５ ｐｐｍ　（ｓ、３Ｈ）：　Ｈ３：　８．２０ｐｐｍ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝７．５Ｈ ｚ）：ＨｓおよびＨｔ：８．４０ｐｐｍ　（ｍ、２Ｈ）；ＨａおよびＨａ：８． ７０ｐｐｍ　（ｄｄ、２Ｈ，Ｊ＝８〜１．８Ｈｚ）：　Ｈｚ：　９．５ｐｐｍ　 （ｄ、ＩＨ。

Ｊ＝７．５Ｈｚ） ＊ＭＳ：　（ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオン＋Ｍ”：１７８陰イオ ン：Ｍ−：８７ 撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、２．０ミ リモルの７−クロロ−２−メチルキノリン（アルドリッチ）を撹拌しなからアセ トニトリル（５ｍｌ）中に溶解する。１０℃にてアセトニトリル（４ｍｌ）中の トリメチルオキソニウムテトラフルオロポレート（ランカスター）（２，６０ミ リモル）の溶液を１０分間かけて加える。撹拌を１時間３０分続け、溶媒を空下 で蒸発させる。得られた粗製の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５ｍｌ ）中に取り、排水し、２時間真空乾燥させる。

ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／２−プロパツール混合物（１／１）から再結 晶させた後、所望の生成物（１，５ミリモル）を得る。収率ニア６％物理特性。

＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２，ＣＤ３ＣＯＣＤ３）：ＣＨ３：　３．２０ｐｐｍ 　（ｓ、３Ｈ）；ＣＨ３−Ｎ′″：４．６５ｐｐｍ　（ｓ、３Ｈ）；Ｈａ：　８ ．ＯＯｐｐｍ　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝８．８〜１．６Ｈｚ）：Ｈ３：　８．１２＋ ）ｌ）ｍ（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝８Ｈｚ）；Ｈｓ：８．４５ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨＳＪ＝ ８．８Ｈｚ）：Ｈａ：　８．７２ｐｐｍ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ　１．８Ｈｚ）：Ｈ４ ：９．１２＋）ｌ）ｍ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝８Ｈｚ） ＊ＭＳ：　（ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオン：Ｍ”：１９２陰イオ ン：Ｍ−：８７ ＊元素分析値： 計算１ｍ（％）：Ｃ＝４７．２：Ｈｚ３．９；Ｈｚ５．Ｏ；Ｃ１＝１２．７実測 値（％）：Ｃ＝４７．０：Ｈｚ３．８；Ｈｚ５．１：Ｃ１＝１２．５撹拌装置お よび温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、２．０ミリモルの４ ．７−ジクロロキノリン（アルドリッチ）を撹拌しなからアセトニトリル（５ｍ ｌ）中に溶解する。１０℃にてアセトニトリル（４ｍｌ）中のトリメチルオキソ ニウムテトラフルオロポレート（ランカスター）（２，６０ミリモル）の溶液を １０分間かけて加える。撹拌を１時間続け、溶媒を真空下で蒸発させる。

得られた粗製の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５０ｍｌ）中に取り、 排水し、２時間真空乾燥させる。

ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／２−プロパツール混合物（１／１）から再結 晶させた後、所望の生成物（１，４ミリモル）を得る。収率２７０％物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、Ｄ２０）：ＣＨｓ−Ｎ”　：　７ｐｐｍ　（ｓ、 　３Ｈ）　：　Ｈｓ　：　１０．４９ｐ　ｐｍ　（ｄｄ、　ＩＨ。

Ｊ＝９〜２．２Ｈｚ）：Ｈｓ：　１０．５８ｐｐｍ（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝６．７Ｈｚ ）；Ｈａ　：　１０．９４ｐｐｍ　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ＝２．１Ｈｚ）　：　Ｈｓ 　：　１１．２ｐｐｍ　（ｄ。

ＩＨ，Ｊ＝９Ｈｚ）；Ｈ２：　１１．５６ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝６．５Ｈｚ ）＊ＭＳ　：　（ＦＡＢ、　グリセロールーＮ０ＢＡ）陽イオ：／：Ｍ”：２１ ２陰イオン：Ｍ−：８７ ＊元素分析値： 計算値（％）　：　Ｃ＝４０．０　；Ｈｚ２．６　：Ｈｚ４．６　；　Ｃ１＝２ ３．６実測値（％）：　Ｃ＝４１．１　；Ｈｚ２．４　；Ｈｚ４．８　；Ｃ１＝ ２３．６撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、 ２．０らアセトニトリル（５ｍｌ）中に溶解する。１０℃にてアセトニトリル（ ４ｍｌ）中のトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート（ランカスター） （２，４０ミリモル）の溶液を１０分間かけて加える。撹拌を３０分間続け、溶 媒を真空下で蒸発させる。得られた粗製の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテ ル（５０ｍｌ）中に取り、排水し、２時間真空乾燥させる。

ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／２−プロパツール混合物（１／１）から再結 晶させた後、所望の生成物（１，４ミリモル）を得る。収率ニア０％物理特性 ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚＳＣＤ３ＣＯＣＤ３）：ＣＨｓ−Ｎ”：５．Ｏ５ｐ ｐｍ　（ｓ、３Ｈ）；Ｈ７：　７゜６５ｐｐｍ　（ｄ、ＬＨ。

Ｊ＝８．６Ｈｚ）；Ｈａ＋７．９５ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）；Ｈ ３：８．２０ｐｐｍ　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝５．７〜２．３Ｈｚ）：Ｈ４：９．３ ５ｐｐｍ（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）：Ｈｚ：　９．４０ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）＊ＭＳ　：　（ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオン ：Ｍ”：１９４陰イオン：Ｍ−：８７ 実施例７：５−クロロ−８−ベンジルオキシ−１−メチルキノリニウムテトラフ ルオロボレート（ＢＸＴＯ３０６３） ５−クロロ−８−ベンジルオキシキノリン。

撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、１０．０ミリモルの ５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン（アルドリッチ）を撹拌しながら乾燥Ｄ〜 ｉＦ　（２０ｍｌ）中に溶解する。ついで、炭酸カリウム（１１ミリモル）およ びヨウ化カリウム（１０重量％）を加える。ＤＭＦ　（５ｍｌ）中のベンジルク ロライド（ジャンセン）（１１９モル）の溶液を室温で撹拌しながら５分間かけ て滴下する。５０°Ｃで１８時間反応させた後、水（１００ｍｌ）を添加した反 応混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（４Ｘ５０ｍｌ）で抽出する。有機 相をコンバインし、ついでＩＮ　ＨＣＩ　（３Ｘ５０ｍｌ）で洗浄する。水性相 をコンバインし、ｐＨ＝９のアルカリ性にし、酢酸エチル（２ｘ５０ｍｌ）で抽 出する。有機相をＭｇ５Ｏ，で乾燥させた後、減圧下で溶媒を蒸発させる。エタ ノールから再結晶させた後に所望の生成物を得る。

収率ニア９．５％ 物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ５ＣＯＣＤｓ）：ＣＨｚｏ：　５．３５ｐｐ ｍ　（ｓ、２Ｈ）；　７．２２〜７．４５ｐｐｍ　（ｍ、４Ｈ）；７．５５〜７ ．７０ｐｐｍ　（ｍ、４Ｈ）；Ｈ４：８．５３ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝５．２ Ｈｚ）：Ｈ２：　８．９５ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨＳＪ＝２．１Ｈｚ）５−クロロ− ８−ベンジルオキシキノリニウムテトラフルオロポレート（ＢＸＴ０３０６３） ： 撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、１０．０ ミリモルの５−クロロ−８−ベンジルオキシキノリンを撹拌しながらアセトニト リル（５ｍｌ）中に溶解する。１０℃にてアセトニトリル（４ｍｌ）中のトリメ チルオキソニウムテトラフルオロボレート（ランカスター）（２３，０ミリモル ）の溶液を１０分間かけて加える。撹拌を１時間続け、溶媒を真空下で蒸発させ る。

得られた粗製の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５０ｍｌ）中に取り、 排水し、２時間真空乾燥させる。

粗製の生成物を、アセトニトリル−水混合物（２０／８０）で溶出するカラム（ Ｃ，，５ｕｍ、Ｌ＝２５０ｍｍ、ＩＤ＝１０．５ｍｍ）上の分取ＨＰＬＣにより 精製する。凍結乾燥後、所望の生成物（２ミリモル）を得る。

収率：２１％ 物理特性。

＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２，ＣＤ３ＣＯＣＤ３）：ＣＨ３−Ｎ”：５．ＯＯｐ ｐｍ　（ｓ、３Ｈ）：ＣＨｚＯ：５．５５１）Ｉ）ｍ（Ｓ−２Ｈ）；Ｈ，、Ｈ４ およびＨ６：７．４５＋）Ｉ）ｍ　（ｍ、３Ｈ）、；ＨｌおよびＨ，ニア、７５ ｐｐｍ　（ｍ、２Ｈ）：Ｈｔ：　７．９５ｐｐｍ　（ｄ１１ＨＳＪ＝１０Ｈｚ） ；Ｈａ：８．１５ｐｐｍ（ｄ、ＩＨＳＪ＝１０Ｈｚ）；Ｈｓ：８．３５１：）ｔ ）ｍ（ｔ、ＩＨｌＪ”１１．２Ｈｚ）；８２およびＨ４：　９．５ｐｐｍ　（ｄ 、２Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ）＊ＭＳ：　（ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽 イオン：Ｍ”：２８４陰イオン：Ｍ−：８７ ５−フルオロキノリン： 撹拌装置および温度計を備えた１００ｍ１容の３つ首丸底フラスコ中、１３．７ ミリモルの５−アミノキノリン（アルドリッチ）を室温にてエタノール（２０ｍ ｌ）中に溶解する。３４％テトラフルオロ硼酸溶液を５分間かけて加える。反応 混合物を一５℃に冷却し、この温度でイソアミルナイトレート（ジャンセン）（ ３６，０ミリモル）を１０分間かけて加える。添加終了時、反応媒体を撹拌しな から０℃で１時間保持する。得られた懸濁液を濾過し、固体を無水エタノール（ ３Ｘ２０ｍｌ）および酢酸エチル（３Ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、ついで真空下で１ ８時間乾燥させる。か（して８５．７％の収率で得られたジアゾニウム塩をつぎ の工程にそのまま用いる。

撹拌装置、温度計および還流冷却器（ｒｅｔｕｒｎ　ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）　（ それ自体、オイルバブラーを備えている）を備えた２５０ｍ１容の３つ首丸底フ ラスコ中、上記で得たジアゾニウム塩を無水へブタン（１００ｍｌ）中に懸濁し 、撹拌しながら３時間加熱還流した。この反応混合物を冷却し、ＩＮ水酸化ナト リウム溶液（１００ｍｌ）を加える。有機相をデカントし、この同じ水酸化ナト リウム溶液（２Ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、ついでＮａＣ１飽和水（２Ｘ１００ｍ ｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させる。溶媒をロータリーエバポレーターで真 空蒸発させる。

所望の生成物をゲデュラン８シリカ［メルク、４０〜６３μｍ（２３０〜４００ メッシュ）コ上のクロマトグラフィー（溶出液ＣＨ２Ｃｌ　２）により精製する 。収率、３５％ 物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２，ＣＤＣｌ２）：Ｈｓニア、２６〜７．４０ｐｐｍ 　（ｄｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝１〜６．８〜９．７Ｈｚ）；Ｈ３：　７．５４−７．６ ４ｐｐｍ　（ｄｄ、１．ＨＳＪ＝４．８〜１０Ｈｚ）；Ｈ７：７．６７〜７．７ ９ｐｐｍ　（ｄｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝４〜６．８〜８Ｈｚ）；Ｈａニア、８８ｐｐｍ 　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝１〜８Ｈｚ）；Ｈ４：８．４５＋）Ｉ）ｍ　（ｄｄ。

ＩＨＳＪ＝２〜１０Ｈｚ）：　Ｈ２：　８．９５　ｐＩ）ｍ　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ ＝２〜４．８Ｈｚ） ＊ＭＳ：　（ＥＩ、７０ｅＶ）Ｍ’：　１４７　（１００）；　１２０　（２１ ）；　９９（１０）：　７４　（１４） ＥＩ＝電子衝撃 ５−フルオロ−１−メチルキノリニウムテトラフルオロボレート（ＢＸＴ０３０ ６８）： 撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、１０．０ ミリモルの５−フルオロキノリンを撹拌しながらアセトニトリル（５ｍｌ）中に 溶解する。１０°Ｃにてアセトニトリル（４ｍｌ）中のトリメチルオキソニウム テトラフルオロポレート（ランカスター）（２３，０ミリモル）の溶液を１０分 間かけて加える。撹拌を１時間続け、溶媒を真空下で蒸発させる。得られた粗製 の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５０ｍ　ｌ　）中に取り、排水し、 ２時間真空乾燥させる。

ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／２−プロパツール混合物（１，／１）から再 結晶させた後、所望の生成物を得る。収率：５０％物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２，ＣＤ３ＣＯＣＤ３）：ＣＨａ　Ｎ”：４．９０ｐ ｐｍ　（ｓ、３Ｈ）；Ｈ３ニア、８５ｐｌ）ｍ　（ｄｄ、ＩＨｌＪ”９．５〜１ ２Ｈｚ）：ＨｓおよびＨ７：　８．２５〜８．４０ｐｐｍ　（ｍ、２Ｈ）；Ｈｓ ：　８．４８ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ）；Ｈ４：　９．４５ｐｐ ｍ　（ｄ。

ＩＨＳＪ＝１２Ｈｚ）；Ｈ２：９．６５ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝９．５Ｈｚ） ＊ＭＳ　：　（Ｅｌ、７０ｅＶ）Ｍ”＋　１６２　（８０）；　１４７　（１０ ０）：　１２０（４８）；　９９　（２１）：　７４　（２０）５−フルオロ− ８−ニトロキノリン： 撹拌装置および温度計を備えた１００ｍ１容の３つ首丸底フラスコ中、５−フル オロキノリン（２０，０ミリモル）の溶液を濃硫酸（１０ｍｌ　；ｄ＝１．８４ ）中に導入する。温度を０℃に保持しながら、発煙硝酸（５ｍｌ）を撹拌しなが ら加える。反応混合物を２０°Ｃにて１０分間保持し、ついで氷（１００ｇ）上 にゆっくりと注ぐ。濃水酸化ナトリウムをゆっくりと添加することにより、反応 混合物のｐＨを８とする。か（して得られた沈殿を酢酸エチル（１００ｍｌ）で 抽出する。有機相を水（２Ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させる。溶 媒を減圧下で蒸発させる。

所望の生成物をゲデュラン８ンリカ上のクロマトグラフィー（溶出液ＣＨ２Ｃｌ 、）により精製する。収率、６７％ 物理特性。

＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２，ＣＤＣｌ２）：Ｈ６：　７．２７ｐｐｍ　（ｄｄ 、ＩＨＳＪ＝８．５８〜８．６４Ｈｚ）：Ｈｓ：　７．６２ｐｐｍ（ｄｄ、ＬＨ ，Ｊ＝８．６０〜４．２０Ｈｚ）：Ｈｔ：８．１１０１）Ｉ）　（ｄｄ。

ＩＨ１Ｊ＝８．５６〜５．２２Ｈｚ）；Ｈ４：　８．４８ｐＩ）ｍ　（ｄｄ、Ｉ Ｈ，Ｊ＝２．５〜８．６Ｈｚ）＋Ｈ２：９．１２ｐｐｍ　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝２ ．５〜４．２Ｈｚ）＊ＭＳ：（ＥＩ、７０ｅＶ）Ｍ”：　１９２　（１００）　 、１７６　（１６）　、１６２（４７）、１４６　（３３）、１３４　（９８） 　、１２６　（４３）　、１１９　（２１）、１０７　（３６）、９９　（４４ ） ５−フルオロ−８−二トロー１−メチルキノリニウムフルオロスルホネート（Ｂ ＸＴＯ３０６９）： 撹拌装置および温度計を備えた１００ｍ１容の３つ首丸底フラスコ中、窒素流下 、２．５ミリモルの５−フルオロ−８〜ニトロキノリンを撹拌しながら乾燥グラ イム（１０ｍｌ）中に溶解する。室温にてメチルフルオロスルホネート（１ｍｌ ）（ＩＯミリモル：アルファ・ペントロン）を３分間かけて加える。反応混合物 を６０℃で１時間撹拌する。室温に戻した後、得られた沈殿を排水し、ｔｅｒｔ −ブチルメチルエーテル（３ｘｌＯｍｌ）で洗浄し、ついで真空乾燥させる。

所望の生成物を４６％の収率で得る。

物理特性： ＊宜ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ　Ｓ　ＣＤ５ＣＯＣＤｓ）　：ＣＨ３Ｎ”：４．７ ０ｐｐｍ　（Ｓ、３Ｈ）　；Ｈｓ：８．１０ｐｐｍ（ｄｄ、ＩＨ。

ｄ＝８．４６〜８．５６Ｈｚ）；Ｈｓ：　８．５８ｐｐｍ　（ｄｄ、ＩＨＳＪ＝ ８．７２〜５．８６Ｈｚ）：Ｈ７：　８．９０＋）ｐｍ　（ｄｄ、ＩＨＳＪ＝８ ．７２〜５．２８Ｈｚ）；Ｈ４：９．６６ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，ｄ＝８．８Ｈｚ ）；Ｈ２：９．８８ｐｐｍ（ａ、ＩＨ，Ｊ＝５．８６Ｈｚ） ＊ＭＳ　（ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオン：Ｍ”：２０７陰イオン 二Ｍ−二４０４ （２Ｍ−／ＬＭつ 撹拌装置および温度計を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、５．７４ ミリモルの５−ニトロキノリン（アルドリッチ）を撹拌しなからアセトニトリル （１０ｍｌ）中に溶解する。２５℃にてアセトニトリル（４ｍｌ）中のトリメチ ルオキソニウムテトラフルオロポレート（ランカスター’）　（６，４ミリモル ）の溶液を１０分間かけて加える。撹拌を１７２時間続け、溶媒を真空下で蒸発 させる。得られた粗製の残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／２−プロパツ ール混合物（１／１）中に取り、排水し、２時間真空乾燥させる。

ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル／２−プロパツール混合物（１／１）から所望 の生成物を再結晶させる。

収率：８９％ 物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚＳＤ２０）：ＣＨ３Ｎ’：　４．７０ｐｐｍ　（ｓ 、３Ｈ）：Ｈｓ：　８．２０ｐｐｍ　（ｄｄ、ＩＨ１Ｊ＝９．６〜５．６Ｈｚ） ：Ｈｔ：　８．３３ｐｐｍ　（ｔ、ＩＨ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）；Ｈ６およびＨｓ： ８．７４ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）：Ｈ４：９．３７＋）Ｉ）ｍ（ｄ 、ＬＨ，Ｊ−５，６Ｈｚ）；Ｈ２：　９．６４ｐｌ）ｍ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝９． ６Ｈｚ）＊ＭＳ・　（ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオン＝Ｍ′″、１ ８９陰イオン＋Ｍ−：８７ ロークロロ−７−トリフルオロメチルキノリンおよび６−クロロ−５−トリフル オロメチルキノリン： 撹拌装置および温度計を備えた１００ｍ１容の３つ首丸底フラスコ中、２０ミリ モルの５−アミノ−２−クロロ−１−トリフルオロメチルベンゼン（アルドリッ チ）および１４ミリモルの酸化ヒ素（アルドリッチ）を無水グリセロール（ジグ ？）（８０ｍｌ）中に導入する。濃硫酸（ｄ＝１．８４）（２，１５ｍ１）を室 温にて滴下する。温度を徐々に１１０°Ｃにもっていきながら、反応混合物を真 空下（２６６６パスカル（２０ｍｍＨｇ））に置（。この温度で撹拌を４時間続 ける。ついで、反応混合物を大気圧に戻し、濃硫酸（ｄ＝１．８４　；　１ｍ１ ）の２回目の添加を行う。真空下［２６６６パスカル（２０ｍｍＨｇ）コ、１２ ０℃を決して越えない温度で４時間、激しく撹拌しながら水の除去を再開する。

反応媒体が１００℃の温度に戻った後、水（５０ｍｌ）をゆっくりと加える。得 られた溶液（室温に戻り、ｐＨは濃水酸化アンモニウム溶液（ｄ＝ｏ、８９；５ ｍ１：プロラブ）の添加により塩基性にしである）を酢酸エチル（２Ｘ１００ｍ ｌ）で抽出する。有機相をコンバインし、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ついで 溶媒を真空蒸発させる。得られた固体残渣を、最後に溶出液混合物：メチレンク ロライド／ペンタン（４／１）によるゲデュラン８ンリカカラム［メルク：４０ 〜６３μｍ（２００〜４００メツシユ）］上のクロマトグラフィーにかける。

６−クロロ−７−トリフルオロメチルキノリン　収率＝２４％物理特性。

＊融点＝１３７〜１３９°Ｃ ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）Ｈ３＋　７．５３ｐｐｍ　（ｄｄ、 ＩＨ，Ｊ＝４．１８〜８．４０Ｈ２）；Ｈ５：　７．９６ｐｐｍ　（ｓ、ＬＨ） ；Ｈ４：８．１２＋）ｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ）：Ｈｓ：８．４８ ｐｐｍ　（ｓ、ＩＨ）；Ｈｚ：８．９９ｐｐｍ　（ｄｄ、ＩＨ％Ｊ＝１．３８〜 ２．７８Ｈｚ） ＊ＭＳ：　（ＥＩ、７０ｅＶ）：２３３　（３０）；２３１　（１００）；２１ ２（１０）；１９６　（２０） ６−クロロ−５−トリフルオロメチルキノリン：収率＝８％物理特性： ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚＳＣＤＣ＋　３）　：Ｈ３：　７．４０ｐｐｍ　（ ｄｄ、ＩＨ１Ｊ＝４．２０〜８．９６Ｈｚ）；Ｈ？：　７．５８ｐＩ）ｍ　（ｄ 、ＬＨ，Ｊ＝９．１６Ｈｚ）；Ｈｓ：８．Ｏ３ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨＳＪ＝８．９ ４Ｈｚ）：Ｈ＜：　８．４５ｐｐｍ　（ｄ１１ＨＳＪ＝９．０ＯＨｚ）；Ｈｚ： ８．８５ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝２．９４Ｈｚ）＊ＭＳ＝　（ＥＩ、７０ｅＶ ）：２３３　（３０）：２３１　（１００）；２１２（１０）；１９６　（２０ ）；１７９　（１５）６−クロロ−５−トリフルオロメチル−１−メチルキノリ ニウムフルオロスルホネート（ＢＸＴＯ３０７１）： 撹拌装置を備えた５０ｍ１容丸底フラスコ中、窒素流下、０．６ミリモルの６− クロロ−５−トリフルオロメチルキノリンをエチレングリコールジメチルエーテ ル（５ｍｌ）中に導入し、ついでメチルフルオロスルホネート（アルファ）（０ ，２ｍｌ、２．４ミリモル）を撹拌しながら滴下する。５０℃で１時間加熱しつ いで室温に戻した後、得られた溶液にエチルエーテル（１０ｍｌ）を加える。

生成した沈殿を濾過し、エチルエーテル（２Ｘ５ｍｌ）で洗浄し、ついで真空オ ーブン中、４０°Ｃで無水リン酸を用いて乾燥させる。

所望の生成物（白色粉末）を７２％の収率で単離する。

物理特性： ＊融点＝１４９〜１５１°Ｃ ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ）ＣＤ３ＳＯＣＤ３）：ＣＨ，−Ｎ”：　ｔ４．７ ０ｐｐｍ　（ｓ、３Ｈ）；Ｈｓ：８．３５ｐｐｍ（ｄｄ、ＩＨ１Ｊ＝５．７８〜 ９．１２Ｈｚ）；　Ｈ７：　８．５１ｐｐｍ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）； Ｈ，：　８．８６ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝９．９Ｈｚ）：Ｈ４：　９．３８ｐ ｐｍ　（ｄ、１）１．Ｊ＝９．０６Ｈｚ）：Ｈ２：９．６４ｐｐｍ　（ｄ、ＬＨ ，Ｊ＝５．４８Ｈｚ）＊〜ｉＳ：　（ＦＡＢ、グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオ ン：Ｍ”：３４５陰イオン＋Ｍ−：９９ ６−クロロ−７−トリフルオロメチル−１−メチルキノリニウムフルオロスルホ ネート（ＢＸＴＯ３０７２）： ６−クロロ−５−トリフルオロメチルキノリンの代わりに６−クロロ−７−トリ フルオロメチルキノリンを用いる他は、この化合物の調製に用いる手順は上記化 合物のものと同じである。所望の生成物を８０％の収率で得る。

物理特性 ＊融点＝１８７〜１８９°Ｃ ＊’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２）ＣＤ３ＳＯＣＤ３）：ＣＨ３−Ｎ”：　４．７８ ｐｐｍ　（Ｓ、３Ｈ）；Ｈ３：　８，３８ｐｐｍ　（ｄｄｌｌＨ。

Ｊ＝６．ＯＯ〜９．３Ｈｚ）；Ｈｓ：８．９０ｐＴ）ｍ（ｄ、ＩＨ）；Ｈｓ：８ ．９８ｐｐｍ（ｓ、ＬＨ）：Ｈ４：９．２５ｐｐｍ　（ｄ、ＩＨＳＪ＝７．５Ｈ ｚ）；Ｈ２：９．６４ｐｐｍ（ｄ、ＬＨ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）＊ＭＳ：（ＦＡＢ、 グリセロール−ＮＯＢＡ）陽イオン二Ｍ”：３４５陰イオン：Ｍ−：９９ ■　応用例 以下に記載する手順は、試薬ＢＸＴＯ３０１５による赤血球溶解液中の非タンパ ク質メルカプタンおよび還元型グルタチオンのアッセイへの本発明の方法の応用 例である。

試薬ボックスの例を以下に記載する。この本発明による試薬ボックスまたはキ・ ソトは０〜４℃の温度で貯蔵しなければならない。

試薬の記載。

Ｔ：　１ｍＭ　ＤＴＰＡを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）（使 用前に空気中および２５°Ｃで放置して平衡化させる）８１５％メタリン酸溶液 （試料の調製のため０〜４℃に保持しなければならない）Ｓ２　：　３０％水酸 化ナトリウム溶液（空気中および２５℃で放置して平衡化させる）Ｒ１・固体形 状のＢＩＴ試薬 （Ｔ緩衝液中で使用する直前に１０−２Ｍストック溶液を調製する）Ｅ、固体形 状のＧＳＨ 試料の調製ニ ー２ｍｌの全血を４℃、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離する；−上澄み液 を除く。

一赤血球のペレットを、０〜４℃に冷却した４倍量の８１溶液中に取る；−この 懸濁液を混合するニ ー４℃、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離する。

か（して得られた赤血球溶解液に対応する上澄み液（タンパク質を沈殿させてあ り、１１５に希釈しである）がアッセイすべき試料を構成するであろう（測定の ためには０〜４℃で保持しなければならない）。

測定キュベツトにサーモスタットを付した分光測光計中、２５℃で測定を行う。

以下の手順に従い、１ｍｌキュベツトに対して各アッセイに対応する反応混合物 を使用の直前に調製するニ ー以下のものを混合する： アッセイすべき試料（１１００μｌ）およびＴ溶液（８００μｌ）。

−この混合物を２５℃で１分間インキュベートする；−Ｔ緩衝液中の１０−２Ｍ ＲＩストック溶液（１００μｌ）を加えることにより反応を開始させる；ついで −この混合物を２５°Ｃで５万間インキュベートする〇吸光度（Ａ）の測定は、 １ｃｍの光路長を有するキュベツト中、空気に対し、Ｒ１が化合物ＢＸＴＯ３０ １５の場合は３５６ｎｍにて行う。

試薬ボックス中に存在するＧＳＨ（Ｅ）は、必要なら検量曲線を定めるのに用い ることができる。

結果の記載： このアッセイの条件下、全メルカプタンの濃度を式：％式％ （式中、Ａは測定した吸光度である） に従って決定する。

注：ここで用いるモル吸光係数（１６２００１，モル−’ｃｍ−’）は、試薬Ｂ ＸＴ０３０１５と上記表■に記載した重要な生理学的に重要なメルカプタンとの 間に生成した付加物について得られた３５６ｎｍにおけるモル吸光係数の平均で ある。

これら条件下において相対誤差は±９％に等しい。

この場合、試料中の全メルカプタンの濃度の測定値（モル／１で表される）が得 られる。

測定キュベツトにサーモスタットを付した分光測光計中、２５℃で測定を行う。

以下の手順に従い、１ｍｌキュベツトに対して各アッセイに対応する反応混合物 を使用の直前に調製する 一全メルカブタンをアッセイするための溶液に溶液５２（５０μｍ）を加える； ついで −この混合物を２５℃で１５分間インキュベートする。

吸光度の測定は、１ｃｍの光路長を有するキュベツト中、空気に対し、Ｒ１が化 合物ＢＸＴＯ３０１５の場合は４００　ｎｍｌ：テ行う。

結果の記載： このアッセイの条件下、Ｇ　Ｓ　Ｈの１度を式：％式％ （式中、八゛は測定した吸光度である）に従って決定する。

この場合、還元型グルタチオン（Ｇ　Ｓ　Ｈ）の濃度の測定値（モル／ｌで表さ れる）が得られる。

５％メタリン酸（溶液ＳＬ）中のＧＳＨ（試薬Ｅ　；　１０−２モル／１）の溶 液は必要なら使用の直前に調製することができ、検量曲線を定めるのに用いるこ とができる。

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Ｈ，）　（１９６８）　ＡｎａＬ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２５．１９２〜２０５ ８−　ルスラ（ＬＵＴＨＲＡ　Ｎ、Ｐ、）　、ダンラップ（ＤＵＮＬＡＰ　Ｂ、 ）およびオダム（ＯＤＡＭ　Ｊ、）（１９８１）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｏ、 １エユ、９４〜９−　トルノンスキー（ＴＯＲＳＨＩＮＳＫＩ　Ｙ、Ｍ、）（１ ９８１）Ｓｕｌｆｕｒｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、パーガモンプレス、１２４〜１ ２５頁１０−　ファリス（ＦＡＲＩＳＳＭ、〜Ｖ、）およびリード（ＲＥＥＤ　 Ｄ、Ｊ、）１１−　リードおよびベラティ（ＢＥＡＴＴＹ　Ｐ、Ｗ、）（１９８ ０）Ｒｅｖｉｅｗｓｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ−エ ルセビエ、ス、２１３〜２４１２−　コソワー（ＫＯ３ＯＷＥＲＥ、Ｒ，）　、 コソワー（ＫＯ８ＯＷＥＲＮ。

Ｓ、）およびラドコラスキー（ＲＡＤＫＯＷＳＫＹ　Ａ、）（１９８３）　、グ ルタチオンの機能：生化学的、生理学的、毒物学的および臨床的側面中、ラーソ ン（ＬＡＲＳＳＯＮ　Ａ、）編、レイダンプレス、ニューヨーク、２４３〜２５ ０頁１３−　ライス（ＲＩＣＥ　Ｇ、Ｃ，）　、バンプ（ＢＵＭＰ　Ｅ、Ａ、） 　、シュリーブ（ＳＨＲＩ　ＥＶＥ　Ｄ、　Ｃ，）　、リー（ＬＥＥ　Ｗ、）お よびコバックス（ＫＯＶＡＣ３Ｍ、）（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４ ６．６１０５〜５１１０１４−　ホロウェイ（ＨＯＬＬＯＷＡＹ　Ｃ，Ｊ、）（ １９８７）Ｊ、ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、３９０，１０１〜１１０１５−　 ムタス（ＭＵＴＵＳ　Ｂ、）　、ワグナ−（ＷＡＧＮＥＲＪ、Ｄ、）　、タルバ ス（ＴＡＬＰＡＳ　Ｃ，Ｊ、）　、ディモック（ＤＩＭＭＯＣＫ　Ｊ、Ｒ，）　 、フィリップス（ＰＨＩＬＬＩＰＳ　Ｏ，Ａ、）　、レイド（ＲＥＩＤ　Ｒ，Ｓ 、）（１９８９）Ａｎａｌ、　Ｂ　１ｏｃｈｅＩ１１．　、エヱユ、２３７〜２ ４３１６−　グリフイス（ＧＲＩＦＦ　ＩＴＨＯ，Ｗ、）　（１９８０）　Ａｎ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、よ立見、２０７〜２１２ １７−　ヒンジ（Ｈｌｓｓ　ＩＮ　Ｐ、）　、ヒルフ（ＨＩＬＦ　Ｒ，）（１９ ７６）Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　、　７４．２１４〜２２６１８−７− テンソン（ＭＡＲＴＥＮＳＳＯＮ　Ｊ、）（１９８７）Ｊ、ｏｆＣｈｒｏｍａｔ ｏｇｒ、　、　４２０．１５２〜１５７１９−　ファヘイ（ＦＡＨＥＹ　Ｒ，Ｃ ，）（１９８９）、「グルタチオン：化学的、生化学的および医学的側面」、ド ルフィン、ブールソンおよびアブラモビック編、ジョンウイリーアンドサンズ、 ３０３〜３３７頁２０−　リング（ＢＮ　ＬＩＮＧ　Ｂ、）　、ベイニング（Ｂ ＡＥＹＥＮＳ　Ｆ、Ｒ。

Ｇ、）、メアリーシール（ＭＡＲＹＳＥＡＬ　Ｈ，）（１９８９）Ａｎａｌ、Ｃ ｈｉｍ、Ａｃｔａ。

２２７．２０３〜２０９ ２１−　イ／ウニ（ＩＮＯＵＥ　Ｍ、）　、”ｊ−イト−（ＳＡＩＴＯＹ、）　 、ヒ−ｙ９（ＨＩＲＡＴＡ　Ｅ、）　、モＩＪ／　（ＭＯＲＩＮＯＹ、）　、ナ ７’／セ（ＮＡＧＡＳＥＳ、）、（１９８７）　Ｊ、　Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅａｐ 、、旦、２０７〜２２５Ｆ’１ｇ−１ （ＬＬ’ＬＩ　９ｇＥ）ｉｏｎｔ Ｆ　ｉ　ｇ−２ （’Ｇ’Ｏ）　表￥積 １ｇ−３ （°○’Ｇ）Ｅγ萄 Ｄ−Ｉ□ｌｌ〜　ＰＣＴ／ＦＲ９２１０１１８４フロントページの続き （７２）発明者　ショーディエール、ジャン・レイモンフランス国エフー９４１ ００サン・モール・デ・フォス、アブニュー・ガブリエル・ペリ４９番テール

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．−水性試料、とりわけ生物学的試料中のメルカブタンのアッセイ法であって 、該試料中に存在するすべてのメルカプクンと一般式（Ｉ）：▲数式、化学式、 表等があります▼（Ｉ）（式中、 Ｒ１＝アルキル（炭素数１〜６）、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、フェニルま たはｏ、ｐ−ジニトロフェニル； Ｒ２＝水素またはメチル； Ｒ３＝水素、Ｆ、Ｃ１、Ｂｒ、ＩまたはＳＣＮ；Ｒ４＝水素、Ｆ、Ｃ１、ＮＯ２ またはＣＦ３；Ｒ５＝水素、ＮＯ２またはＣ１； Ｒ６＝水素、Ｆ、Ｃ１、ＣＦ３またはＮＯ２；Ｒ７＝水素、ＯＨ、ベンジルオキ シまたはＮＯ２；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は同時に水素を表さない；Ｙ＝フ ルオライド、クロライド、ブロマイド、ヨーダイド、メチルサルフェート、フル オロスルホネート、ホスフェート、テトラフルオロボレートまたはトシレート） に対応するキノリニウムタイプの化合物から選ばれる試薬との間での発色団置換 生成物の形成から本質的になることを特徴とする方法。 ２．水性試料、とりわけ生物学的試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のアッ セイ法であって、本質的に下記工程： １．該試料中に存在するすべてのメルカブタンと上記一般式（Ｉ）の化合物から 選ばれる試薬との間で発色団置換生成物を生成させ；ついで２．ＧＳＨと該試薬 との間で工程１において生成した発色団置換生成物から発色団チオンを特異的に 生成させるために、反応媒体のｐＨを１２．８〜１３．８の値とする からなることを特赦とする方法。 ３．水性試料、とりわけ生物学的試料中の全メルカブタンのアッセイ法であって 、本質的に以下の工程： １．ｐＨ７．０〜７．５の範囲に緩衝したアッセイすべき試料に、水または水に 相溶性の溶媒中の一般式（Ｉ）のＢＸＴ試薬のストック溶液のアリコートを過剰 量で加え、 ２．かくして得られた反応媒体を均質にし、３．少なくとも５分間インキュベー トし、４．ＢＸＴ試薬と試料中に存在するメルカブタンとの間で生成した置換生 成物すなわち付加物の吸光度を分光測光計により測定し、ついで５．以下の式： ［全メルカブタン］＝（Ａ／εｍ×ｄ）×Ｄ（式中： −Ａは測定した吸光度を表す、 −εｍは使用したＢＸＴ試薬に特異的なモル吸光係数を表す（１．モル−１．ｃ ｍ−１で表す）、 −ｄはキュベットの長さを表す（ｃｍで表す）、および−Ｄは希釈の係数を表す ） に従い、試料中に存在する全メルカブタンの濃度をモル／リットルにて決定する からなることを特徴とする方法。 ４．水性媒体、とりわけ生物学的試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のアッ セイ法であって、本質的に以下の工程：１．ｐＨ７．０〜７．５の範囲に緩衝し たアッセイすべき試料に、水または水に相溶性の溶媒中の一般式（Ｉ）のＢＸＴ 試薬のストック溶液のアリコートを過剰量で加え、 ２．かくして得られた反応媒体を均質にし、３．少なくとも５分間インキュベー トし、４．選択したＢＸＴ試薬に従い、１２．８〜１３．８の範囲の値に混合物 のｐＨを調節し、 ５．少なくとも１５分間インキュベートし、６．とりわけ付加物ＧＳＨ−ＢＸＴ 試薬から、β−脱離により生成した発色団チオンの吸光度を分光測計により測定 し、７．以下の式： ［ＧＳＨ］＝（Ａ′／εｍ×ｄ）ｘＤ （式中： −Ａ′は測定した吸光度を表す、 −εｍは使用したＢＸＴ試薬に特異的なモル吸光係数を表す（１．モル−１．ｃ ｍ−１で表す）、 −ｄはキュベットの長さを表す（ｃｍで表す）、および−Ｄは希釈の係数を表す ） に従い、試料中に存在するＧＳＨの濃度をモル／リットルにて決定するからなる ことを特徴とする方法。 ５．式： ［ＧＳＨとは異なるメルカブタン］＝［全メルカブタン］−〔ＧＳＨ］を用い、 請求項３および４に記載の方法に従ってそれぞれ測定した濃度を引き算すること による、水性媒体、とりわけ生物学的試料中のグルタチオンとは異なるメルカブ タンの濃度のアッセイ法。 ６．使用した試薬が試薬ＢＸＴ０３０１５すなわち４−クロロ−７−トリフルオ ロメチル−１−メチルキノリニウムテトラフルオロボレートである、請求項１〜 ５のいずれか一つに記載の方法。 ７．試薬として請求項１に記載の一般式（Ｉ）の化合物を本質的に包含すること を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法を行うためのセットま にはキット。 ８．Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６およびＲ７が請求項１の記載と同じであり；−Ｒ２水素； −Ｒ４＝水素、Ｆ、Ｃ１またはＣＦ３；−Ｒ５＝水素またはＣ１； −Ｙ＝フルオライド、クロライド、ブロマイド、メチルサルフェート、フルオロ スルホネート、ホスフェート、テトラフルオロボレートまたはトシレート、−Ｒ ３＝Ｆ、Ｃ１、ＢｒまたはＩである場合は、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７ は同時にＨを表さない； −Ｒ４＝ＦまたはＣ１である場合は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同時 にＨを表さない； −Ｒ５＝Ｃ１である場合は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ７は同時にＨを表 さない；−Ｒ６＝ＦまたはＣ１である場合は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ ７は同時にＨを表さない； −Ｒ３＝Ｒ６＝Ｃ１である場合は、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は同時にＨを表 さない；−Ｒ６＝Ｃ１またはＲ７＝ＯＨである場合は、Ｙはメチルサルフェート を表さない一般式（Ｉ）の化合物。