JPH07501548A - 抗腫瘍ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗腫瘍ワクチン 発明の分野 本発明はガン治療の方法とガン治療や予防に関する。特に、本発明は合成的に調 製しリポソームに封止又は結合された、特定の組織学的タイプの腫瘍に共通にみ られる腫瘍関連抗原から成る抗腫瘍ワクチンに関する。

発明の背景 癌はアメリカ合衆国において毎年的５００，０００件の死亡の原因であり、例年 １，０００．００１１以上の新しい癌が診断されている。平均野分の増加に従い 癌発生率も増加している。問題が深刻であるにもかかわらず、その治療方法は開 発がおそく、典型的には侵襲性で、痛みそして長期的な激しい苦痛を伴うもので ある。手術、化学療法、放射線がわずかの成功をとげているが、同時に激しい副 作用が生じ生活の質の劇的な低下をもたらす。明らかにより効果的な治療手段が 必要である。

患者自身の腫瘍から摘出され、リポソーム組成物に処方され、治療に適用された 腫瘍関連抗原の使用は、口本特許出１１ｉＪＰ２，１８８，５３２に開示されて いる。この出願は腫瘍関連抗原の抽出、部分的精製、そしてリポソーム組成物へ の再構成並びに腫瘍の治療におけるこのリポソーム組成物の使用を示すものであ る。

抽出した腫瘍関連抗原をリポソームに組み込んだものをワクチンとして使用する ことは、Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｎ、　Ｃ，らのＣａｎｃｅｒＤｅｔ＆Ｐｒｅｖ　 （１９９０）　１４　；　４９１−４９６に記載されている。また、ワクチンの アジュバントとしてのリポソームの一般的使用は、米国特許第４．８９１，２０ ８号、４，７２１，６１２号、及びヨーロッパ出ｊ！ｍ０３６，２７７号に記載 されている。腫瘍から抽出した腫瘍関連抗原は、米国特許４，３４３，８９５号 にみられるように、ｅＸ　ＶＩＶＱのテストのためにリポソームに封じこめられ た。一般にリポソームへのタンパク質の共有結合的付着はｌ１ｅａｔｈ、　Ｔ、 　Ｄ、のＭｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　（１９８７）↓４９；１１１−１１９に記 載されている。

特定の組織学的タイプの腫瘍を特徴づける腫瘍関連抗原も同様に記載されている 。５ｅｌａ、　Ｂ、−Ａ、らは　Ｈｙｂｒｉｒｄｏｍａ（１９８９）８：４８１ −４９１において、消化管腫瘍抗原Ｃ０−０２９とＧＡ２２１に対する抗体及び 沈殿した抗原について記載している。Ｓｚａ］、ｏ、　Ｓ、らは、癌腫関連抗原 ＧＡ７３３−２のｃＤＮＡのクローニングを記載している。一般に、特定の組織 学的特徴を有する腫瘍タイプに広く関連する抗原が同定、精精されている。由来 する腫瘍から独立して調製された抗原は、本発明のワクチンに有効である。

発明の開示 本発明は特定の組織学的タイプの腫瘍の治療に有効であるワクチンの組成物を提 供する。この組成物は活性成分として、腫瘍から独立して調製された組織学的に 共通した腫瘍関連抗原を使用する。従ってそのような抗原は異種宿主の中で組み かえ法により調製したり、ウィルスベクターからその場で（ｉｎ　５ｉｔｕ）発 現させたり、初期の免疫感作で免疫源としてその抗原を使用し、擬抗イデオタイ ブ抗体の形に調製したりすることができる。独立して調製された抗原は、その効 果を高めるためにリポソームに封じこめられ、または共有結合される。

したがって、一つの観点として本発明は抗腫瘍ワクチン組成物を提供し、それは 、特定の組織学的タイプの腫瘍に共通で、腫瘍自体とは独立して調製された。

例えば合成的に調製された腫瘍関連抗原を、活性成分として含んでいる。この組 成物はリポソームに封じこめられまたは結合した活性成分を含む。

他の観点として、本発明は抗腫瘍処置の必要な患者への治療手段を提供する方法 や本発明のワクチンの調製方法を示している。

発明を実施するための態様 本発明の抗腫瘍ワクチン組成物は２つの本質的な要素をもつ・腫瘍から独立して 調製される少なくとも１つの腫瘍に関連した抗原、そしてリポソーム調製物であ る。アジュバントおよび／またはサイトカイン並びに他の助剤を含めることもで きる。実際的な理由として、腫瘍関連抗原は、典型的には特定の組織的特徴を有 する多くの患者の腫瘍に共通の抗原であるが、特定の患者の腫瘍に独自に付随す る抗原を独立に調製してワクチンとして使用″ｃきないという理論的理由はない 。

しかし今のところ、腫瘍から個々の抗原を調製することは非実用的である、それ はこのような調製物のためには個々の腫瘍に対する特定の抗原を精製し、特徴づ けることが必要であるためである。従って本発明のワクチンは、特定の組織学的 腫瘍型も与える患者の腫瘍に共通の抗原を使用する。そのような抗原の代表的な ものは、Ｃ０−０２９（これは、胃腸管、結直腸、膵臓の腫瘍に関連している抗 原である）、およびＧＡ７３３１（これは、胃腸管、前立腺、子宮頚管、卵巣、 膀胱、肺、胸（乳癌）、結直腸、膵臓に関連している抗原である）である。これ らの共通の抗原は、合成の方法を用いて、容易に腫瘍から独立に調製できる。例 えば、組みかえ法を使っであるいは、固相ペプチド合成法などである。他の゛合 成一方法は、抗原が抗イディオタイプ単クローン抗体によってまねされるという 点で、抗体の生産を含む。その抗原はｉｎ　５ｉｔｕでも生産可能で、その場合 はウィルスベクターの中にコードをもつＤＮＡを挿入する方法が採用される。

「合成的調製」の用語によって意味することは、その抗原により特徴づけられた り、その抗原が抽出されたりする腫瘍とは無関係な方法によって抗原を生成させ ることであり、すなわちその抗原はその組織学的マークをつけた腫瘍や他の腫瘍 から単離されたものではないことを意味する。

リポソーム成分の調製 リポソーム自体の調製は技術上既知である；いろいろな方法がリン脂質や他の脂 質、およびそれらの混合からリポソームを調製するために適用できる。リポソー ムは共通して単ラメラと多重ラメラとして特徴づけられている。このようなリポ ソームの利用は、咄乳類宿主系の免疫応答の生産部位の−っである、細網内皮系 へ活性をもつ治療に適した薬剤を指向させるために役に立つ。

リポソームの形成には、小胞を形成できる任意の脂質が使われる。臨床学的な応 用のためには、その脂質が毒性がなく、生理学的にも受けいれられ、代謝可能で あることが望ましい。通常の生理学」―の可能性をもち、脂質二重層を形成する 脂質は、リン脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質およびステロイ ドであり、特に、グリセロールを含むリン脂質類である。

特に好まれるのは、ホスファチジルコリン又は、レシチン又はコレステロールお よびその誘導体である。

リポソームの会合や融合の傾向は、形成する時少量の酸性や塩基性の脂質を含ま せることによってコントロールすることができる。リポソームの特徴は、炭化水 素鎖の強度、炭化水素鎖の不飽和の度合、炭化水素鎖の枝分れの度合さらにイオ ン部分の存在のような要素の特性で決まる。その系の温度も重要である。

多重ラメラリポソームの製造は、脂質混合物を減圧下に薄いフィルムとして沈着 させ、つづいて有機溶媒の存在または非存在下で過剰な水性緩衝液に分散させる ことによって行なうことができる。別の方法は水性の相を小型の単ラメラリポソ ームと混合し、さらに凍結乾燥することによる。凍結乾燥したものを、通常は夕 晴の蒸留水を加えて再水和させると、多重ラメラリポソームが形成する。この過 程に使用する小さな単ラメラリポソームは、超音波処理のような機械的分散、高 圧装置、あるいは溶媒注入方法などに従って、水性媒体中に脂質を分散させて製 造する。大きいおよび中間の大きさの弔ラメラリポソームも、洗剤透析、高圧下 で小さな孔の膜を通しての押し出し、ゆっくりと膨張させながらの凍結解凍、再 水和と希釈による脱水和、あるいはカオトロピックイオン存在下での脂質の透析 などを含む慣用の技術により製造できる。リポソームの大きさは、遠心分離、サ イズ排除クロマトグラフィー、ホモジネート又はキャピラリー型の細孔膜通過の ような分別方法によって均一のものに分画することができる。

宿主内の標的およびリポソームの取りこみの主な部位は、主として宿主の肝臓、 膵臓、肺の中での細網内皮系である。宿主によるリポソームの取りこみに影響す る要素は、リポソームの大きさ、安定性そして表面電荷を含んでいる。

細網内皮系を標的とするための明らかな最適な大きさは、１．０μｍ以上で、特 に肝臓、肺および膵臓を標的とする場合はこのとおりである。

腫瘍関連抗原の調製 多（の個体の腫瘍に共通な腫瘍関連抗原の多（が単離精製され、関連ｃＤＮＡが クローニングされている。更に別のこのような抗原も将来的に精製され、そのＤ ＮＡが得られることが期待される。一度その抗原の構造が同定されると、技術上 周知であるように、標準的な固相法をタンパク抗原の調製に使うことができる。

他の方法としてその抗原は関連するｃＤＮＡから組みかえ技術を使用して調製す ることもできる。一般に、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌細胞そして 植物細胞というような多くの宿主系における組み換え体の発現方法は、今や技術 上周知である。例えばバキュロウィルス−昆虫細胞系は米国特許４．　８７９゜ ２３６号に記載されている。

組み換え体による生成、タンパク抗原の回収、それに続いてワクチンの生成に加 え、調製されたリポソームの組成物は、抗原をｉｎ　５ｉｔｕで生産するため、 抗原のウィルス生産系を内部に取りこむことに使われる。この方法として抗原を コードするＤＮＡを、ウィルスベクター内の発現調節系に機能的連結状態に挿入 し、その組みかえベクターを、投与用ワクチンの処方にする。その抗原はウィル スベクターからｉｎ　５ｉｔｕで発現することで患者体内で生産される。

抗原がｉｎ　５ｉｔｕで生産されるためのワクチンにウィルスベクターを利用す る手法は既知である。例えば、このような手法は１ｌｒｕｂｙ、　Ｄ、　Ｅ、が Ｙｅｔ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ（１９８８）２９：２８１−２９２でワクチニア ウィルスについて記載している：そして宿主ベクターとしてトリのポックスウィ ルスの使用については、Ｔａｙｌｏｒ。

Ｊ、らがＶａｃｃｉｎｅ　（１９９１）　９　：１９０−１９３に記載している 。

ＡＩＤＳワクチンにおけるウィルスベクターの使用は、すてにＩｉｕ、Ｓ−Ｌが ”Ａ　Ｉ　ＤＳ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｒｅｖｉｅｗｓ”　Ｖｏｌ　１　（１９９１ ）　、　ｉ［ａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ、ニューヨーク出版、ｐ４０３ −４１６において記載している。

最後に、腫瘍関連抗原の腫瘍非依存性供給源は、抗原の輪かくをまねるモノクロ ナル抗イデイオタイプ抗体の形でみられる。抗イデオタイブ抗体の生産は、例え ばＧｏｄｉｎｇ、　Ｊ、　Ｌ　の”１ｌｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｔｘｘｌｉ ｅｓ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃ■|第 ２版Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８６）に記載されている。これらの 抗体は一般に非ヒト宿主で生産されるものではあるが、この抗体の定常部はキメ ラ組み換え技術を使用して“ヒト化”することもできるだろう。このような腫瘍 抗原に対する抗イデオタイブモノクロナル抗体は、例えばＡｕ５ｔｉｎらＩｍｕ ｎｏｌｏｇｙ　（１９８９）　６７　：５２５−５３０によって製造されている 。

前記に示したように、Ｃ０−０２９やＧＡ７３３１ならびに黒色腫に特徴的５２ に記載されているように、精製され特徴づけられている。癌胎児性抗原（ＣＥＡ ）は、ＶｉａｌｏらＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８７）↓３９：４２５０に記 載されている。

腫瘍細胞源に依存しない生産を可能にするために単離し特徴づけられる腫瘍関連 抗原なら、いずれも使用することができる。

ワクチンの調製と投与 抗腫瘍ワクチンの組成物は、リポソームに腫瘍関連抗原を封じこめまたは共有結 合させることによって調製される。封じこめとして、中間の大きさのリポソーム が好ましい。水溶性あるいは疎水性の抗原はリポソーム形成の前に水性組成物に 加えられる。これは、場合に応じて抗原をリポソーム内に包まれている水性相に 捕獲しあるいは脂質二重膜層中に捕獲するためである。リポソームへ共有結合法 は、水溶性の媒質を使用する。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性さ れたカルボキシル基を、アミドを生成させるためにアミノ基と反応させることが できる。ピリジルジチオールはジスルフィド結合を形成させるためにチオールと 反応させ、マレイミド誘導体はチオエーテルを生成させるためにチオールと反応 させる。そのかわりとして、抗原は個々の脂質分子に結合させ、そして前もって 作られたリポソーム中に挿入することもできる。

結果として生じるリポソーム処方物は、１つまたは数個の合成的に生産された抗 原を含んでいてもよい。０ｓｔｒｏ、　Ｍ、　Ｊ、編、　−Ｌｉ　ｐｏｓｏｍｅ ｓ″Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ。

（１９８３）２４９ページに記載されているように、ＬＰＳ、Ｌｉｐｉｄ　Ａ。

ムラミルジベブチターゼなどのようなアジュバント、又は多糖類をリポソーム処 方物に補給してもよい。リポソーム処方物は、ＩＬ、−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１ ２、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｇ−Ｃ５Ｆそしてγ−インターフェロンのような免疫増強サ イトカインとともに処方することもできる。

得られるリポソーム処方物は、一般に注射や経粘膜式の投与による通常の方法を 使用して投与される。注射は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内を含む通常の経路 を用いて実施されるが、静脈内注入が好ましい。フミジン酸、胆汁酸塩、界面活 性剤のように経粘膜式の輸送を成しとげるための薬剤が組成物に加えられること を条件に、エアゾール投与も簡便である。抗原は１回に０．０１μｇから１００ １１ｇの範囲での量を投与されるが、好ましくは０．１μｇから１０ｍｇ、より 好ましいのはＩＯμｇからｌｏｇであり、非経口投与においては、１回量は０． １ないし５ゴ中で投与される。最初の１年は１週間に１回収度の割合で複数回の 全接種を施行し、そののち毎６ケ月から５年間追加免疫を行なうこともできる。

以下の実施例は説明を目的とするもので発明を限定するためのものではない。

実施例１ ジスチロールホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフエイトお よびメタノールを、脂質溶媒中、容量比で５＝１の割合で使用する。多重膜リポ ソーム（ＭＬＶ）は、Ｂａｎｇｈａｍらによって述べられた方法を用いて、いく つかの修飾を伴い調製される。ジスチロールホスファチジルコリン（７０モル％ ）、コレステロール（２４モル％）、ジセチルホスフエイト（６モル％）は丸底 フラスコ内で混ぜ、脂質溶媒を窒素気流下で蒸発させる。ＰＢＳ中にＧＡ７３３ −２を含む水溶液相は、フラスコ内に乾燥した脂質の薄いフィルムに４２℃下で 加えられる。　（疎水性タンパク質においては、リポソーム封入工程の一部に技 術上周知である洗剤透析方法を施こしてもよい）。３０分の膨張時間後、４２℃ 下で、少数のガラス玉を加え、混合物を１５分間勢いよ（攪はんすることによっ て分散を完了する。このようにして生成したＭＬＶリポソームは室温下で２時間 平衡させ、精製し、すぐに使用される。

このＭＬＶリポソームはレーザー光学ソーターで大きさを決められる。リポソー ム調製物は、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５カラムを通して、リポソーム結合抗 原を遊離タンパク質から分離させる。リポソームはボイド容積中に溶離され、封 入されなかったタンパクはあとに続いて溶離される。小胞体へのタンパク質封入 の効率を評価するために、膜抗原を１２５■ヨードピーズで放射ラベルする。遊 離の１２５Ｉは、十分な透析によって除外する。　１２５Ｉでラベルされたタン パク質は、上記したＭＬＶ調製物の水溶相で使われ、５ｈｅｈａｄｅｘ　Ｇ　− ７５カラムを通過させる。リポソームと共に溶離した放射活性の割合は、封入の 効率の指標とみなされる。哺乳類宿主で使用するリポソーム組成物は放射ラベル なしで調製される。これらの条件下でタンパク質の濃度は技術」−１知られてい る方法であるタンパク質アッセイにより測定される。ＧＡ７３３−２−リポソー ム封入へ組成物は、哺乳類宿主へ投与するために処方するまでアルゴン存在下で ４℃で保存される。

実施例２ リポソームは、ホスホファチジルコリン、コレステロール、そしてジセチルホス フエイトを７：２：ｌのモル比で混合して調製される。クロロフォルム：メタノ ール（９５：　５）中の脂ｎは、アルゴン存在下で固転しながら蒸発することに より丸底フラスコ中で乾燥される。乾燥した脂質の膜は、＋′Ｉで追跡ラベルし た１５０ｍｇのＧＡ７３３−２　ＴＡＡを含むｐＨ８の０．１５Ｍのほう酸塩緩 衝液２鹸中に再けんだくされる。そのけんだ（液は１時間インキュベートし、１ 時間水そう型のソニケーターで超音波処理し、それから１時間放置後、脂質によ り前もって飽和されている５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００の上に導入してリポ ソームに関連しないタンパク質を除去する。リポソームのピーク中のＴＡＡ含有 量は　１２８Ｉタンパク質の特異的活性により測定される。哺乳類宿主で使用す るリポソーム組成物は放射ラベルをせずに調製され、そのタンパク質濃度はすで に述べた方法で測定される。ＧＡ７３３−２−リポソーム封入組成物は、哺乳類 宿主へ投与されるまでアルゴン存在下で４℃にて保管される。

実施例３ ＩｍｇのＧＡ７３３１．７５＋ｎｇのＰＯＰＣ（１−バルミトイル−２−オレオ イル−ホスファチジルコリン、および１７５ｎｇのＤＯＰＧ　（１，２−ジオレ オイルホスファチジルグリセロール）が、総容量２．５−のｔｅｒｔ−ブタノー ルに含まれているものが、パイロジエンを含まない５ｉのバイアルの中に分注さ れ、４℃にて７１ｉ’Ｊｌｈ　ｓそして１６時間かけて凍結乾燥される。最終調 製物はアルゴン存在下で４℃で保存し、数ケ月に渡って安定な状態として保たれ る。注射に用いるには、２．５−の滅菌生理水をバイアルに加えてリポソームを 分散させ、室温で１５秒放置する。その後バイアルは３０秒間ポルテックスかく はんする。この手法はリポソームの大きさを０．１μｍから０．３μｍの大きさ にする。

実施例４ ジスチロールホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフエイトお よびメタノールを、脂質溶媒中、容量比で５．１の割合で使用する。多重膜リポ ソーム（ＭＬＶ）は、Ｂａｎｇｈａｍらによって述べられた方法を用いていくつ かの修飾を伴い調製される。ジスチロールホスファチジルコリン（７０モル％） 、コレステロール（２４モル％）、ジセチルホスフエイト（６モル％）は丸底フ ラスコ内で混ぜ、脂質溶媒を窒素気流下で蒸発乾固させる。フラスコ内に乾燥し た脂質の薄いフィルムに、ＰＢＳ中にＣ０−０２９を含む水溶液相を、４２℃下 で加える。　（親油性タンパク質は、封入手段の一部として、技術上周知である 洗剤透析方法を施してもよい）。３０分の膨張時間後、４２℃下で少数のガラス 玉を加え、混合物を１５分間勢いよ（攪はんすることによって分散を完了する。

このようにして生成したＭＬＶリポソームは室温下で２時間平衡させ、精製し、 すぐに使用する。

このＭＬＶリポソームは、レーザー光学ソーターで大きさを決められる。リポソ ーム調製物は、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５カラムを通して、リポソーム結合抗 原を遊離タンパク質から分離させる。リポソームはボイド容積中に溶離され、封 入されなかったタンパクはあとに続いて溶離される。小胞体へのタンパク質封入 の効率を評価するために膜抗原を１２Ｊヨードピーズで放射ラベルする。遊離の Ｉｔ！ｉは、十分な透析によつて除外する。　１２Ｊでラベルされたタンパク質 は、上記したＭＬＶ調製物の水溶相で使われ、５ｈｅｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５カ ラムを通過させる。リポソームと共に溶離した、放射活性の割合は、封入の効率 の指標とみなされる。

嘩乳類宿主で使用するリポソーム組成物は放射ラベルなしで調製される。これら の条件下でタンパク質の濃度は技術上、知られている方法であるタンパク質アッ セイにより測定される。Ｃ０−０２９−リポソーム封入組成物は、哺乳類宿主へ 投与するために処方するまでアルゴン存在下で４℃で保存される。

実施例５ リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、そしてジセチルホスフ エイトを７：２：１のモル比で混合して調製される。クロロフォルム：メタノー ル（９５：５）中の脂質は、アルゴン存在下で回転しながら蒸発すること１．″ より丸底フラスコ中で乾燥される。乾燥した脂質の膜は、＋２６Ｉで追跡ラベル した１５０■のＣｏ−０２９ＴＡＡを含むｐＨ８の０．１５Ｍのほう酸塩緩衝液 ２＋ａ／中に再けんだくされる。そのけんだ（液は１時間インキュベートし、１ 時間水そう型のソニケーターで超音波処理し、それから１時間放置後脂質により 前もって飽和されている５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００の上に導入して、リポ ソームに関連しないタンパク質を除去する。リポソームのピーク中のＴＡＡ含有 量は　＋２３１タンパク質の特異的活性により測定される。哺乳類宿主で使用す るリポソーム組成物は放射ラベルをせずに調製され、そのタンパク質濃度はすで に述べた方法で測定される。Ｃ０−０２９−リポソーム封入組成物は、哺乳類宿 主へ投薬されるまでアルゴン存在下で４℃にて保管される。

実施例６ １ｍｇのＣｏ−０２９，７５ｍｇのＰＯＰＣ（１−バルミトイル−２−オレオイ ル−ホスファチジルコリン、および１７５ｎｇのＤＯＰＧ　（１，２−ジオレオ イルホスファチジルグリセロール）が総容ｆｆ１２．５Ｒ１のｔｅｒｔ−ブタノ ールに含まれているものが、パイロジエンを含まない５＃Ｌ／のバイアルの中に 分注され、４℃にて凍結、そして１６時間かけて凍結乾燥される。最終調製物は アルゴン存在下で４℃で保存し、数ケ月に渡って安定な状態として保たれる。注 射に用いるには、２．５ＷＬｌの減菌生理水をバイアルに加えてリポソームを分 散させ、室温で１５秒放置する。

その後バイアルは３０秒間ポルテックスかくはんする。この手法はリポソームの 大きさを０．１μｍから０．３μｍの大きさにする。

実施例７ ＴＡＡ　ＧＡ−７３３−２は、前述のｌ１ｅａｔｈ　Ｔ、　Ｄ、　によって記載 された方法によってリポソームの表面に結合される。特に飽和された合成ホスフ ァチジルエタノールアミン複合脂質は、適当な反応容器に入れられた１００マイ クロモルの脂質を乾燥することによって活性化される。脂質は１０＋ＩＬ／の乾 燥クロロホルム中で再び溶かされる。３００マイクロモルのトリエチルアミンが 加えられ、続いて５ｉのメタノールに溶解した１５０マイクロモルのＮ−スクシ ニミジルピリジルジチオプロビオネートが加えられる。混合液はアルゴン存在下 で室温でかくはんされる。反応の進行は、クロロホルム（６５）：メタノール（ ２５）：水（４）によって行なわれるシリカゲルプレートを用いた薄層クロマト グラフィによりチェックされる。誘導体はホスファチジルエタノールアミンより 早いランニングスポットを与え、スポットはリン酸モリブデン噴霧によって呈色 する。反応はホスファチジルエタノールアミンがプレート上で検知されなくなっ た時完了し、これは通常開始後１〜２時間である。混合物は乾燥され、クロロホ ルムで再けんだくされ、クロロホルムで平衡された１０ｇのケイ酸カラムに導入 される。カラムは２０ゴのクロロホルムで洗浄され、２０ｄづつのクロロホルム −メタノール溶液で溶出される。その組成は最初９５：５、次に９０・１０，８ ５：１５、最後に８０２０である。５ｍｉづつの分画が集められ、純粋な誘導体 が薄層クロマトグラフィーにより位置ずけられる。１１的分画をプールして、回 転蒸発器で減圧ドで蒸発され、濃縮される、そして薄層クロマトグラフィにより 再び純度がチェックされる。生成物はアルゴン存在下で一２０℃において、封止 したアンプル中でクロロホルム溶液として保管される。

ＧＡ−７３３−２は、Ｎ−スクシニミジルピリジルジチオプロビオネートでチオ ール化される。アグリゲートを含まないＧＡ−７３３−２の溶液は、０．１Ｍリ ン酸ナトリウムと０．１Ｍ　ＮａＣｌによりｐＨ７，５において調製される。Ｇ Ａ−７３３−２の濃度は約２−６　ｆｆ１ｇ、・ｍｌである。Ｎ−スクシニミジ ルピリジルジチオプロビオネート溶液は、エタノール中で２０マイクロモル／＋ １／に調製される。Ｎ−スクシニミジルピリジルジチオプロビオネートは、次に Ｎ−スクシニミジルピリジルジチオプロビオネート：ＧＡ−７３３−２のモル比 が１５：ｌとなるように上記のＧＡ−７３３１溶液に滴加されるが、但しエタノ ールの濃度が１％を越えないように実施する。混合物は、室温で３０分間反応さ せられる。生成物は０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウ ム、０．０５Ｍ　ＮａＣ１で平衡された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０上でゲル クロマトグラフィにより反応成分からの数の測定により同定される。ピリジルジ チオ−ＧＡ−７３３−２生成物はろ過滅菌の後に４℃で保管される。

複合体化の直前に、ピリジルジチオ−ＧＡ−７３３−２は、クエン酸・リン酸緩 衝液ｐＨ７に入れ、ＩＮのＭＣＩを微量滴量してＩ）Ｈ４，５にし、還元してチ オール基を形成させる。２．５Ｍジチオトレイトール溶液は、０．１Ｍ酢酸緩衝 液ｐＨ４，５中に作られ、この溶液をタンパク溶液ＩＲ１ｆｉすｌＯμｆ加える 。３０分後、タンパク溶液をジチオトレイトールから分離するため、ｐＨ６，７ の緩衝液を窒素かアルゴンでパージして溶存酸素を除いたもので平衡化した５ｅ ｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５によりゲルクロマトグラフィーを行なう。タンパク質 の分画は、酸素を除くため不活性ガス中で集められた。

リポソームは知られているいかなる方法でも調製される、例えば、ホスファチジ ルコリン　コレステロールのｌ：１または２：１のモル比のものがら調製される 。複合化された脂質は、他の脂質に１００分の１〜５ｍｏｌの濃度で加えられる 。

チオール化されたＧＡ−７３３−２は、ｐ　Ｉ−Ｉ　６．　Ｏ〜８．０で混ぜら れることによりリポソームとの複合体にでき、その反応は一晩行なう。反応して なかったチオール基は、Ｅｌｌｍａｎの試薬によってブロックされ、リポソーム は非複合タンパク質からゲルクロマトグラフィ又は遠心分離機によって分離され る。好ましいのは、ゲルマトリ、クスでリポソームが失なわれるのを防ぐため遠 心分離による方法である。複合体組成物は哺乳類宿主に投薬するために処方され るまで４℃で保管される。

実施例８ ’１’ＡＡ　Ｃ０−０２４）は、１１；ｊ述の１ＩｃａＬｈ　Ｔ、　Ｄ　によっ て記載された方法によってリポソームの表面に結合される。特に飽和された合成 ホスファチジルエタノールアミンは、適当な反応容器に入れられた１００マイク ロモルの脂質を乾燥することによって活性化される。ＩＩｔｆ？ｆｆは１０−の 乾燥クロロホルム中で再び溶かされる。３００マイクロモルのトリエチルアミン が加えられ、さらに５献のメタノールに入った１５０マイクロモルのＮ−スクシ ニミジルピリジルジチオプロビオネートが加えられる。混合物はアルゴン存在下 で室温でかくはんされる。反応の進行は、クロロホルム（６５）：メタノール（ ２５）：水（４）によって実施されたシリカゲルプレートを用いた薄層クロマト グラフィによりチェックされる。誘導体はホスファチジルエタノールアミンより 早いランニングスポットを与え、スポットはリン酸モリブデン噴霧によって呈色 する。反応はホスファチジルエタノールアミンがプレート」−で検知されなくな った時完了する、これは通常開始後１〜２時間である。混合物は乾燥され、クロ ロホルムで再けんだ（され、クロロホルムで甲衡化された１０ｇのケイ酸カラム に導入される。カラムは２０ｄのクロロホルムで洗浄され、２０ｍＩづつのクロ ロホルム−メタノール溶液で溶出される：その組成は最初９５：５、次に９０： １０．８５　Ｉ５、そして最後に８０２０である。５ｉの分画が集められ、純粋 な誘導体が薄層クロマトグラフィーにより位置ずけられる。誘導体の分画はプー ルし、回転蒸発器で減圧下で蒸発され、濃縮される、そして薄層クロマトグラフ ィにより再び純度がチェックされる。生成物はアルゴン存在下で一２０℃におい て、封止アンプル中でクロロホルム溶液として保管される。

Ｃ０−０２９は、Ｎ−スクシニミジルピリジルジチオプロビオネートでチオール 化される。アグリゲートしていないＣ０−０２０の溶液は、Ｏ，１Ｍリン酸ナト リウムおよび０．ＩＭ　ＮａＣｌ中にてｐｔ−Ｉ７．５において調製される。Ｃ ｏ−０２９のＫｉ度は約２−６ｍｇ、’Ｉ＋！／である。Ｎ−スクシニミジルピ リジルジチオプロビオネート溶液は、エタノール中で２０マイクロモル／ｄに調 製される。Ｎ−スクシニミジルピリジルジチオプロビオネートは、次にＮ−スク シニミジルピリジルジチオプロピオネ−）：Ｃ０−０２９のモル比か１５・ｌと なるようにＣｏ−０２９に滴加されるうその際、エタノールの濃度が１％を越え ないようにする。混合物は、室温で３０分間反応させられる。生成物の反応成分 からの分離は０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０ ．０５Ｍ　ＮａＣＬ　ｐＨ７，０で゛［衝された５ｃｐｈａｄｃｘ　Ｇ　−５０ ゲルクロマトクラフイにより分離される。

千オール化されたＣｏ−０２４）は、Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｃｍ、ノ ：、（１！１１７Ｂ）ｊ７３　ニア２３に記載されたように、１モル当りのピリ ジルチオールの数を数えて同定される。ピリジルジチオ−ＣＯ−０２０生成物は 滅菌ろ過の後４℃で保管される。

結合化の直前に、ピリジルジチオ−ＣＯ−０２９は、クエン酸・リン酸緩衝液ｐ Ｈ７に入れ、ｌＮＨＣｌで＠量適用してｐＨ４，５にし、チオール基を生じるた めに還元される。２．５Ｍジチオトレイトール溶液は、Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ ４゜５によって作られ、この溶液はタンパク溶液ｌＲ／毎に１０μｒ加える。３ ０分後、タンパク溶液はジチオトレイトールから、窒素がアルゴンによって溶存 した酸素を除くためにパージしたｐＨ６，７緩衝液による５ｃｐｈａｄｃｘ　Ｇ 　−７５上のゲルクロマトグラフィーによって分離される。タンパク質の両分は 、酸素を除くために不活性ガス中で集められる。

リポソームは公知のいかなる方法でも調製される、例えば、ホスファチジルコリ ンとコレステロールはｌ・１または２：１のモル比がら調製される。複合化され た脂質は、他の脂質に１００分のＩ〜５ｍｏｌの濃度で加えられる。

チオール化されたＣ０−０２９は、ｐ）Ｉ６．０〜８，０て混ぜられることでリ ポソームに結合され、その反応は一晩行なわれる。反応しなかったチオール基は 、Ｅｌｌｍａｎの試薬によつてブロックされ、リポソームは非結合タンパク質か らゲルクロマトグラフィ又は遠心分離機によって分離される。好ましいのは、ゲ ルマトリックスでリポソームが失なわれるのを防ぐため遠心分離による方法であ る。結合した組成物は哺乳類に投与するために処方されるまで４℃で保管される 。

実施例９ ＧＡ７３３−２またはＣ０−０２９腫瘍関連抗原をまねている抗イデイオタイプ 抗体またはＡｂ２モノクロナル抗体は、技術上周知の手法により製造される。

（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、　Ｗ　らのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｊｂｏ ｄｊｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃ−ｔｉｃｅ　２ｅｄ、 、八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８６）参照）。実質上、タンパク質や そのタンパク質か誘導される腫瘍細胞系列が、哺乳類宿主、通常はネズミ、最も ひんばんにはＢａ１ｂ　Ｃマウス中で抗抗原モノクロナル抗体もしくはＡｂｌを 製造するための免疫原として使用される。それらのタンパク質や細胞系列は、完 全又は不完全フロインドアジュバントのようなアジュバントと一緒にまたはアジ ュバント無しに注射される。次に、モノクロナル抗体（Ａｂｌｌを同様の方法で Ａｂ２抗−イデオタイブモノクロナル抗体を産出する免疫原として１吏用する。

別の方法として、どちらの抗原に対しても現存するＭＡｂをＡｂ２を生産するた めに免疫原として使うことができるであろう。例えば、ＭＡｂＧＡ７３３が１ｌ ｅｒｌｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）２３２．：１００−０２に記載され ている。

抗ＴＡＡ　Ａｂ２抗体は、技術」二周知の方法でリポソーム内部に閉じこめられ る。そのかわりに、このような免疫グロブリン分子は前記したようにリポソーム の表面に結合させることもできる。

実施例ＩＯ 正常のネズミは、ＧＡ７３３−２およびＣｏ−０２９のネズミにおける類似抗原 （８００６以」−の相同性）を、ヒトの抗原の分布と似た組織分布で示す。その −Ｌネズミの腫瘍、例えばＰ８１５またはＣｒ２は、技術」−周知の方法でヒト ＧＡ７３３−２およびＣ０−０２９抗原をコードするｃＤＮＡを用いてトランス フェクトされ、その結果、ネズミ腫瘍の表面にヒトの遺伝子産物の安定的な発現 がおきる。その腫瘍を引きつづき正常のマウスに導入すると、組みかえ抗原の発 現を継続したまま増殖する。このモデルは本発明のリポソームワクチンの安全性 及び有効性の両方のテストを可能にする。

安全性のテストでは、正常又は腫瘍をもつネズミに本発明の任意の組成物のＧＡ ７３３−２、Ｃｏ−０２９又は抗イデイタイプモノクロナル抗体の様々の生成物 でワクチン接種をする。その際、抗原全量で０．ＯＩμｇから１００ｍｇ、通常 は０．１μｇ＝１０＋＋１ｇ、より通常のもので１０Ｍｇから１ｍｇの１回量に て、６回まで投与する。ワクチン接種は、１０μｒから２−をｉ、ｐ、、　ｉ、 ｍ、、　ｓ、ｃ、、又は足裏のふ（らみに投与する。その結果は、体重の連続し た測定、臨床的観察、および租液の総数、化学的現象、検死での総合的組織病理 学を含む実験上のパラメーターにより評価される。

有効性のテストでは、ネズミは、腫瘍移植前、移植中、移植後に同じ免疫措置を 受ける。その有効性は以下の方法で測定される。■）皮下移植した腫瘍の生長の 測定、２）ミクロ転移モデルでの腫瘍塊数の計数、３）総合的生存率。有効性は また、抗原に特異的な抗体のタイツ、遅延型過敏症、ＡＤＣＣ，細胞障害Ｔリン パ球を含む免疫学的反応によって測定されるが、これらのみには限定されない。

実施例１１ 癌を保持する患者は、手術によって癌を取りのぞき、本発明の腫瘍ワクチンを与 えることができる。もし臨床的、実験室的、放射線学検査が全般的な病気を示す 証拠を明らかにしないのなら、本発明の処置は“外科手術を補助する処置”と考 えられる。ワクチン接種は手術の前にはじめてもよく、その場合は、”前補助処 置゛と考えられる。手術による切除が不可能な転移病巣をもつ癌患者も処置する ことができる。

患者は本発明の組成物のどの場合も、ＧＡ７３３−２、Ｃ０−０２９あるいは抗 イデイオタイプモノクロナル抗体のいろいろな処方物でワクチン接種される。

そのルートは筋肉内（ｉ、ｍ、Ｌ皮下（ｓ、　ｑ、　）あるいは皮フ内（ｉ、ｄ 、）であろう。

投与する抗原量は非経【コ投与の０．１ないし５ｄ容積の１回量当り０．Ｏ１μ ｇから１００　ｒｐｇ１通常Ｏ１μｇからｔｏｍｇ、より一般的には１０Ｍｇか らｆｍｇである。

ワクチンの接種は、はじめの６ケ月は１週間毎の割合で、そしてはじめの１年ま ではｌケｎおき、２ケｎおき、あるいは３又は６ケ月ごとにする。次の年にＩ〜 １２ケ月の間隔をおいて追加免疫を行なうことができる。

他の方法では、関連抗原を発現する生きた組換え体キャリヤーを用いて初期免疫 感作を施行し、」二記に示したスケジュールで関連する精製された抗原を持つリ ポソームを用いて追加接種する。

実施例Ｉ２ 正常ヒト又は悪性腫瘍の発生の危険性が高い患者は、上記に示すように予防接種 し、６ケ月ないし５年おきに追加免疫される。悪性腫瘍の発生の危険性が高い患 者の例は、結腸ＩＣｆ腸癌０原因の家族性ポリープを持つ患者や肺ガンの原因の 喫煙患者を含む。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．合成的に調製された特定の組織学的タイプの腫瘍を代表する腫瘍関連抗原が リポソームキャリヤーに封入され、または共有結合したものを活性成分として含 んで成る、抗腫瘍ワクチン組成物。
2. ２．前記抗原が前記抗原をコードする遺伝子を異種宿主中で発現させ、そして該 抗原を回収することにより調製される、請求項１記載のワクチン組成物。
3. ３．前記抗原が固相ペプチド合成により調製される、請求項１記載のワクチン組 成物。
4. ４．前記抗原が前記抗原をコードする遺伝子をウイルスベクター発現系に挿入し ｉｎｓｉｔｕで（その場で）生産される、請求項１記載のワクチン組成物。
5. ５．前記抗原がＧＡ７３３−２である請求項１記載のワクチン組成物。
6. ６．前記抗原がＣＯ−０２９である請求項１記載のワクチン組成物。
7. ７．前記抗原が、当該腫瘍関連抗原による免疫感作によって調製された抗体と反 応する、前記腫瘍関連抗原の抗イデイオタイプ抗体である、請求項１記載のワク チン組成物。
8. ８．更にアジュバンドを含む請求項１記載のワクチン組成物。
9. ９．更にサイトカインを含むせい請求項１記載のワクチン組成物。
10. １０．特定の組織学的タイプの腫瘍が潜在し、あるいは発生しやすい患者に、請 求項１記載のワクチン組成物を投与することからなる、当該患者の治療手段を提 供する方法。