JPH07502526A - 水性媒体中の全メルカプタン,還元型グルタチオン(gsh)およびgsh以外のメルカプタンの分光測光アッセイ法,該方法を行うための試薬およびキット - Google Patents

水性媒体中の全メルカプタン,還元型グルタチオン(gsh)およびgsh以外のメルカプタンの分光測光アッセイ法,該方法を行うための試薬およびキット

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水性媒体中の全メルカプタン、還元型グルタチオン(G S H)およびGSH 以外のメルカプタンの分光測光アッセイ法、該方法を行うための試薬およびキッ ト本発明は、とりわけ生物学的媒体中のメルカプタンおよび還元型グルタチオン のアッセイ法に関する。
本発明の主題は、さらに詳しくは、水性媒体、とりわけ生物学的媒体中の全メル カプタン、還元型グルタチオン(rGSHJと略す)および引き算によりGSH 以外のメルカプタンの分光測光アッセイ法、該方法を行うための試薬およびセッ トまたはキットである。
あらゆる細胞に存在する化合物であるグルタチオンは、その多(の生化学的機能 のため、生理学的観点から重要な分子である(文献1)。従って、その濃度の変 動、とりわけ通常の細胞内レベル(1〜10mM)からの減少は実質的な疾患を 引き起こし得る。それゆえ、信頼性があり簡便で感度が高くしかもこの生化学的 パラメータに特異的なGSHのアッセイ法が必要とされている。
GSHをアッセイするために多くの方法が存在することは、これら方法が満足の いくものではないことを示唆している(文献2)。
一般にメルカプタンを測定するための公知方法、およびとりわけGSHを測定す るための公知方法は、メルカプタンの2つの主要な化学的性質(還元力および核 力)のいずれか一方を活用するものであり、それゆえ以下に分類されるニーメル カプタンの還元力を用いる方法:これら方法はGSHに特異的なものではないた め、GSHをアッセイするためクロマトグラフィー精製工程を必要とし、場合に よりたとえばグルタチオンリダクターゼなどのカップリング酵素の存在を必要と する(文献3);および−メルカプタンの核力を用いる方法 これら方法は、グルタチオントランスフェラーゼを用いまたは用いることなく、 ハロゲン化誘導体(たとえば、ジニトロハロベンゼンまたはモノハロバイマン( monohalobimane)タイプ)の置換に基づいている。これら方法も 、酵素の不在下ではGSHに特異的ではな(、GSHのアッセイを行うにはクロ マトグラフィー分離工程を必要とする。
場合場合に依存して、検出法は分光測光タイプ、分光蛍光タイプ(文献4)また は電気化学タイプ(文献5)によるものである。
以下の明細書では、検出法としてUV/可視吸光分光測光または分光蛍光を用い た方法に限定するものとする。
メルカプタンの還元力を用いた方法は、以下の反応機構(グルタチオンの場合) に従って、チオール−ジスルフィド交換に基づいている:2GS−+ R35R → G55G + 2RS−最も広(知られた方法では、エルマン試薬を用いる (文献6および7)。412nmでの発色団の生成に基づ(この方法は、それほ ど複雑ではないが、光およびpHに対するエルマン試薬の不安定性(加水分解) 、および放出される発色団の自動酸化のために参照測定を行う必要があり、この ため該試験を繁雑にしている。これらすべてのために、大量の試料の臨床生物学 に使用できな4)試薬となっている。
エルマン試薬のセレン化同族体が合成され、メルカプタンのアッセイに用いられ ている(文献8)。このものはエルマン試薬に比べてアルカリ加水分解に対する 抵抗性が大きいが、他の点ではエルマン試薬と同じ不都合を有する。
最後に、ピリジンジスルフィドの使用について言及する必要がある(文献9)。
一般に、チオール−ジスルフィド交換のための試薬はGSHの特異的アッセイに 用いることはできない。
メルカプタンの核力に基づく方法は請求電子試薬への付加能を活用する。す1− クロロ−2,4−ジニトロベンゼン(CDNB)または2.4−ジニトロ−1− フルオロベンゼン(DNFB)タイプのこれら試薬は、アルカリpHでチオール 基に特異的ではない。これら試薬にはGSHl−ランスフェラーゼなどの酵素の 存在を必要とし、さらにこれら試薬は該酵素の活性を測定するために用いられる 。これら試薬の感度が低いことは、これら方法の主要な不都合の一つである。
さらに、これら試薬の非酵素的反応性はOではなく、そのためGSHに対して完 全に特異的なアッセイではないものにしている。この不都合を克服するため、多 くの方法は反応生成物のクロマトグラフィー分離に基づいている。たとえば、リ ード(REED)の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法(文献10およ び11)が挙げられ、この方法では、アミンの誘導体の生成または誘導体化(D NFB・サンガー試薬による)をS−カルボキンメチル化と組み合わせたもので あるが、時間がかかり、実行するのが繁雑である。
2°モノハロバイマン(文献12)。
これら化合物は、たとえばアミンなどのチオール基以外の核基と反応し得る。
これら化合物もまた、他のメルカプタンの存在下でGSHに対して特異的ではな い そのため、この場合もまたクロマトグラフィー分離工程を方法の中に組み入 れる必要がある。にもかかわらず、この方法は、存在するメルカプタンの網羅的 なプロフィールを得ることが可能である。しかしながら、試薬および反応生成物 の光感受性のため使用に際して注意が必要であり、そのためこのアッセイ法は繁 雑である。
さらに、8またはそれ以下のpHでのモノクロロパイマンのゆっくりとした動力 学のため、中性付近のpHでのグルタチオン−S−トランスフェラーゼの生化学 的特異性を活用することが可能である。この試薬は完全な細胞中にゆっくりと浸 透し、該細胞内で該試薬は酵素およびその基質(G S H)と反応し、それゆ えフローサイトメトリーによるアッセイが可能となる(文献13)。モノブロモ トリメチルアンモニオバイマン誘導体(文献14)は、それ自体としては、水に 対す、る高い溶解度という利点を有し、伝導検出を行うことができるが、後者は 標準化するのが困難である。
一般的に、その利点がいかなるものであろうとも、これら方法のほとんどは洗練 されたクロマトグラフィー分離を必要とし、大量の試料の迅速な分析を行うには 時間がかかりすぎる。
これら化合物は、上記試薬に比べて特異性が低(、その感度もどちらかといえば 平均的なものであるかまたはある場合には劣ってさえいる。これら化合物は一般 に光に対して不安定であり、付加生成物と類似した吸光特性のためにクロマトグ ラフィー分離を行う必要がある。
4°マレイミド誘導体: これら化合物の特異性は上記試薬に比べて良(ない。その感度は、付加生成物が 蛍光である場合にのみ良好である。
後者の方法の主要な不都合は、すでに存在する吸収の減少をモニターするので、 新たな吸収の増加をモニターする場合に比べて信頼性に劣り一層細心の注意を要 することである。
5°活性化求電子、二重結合を有する試薬(ミカエル(Michael)アクセ プター):これら試薬としては以下のものが挙げられるニー窒素含有または酸素 化求核化合物とは非常にゆっくりと反応するが硫黄含有求核化合物とは一層迅速 に反応するエノン(文献15);その特異性はチオール基に対して絶対的なもの ではない;その感度は、それ自体としては、考慮する試薬に従って変動する:こ れら試薬は一般に、上記試薬と同じ主要な不都合を有する; −遅い試薬であり、水性媒体にはそれほど可溶性ではなく、一般にメルカプタン のSH基のブロッキング、とりわけグルタチオンのSH基のブロッキングに用い られるが(文献16)、そのアッセイには用いられないビニルピリジン。
最後に、方法の複雑さ、および一般にチオール基に限定されグルタチオンに関し ては存在しない特異性のために日常的なアッセイには適していない2つのタイプ の蛍光試薬について言及する必要がある。これら試薬は、−蛍光イツインドール 誘導体を生成するにはチオール基および第一級アミンの存在を必要とするオルト −フタル酸アルデヒド;および−長い反応時間と9.5のアルカリpHを必要と する、ベンゾキサ−1,3−ジアゾール誘導体、とりわけ7−クロロ−2−ベン ゾキサ−1,3−ジアゾール−4−スルホネート(SBD−CI)および7−フ ルオロ−2−ペンゾキサ−1.3−シフソール−4−スルホネート(SBD−F ) (文献19および20)。
本発明の目的は、 一混在するメルカプタンの存在下でGSHの特異的なアッセイを行うことが可能 であり、迅速である、すなわち媒体中のメルカプタンとの全反応時間が作業条件 下で15分未満である、粗製の試料中、とりわけ生物学的試料中のメルカプタン に特異的な発色試薬ニ ー単一の試料で第一工程で全メルカプタンのアッセイを、第二工程で還元型GS Hのアッセイを可能とし、以下の3つの生理学的パラメータを決定する該試薬の 使用方法: *全メルカプタンの量 *GSHの量 *引き算により、GSHとは異なるメルカプタンの量を提供することにより、一 般にメルカプタン、およびとりわけGSHをアッセイするための公知法の不都合 を克服することにある。
本発明の目的は、とりわけ、大量の試料の日常的なアッセイに適合した還元型G SHの測定ちための簡便で迅速な方法を開発することにあり、該方法は、*その 吸収が最もしばしば可視領域にあり、その吸光度の測定に特別の分光測光計を要 しない発色団の生成: *終点アッセイであって動力学アッセイではな(;*短いインキュベーション時 間:たとえば30分未満;*アッセイ期間の間のチオール基の自動酸化のリスク を排除し得る作業条件を特徴とする。
これら目的は本発明によって達成することができる。本発明は、これら態様の一 つに従って、水性試料、とりわけ生物学的試料中のメルカプタンのアッセイ法で あって、該試料中に存在するすべてのメルカプタンと一般式(■)。
(式中、 Rl =アルキル(炭素数1〜6)、ベンジル、p−ニトロベンジル、フェニル またはo、p−ジニトロフェニル: R−水素またはメチル; R3=水素、F、CI、BrS IまたはSCN;R4=水素、F、Cl5NO z*たはCFs:RS =水素、N0xtたはC1: R6=水素、F、CI、CF3*たはNOz:R7=水素、OH1ベンジルオキ シまたはNo、。
R3、R4、R5およびR6は同時に水素を表さない、Y=フルオライド、クロ ライド、ブロマイド、ヨーダイト、メチルサルフェート、フルオロスルホネート 、ホスフェート、テトラフルオロポレートまたはトシレート)に対応するキパニ ウムタイプの化合物から選ばれる試薬との間での発色団置換生成物の形成から本 質的になることを特徴とする。
上記一般式(I)の化合物は、公知方法により、とりわけ以下のようにして市販 の化合物から調製することができる。
フルオロキノリニウムタイプの誘導体は、対応するジアゾニウム塩(それ自体、 市販の化合物から調製される)に対するンーマン反応により得られる。
一般式(I)の化合物の合成の最終工程のための一般手順は、以下のようにして 行う。
たとえばアセトニトリルなどの有機溶媒(10容量)中に溶解したキノリン誘導 体(1ミリモル)に、100Cにてたとえばメチルヨーダイトなどの純粋な形態 または1容量のアセトニトリル中のトリメチルオキソニウムテトラフルオロポレ ート(2ミリモル)などの有機溶媒中の溶液の形態のアルキル化剤を加える。反 応媒体を30分から2時間撹拌する。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をtert −ブチルメチルエーテル(1容量)中に取り、ついで排出し、洗浄し、真空乾燥 させる。
必要なら、水/アセトニトリル混合物で溶出するシリカカラム(C8,5μm) 上の分取高速液体クロマトグラフィー(HP L C)により生成物を精製する 。最後に凍結乾燥すると、20〜89%の間の非最適収率にて所望の生成物を得 ることが可能となる。
適当なら、アルキル化は、所望の最終生成物に従い、還流下でメチルヨーダイト 中で、または還流下でアセトン中のメチルサルフェートにより、またはたとえば グライムなどの有機溶媒中のメチルフルオロスルホネートにより行う。
一般式(1)において、R1、R3、R6およびR7が前記と同じであり;−R 2=水素; −R4=水素、FSClまたはCF3ニーR5=水素またはCI。
−Y=フルオライド、クロライド、ブロマイド、メチルサルフェート、フルオロ スルホネート、ホスフェート、テトラフルオロポレートまたはトシレート、−R ’=F、Cl5BrまたはIである場合は、R2、R4、R5,R6およびR7 は同時にHを表さない。
−R’=FまたはCIである場合は、R2、R3、R5、R6およびR7は同時 にHを表さないニ ーRs=c lテt)ル場合1;!、R2、R3、R4、R6およびRフは同時 にHを表さないニーR’=FまたはCIである場合は、R2、R3、R4、R5 およびR7は同時にHを表さないニ ーR’=R’=CIである場合は、R2、R4、R5およびR7は同時にHを表 さない;−R’=CIまたはR7=OHである場合は、Yはメチルサルフェート を表さないである化合物は、新規であり、本発明の主題の一つを構成する。
他の態様に従い、本発明は、水性試料、とりわけ生物学的試料中の還元型グルタ チオン(G S H)のアッセイ法であって、本質的に下記工程・1、該試料中 に存在するすべてのメルカプタンと上記一般式(I)の化合物から選ばれる試薬 との間で発色団置換生成物を生成させ:ついで2、GSHと該試薬との間で工程 1において生成した発色団置換生成物から発色団チオンを特異的に生成させるた めに、反応媒体のpHを12.8〜13.8の値とする からなることを特徴とする方法を提供する。
それゆえ、本発明による還元型グルタチオンアッセイの原理は、以下の2つの連 続的な化学工程からなる戦略に基づいているニーまず、以下の反応式に従い、試 料中に存在するすべてのメルカプタン(R3H)(とりわけ、還元型グルタチオ ン(G S H)を含む)と上記試薬(rBXT試薬」と称する)の一つとの間 で置換生成物(以下、「付加物」と称する)を生成させ:R8H+ BXTti C薬 → R8−BXT(発色団1)一ついで、使用したBIT試薬に従って媒 体を12.8〜13.8のpHのアルカリ性にした後、以下の反応式に従い、G SHとBIT試薬とから生成した付加物GS−BXTに特異的な発色団チオンの β−説離反応による生成:この方法は、分光測光手段により、以下を決定するこ とができる:*第一の段階において、試料中に存在する全メルカプタン(RS  H)の量;*第二の段階において、同試料中に存在する還元型グルタチオン(G SH)の量;および *引き算により、還元型グルタチオンとは異なるメルカプタンの量。
それゆえ、この方法は、単一の試料により3つのパラメータを得ることを可能と する。
本発明によるアッセイ法の新規さは、BXT試薬と試料中に存在する全メルカプ タンとの間での発色団付加物の生成の第一工程、およびアルカリ性にした後、付 加物GSH/BIT試薬に特異的な発色団チオンの生成の第二工程からなる戦略 に基づ(点にある。
それゆえ、記載した試薬および方法を使用すれば、二重発色測定により、水性媒 体中の一般にメルカプタンの全量、とりわけGSHの全量を単一の試料で測定す ることが可能となる。この新規な方法の実行の簡便さは、従前に記載された分光 測光法に比べて非常に優れている。本明細書に記載したGSHの発色アッセイ法 は、酵素試薬の不在下で完全に特異的なものとしては最初のものである。
それゆえ、この新規なアッセイ法は、アッセイまたは診断キットの製造のため、 一般に生物学的研究のため、とりわけ臨床化学のための新規手段を構成し、適用 面が挙げられる。
試料としては、とりわけ、赤血球、血漿、血小板、および一般にメルカプタンと りわけGSHを含有するあらゆる試料、とりわけ生物学的試料が挙げられる。
有利な態様に従い、本発明の主題は、水性試料、とりわけ生物学的試料中の全メ ルカプタンのアッセイ法であって、本質的に以下の工程:1、pH7,0〜7, 5の範囲に緩衝したアッセイすべき試料に、水または水に相溶性の溶媒中の一般 式(1)のBIT試薬のストック溶液のアリコートを過剰量で加え、 2、かくして得られた反応媒体を均質にし、3、少なくとも5分間インキュベー トし、4、BXT試薬と試料中に存在するメルカプタンとの間で生成した置換生 成物すなわち付加物の吸光度を分光測光計により測定し、ついで5、以下の式・ [全メルカプタン] = (A/εmXd)XD(式中 −Aは測定した吸光度を表す、 一εmは使用したBXT試薬に特異的なモル吸光係数を表す(19モル−’、c m−’で表す)、 −dはキュベツトの長さを表す(cmで表す)、および−りは希釈の係数を表す ) に従い、試料中に存在する全メルカプタンの濃度をモル/リットルにて決定する からなることを特徴とする方法である。
他の有利な態様に従い、本発明の主題は、水性媒体、とりわけ生物学的試料中の 還元型グルタチオン(GSH)のアッセイ法であって、本質的に以下の工程・1 、pH7,0〜7.5の範囲に緩衝したアッセイすべき試料に、水または水に相 溶性の溶媒中の一般式(1)のBIT試薬のストック溶液のアリコートを過剰量 で加え、 2、かくして得られた反応媒体を均質にし、3、少な(とも5分間インキュベー トし、4、選択したBXT試薬に従い、12.8〜13.8の範囲の値に混合物 のpHを調節し、 5、少な(とも15分間インキュベートし、6、とりわけ付加物GSH−BXT 試薬がらβ−説離により生成した発色団チオンの吸光度を分光測光計により測定 し、7、以下の式。
[GSH] = (A’/εm x d) X D(式中。
−A’は測定した吸光度を表す、 一εmは使用したBIT試薬に特異的なモル吸光係数を表す(11モル−’、c m−’で表す)、 −dはキュベツトの長さを表す(cmで表す)、および−Dは希釈の係数を表す ) に従い、試料中に存在するGSHの濃度をモル/リットルにて決定するからなる ことを特徴とする方法である。
本発明のさらに有利な態様に従い、試料中に存在する還元型グルタチオンとは異 なるメルカプタンの濃度を、上記2つの方法に従って測定した濃度を引き算する ことにより、すなわち、以下の式: [GSHとは異なるメルカプタン]=[全メルカプタン] −[GSH]を用い て測定する。
それゆえ、一般式(1)の新規試薬による水性試料、とりわけ生物学的試料中の 全メルカプタン、還元型グルタチオンおよびG S H以外のメルカプタンのア ッセイ法は、この新規方法を構成する2つの反応でそれぞれ生成される新規発色 団1および2の生成の分光測光測定に基づいている。
これら決定を行うのに使用可能な一般法を、以下にさらに詳細に説明する。
全メルカプタンのアッセイ 反応媒体は、]、mMジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)を含有する 、たとえば50mMリン酸緩衝液などのpH7,0〜7.5の緩衝液からなる。
考慮する緩衝液の性質に従い、室温で水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加するこ とによりpHを所望の値に調節することができる。選択した作業温度(たとえば 25℃)は、インキュベーションおよび測定期間の間、一定(±3°C)に保持 しなければならない。緩衝液および試薬溶液の調製および保存は0〜4℃で行わ なければならない。これら条件下でこれら溶液は3力月間安定である。BXT試 薬の濃度/メルカプタンの推定濃度の比は、短い反応時間を確保するため、10 またはそれ以上でなければならず、一般に1000を越えない。
反応の開始は、水または水相溶性の有機溶媒(たとえばエタノール、アセトニト リル、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドなど)中のBIT試薬 のストック溶液のアリコートを、たとえばアッセイすべき試料を入れた分光測光 計のキュベツトに添加することにより行う。最終容量(たとえば1m1)は、測 定ごとに変えてはならない。
溶液を均質にし選択した作業温度にて5〜10分間インキュベートした後、付加 物の波長にて吸光度を測定する:たとえば、本発明による化合物BXTO301 5(以下の実験項目の実施例1に記載)とGSHとの間の付加物の場合は356 nmにて。
下記表Iには、−例として、試薬BXTO3015と多くの生理学的メルカプタ ンとで得られ生化学または臨床化学に用いることの可能な分光測光データを示す 。
表■ アルカリ化の前後における試薬BXTO3015と幾つかのメルカプタンとの間 の反応により得られた発色団に関するスペクトルデータアルカリ化前 アルカリ 化浚 1)レヵプタン BITO3015の付加物廊献(膓)、 −社(−1゜ oafl、mol*”、c+m’J oalL+11ol@”、em”)or、 −ヘニン5 ミ7 xs4.tgooa 付加物+358.15000H−7セ チル−1−>294> 358,15000 氷解物+32L1050Gメルカ 7’)Xりy*−ト362.150QO水解物1329.10800シスナイ、  352.111500 付加物+ 356,1840Ohモノスfイン352 .工5000 付加物+ 356.140OO2−メル力ブトヒリノン34S、 1450o 水解物+327.L3000ノエチルノチオヵルJ4fi + ト 2フ9,1ユooo 水解物+329,10400カフ) フ+) ル359, 14000 水解物132!、10300+1−β−D−り)Lt:2−2 3 41.14000 水解物+329.10フ00ノステイングリノ7 350, 1gooo 付加物+ 3!5.13000) x ノfイA A 359,1 6000 氷解物+ 329.11000つ/血消アルブミ7 (2345,1 25QO(會@1(*)付加物の0.5当量のみが生成(文献21参照)(** )吸収スペクトルはアルカリ化前に得られたものと類似。
全メルカプタンの定量は、上記のようにして行う。
アッセイの感度は、ある種の生理学的に重要なメルカプタンに対する検量系列か ら決定した。アッセイの感度は、たとえばGSHの場合、添付の図1を調べると 明らかなように、試薬BXTO3015を用いて0.017AU、 1.μモル ー1に等しい。
図1は、メルカプタンのマイクロ濃度の関数としての、それぞれ試薬BXTO3 015とGSH,N−アセチルシスティン、システィンおよびシステイニルグリ シンとの間で生成した付加物の356nmにおける吸光度の変動を示す。
吸光度はこの濃度の関数として直線状に変化すること、およびGSHについては アッセイの感度が0.017AU、1.μモルー1に等しいことが観察できる。
還元型グルタチオンのアッセイ: 上記全メルカプタンのアッセイに使用したのと同じ反応混合物を還元型グルタチ オンのアッセイにも使用する。この混合物に、たとえば水酸化ナトリウムの30 に溶液などの濃いアルカリ性溶液を選択した作業温度、たとえば25℃で添加す ることによりpH値を13.5に調節する。これら同じ条件下で15〜20分間 インキュベートした後、GSHとBXT試薬との間の付加物のβ−説離による単 一生成物の吸光度を、考慮するBXT試薬について定めた波長、たとえば試薬B XT03015については400nmで測定する。下記表■は、本発明の幾つか の試薬およびGSHで得られた分光測光データを示す。
表■ アルカリ化の前後における、GSHと幾つかのBIT試薬(vR創製法下記実験 項目に記載)との間の反応により得られた発色団についてのスペクトルデータア ルカリ化前 アルカリ化後 B酊 試薬 付加物 チオン No、 kIx(+ml kIx(nml kMx(nm+amf1.111o l”、c+a−C+all+aol”、am”l gmfl、シー”、c+n内 11X’T 03015 315 356 400(実施例1 ) 18000  uooo 14700BX? Q3QL6 32L コ39 、3111(実 施例2 )、 12000 15000 zgoo。
!IrT 03034 319 346 38!1(実施例3) 9000 x sooo 1aoo。
BXT 03065 326 343 393(実施例5 ) 9000 17 000 2000011ff 030g9 312 414 520(gill l19 ) 5400 gdoo 2500アツセイの感度はGSH濃度の標準 範囲から決定され、添付の図3に示すように、たとえば試薬BXTO3015i :つぃrは0.010AU、1.μ%ルー’に等しい。
図2は、アルカリ化前における、GSHと試薬BXTO3015との間で生成し た付加物の356nmにおける吸光度または光学密度(0,D、 )の変動をG SHの濃度(マイクロモル)の関数として示す。
吸光度はGSH濃度の関数として直線状に変化することが観察される。この図は また、アッセイの感度をも示している。
図3は、アルカリ化後における、付加物GSH/BXTO3015試薬がら生成 するチオンの400nmにおける吸光度または光学密度(0,D、)の変動をG SHI!度の関数として示す。
吸光度はGSH濃度の関数として直線状に変化することが観察される。この図ハ マタ、アッセイの感度をも示している。
本発明の主題はまた、試薬として本質的に一般式(I)で示される化合物を含む ことを特徴とする、上記本発明の方法を実行するためのセットまたはキットであ る。
本発明を以下の実験項目に示す実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明は これらに限られるものではない。
撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、2.15 ミリモルの4−クロロ−7−トリフルオロメチルキノリン(アルドリッチ)を撹 拌しなからアセトニトリル(5ml)中に溶解する。10℃にてアセトニトリル (4ml)中のトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(ランカスター )(4,30ミリモル)の溶液を1o分間かけて加える。撹拌を1時間続広溶媒 を真空下で蒸発させる。得られた粗製の残渣をtert−ブチルメチルエーテル (50ml)中に取り、排水し、2時間真空乾燥させる。
粗製の生成物を、アセトニトリル−水混合物(20/80)で溶出するカラム( C,,5um、L=250mm、ID=10.5mm)上の分取HPLCにより 精製する。凍結乾燥後、所望の生成物(1,7ミリモル)を得る。
収率ニア7% 物理特性: *’HNMR(200MH2,CD3COCD3):CH3−N”+5.OOp pm (s、3H);Ha:8.45ppm (dd、LH1J=1.9〜9. 5Hz);H3:8.60ppm (d、IHSJ=7.14Hz);Hs:  8.95ppm (d、LH,J=9.50Hz):Hs: 9.10ppm  (s。
LH):Hz:9.701)pm (d、LH,J=7.14Hz)*MS・( FAB、グリセロール−NOBA)陽イオン:M”:246陰イオン:M−:8 7 FAB=高速原子衝撃 N0BA=メタ−ニトロベンジルアルコール*元素分析値。
計算値(%): C=39.6 :H=2.4 ;N=4.2 、CI=10. 6実測値(%)・C=39.4 :H=2.2 ;N=4.O;CI=10.2 撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、2.0ミ リモルの4−クロロ−2−メチルキノリン(アルドリッチ)を撹拌しなからアセ トニトリル(5ml)中に溶解する。10℃にてアセトニトリル(4ml)中の トリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(ランカスター)(4,0ミリ モル)の溶液を10分間かけて加える。撹拌を1時間続け、溶媒を真空下で蒸発 させる。得られた粗製の残渣をtert−ブチルメチルエーテル(50ml)中 に取り、排水し、2時間真空乾燥させる。
粗製の生成物を、アセトニトリル−水混合物(20/80)で溶出するカラム( Ca、5μm、L=250mm、ID=10.5mm)上の分取HPLCにより 精製する。凍結乾燥後、所望の生成物(0,8ミリモノりを得る。
収率・38% 物理特性: *’HNMR(200MH2SCD3COCD3):CH3: 3.2ppm  (s、3H):CH3−N”:4.70ppm (s、3H);Hy:8.10 +)I)m (dd、IH,J=8〜6.5Hz);Hs: 8.30ppm( dd、LH,J−8〜6.5Hz);H3: 8.40ppm (s、IH): Ha:8.60ppm (d、IH,J=8Hz):Hs:8.70ppm ( d、IH,J=8Hz) *MS : (FAB、 グ’)セロ−ルーN0BA) 陽イオン:M”: 1 92陰イオン:M−・87 *元素分析値: 計算値(%)20士47.2 ;H=3.9 :N=5.O;C1=12.7実 測値(%):C=47.3;H=3.9:N=4.9;CI=13.0撹拌装置 および温度計を備えた100m1容丸底フラスコ中、窒素流下、3、17 ミリ モルの4−クロロキノリン(アルドリッチ)を撹拌しなからアセトニトリル(1 0ml)中に溶解する。室温にてアセトニトリル(4ml)中のトリメチルオキ ソニウムテトラフルオロボレート(ランカスター)(6,30ミリモル)の溶液 を10分間かけて加える。撹拌を30分間続け、溶媒を真空下で蒸発させる。
得られた粗製の残渣を2−プロパツール(10ml)中に取り、10分間撹拌す る。
得られた沈殿を濾過し、tert−ブチルメチルエーテル(50ml)で洗浄し 、排水し、2時間真空乾燥させる。
tert−ブチルメチルエーテル/2−プロパツール混合物(1/1)から再結 晶させた後、所望の生成物(1,5ミリモル)を得る。収率:84%物理特性。
*’HNMR(200MHz 1CD3COCDs):CH3N’: 4.45 ppm (s、3H): H3: 8.20ppm (d、LH,J=7.5H z):HsおよびHt:8.40ppm (m、2H);HaおよびHa:8. 70ppm (dd、2H,J=8〜1.8Hz): Hz: 9.5ppm  (d、IH。
J=7.5Hz) *MS: (FAB、グリセロール−NOBA)陽イオン+M”:178陰イオ ン:M−:87 撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、2.0ミ リモルの7−クロロ−2−メチルキノリン(アルドリッチ)を撹拌しなからアセ トニトリル(5ml)中に溶解する。10℃にてアセトニトリル(4ml)中の トリメチルオキソニウムテトラフルオロポレート(ランカスター)(2,60ミ リモル)の溶液を10分間かけて加える。撹拌を1時間30分続け、溶媒を空下 で蒸発させる。得られた粗製の残渣をtert−ブチルメチルエーテル(5ml )中に取り、排水し、2時間真空乾燥させる。
tert−ブチルメチルエーテル/2−プロパツール混合物(1/1)から再結 晶させた後、所望の生成物(1,5ミリモル)を得る。収率ニア6%物理特性。
*’HNMR(200MH2,CD3COCD3):CH3: 3.20ppm  (s、3H);CH3−N′″:4.65ppm (s、3H);Ha: 8 .OOppm (dd、IH,J=8.8〜1.6Hz):H3: 8.12+ )l)m(d、LH,J=8Hz);Hs:8.45ppm (d、IHSJ= 8.8Hz):Ha: 8.72ppm (d、LH,J 1.8Hz):H4 :9.12+)l)m (d、LH,J=8Hz) *MS: (FAB、グリセロール−NOBA)陽イオン:M”:192陰イオ ン:M−:87 *元素分析値: 計算1m(%):C=47.2:Hz3.9;Hz5.O;C1=12.7実測 値(%):C=47.0:Hz3.8;Hz5.1:C1=12.5撹拌装置お よび温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、2.0ミリモルの4 .7−ジクロロキノリン(アルドリッチ)を撹拌しなからアセトニトリル(5m l)中に溶解する。10℃にてアセトニトリル(4ml)中のトリメチルオキソ ニウムテトラフルオロポレート(ランカスター)(2,60ミリモル)の溶液を 10分間かけて加える。撹拌を1時間続け、溶媒を真空下で蒸発させる。
得られた粗製の残渣をtert−ブチルメチルエーテル(50ml)中に取り、 排水し、2時間真空乾燥させる。
tert−ブチルメチルエーテル/2−プロパツール混合物(1/1)から再結 晶させた後、所望の生成物(1,4ミリモル)を得る。収率270%物理特性: *’HNMR(200MHz、D20):CHs−N” : 7ppm (s、  3H) : Hs : 10.49p pm (dd、 IH。
J=9〜2.2Hz):Hs: 10.58ppm(d、IH,J=6.7Hz );Ha : 10.94ppm (d、 IH,J=2.1Hz) : Hs  : 11.2ppm (d。
IH,J=9Hz);H2: 11.56ppm (d、IH,J=6.5Hz )*MS : (FAB、 グリセロールーN0BA)陽イオ:/:M”:21 2陰イオン:M−:87 *元素分析値: 計算値(%) : C=40.0 ;Hz2.6 :Hz4.6 ; C1=2 3.6実測値(%): C=41.1 ;Hz2.4 ;Hz4.8 ;C1= 23.6撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、 2.0らアセトニトリル(5ml)中に溶解する。10℃にてアセトニトリル( 4ml)中のトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(ランカスター) (2,40ミリモル)の溶液を10分間かけて加える。撹拌を30分間続け、溶 媒を真空下で蒸発させる。得られた粗製の残渣をtert−ブチルメチルエーテ ル(50ml)中に取り、排水し、2時間真空乾燥させる。
tert−ブチルメチルエーテル/2−プロパツール混合物(1/1)から再結 晶させた後、所望の生成物(1,4ミリモル)を得る。収率ニア0%物理特性 *’HNMR(200MHzSCD3COCD3):CHs−N”:5.O5p pm (s、3H);H7: 7゜65ppm (d、LH。
J=8.6Hz);Ha+7.95ppm (d、IH,J=8.6Hz);H 3:8.20ppm (dd、IH,J=5.7〜2.3Hz):H4:9.3 5ppm(d、LH,J=5.7Hz):Hz: 9.40ppm (d、IH ,J=2.3Hz)*MS : (FAB、グリセロール−NOBA)陽イオン :M”:194陰イオン:M−:87 実施例7:5−クロロ−8−ベンジルオキシ−1−メチルキノリニウムテトラフ ルオロボレート(BXTO3063) 5−クロロ−8−ベンジルオキシキノリン。
撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、10.0ミリモルの 5−クロロ−8−ヒドロキシキノリン(アルドリッチ)を撹拌しながら乾燥D〜 iF (20ml)中に溶解する。ついで、炭酸カリウム(11ミリモル)およ びヨウ化カリウム(10重量%)を加える。DMF (5ml)中のベンジルク ロライド(ジャンセン)(119モル)の溶液を室温で撹拌しながら5分間かけ て滴下する。50°Cで18時間反応させた後、水(100ml)を添加した反 応混合物をtert−ブチルメチルエーテル(4X50ml)で抽出する。有機 相をコンバインし、ついでIN HCI (3X50ml)で洗浄する。水性相 をコンバインし、pH=9のアルカリ性にし、酢酸エチル(2x50ml)で抽 出する。有機相をMg5O,で乾燥させた後、減圧下で溶媒を蒸発させる。エタ ノールから再結晶させた後に所望の生成物を得る。
収率ニア9.5% 物理特性: *’HNMR(200MHz、CD5COCDs):CHzo: 5.35pp m (s、2H); 7.22〜7.45ppm (m、4H);7.55〜7 .70ppm (m、4H);H4:8.53ppm (d、IH,J=5.2 Hz):H2: 8.95ppm (d、IHSJ=2.1Hz)5−クロロ− 8−ベンジルオキシキノリニウムテトラフルオロポレート(BXT03063) : 撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、10.0 ミリモルの5−クロロ−8−ベンジルオキシキノリンを撹拌しながらアセトニト リル(5ml)中に溶解する。10℃にてアセトニトリル(4ml)中のトリメ チルオキソニウムテトラフルオロボレート(ランカスター)(23,0ミリモル )の溶液を10分間かけて加える。撹拌を1時間続け、溶媒を真空下で蒸発させ る。
得られた粗製の残渣をtert−ブチルメチルエーテル(50ml)中に取り、 排水し、2時間真空乾燥させる。
粗製の生成物を、アセトニトリル−水混合物(20/80)で溶出するカラム( C,,5um、L=250mm、ID=10.5mm)上の分取HPLCにより 精製する。凍結乾燥後、所望の生成物(2ミリモル)を得る。
収率:21% 物理特性。
*’HNMR(200MH2,CD3COCD3):CH3−N”:5.OOp pm (s、3H):CHzO:5.551)I)m(S−2H);H,、H4 およびH6:7.45+)I)m (m、3H)、;HlおよびH,ニア、75 ppm (m、2H):Ht: 7.95ppm (d11HSJ=10Hz) ;Ha:8.15ppm(d、IHSJ=10Hz);Hs:8.351:)t )m(t、IHlJ”11.2Hz);82およびH4: 9.5ppm (d 、2H,J=11.4Hz)*MS: (FAB、グリセロール−NOBA)陽 イオン:M”:284陰イオン:M−:87 5−フルオロキノリン: 撹拌装置および温度計を備えた100m1容の3つ首丸底フラスコ中、13.7 ミリモルの5−アミノキノリン(アルドリッチ)を室温にてエタノール(20m l)中に溶解する。34%テトラフルオロ硼酸溶液を5分間かけて加える。反応 混合物を一5℃に冷却し、この温度でイソアミルナイトレート(ジャンセン)( 36,0ミリモル)を10分間かけて加える。添加終了時、反応媒体を撹拌しな から0℃で1時間保持する。得られた懸濁液を濾過し、固体を無水エタノール( 3X20ml)および酢酸エチル(3X20ml)で洗浄し、ついで真空下で1 8時間乾燥させる。か(して85.7%の収率で得られたジアゾニウム塩をつぎ の工程にそのまま用いる。
撹拌装置、温度計および還流冷却器(return condenser) ( それ自体、オイルバブラーを備えている)を備えた250m1容の3つ首丸底フ ラスコ中、上記で得たジアゾニウム塩を無水へブタン(100ml)中に懸濁し 、撹拌しながら3時間加熱還流した。この反応混合物を冷却し、IN水酸化ナト リウム溶液(100ml)を加える。有機相をデカントし、この同じ水酸化ナト リウム溶液(2X100ml)で洗浄し、ついでNaC1飽和水(2X100m l)で洗浄し、MgSO4で乾燥させる。溶媒をロータリーエバポレーターで真 空蒸発させる。
所望の生成物をゲデュラン8シリカ[メルク、40〜63μm(230〜400 メッシュ)コ上のクロマトグラフィー(溶出液CH2Cl 2)により精製する 。収率、35% 物理特性: *’HNMR(200MH2,CDCl2):Hsニア、26〜7.40ppm  (ddd、IH,J=1〜6.8〜9.7Hz);H3: 7.54−7.6 4ppm (dd、1.HSJ=4.8〜10Hz);H7:7.67〜7.7 9ppm (ddd、IH,J=4〜6.8〜8Hz);Haニア、88ppm  (dd、IH,J=1〜8Hz);H4:8.45+)I)m (dd。
IHSJ=2〜10Hz): H2: 8.95 pI)m (dd、IH,J =2〜4.8Hz) *MS: (EI、70eV)M’: 147 (100); 120 (21 ); 99(10): 74 (14) EI=電子衝撃 5−フルオロ−1−メチルキノリニウムテトラフルオロボレート(BXT030 68): 撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、10.0 ミリモルの5−フルオロキノリンを撹拌しながらアセトニトリル(5ml)中に 溶解する。10°Cにてアセトニトリル(4ml)中のトリメチルオキソニウム テトラフルオロポレート(ランカスター)(23,0ミリモル)の溶液を10分 間かけて加える。撹拌を1時間続け、溶媒を真空下で蒸発させる。得られた粗製 の残渣をtert−ブチルメチルエーテル(50m l )中に取り、排水し、 2時間真空乾燥させる。
tert−ブチルメチルエーテル/2−プロパツール混合物(1,/1)から再 結晶させた後、所望の生成物を得る。収率:50%物理特性: *’HNMR(200MH2,CD3COCD3):CHa N”:4.90p pm (s、3H);H3ニア、85pl)m (dd、IHlJ”9.5〜1 2Hz):HsおよびH7: 8.25〜8.40ppm (m、2H);Hs : 8.48ppm (d、IH,J=12.3Hz);H4: 9.45pp m (d。
IHSJ=12Hz);H2:9.65ppm (d、IH,J=9.5Hz) *MS : (El、70eV)M”+ 162 (80); 147 (10 0): 120(48); 99 (21): 74 (20)5−フルオロ− 8−ニトロキノリン: 撹拌装置および温度計を備えた100m1容の3つ首丸底フラスコ中、5−フル オロキノリン(20,0ミリモル)の溶液を濃硫酸(10ml ;d=1.84 )中に導入する。温度を0℃に保持しながら、発煙硝酸(5ml)を撹拌しなが ら加える。反応混合物を20°Cにて10分間保持し、ついで氷(100g)上 にゆっくりと注ぐ。濃水酸化ナトリウムをゆっくりと添加することにより、反応 混合物のpHを8とする。か(して得られた沈殿を酢酸エチル(100ml)で 抽出する。有機相を水(2X50ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥させる。溶 媒を減圧下で蒸発させる。
所望の生成物をゲデュラン8ンリカ上のクロマトグラフィー(溶出液CH2Cl 、)により精製する。収率、67% 物理特性。
*’HNMR(200MH2,CDCl2):H6: 7.27ppm (dd 、IHSJ=8.58〜8.64Hz):Hs: 7.62ppm(dd、LH ,J=8.60〜4.20Hz):Ht:8.1101)I) (dd。
IH1J=8.56〜5.22Hz);H4: 8.48pI)m (dd、I H,J=2.5〜8.6Hz)+H2:9.12ppm (dd、IH,J=2 .5〜4.2Hz)*MS:(EI、70eV)M”: 192 (100)  、176 (16) 、162(47)、146 (33)、134 (98)  、126 (43) 、119 (21)、107 (36)、99 (44 ) 5−フルオロ−8−二トロー1−メチルキノリニウムフルオロスルホネート(B XTO3069): 撹拌装置および温度計を備えた100m1容の3つ首丸底フラスコ中、窒素流下 、2.5ミリモルの5−フルオロ−8〜ニトロキノリンを撹拌しながら乾燥グラ イム(10ml)中に溶解する。室温にてメチルフルオロスルホネート(1ml )(IOミリモル:アルファ・ペントロン)を3分間かけて加える。反応混合物 を60℃で1時間撹拌する。室温に戻した後、得られた沈殿を排水し、tert −ブチルメチルエーテル(3xlOml)で洗浄し、ついで真空乾燥させる。
所望の生成物を46%の収率で得る。
物理特性: *宜HNMR(200MHz S CD5COCDs) :CH3N”:4.7 0ppm (S、3H) ;Hs:8.10ppm(dd、IH。
d=8.46〜8.56Hz);Hs: 8.58ppm (dd、IHSJ= 8.72〜5.86Hz):H7: 8.90+)pm (dd、IHSJ=8 .72〜5.28Hz);H4:9.66ppm (d、IH,d=8.8Hz );H2:9.88ppm(a、IH,J=5.86Hz) *MS (FAB、グリセロール−NOBA)陽イオン:M”:207陰イオン 二M−二404 (2M−/LMつ 撹拌装置および温度計を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、5.74 ミリモルの5−ニトロキノリン(アルドリッチ)を撹拌しなからアセトニトリル (10ml)中に溶解する。25℃にてアセトニトリル(4ml)中のトリメチ ルオキソニウムテトラフルオロポレート(ランカスター’) (6,4ミリモル )の溶液を10分間かけて加える。撹拌を172時間続け、溶媒を真空下で蒸発 させる。得られた粗製の残渣をtert−ブチルメチルエーテル/2−プロパツ ール混合物(1/1)中に取り、排水し、2時間真空乾燥させる。
tert−ブチルメチルエーテル/2−プロパツール混合物(1/1)から所望 の生成物を再結晶させる。
収率:89% 物理特性: *’HNMR(200MHzSD20):CH3N’: 4.70ppm (s 、3H):Hs: 8.20ppm (dd、IH1J=9.6〜5.6Hz) :Ht: 8.33ppm (t、IH,J=8.6Hz);H6およびHs: 8.74ppm(t、2H,J=8.6Hz):H4:9.37+)I)m(d 、LH,J−5,6Hz);H2: 9.64pl)m (d、LH,J=9. 6Hz)*MS・ (FAB、グリセロール−NOBA)陽イオン=M′″、1 89陰イオン+M−:87 ロークロロ−7−トリフルオロメチルキノリンおよび6−クロロ−5−トリフル オロメチルキノリン: 撹拌装置および温度計を備えた100m1容の3つ首丸底フラスコ中、20ミリ モルの5−アミノ−2−クロロ−1−トリフルオロメチルベンゼン(アルドリッ チ)および14ミリモルの酸化ヒ素(アルドリッチ)を無水グリセロール(ジグ ?)(80ml)中に導入する。濃硫酸(d=1.84)(2,15m1)を室 温にて滴下する。温度を徐々に110°Cにもっていきながら、反応混合物を真 空下(2666パスカル(20mmHg))に置(。この温度で撹拌を4時間続 ける。ついで、反応混合物を大気圧に戻し、濃硫酸(d=1.84 ; 1m1 )の2回目の添加を行う。真空下[2666パスカル(20mmHg)コ、12 0℃を決して越えない温度で4時間、激しく撹拌しながら水の除去を再開する。
反応媒体が100℃の温度に戻った後、水(50ml)をゆっくりと加える。得 られた溶液(室温に戻り、pHは濃水酸化アンモニウム溶液(d=o、89;5 m1:プロラブ)の添加により塩基性にしである)を酢酸エチル(2X100m l)で抽出する。有機相をコンバインし、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ついで 溶媒を真空蒸発させる。得られた固体残渣を、最後に溶出液混合物:メチレンク ロライド/ペンタン(4/1)によるゲデュラン8ンリカカラム[メルク:40 〜63μm(200〜400メツシユ)]上のクロマトグラフィーにかける。
6−クロロ−7−トリフルオロメチルキノリン 収率=24%物理特性。
*融点=137〜139°C *’HNMR(200MHz、CDCl5)H3+ 7.53ppm (dd、 IH,J=4.18〜8.40H2);H5: 7.96ppm (s、LH) ;H4:8.12+)pm (d、IH,J=7.40Hz):Hs:8.48 ppm (s、IH);Hz:8.99ppm (dd、IH%J=1.38〜 2.78Hz) *MS: (EI、70eV):233 (30);231 (100);21 2(10);196 (20) 6−クロロ−5−トリフルオロメチルキノリン:収率=8%物理特性: *’HNMR(200MHzSCDC+ 3) :H3: 7.40ppm ( dd、IH1J=4.20〜8.96Hz);H?: 7.58pI)m (d 、LH,J=9.16Hz);Hs:8.O3ppm (d、IHSJ=8.9 4Hz):H<: 8.45ppm (d11HSJ=9.0OHz);Hz: 8.85ppm (d、IH,J=2.94Hz)*MS= (EI、70eV ):233 (30):231 (100);212(10);196 (20 );179 (15)6−クロロ−5−トリフルオロメチル−1−メチルキノリ ニウムフルオロスルホネート(BXTO3071): 撹拌装置を備えた50m1容丸底フラスコ中、窒素流下、0.6ミリモルの6− クロロ−5−トリフルオロメチルキノリンをエチレングリコールジメチルエーテ ル(5ml)中に導入し、ついでメチルフルオロスルホネート(アルファ)(0 ,2ml、2.4ミリモル)を撹拌しながら滴下する。50℃で1時間加熱しつ いで室温に戻した後、得られた溶液にエチルエーテル(10ml)を加える。
生成した沈殿を濾過し、エチルエーテル(2X5ml)で洗浄し、ついで真空オ ーブン中、40°Cで無水リン酸を用いて乾燥させる。
所望の生成物(白色粉末)を72%の収率で単離する。
物理特性: *融点=149〜151°C *’HNMR(200MHz)CD3SOCD3):CH,−N”: t4.7 0ppm (s、3H);Hs:8.35ppm(dd、IH1J=5.78〜 9.12Hz); H7: 8.51ppm (d、LH,J=9.8Hz); H,: 8.86ppm (d、IH,J=9.9Hz):H4: 9.38p pm (d、1)1.J=9.06Hz):H2:9.64ppm (d、LH ,J=5.48Hz)*〜iS: (FAB、グリセロール−NOBA)陽イオ ン:M”:345陰イオン+M−:99 6−クロロ−7−トリフルオロメチル−1−メチルキノリニウムフルオロスルホ ネート(BXTO3072): 6−クロロ−5−トリフルオロメチルキノリンの代わりに6−クロロ−7−トリ フルオロメチルキノリンを用いる他は、この化合物の調製に用いる手順は上記化 合物のものと同じである。所望の生成物を80%の収率で得る。
物理特性 *融点=187〜189°C *’HNMR(200MH2)CD3SOCD3):CH3−N”: 4.78 ppm (S、3H);H3: 8,38ppm (ddllH。
J=6.OO〜9.3Hz);Hs:8.90pT)m(d、IH);Hs:8 .98ppm(s、LH):H4:9.25ppm (d、IHSJ=7.5H z);H2:9.64ppm(d、LH,J=7.0Hz)*MS:(FAB、 グリセロール−NOBA)陽イオン二M”:345陰イオン:M−:99 ■ 応用例 以下に記載する手順は、試薬BXTO3015による赤血球溶解液中の非タンパ ク質メルカプタンおよび還元型グルタチオンのアッセイへの本発明の方法の応用 例である。
試薬ボックスの例を以下に記載する。この本発明による試薬ボックスまたはキ・ ソトは0〜4℃の温度で貯蔵しなければならない。
試薬の記載。
T: 1mM DTPAを含有する50mMリン酸緩衝液(pH=7.3)(使 用前に空気中および25°Cで放置して平衡化させる)815%メタリン酸溶液 (試料の調製のため0〜4℃に保持しなければならない)S2 : 30%水酸 化ナトリウム溶液(空気中および25℃で放置して平衡化させる)R1・固体形 状のBIT試薬 (T緩衝液中で使用する直前に10−2Mストック溶液を調製する)E、固体形 状のGSH 試料の調製ニ ー2mlの全血を4℃、3000rpmにて10分間遠心分離する;−上澄み液 を除く。
一赤血球のペレットを、0〜4℃に冷却した4倍量の81溶液中に取る;−この 懸濁液を混合するニ ー4℃、3000rpmにて10分間遠心分離する。
か(して得られた赤血球溶解液に対応する上澄み液(タンパク質を沈殿させてあ り、115に希釈しである)がアッセイすべき試料を構成するであろう(測定の ためには0〜4℃で保持しなければならない)。
測定キュベツトにサーモスタットを付した分光測光計中、25℃で測定を行う。
以下の手順に従い、1mlキュベツトに対して各アッセイに対応する反応混合物 を使用の直前に調製するニ ー以下のものを混合する: アッセイすべき試料(1100μl)およびT溶液(800μl)。
−この混合物を25℃で1分間インキュベートする;−T緩衝液中の10−2M RIストック溶液(100μl)を加えることにより反応を開始させる;ついで −この混合物を25°Cで5万間インキュベートする〇吸光度(A)の測定は、 1cmの光路長を有するキュベツト中、空気に対し、R1が化合物BXTO30 15の場合は356nmにて行う。
試薬ボックス中に存在するGSH(E)は、必要なら検量曲線を定めるのに用い ることができる。
結果の記載: このアッセイの条件下、全メルカプタンの濃度を式:%式% (式中、Aは測定した吸光度である) に従って決定する。
注:ここで用いるモル吸光係数(162001,モル−’cm−’)は、試薬B XT03015と上記表■に記載した重要な生理学的に重要なメルカプタンとの 間に生成した付加物について得られた356nmにおけるモル吸光係数の平均で ある。
これら条件下において相対誤差は±9%に等しい。
この場合、試料中の全メルカプタンの濃度の測定値(モル/1で表される)が得 られる。
測定キュベツトにサーモスタットを付した分光測光計中、25℃で測定を行う。
以下の手順に従い、1mlキュベツトに対して各アッセイに対応する反応混合物 を使用の直前に調製する 一全メルカブタンをアッセイするための溶液に溶液52(50μm)を加える; ついで −この混合物を25℃で15分間インキュベートする。
吸光度の測定は、1cmの光路長を有するキュベツト中、空気に対し、R1が化 合物BXTO3015の場合は400 nml:テ行う。
結果の記載: このアッセイの条件下、G S Hの1度を式:%式% (式中、八゛は測定した吸光度である)に従って決定する。
この場合、還元型グルタチオン(G S H)の濃度の測定値(モル/lで表さ れる)が得られる。
5%メタリン酸(溶液SL)中のGSH(試薬E ; 10−2モル/1)の溶 液は必要なら使用の直前に調製することができ、検量曲線を定めるのに用いるこ とができる。
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227.203〜209 21− イ/ウニ(INOUE M、) 、”j−イト−(SAITOY、)  、ヒ−y9(HIRATA E、) 、モIJ/ (MORINOY、) 、ナ 7’/セ(NAGASES、)、(1987) J、 Prot、 Cheap 、、旦、207〜225F’1g−1 (LL’LI 9gE)iont F i g−2 (’G’O) 表¥積 1g−3 (°○’G)Eγ萄 D−I□ll〜 PCT/FR92101184フロントページの続き (72)発明者 ショーディエール、ジャン・レイモンフランス国エフー941 00サン・モール・デ・フォス、アブニュー・ガブリエル・ペリ49番テール

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.−水性試料、とりわけ生物学的試料中のメルカブタンのアッセイ法であって 、該試料中に存在するすべてのメルカプクンと一般式(I):▲数式、化学式、 表等があります▼(I)(式中、 R1=アルキル(炭素数1〜6)、ベンジル、p−ニトロベンジル、フェニルま たはo、p−ジニトロフェニル; R2=水素またはメチル; R3=水素、F、C1、Br、IまたはSCN;R4=水素、F、C1、NO2 またはCF3;R5=水素、NO2またはC1; R6=水素、F、C1、CF3またはNO2;R7=水素、OH、ベンジルオキ シまたはNO2;R3、R4、R5およびR6は同時に水素を表さない;Y=フ ルオライド、クロライド、ブロマイド、ヨーダイド、メチルサルフェート、フル オロスルホネート、ホスフェート、テトラフルオロボレートまたはトシレート) に対応するキノリニウムタイプの化合物から選ばれる試薬との間での発色団置換 生成物の形成から本質的になることを特徴とする方法。 2.水性試料、とりわけ生物学的試料中の還元型グルタチオン(GSH)のアッ セイ法であって、本質的に下記工程: 1.該試料中に存在するすべてのメルカブタンと上記一般式(I)の化合物から 選ばれる試薬との間で発色団置換生成物を生成させ;ついで2.GSHと該試薬 との間で工程1において生成した発色団置換生成物から発色団チオンを特異的に 生成させるために、反応媒体のpHを12.8〜13.8の値とする からなることを特赦とする方法。 3.水性試料、とりわけ生物学的試料中の全メルカブタンのアッセイ法であって 、本質的に以下の工程: 1.pH7.0〜7.5の範囲に緩衝したアッセイすべき試料に、水または水に 相溶性の溶媒中の一般式(I)のBXT試薬のストック溶液のアリコートを過剰 量で加え、 2.かくして得られた反応媒体を均質にし、3.少なくとも5分間インキュベー トし、4.BXT試薬と試料中に存在するメルカブタンとの間で生成した置換生 成物すなわち付加物の吸光度を分光測光計により測定し、ついで5.以下の式: [全メルカブタン]=(A/εm×d)×D(式中: −Aは測定した吸光度を表す、 −εmは使用したBXT試薬に特異的なモル吸光係数を表す(1.モル−1.c m−1で表す)、 −dはキュベットの長さを表す(cmで表す)、および−Dは希釈の係数を表す ) に従い、試料中に存在する全メルカブタンの濃度をモル/リットルにて決定する からなることを特徴とする方法。 4.水性媒体、とりわけ生物学的試料中の還元型グルタチオン(GSH)のアッ セイ法であって、本質的に以下の工程:1.pH7.0〜7.5の範囲に緩衝し たアッセイすべき試料に、水または水に相溶性の溶媒中の一般式(I)のBXT 試薬のストック溶液のアリコートを過剰量で加え、 2.かくして得られた反応媒体を均質にし、3.少なくとも5分間インキュベー トし、4.選択したBXT試薬に従い、12.8〜13.8の範囲の値に混合物 のpHを調節し、 5.少なくとも15分間インキュベートし、6.とりわけ付加物GSH−BXT 試薬から、β−脱離により生成した発色団チオンの吸光度を分光測計により測定 し、7.以下の式: [GSH]=(A′/εm×d)xD (式中: −A′は測定した吸光度を表す、 −εmは使用したBXT試薬に特異的なモル吸光係数を表す(1.モル−1.c m−1で表す)、 −dはキュベットの長さを表す(cmで表す)、および−Dは希釈の係数を表す ) に従い、試料中に存在するGSHの濃度をモル/リットルにて決定するからなる ことを特徴とする方法。 5.式: [GSHとは異なるメルカブタン]=[全メルカブタン]−〔GSH]を用い、 請求項3および4に記載の方法に従ってそれぞれ測定した濃度を引き算すること による、水性媒体、とりわけ生物学的試料中のグルタチオンとは異なるメルカブ タンの濃度のアッセイ法。 6.使用した試薬が試薬BXT03015すなわち4−クロロ−7−トリフルオ ロメチル−1−メチルキノリニウムテトラフルオロボレートである、請求項1〜 5のいずれか一つに記載の方法。 7.試薬として請求項1に記載の一般式(I)の化合物を本質的に包含すること を特徴とする、請求項1〜5のいずれか一つに記載の方法を行うためのセットま にはキット。 8.R1、R3、R6およびR7が請求項1の記載と同じであり;−R2水素; −R4=水素、F、C1またはCF3;−R5=水素またはC1; −Y=フルオライド、クロライド、ブロマイド、メチルサルフェート、フルオロ スルホネート、ホスフェート、テトラフルオロボレートまたはトシレート、−R 3=F、C1、BrまたはIである場合は、R2、R4、R5、R6およびR7 は同時にHを表さない; −R4=FまたはC1である場合は、R2、R3、R5、R6およびR7は同時 にHを表さない; −R5=C1である場合は、R2、R3、R4、R6およびR7は同時にHを表 さない;−R6=FまたはC1である場合は、R2、R3、R4、R5およびR 7は同時にHを表さない; −R3=R6=C1である場合は、R2、R4、R5およびR7は同時にHを表 さない;−R6=C1またはR7=OHである場合は、Yはメチルサルフェート を表さない一般式(I)の化合物。
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