JPH07303493A - 組換え及び合成ペプチドの製造法並びにそれらの用途 - Google Patents
組換え及び合成ペプチドの製造法並びにそれらの用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 既定の特異的結合パートナーと結合するペプ
チドの製造法およびそのペプチドの用途を提供する。 【構成】 種々のペプチドを適切な微生物の表面上に、
そのペプチドがレセプターに直接到達可能でかつ適切な
スクリーニング法を用いて同定および単離されるように
直接発現させる方法であり、その方法はヌクレオチドバ
ンクの作製、微生物の形質転換、形質転換された微生物
の培養及び必要とされているペプチドを発現する微生物
の選択を含む。得られたペプチドは、レセプターまたは
リガンド部位の同定および特徴付け、さらには天然のリ
ガンドに代えて用いることができる。
チドの製造法およびそのペプチドの用途を提供する。 【構成】 種々のペプチドを適切な微生物の表面上に、
そのペプチドがレセプターに直接到達可能でかつ適切な
スクリーニング法を用いて同定および単離されるように
直接発現させる方法であり、その方法はヌクレオチドバ
ンクの作製、微生物の形質転換、形質転換された微生物
の培養及び必要とされているペプチドを発現する微生物
の選択を含む。得られたペプチドは、レセプターまたは
リガンド部位の同定および特徴付け、さらには天然のリ
ガンドに代えて用いることができる。
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明はヌクレオチドバンクの作製、微
生物の形質転換、形質転換された微生物の培養および所
望とされるペプチドを発現する微生物の選択を含む、既
定の特異的結合パートナーと結合するペプチドの製造
法、並びに、このペプチドの用途に関する。
生物の形質転換、形質転換された微生物の培養および所
望とされるペプチドを発現する微生物の選択を含む、既
定の特異的結合パートナーと結合するペプチドの製造
法、並びに、このペプチドの用途に関する。
【０００２】特に治療および診断上重要であるレセプタ
ー‐リガンド相互作用において、非常に多数の重要な物
質が結合パートナーとして反応する。例えば、タンパク
質分解酵素カスケードにおける阻害剤、免疫系の調節
剤、ホルモンレセプターのリガンド、核酸と結合するタ
ンパク質、および、抗体‐抗原反応における結合パート
ナーが挙げられる。
ー‐リガンド相互作用において、非常に多数の重要な物
質が結合パートナーとして反応する。例えば、タンパク
質分解酵素カスケードにおける阻害剤、免疫系の調節
剤、ホルモンレセプターのリガンド、核酸と結合するタ
ンパク質、および、抗体‐抗原反応における結合パート
ナーが挙げられる。
【０００３】レセプターおよびリガンドの結合部位を同
定して特徴付けること、および／または、ある結合パー
トナーを、その結合パートナーと同様に反応する別の化
合物、好ましくは低分子量化合物、で代用することはし
ばしば興味あることである。
定して特徴付けること、および／または、ある結合パー
トナーを、その結合パートナーと同様に反応する別の化
合物、好ましくは低分子量化合物、で代用することはし
ばしば興味あることである。
【０００４】多くの場合において、簡単に低コストでか
つ大量に高純度で合成できる合成ペプチドを、そのよう
な低分子量結合パートナーとして用いることが望まれ
る。
つ大量に高純度で合成できる合成ペプチドを、そのよう
な低分子量結合パートナーとして用いることが望まれ
る。
【０００５】現在、タンパク質またはペプチドにより構
成される構造は、いくつかの場合には合成ペプチドで代
用できる。しかしながら、生物活性に寄与するかまたは
それに関与する構造またはアミノ酸配列を同定すること
は、不可能でないにしても、非常に困難であることが多
い。レセプターに対するタンパク質の結合部位のアミノ
酸配列が、例えば一部の抗原‐抗体結合について可能で
あったように一部の場合においてたとえうまく解明でき
るとしても（Immunology Today,10,266-272)、結合部位
領域中の抗原のアミノ酸配列を含む合成ペプチドが抗体
と同様に反応するかどうかについては予測できない。そ
の理由は、それが有する構造が、しばしば液中または固
相上において、抗原における構造と完全に異なりそのた
め対応抗体と反応しないものとなってしまうことがある
からである。
成される構造は、いくつかの場合には合成ペプチドで代
用できる。しかしながら、生物活性に寄与するかまたは
それに関与する構造またはアミノ酸配列を同定すること
は、不可能でないにしても、非常に困難であることが多
い。レセプターに対するタンパク質の結合部位のアミノ
酸配列が、例えば一部の抗原‐抗体結合について可能で
あったように一部の場合においてたとえうまく解明でき
るとしても（Immunology Today,10,266-272)、結合部位
領域中の抗原のアミノ酸配列を含む合成ペプチドが抗体
と同様に反応するかどうかについては予測できない。そ
の理由は、それが有する構造が、しばしば液中または固
相上において、抗原における構造と完全に異なりそのた
め対応抗体と反応しないものとなってしまうことがある
からである。
【０００６】結合上活性であって、対応天然リガンドの
場合と同じように選択結合パートナーと反応する構造を
同定し、特徴付けることを可能にする実験方法が知られ
ている。よって、これらの構造は組換えまたは合成ペプ
チドとして製造でき、用いることができる。
場合と同じように選択結合パートナーと反応する構造を
同定し、特徴付けることを可能にする実験方法が知られ
ている。よって、これらの構造は組換えまたは合成ペプ
チドとして製造でき、用いることができる。
【０００７】ペプチドバンクは特許出願ＷＯ第９１／１
７２７１号、ＷＯ第９１／１９８１８号明細書ならびに
Scott et al., Science,249,386-390(1990), Devlin e
t al., Science,249,404-406(1990), Cwirla et al., P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,87,6378-6382(1990)およびFeli
ci et al., J.Mol.Biol.(1991)222,301-310 の論文に記
載されているように分子生物学的方法を用いて、もしく
は、特許出願ＷＯ第９２／０００９１号明細書および v
on Lam et al., Nature,354,82-84(1991) に記載されて
いるように化学的方法を用いて製造されている。それら
は結合パートナーとしてかなり多様なペプチドオリゴマ
ーを利用可能なものとしており、その多様性はペプチド
において５〜１５位で２０アミノ酸の置換えにより得ら
れる。５〜１５アミノ酸の置換えで理論上可能な組換え
の数は３．２×１０６〜３．３×１０19である。これら
文献に記載されたペプチドバンクは約２．５×１０６〜
３×１０８の異なるペプチドを含んでなる。
７２７１号、ＷＯ第９１／１９８１８号明細書ならびに
Scott et al., Science,249,386-390(1990), Devlin e
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ci et al., J.Mol.Biol.(1991)222,301-310 の論文に記
載されているように分子生物学的方法を用いて、もしく
は、特許出願ＷＯ第９２／０００９１号明細書および v
on Lam et al., Nature,354,82-84(1991) に記載されて
いるように化学的方法を用いて製造されている。それら
は結合パートナーとしてかなり多様なペプチドオリゴマ
ーを利用可能なものとしており、その多様性はペプチド
において５〜１５位で２０アミノ酸の置換えにより得ら
れる。５〜１５アミノ酸の置換えで理論上可能な組換え
の数は３．２×１０６〜３．３×１０19である。これら
文献に記載されたペプチドバンクは約２．５×１０６〜
３×１０８の異なるペプチドを含んでなる。
【０００８】ペプチドバンクを作製するための分子生物
学的プロセス（即ち、Scott et al.、前記参照）は、確
率論的に分布するまたはランダムに変化したヌクレオチ
ド配列を１５〜６０位に含むオリゴヌクレオチドによる
ファージＤＮＡの組換えを基礎とする。次いで宿主細菌
が組換えファージＤＮＡで形質転換される。記載のケー
スでは、繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｄ、ｆ
１）が用いられる。この目的のために、オリゴヌクレオ
チドはファージの表面上におけるｐVIII（即ち、Felici
et al. 、前記参照）およびｐIII(即ち、Scott et a
l.、前記参照）のようなコートタンパク質およびレセプ
タータンパク質をコードするファージ遺伝子中に挿入さ
れる。こうして確率論的に分布するヌクレオチド配列は
確率論的に分布するアミノ酸配列に翻訳され、ファージ
の表面上に存在させられる。
学的プロセス（即ち、Scott et al.、前記参照）は、確
率論的に分布するまたはランダムに変化したヌクレオチ
ド配列を１５〜６０位に含むオリゴヌクレオチドによる
ファージＤＮＡの組換えを基礎とする。次いで宿主細菌
が組換えファージＤＮＡで形質転換される。記載のケー
スでは、繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｄ、ｆ
１）が用いられる。この目的のために、オリゴヌクレオ
チドはファージの表面上におけるｐVIII（即ち、Felici
et al. 、前記参照）およびｐIII(即ち、Scott et a
l.、前記参照）のようなコートタンパク質およびレセプ
タータンパク質をコードするファージ遺伝子中に挿入さ
れる。こうして確率論的に分布するヌクレオチド配列は
確率論的に分布するアミノ酸配列に翻訳され、ファージ
の表面上に存在させられる。
【０００９】ペプチドバンクを作製する上でファ−ジを
用いることは、例えばファージが宿主として細菌を必要
とし、ファージの表面上における組換えタンパク質のコ
ピー数が比較的少ないという点で不利である。
用いることは、例えばファージが宿主として細菌を必要
とし、ファージの表面上における組換えタンパク質のコ
ピー数が比較的少ないという点で不利である。
【００１０】所望とされているペプチドを同定する上で
適当とされるスクリーニング方法は、用いられるレセプ
ターと特異的に反応するペプチドを約３×１０６〜４×
１０19の化合物（前記参照）の中から同定できねばなら
ない。
適当とされるスクリーニング方法は、用いられるレセプ
ターと特異的に反応するペプチドを約３×１０６〜４×
１０19の化合物（前記参照）の中から同定できねばなら
ない。
【００１１】その結果、スクリーニング方法における要
求はかなり高く、特別なアプローチを要する。
求はかなり高く、特別なアプローチを要する。
【００１２】従来技術として記載されたファージ‐ペプ
チドバンクのスクリーニングとその後の結合タンパク質
の同定は、下記のような Parmelyら(Gene,73,305-318(1
988)) により記載された方法で行われる。
チドバンクのスクリーニングとその後の結合タンパク質
の同定は、下記のような Parmelyら(Gene,73,305-318(1
988)) により記載された方法で行われる。
【００１３】組換えファージは、ペトリ皿に固定された
レセプターと共にインキュベートされる。結合しないフ
ァージは洗浄により除去される。結合ファージは、第二
工程において酸性緩衝液またはＳＨ試薬での処理により
放出され、その後栄養培地で増幅される。精製工程は、
特異的結合ファージの十分な高純度化が達成されるまで
（３〜４回）繰返されなければならない。次いで、ファ
ージのヌクレオチド配列が、挿入されたオリゴヌクレオ
チドの領域で決定され、そしてレセプター結合ペプチド
のアミノ酸配列が導き出される。こうしてそのペプチド
は化学合成されることとなる。
レセプターと共にインキュベートされる。結合しないフ
ァージは洗浄により除去される。結合ファージは、第二
工程において酸性緩衝液またはＳＨ試薬での処理により
放出され、その後栄養培地で増幅される。精製工程は、
特異的結合ファージの十分な高純度化が達成されるまで
（３〜４回）繰返されなければならない。次いで、ファ
ージのヌクレオチド配列が、挿入されたオリゴヌクレオ
チドの領域で決定され、そしてレセプター結合ペプチド
のアミノ酸配列が導き出される。こうしてそのペプチド
は化学合成されることとなる。
【００１４】しかしながら、このプロセスの欠点は、大
腸菌で感染により増幅させるために、結合ファージがキ
ャリアからまず放出されなければならないことである。
放出条件の選択によっては、放出されたファージはかな
り損傷されそれらがもはや増幅されないか、または、高
親和性（ひいては特に質的に重要な）ファージが放出さ
れず、したがって失われるという危険が伴う。
腸菌で感染により増幅させるために、結合ファージがキ
ャリアからまず放出されなければならないことである。
放出条件の選択によっては、放出されたファージはかな
り損傷されそれらがもはや増幅されないか、または、高
親和性（ひいては特に質的に重要な）ファージが放出さ
れず、したがって失われるという危険が伴う。
【００１５】
【発明の具体的説明】したがって、本発明の目的は、高
い量的および質的収率で所望のペプチドを得ることがで
きる方法を提供することある。
い量的および質的収率で所望のペプチドを得ることがで
きる方法を提供することある。
【００１６】この目的は、様々なペプチドが適切な微生
物の表面上に直接発現され、そのペプチドがレセプター
に直接到達できて、かつ、適切なスクリーニング方法を
用いて同定および単離されるような方法により達成され
る。ここで、ペプチドバンクの多様度は１０６以上であ
るべきである。
物の表面上に直接発現され、そのペプチドがレセプター
に直接到達できて、かつ、適切なスクリーニング方法を
用いて同定および単離されるような方法により達成され
る。ここで、ペプチドバンクの多様度は１０６以上であ
るべきである。
【００１７】したがって、本発明は既定の特異的結合パ
ートナーと結合するペプチドの製造法に関し、その方法
は： ａ）ヌクレオチド配列が確率論的に変化した領域を含
む、オリゴヌクレオチドの単離または合成、 ｂ）微生物の外被タンパク質を発現するベクターコード
遺伝子中に前記オリゴヌクレオチドが挿入されるよう行
われる、ベクター分子による前記オリゴヌクレオチドの
組換えであって、オリゴヌクレオチドは各ベクター分子
中に挿入され、それによってそれらヌクレオチド配列の
領域において互いに異なる様々なベクター分子（オリゴ
ヌクレオチドバンク）を生じるようにする組換え、 ｃ）前記組換えベクター分子による微生物の形質転換、 ｄ）組換えＤＮＡ配列を発現させ、対応する組換えタン
パク質を微生物の表面上に存在させることができる条件
下における前記形質転換微生物の培養、 ｅ）前記微生物と、固相に結合された既定の特異的結合
パートナーとのインキュベーションであって、所望のペ
プチドを発現した微生物が結合するインキュベーショ
ン、 ｆ）未結合微生物の除去、 ｇ）前記結合微生物の複製、 ｈ）前記結合微生物のクローニングおよび単離、 ｉ）対応ＤＮＡ配列の配列決定またはペプチド配列決定
によって行われる、確率論的に変化したアミノ酸配列の
決定、 ｊ）前記微生物から組換えタンパク質を単離するか、ま
たは、対応ペプチドの化学合成により、所望ペプチドを
得る 工程を含んでなり、微生物が細菌および哺乳動物細胞か
らなる群より選択される（大腸菌が微生物として有利に
用いられる）、方法である。
ートナーと結合するペプチドの製造法に関し、その方法
は： ａ）ヌクレオチド配列が確率論的に変化した領域を含
む、オリゴヌクレオチドの単離または合成、 ｂ）微生物の外被タンパク質を発現するベクターコード
遺伝子中に前記オリゴヌクレオチドが挿入されるよう行
われる、ベクター分子による前記オリゴヌクレオチドの
組換えであって、オリゴヌクレオチドは各ベクター分子
中に挿入され、それによってそれらヌクレオチド配列の
領域において互いに異なる様々なベクター分子（オリゴ
ヌクレオチドバンク）を生じるようにする組換え、 ｃ）前記組換えベクター分子による微生物の形質転換、 ｄ）組換えＤＮＡ配列を発現させ、対応する組換えタン
パク質を微生物の表面上に存在させることができる条件
下における前記形質転換微生物の培養、 ｅ）前記微生物と、固相に結合された既定の特異的結合
パートナーとのインキュベーションであって、所望のペ
プチドを発現した微生物が結合するインキュベーショ
ン、 ｆ）未結合微生物の除去、 ｇ）前記結合微生物の複製、 ｈ）前記結合微生物のクローニングおよび単離、 ｉ）対応ＤＮＡ配列の配列決定またはペプチド配列決定
によって行われる、確率論的に変化したアミノ酸配列の
決定、 ｊ）前記微生物から組換えタンパク質を単離するか、ま
たは、対応ペプチドの化学合成により、所望ペプチドを
得る 工程を含んでなり、微生物が細菌および哺乳動物細胞か
らなる群より選択される（大腸菌が微生物として有利に
用いられる）、方法である。
【００１８】前記工程ｂ）の組換えにおいて空のベクタ
ーまたは多数のオリゴヌクレオチドを含むベクターが得
られ、多数のオリゴヌクレオチドを含むベクターを意図
的に製造することがしばしば有利であることは当業者に
知られている。
ーまたは多数のオリゴヌクレオチドを含むベクターが得
られ、多数のオリゴヌクレオチドを含むベクターを意図
的に製造することがしばしば有利であることは当業者に
知られている。
【００１９】工程ｅ〜ｇ）で単離された生物が再度結合
パートナーと接触させられて、選択および増幅工程が繰
返される方法であることが好ましい。
パートナーと接触させられて、選択および増幅工程が繰
返される方法であることが好ましい。
【００２０】加えて、生物の表面上における組換えタン
パク質および選択されたレセプターが、一価結合反応
（monovalent binding reaction ）のみ可能であるよう
な濃度で存在する方法であることが好ましい。
パク質および選択されたレセプターが、一価結合反応
（monovalent binding reaction ）のみ可能であるよう
な濃度で存在する方法であることが好ましい。
【００２１】工程ｅ）における固相が粒状である方法が
特に有利であり、また磁気誘引性である固相がまた特に
有利である。
特に有利であり、また磁気誘引性である固相がまた特に
有利である。
【００２２】ベクターがプラスミドである方法であるこ
とが好ましい。
とが好ましい。
【００２３】ヌクレオチドが（ＮＮＫ）Ｘまたは（ＮＮ
Ｓ）Ｘで表されるコドンを含む方法も好ましく、ここで
ＮはヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴを表し、Ｋはヌク
レオチドＧおよびＴを表し、ＳはヌクレオチドＧおよび
Ｃを表し、Ｘは４〜２５の数、好ましくは６である。
Ｓ）Ｘで表されるコドンを含む方法も好ましく、ここで
ＮはヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴを表し、Ｋはヌク
レオチドＧおよびＴを表し、ＳはヌクレオチドＧおよび
Ｃを表し、Ｘは４〜２５の数、好ましくは６である。
【００２４】これに加えて、Ｘ＝８でかつヌクレオチド
が可能なオクタペプチドのフラクションのみをコードも
のである方法が好ましい。
が可能なオクタペプチドのフラクションのみをコードも
のである方法が好ましい。
【００２５】本発明は、合成オリゴヌクレオチドが、ア
ミノ酸のランダムな組合せをコードする一連のコドンを
含み、そのコドンの５´および３´領域において同様に
コートタンパク質配列と同一でなく、好ましくは抗体領
域をコードする配列を含んでなるものである方法にも関
する。
ミノ酸のランダムな組合せをコードする一連のコドンを
含み、そのコドンの５´および３´領域において同様に
コートタンパク質配列と同一でなく、好ましくは抗体領
域をコードする配列を含んでなるものである方法にも関
する。
【００２６】更に本発明は、合成オリゴヌクレオチド
が、アミノ酸のランダムな組合せをコードする一連のコ
ドンを含み、そのコドンの５´および３´領域において
有利にはプロリン残基から構成されるスペーサーをコー
ドする配列を含んでなるものである方法に関する。
が、アミノ酸のランダムな組合せをコードする一連のコ
ドンを含み、そのコドンの５´および３´領域において
有利にはプロリン残基から構成されるスペーサーをコー
ドする配列を含んでなるものである方法に関する。
【００２７】本発明は、微生物が電気穿孔により形質転
換される方法にも関する。
換される方法にも関する。
【００２８】加えて、本発明は、ヌクレオチドバンクが
少くとも１０６、有利には１０８、の成分単位からなる
方法に関する。
少くとも１０６、有利には１０８、の成分単位からなる
方法に関する。
【００２９】本発明は前記した方法のうち少くとも１つ
により製造されたペプチドにも関する。
により製造されたペプチドにも関する。
【００３０】本発明は更に、適当な場合はキャリアタン
パク質にカップリングされてなる上記ペプチドを用いて
産生された抗体に関する。
パク質にカップリングされてなる上記ペプチドを用いて
産生された抗体に関する。
【００３１】本発明は更に、選択されたレセプターと結
合しうる非常に多数の微生物の能力を同時に調べること
ができる方法（スクリーニング）に関する。
合しうる非常に多数の微生物の能力を同時に調べること
ができる方法（スクリーニング）に関する。
【００３２】本発明によるスクリーニング方法は、特に
既知の方法よりも簡単、迅速でかつ効率的である。その
方法のかなりな簡素化および促進は、微生物がもはや固
相から放出される必要がないという事実により達成され
ものである。同時に、これは高親和性を有するペプチド
を同定および単離することも可能にしている。磁気誘引
性微粒状固相を用いることにより、操作の一層の促進お
よび簡素化を実現することが可能となった。
既知の方法よりも簡単、迅速でかつ効率的である。その
方法のかなりな簡素化および促進は、微生物がもはや固
相から放出される必要がないという事実により達成され
ものである。同時に、これは高親和性を有するペプチド
を同定および単離することも可能にしている。磁気誘引
性微粒状固相を用いることにより、操作の一層の促進お
よび簡素化を実現することが可能となった。
【００３３】驚くべきことに、十分な複雑度のペプチド
バンクが大腸菌で直接作製できることが明らかとするこ
とができ、その結果ファージの使用と宿主の併用を不要
とすることができた。
バンクが大腸菌で直接作製できることが明らかとするこ
とができ、その結果ファージの使用と宿主の併用を不要
とすることができた。
【００３４】例えば、確率論的に分布されたヌクレオチ
ドの領域を有するオリゴヌクレオチドが製造された。こ
の領域は１２、１８、２４、３０またはそれ以上のヌク
レオチドからなるが、１８〜４５ヌクレオチドの領域が
好ましい。本発明においては、１８ヌクレオチドの領域
が選択され、その領域はそれに対応してランダムな組合
せで６アミノ酸をコードする。
ドの領域を有するオリゴヌクレオチドが製造された。こ
の領域は１２、１８、２４、３０またはそれ以上のヌク
レオチドからなるが、１８〜４５ヌクレオチドの領域が
好ましい。本発明においては、１８ヌクレオチドの領域
が選択され、その領域はそれに対応してランダムな組合
せで６アミノ酸をコードする。
【００３５】こうして製造されたＤＮＡは、外膜タンパ
ク質Ａ（ＯｍｐＡ）をコードするプラスミドベクターｐ
ＨＳ１６４‐Ｌ（ＥＰ ０ ３３５ ７３７ Ａ２）に
より組換えられた。可変ＤＮＡがＯｍｐＡ遺伝子に挿入
された。大腸菌に組み込んで形質転換した後、確率論的
に置換えられたアミノ酸を有するＯｍｐＡは大腸菌コー
ト上に存在させられ、その結果レセプターに到達可能と
なる。
ク質Ａ（ＯｍｐＡ）をコードするプラスミドベクターｐ
ＨＳ１６４‐Ｌ（ＥＰ ０ ３３５ ７３７ Ａ２）に
より組換えられた。可変ＤＮＡがＯｍｐＡ遺伝子に挿入
された。大腸菌に組み込んで形質転換した後、確率論的
に置換えられたアミノ酸を有するＯｍｐＡは大腸菌コー
ト上に存在させられ、その結果レセプターに到達可能と
なる。
【００３６】確率論的に変化したアミノ酸をＯｍｐＡタ
ンパク質の特定領域に存在させることができ、それによ
り本明細書において紹介した新規なスクリーニング方法
と組合せて、有用なペプチド配列を同定することができ
た。
ンパク質の特定領域に存在させることができ、それによ
り本明細書において紹介した新規なスクリーニング方法
と組合せて、有用なペプチド配列を同定することができ
た。
【００３７】ＯｍｐＡは３２５アミノ酸から構成され
た、大腸菌の外膜で非常に多く存在するタンパク質であ
る。これは感染および中毒の各々に際していくつかのフ
ァージおよびコリシンに関する外部レセプター構造とし
て働く。ＯｍｐＡは１０〜１３の主に親水性のアミノ酸
を有する４つの領域を含んでなる。これらの領域は２×
１５〜１７の主に疎水性のアミノ酸から構成される領域
により分けられる。ＯｍｐＡの三次元構造は未だ決定さ
れていないが、分光測定によれば、ＯｍｐＡをＮ末端の
半分がβ構造を有する８つの経膜領域から構成されるタ
ンパク質とするモデルが支持された。このモデルによれ
ば、アミノ酸２５、７０、１１０および１５４周辺にお
ける４つの親水性領域が細菌表面上で露出されている。
た、大腸菌の外膜で非常に多く存在するタンパク質であ
る。これは感染および中毒の各々に際していくつかのフ
ァージおよびコリシンに関する外部レセプター構造とし
て働く。ＯｍｐＡは１０〜１３の主に親水性のアミノ酸
を有する４つの領域を含んでなる。これらの領域は２×
１５〜１７の主に疎水性のアミノ酸から構成される領域
により分けられる。ＯｍｐＡの三次元構造は未だ決定さ
れていないが、分光測定によれば、ＯｍｐＡをＮ末端の
半分がβ構造を有する８つの経膜領域から構成されるタ
ンパク質とするモデルが支持された。このモデルによれ
ば、アミノ酸２５、７０、１１０および１５４周辺にお
ける４つの親水性領域が細菌表面上で露出されている。
【００３８】PistorおよびHobom(Klin.Wochenschr,198
8,66,110-116)はアミノ酸１１０周辺の領域でＯｍｐＡ
中に外来タンパク質配列を挿入することができ、その配
列自体も同様に大腸菌表面上で発現され、ＯｍｐＡ配列
の構造をはっきりと変えたりしないことを示した。
8,66,110-116)はアミノ酸１１０周辺の領域でＯｍｐＡ
中に外来タンパク質配列を挿入することができ、その配
列自体も同様に大腸菌表面上で発現され、ＯｍｐＡ配列
の構造をはっきりと変えたりしないことを示した。
【００３９】ＯｍｐＡの外膜タンパク質の成分としてヘ
キサペプチドを存在させることは、例えばこれまでの慣
用的なファージと比較して細菌の培養が簡便であるこ
と、細胞当たりかなり多い外膜タンパク質コピー数など
のような一連の利点を有する。
キサペプチドを存在させることは、例えばこれまでの慣
用的なファージと比較して細菌の培養が簡便であるこ
と、細胞当たりかなり多い外膜タンパク質コピー数など
のような一連の利点を有する。
【００４０】ここで用いられるスクリーニング方法は、
細菌の表面で確率論的に置換えられたアミノ酸を含むペ
プチドであって、このペプチドがレセプターと結合でき
るように発現されることに基づいている。レセプターは
粒子、好ましくは磁気誘引性の固相に結合される。多数
の細菌が固相と接触させられる。レセプター‐リガンド
反応が進行した後、特異的に結合した細菌は、結合しな
かった細菌から分離される。意外にも、特異的に結合し
た細菌を固相から放出させずに複製することができた。
もう一つの利点は、微粒状固相を用いた場合に反応時間
が短縮されることである。
細菌の表面で確率論的に置換えられたアミノ酸を含むペ
プチドであって、このペプチドがレセプターと結合でき
るように発現されることに基づいている。レセプターは
粒子、好ましくは磁気誘引性の固相に結合される。多数
の細菌が固相と接触させられる。レセプター‐リガンド
反応が進行した後、特異的に結合した細菌は、結合しな
かった細菌から分離される。意外にも、特異的に結合し
た細菌を固相から放出させずに複製することができた。
もう一つの利点は、微粒状固相を用いた場合に反応時間
が短縮されることである。
【００４１】下記適用例は、ペプチドバンクを製造、ス
クリーニングするための好ましい方法について説明する
ものである。
クリーニングするための好ましい方法について説明する
ものである。
【００４２】本発明に関する方法の利点および可能な応
用例は、抗体‐抗原結合の例を用いた以下の記載によっ
て明らかにされる。これらの例は限定的に理解されるべ
きでなく、抗体‐抗原結合という用語が本発明の意味内
でレセプター‐リガンド相互作用という用語と同義で用
いることができるからである。
用例は、抗体‐抗原結合の例を用いた以下の記載によっ
て明らかにされる。これらの例は限定的に理解されるべ
きでなく、抗体‐抗原結合という用語が本発明の意味内
でレセプター‐リガンド相互作用という用語と同義で用
いることができるからである。
【００４３】本方法によれば、天然リガンドの存在また
は性質に関する情報を何も有することなく、任意のレセ
プターに関するリガンドを単離しうる程度の複雑さの多
数の化合物を産生することができる。
は性質に関する情報を何も有することなく、任意のレセ
プターに関するリガンドを単離しうる程度の複雑さの多
数の化合物を産生することができる。
【００４４】加えて、各固定レセプターに対して異なる
親和性を有するリガンドが単離でき、そのリガンドから
最良の性質を有するものが選択できる。
親和性を有するリガンドが単離でき、そのリガンドから
最良の性質を有するものが選択できる。
【００４５】エピトープ地図化も化学方法を用いた場合
よりかなり効率的に実施できる。このため、モノクロー
ナル抗体に加えて、ポリクローナル抗体のような抗体の
混合物も分析できる。例えば、抗原の一次構造が知られ
ているならば、ポリクローナル抗体が向けられた多数の
エピトープを１回の操作で同定できる。
よりかなり効率的に実施できる。このため、モノクロー
ナル抗体に加えて、ポリクローナル抗体のような抗体の
混合物も分析できる。例えば、抗原の一次構造が知られ
ているならば、ポリクローナル抗体が向けられた多数の
エピトープを１回の操作で同定できる。
【００４６】
１）大腸菌におけるヘキサペプチドエピトープバンクの
作製 グラム陰性菌の外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）をコード
しかつポリクローニング部位を有するプラスミドベクタ
ーｐＨＳ１６４‐Ｌ（ＥＰ ０ ３５５ ７３７ Ａ
２）を、大腸菌の表面上にヘキサペプチド分子を配置す
るために選択した。すべてのヘキサペプチドの組合せを
コードすると思われるオリゴヌクレオチドを、ＣｌａＩ
およびＸｍａＩ制限部位中に挿入した。それらは、プロ
リンおよびグリシンのような更に５つの親水性アミノ酸
がその側に置かれ、ステム領域に似て細菌表面上にヘキ
サペプチド領域がより効率的に存在するよう意図されて
いる。こうして下記合成核酸配列を得た： 配列番号１：5' CG CCA GGA CCC CCG CCT NNK NNK NNK
NNK NNK NNK CCT CCT CCG CCA CC 3' ここで、“Ｎ”は４種すべての可能性（Ａ、Ｃ、Ｇ、
Ｔ）を表し、“Ｋ”はＧおよびＴのみを表す。このコー
ドは２０種すべての天然アミノ酸をランダムに示す。Ｃ
ｌａＩ／ＸｍａＩで開かれたベクター中にＤＮＡ二本鎖
を結合できるようにするため、上記一本鎖を、更に２つ
の逆相補性オリゴヌクレオチドにより、プロリンおよび
／またはグリシンおよびアルギニンのみをコードするそ
の末端領域で部分的に二本鎖に変換した。この目的のた
め、下記オリゴヌクレオチド： 配列番号２： 3' GGT CCT GGG GGC GGA 5' 配列番号３： 3' GGA GGC GGT GGG GCC 5' を合成して、ＤＮＡ一本鎖の保存領域とハイブリッド形
成させた。その結果、その末端領域で二本鎖化されたオ
リゴヌクレオチドを、８００位で開環ベクターのＣｌａ
ＩおよびＸｍａＩ制限部位中に結合させることができ、
さらに宿主細胞に組み込んで形質転換することができ
る。
作製 グラム陰性菌の外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）をコード
しかつポリクローニング部位を有するプラスミドベクタ
ーｐＨＳ１６４‐Ｌ（ＥＰ ０ ３５５ ７３７ Ａ
２）を、大腸菌の表面上にヘキサペプチド分子を配置す
るために選択した。すべてのヘキサペプチドの組合せを
コードすると思われるオリゴヌクレオチドを、ＣｌａＩ
およびＸｍａＩ制限部位中に挿入した。それらは、プロ
リンおよびグリシンのような更に５つの親水性アミノ酸
がその側に置かれ、ステム領域に似て細菌表面上にヘキ
サペプチド領域がより効率的に存在するよう意図されて
いる。こうして下記合成核酸配列を得た： 配列番号１：5' CG CCA GGA CCC CCG CCT NNK NNK NNK
NNK NNK NNK CCT CCT CCG CCA CC 3' ここで、“Ｎ”は４種すべての可能性（Ａ、Ｃ、Ｇ、
Ｔ）を表し、“Ｋ”はＧおよびＴのみを表す。このコー
ドは２０種すべての天然アミノ酸をランダムに示す。Ｃ
ｌａＩ／ＸｍａＩで開かれたベクター中にＤＮＡ二本鎖
を結合できるようにするため、上記一本鎖を、更に２つ
の逆相補性オリゴヌクレオチドにより、プロリンおよび
／またはグリシンおよびアルギニンのみをコードするそ
の末端領域で部分的に二本鎖に変換した。この目的のた
め、下記オリゴヌクレオチド： 配列番号２： 3' GGT CCT GGG GGC GGA 5' 配列番号３： 3' GGA GGC GGT GGG GCC 5' を合成して、ＤＮＡ一本鎖の保存領域とハイブリッド形
成させた。その結果、その末端領域で二本鎖化されたオ
リゴヌクレオチドを、８００位で開環ベクターのＣｌａ
ＩおよびＸｍａＩ制限部位中に結合させることができ、
さらに宿主細胞に組み込んで形質転換することができ
る。
【００４７】実行：ＤＮＡ組立のために、ベクターｐＨ
Ｓ１６４‐ＬのＤＮＡはＤＮＡ配列5' AT'CGAT 3' を認
識する制限酵素ＣｌａＩ、およびＤＮＡ配列5' C'CCGGG
3' を認識するＸｍａＩによりマルチポリクローニング
部位で開き、その後ゲル電気泳動により精製した。可能
性として６４×１０６ヘキサペプチドをコードするオリ
ゴヌクレオチドと、ステム領域に寄与する隣接アミノ酸
プロリンおよび／またはグリシンとを、これらの開裂部
位中に結合させた。リガーゼ反応は、室温で２４時間に
わたり、１０μｌの全リガーゼ混合液中に開環ベクター
１０μｇおよび二本鎖ハイブリッド形成オリゴヌクレオ
チド０．１５４μｇを用いて行った。電気穿孔による形
質転換前に、ＤＮＡはセントリコン(Centrikon、商品
名) ３０微量濃縮器（Amicon， Beverly，ＭＡ，ＵＳ
Ａ）を用いて脱塩した。標準的な方法で既にコンピテン
ト化された大腸菌株４９０Ａの細胞中に、このＤＮＡを
組み込む形質転換は、０．２cm径のキュベット中２．４
kV、４００オーム、２５μFDにおいてジーン・パルサー
(Gene Pulser、商品名）（BioRad，Richmond，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）による電気穿孔により、コンピテント細胞１００
μｌ中リガーゼ混合物からのＤＮＡ１μｇを用いて行っ
た。上記の１０の形質転換混合物を集めて合わせ、最終
的に３×１０８形質転換細胞を得た。形質転換細胞の４
２％がヘキサペプチドをコードするＤＮＡを取り込んで
いることが、異なる細胞クローンの制限切断により示さ
れた。その結果、ヘキサペプチドをもっぱらコードする
組換えプラスミドの平均形質転換効率は約１．２６×１
０７／μｇであった。こうしてすべての理論的に可能な
ヘキサペプチド組合せが２回発現された。エピトープバ
ンクを１ml培養液に分け、１０％グリセロールと一緒に
−８０℃で凍結させた。
Ｓ１６４‐ＬのＤＮＡはＤＮＡ配列5' AT'CGAT 3' を認
識する制限酵素ＣｌａＩ、およびＤＮＡ配列5' C'CCGGG
3' を認識するＸｍａＩによりマルチポリクローニング
部位で開き、その後ゲル電気泳動により精製した。可能
性として６４×１０６ヘキサペプチドをコードするオリ
ゴヌクレオチドと、ステム領域に寄与する隣接アミノ酸
プロリンおよび／またはグリシンとを、これらの開裂部
位中に結合させた。リガーゼ反応は、室温で２４時間に
わたり、１０μｌの全リガーゼ混合液中に開環ベクター
１０μｇおよび二本鎖ハイブリッド形成オリゴヌクレオ
チド０．１５４μｇを用いて行った。電気穿孔による形
質転換前に、ＤＮＡはセントリコン(Centrikon、商品
名) ３０微量濃縮器（Amicon， Beverly，ＭＡ，ＵＳ
Ａ）を用いて脱塩した。標準的な方法で既にコンピテン
ト化された大腸菌株４９０Ａの細胞中に、このＤＮＡを
組み込む形質転換は、０．２cm径のキュベット中２．４
kV、４００オーム、２５μFDにおいてジーン・パルサー
(Gene Pulser、商品名）（BioRad，Richmond，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）による電気穿孔により、コンピテント細胞１００
μｌ中リガーゼ混合物からのＤＮＡ１μｇを用いて行っ
た。上記の１０の形質転換混合物を集めて合わせ、最終
的に３×１０８形質転換細胞を得た。形質転換細胞の４
２％がヘキサペプチドをコードするＤＮＡを取り込んで
いることが、異なる細胞クローンの制限切断により示さ
れた。その結果、ヘキサペプチドをもっぱらコードする
組換えプラスミドの平均形質転換効率は約１．２６×１
０７／μｇであった。こうしてすべての理論的に可能な
ヘキサペプチド組合せが２回発現された。エピトープバ
ンクを１ml培養液に分け、１０％グリセロールと一緒に
−８０℃で凍結させた。
【００４８】２）抗体へのＭ４５０磁気粒子のカップリ
ング 異なるウイルスペプチドに対する３種のモノクローナル
抗体の例を用いて、１．２×１０８以上のヘキサペプチ
ドが得られる細菌エピトープバンクから、標的化方式に
よって、関連抗体により特定のエピトープが選択される
ことは以下によって証明できる。＊ ａに関して：Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｅＡｇに対する
ＭＡｂ‐１４４／１５８(Molecular Immunology,28,199
1,719-726)＊ ｂに関して：ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルスのｇａｇ
タンパク質のアミノ酸１２０〜１３０を含む合成ペプチ
ドに対するＭＡｂ‐９１‐１９５／０３９(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,80,1983,3618-3622)＊ ｃに関して：サイトメガロウイルスのｐｐ１５０タン
パク質のエピトープに対するＭＡｂ‐８７‐５５／０２
／２（ＥＰＡ ０ ５３４ １０２ Ａ１）
ング 異なるウイルスペプチドに対する３種のモノクローナル
抗体の例を用いて、１．２×１０８以上のヘキサペプチ
ドが得られる細菌エピトープバンクから、標的化方式に
よって、関連抗体により特定のエピトープが選択される
ことは以下によって証明できる。＊ ａに関して：Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｅＡｇに対する
ＭＡｂ‐１４４／１５８(Molecular Immunology,28,199
1,719-726)＊ ｂに関して：ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルスのｇａｇ
タンパク質のアミノ酸１２０〜１３０を含む合成ペプチ
ドに対するＭＡｂ‐９１‐１９５／０３９(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,80,1983,3618-3622)＊ ｃに関して：サイトメガロウイルスのｐｐ１５０タン
パク質のエピトープに対するＭＡｂ‐８７‐５５／０２
／２（ＥＰＡ ０ ５３４ １０２ Ａ１）
【００４９】実行：＊ ａに関して：エピトープバンクをモノクローナル抗体
ＭＡｂ‐１４４／１５８でスクリーニングするため、後
者をＭ４５０磁気粒子（マグネトビーズ(Magnetobeads)
Ｍ４５０，ダイナビーズ(Dynabeads、商品名),ダイナル
Ａ．Ｓ．(Dynal A.S.)，ノルウェー）にカップリングさ
せた。このため、磁気粒子２５０μｌおよび抗体７５μ
ｇをｐＨ＝９．５の４０mMホウ酸緩衝液１mlにいれた。
この混合液を室温で一夜振盪し、その後磁気分離ユニッ
トにおいて貯蔵緩衝液（５０mM ２‐〔Ｎ‐シクロヘキ
シルアミノ〕エタンスルホン酸‐略記ＣＨＥＳ、０．０
１％アジ化ナトリウム）で３回洗浄した。最後に、磁気
粒子にカップリングされた抗体を貯蔵緩衝液１ml中４℃
で貯蔵した。使用（スクリーニング）直前に、それらを
ＬＢ培地で３回洗浄した。＊ ｂおよびｃに関して：エピトープバンクをモノクロー
ナル抗体ＭＡｂ‐９１‐１９５／０３９およびＭＡｂ‐
８７‐５５／０２／２でスクリーニングするため、これ
らの後者をＭ１‐０７０／４０磁気粒子（ロット３８
３）（エスタポー(Estapor、商品名) 微小球，ローヌ‐
プーランク(Rhone-Poulenc),フランス）にカップリング
させた。磁気粒子５００μｌを磁気分離ユニットにおい
てカップリング緩衝液（１００mM Ｎ‐２‐ヒドロキシ
エチルピペラジン‐Ｎ´‐２‐エタンスルホン酸‐略記
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ４．７）５mlで３回洗浄し、その後カ
ップリング緩衝液８mlにいれた。振盪しながら、抗体
１．５mgおよび１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミドＨＣｌの溶液２ml（２mg/ml)
を加え、混合液の容量をカップリング緩衝液で２０mlに
した。懸濁液を振盪しながら４℃で１６時間インキュベ
ートした。次いで磁気粒子を磁気分離ユニットにおいて
貯蔵緩衝液（５０mM ２‐〔Ｎ‐シクロヘキシルアミ
ノ〕エタンスルホン酸‐略記ＣＨＥＳ、０．０１％アジ
化ナトリウム）で３回洗浄した。最後に、磁気粒子にカ
ップリングされた抗体を貯蔵緩衝液１ml中４℃で貯蔵し
た。使用（スクリーニング）直前に、それらをＬＢ培地
で３回洗浄した。
ＭＡｂ‐１４４／１５８でスクリーニングするため、後
者をＭ４５０磁気粒子（マグネトビーズ(Magnetobeads)
Ｍ４５０，ダイナビーズ(Dynabeads、商品名),ダイナル
Ａ．Ｓ．(Dynal A.S.)，ノルウェー）にカップリングさ
せた。このため、磁気粒子２５０μｌおよび抗体７５μ
ｇをｐＨ＝９．５の４０mMホウ酸緩衝液１mlにいれた。
この混合液を室温で一夜振盪し、その後磁気分離ユニッ
トにおいて貯蔵緩衝液（５０mM ２‐〔Ｎ‐シクロヘキ
シルアミノ〕エタンスルホン酸‐略記ＣＨＥＳ、０．０
１％アジ化ナトリウム）で３回洗浄した。最後に、磁気
粒子にカップリングされた抗体を貯蔵緩衝液１ml中４℃
で貯蔵した。使用（スクリーニング）直前に、それらを
ＬＢ培地で３回洗浄した。＊ ｂおよびｃに関して：エピトープバンクをモノクロー
ナル抗体ＭＡｂ‐９１‐１９５／０３９およびＭＡｂ‐
８７‐５５／０２／２でスクリーニングするため、これ
らの後者をＭ１‐０７０／４０磁気粒子（ロット３８
３）（エスタポー(Estapor、商品名) 微小球，ローヌ‐
プーランク(Rhone-Poulenc),フランス）にカップリング
させた。磁気粒子５００μｌを磁気分離ユニットにおい
てカップリング緩衝液（１００mM Ｎ‐２‐ヒドロキシ
エチルピペラジン‐Ｎ´‐２‐エタンスルホン酸‐略記
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ４．７）５mlで３回洗浄し、その後カ
ップリング緩衝液８mlにいれた。振盪しながら、抗体
１．５mgおよび１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミドＨＣｌの溶液２ml（２mg/ml)
を加え、混合液の容量をカップリング緩衝液で２０mlに
した。懸濁液を振盪しながら４℃で１６時間インキュベ
ートした。次いで磁気粒子を磁気分離ユニットにおいて
貯蔵緩衝液（５０mM ２‐〔Ｎ‐シクロヘキシルアミ
ノ〕エタンスルホン酸‐略記ＣＨＥＳ、０．０１％アジ
化ナトリウム）で３回洗浄した。最後に、磁気粒子にカ
ップリングされた抗体を貯蔵緩衝液１ml中４℃で貯蔵し
た。使用（スクリーニング）直前に、それらをＬＢ培地
で３回洗浄した。
【００５０】３）エピトープバンクのスクリーニング 実行：−８０℃で貯蔵されたエピトープバンクの培養液
１mlを解凍し、Ｌブロス培地／５０μg/mlアンピシリン
２００ml中において３７℃で一夜インキュベートした。
朝にこの培養液１mlをＬブロス／アンピシリン２００ml
に再度加え、ＯＤ600nm ＝０．５まで３７℃でインキュ
ベートした。細胞を１mMＩＰＴＧ（イソプロピルβ‐チ
オガラクトシド）の存在下で誘導し、その後同様の条件
下で更に２時間インキュベートした。エピトープバンク
をモノクローナル抗体でスクリーニングするため、更に
９００μｌのＬブロス／アンピシリンを細胞培養液１０
０μｌに加え、その後この混合液を磁気粒子にカップリ
ングされた抗体（７５μg/ml）１０μｌと一緒に穏やか
に攪拌しながら、１％Tween ２０の存在下４℃で１時間
インキュベートした。磁気分離装置を用いて磁気粒子を
ＭＡｂとそれらに結合されたすべての細胞とともに分離
し、洗浄緩衝液（１０mMトリス／ｐＨ＝７．４、０．９
％ＮａＣｌ、１％ Tween２０）で更に４回洗浄し、その
後Ｌブロス／アンピシリン２００μｌにいれた。この混
合液１０μｌをアンピシリン含有Ｌブロス寒天上に塗布
し、３７℃で一夜インキュベートした。平均で５００〜
１０００のコロニーがこのプレート上で成長した。磁気
粒子に結合された同様のＭＡｂによるこれら細胞の追加
スクリーニングのために、細胞をＬブロス１mlで洗浄
し、ＯＤ600nm ＝０．５まで、３７℃においてＬブロス
／アンピシリン３００ml中で再度インキュベートした。
次いで細胞を１mMＩＰＴＧで再度誘導した；次いで２回
目のスクリーニングを前記と同様の条件下で行った。Ｍ
Ａｂによるスクリーニングを全部で４回繰返した。
１mlを解凍し、Ｌブロス培地／５０μg/mlアンピシリン
２００ml中において３７℃で一夜インキュベートした。
朝にこの培養液１mlをＬブロス／アンピシリン２００ml
に再度加え、ＯＤ600nm ＝０．５まで３７℃でインキュ
ベートした。細胞を１mMＩＰＴＧ（イソプロピルβ‐チ
オガラクトシド）の存在下で誘導し、その後同様の条件
下で更に２時間インキュベートした。エピトープバンク
をモノクローナル抗体でスクリーニングするため、更に
９００μｌのＬブロス／アンピシリンを細胞培養液１０
０μｌに加え、その後この混合液を磁気粒子にカップリ
ングされた抗体（７５μg/ml）１０μｌと一緒に穏やか
に攪拌しながら、１％Tween ２０の存在下４℃で１時間
インキュベートした。磁気分離装置を用いて磁気粒子を
ＭＡｂとそれらに結合されたすべての細胞とともに分離
し、洗浄緩衝液（１０mMトリス／ｐＨ＝７．４、０．９
％ＮａＣｌ、１％ Tween２０）で更に４回洗浄し、その
後Ｌブロス／アンピシリン２００μｌにいれた。この混
合液１０μｌをアンピシリン含有Ｌブロス寒天上に塗布
し、３７℃で一夜インキュベートした。平均で５００〜
１０００のコロニーがこのプレート上で成長した。磁気
粒子に結合された同様のＭＡｂによるこれら細胞の追加
スクリーニングのために、細胞をＬブロス１mlで洗浄
し、ＯＤ600nm ＝０．５まで、３７℃においてＬブロス
／アンピシリン３００ml中で再度インキュベートした。
次いで細胞を１mMＩＰＴＧで再度誘導した；次いで２回
目のスクリーニングを前記と同様の条件下で行った。Ｍ
Ａｂによるスクリーニングを全部で４回繰返した。
【００５１】４）陽性クローンの分析 ４ａ）ＭＡｂ１４４／１５８（ＨＢｅＡＧ）によるスク
リーニング 次いで、モノクローナル抗体ＭＡｂ１４４／１５８でス
クリーニングすることにより単離することができた陽性
クローンを分析するために、３つの異なる方法を用い
た。阻害実験を、遊離ＭＡｂ１４４／１５８を加えるこ
とによりＭＡｂ１４４／１５８にカップリングされた磁
気粒子への陽性クローンの結合を妨げることができるか
どうかについて試験するために実施した。ＯｍｐＡタン
パク質に組み込まれたエピトープ領域へのモノクローナ
ル抗体１４４／１５８の結合を、ウエスタンブロット分
析を利用して調べ、対応エピトープ領域の核酸配列を配
列分析により最後に決定した。これらの実験では、詳細
な地図化により常法でSallbergら,1991,Molecular Immu
nology,28,719-726 で既に決定されていたアミノ酸配列
Ｔ‐Ｐ‐Ｐ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒを有する１つのペプチドを同定
した。
リーニング 次いで、モノクローナル抗体ＭＡｂ１４４／１５８でス
クリーニングすることにより単離することができた陽性
クローンを分析するために、３つの異なる方法を用い
た。阻害実験を、遊離ＭＡｂ１４４／１５８を加えるこ
とによりＭＡｂ１４４／１５８にカップリングされた磁
気粒子への陽性クローンの結合を妨げることができるか
どうかについて試験するために実施した。ＯｍｐＡタン
パク質に組み込まれたエピトープ領域へのモノクローナ
ル抗体１４４／１５８の結合を、ウエスタンブロット分
析を利用して調べ、対応エピトープ領域の核酸配列を配
列分析により最後に決定した。これらの実験では、詳細
な地図化により常法でSallbergら,1991,Molecular Immu
nology,28,719-726 で既に決定されていたアミノ酸配列
Ｔ‐Ｐ‐Ｐ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒを有する１つのペプチドを同定
した。
【００５２】実行：阻害実験 スクリーニングからの個別的クローンを一夜インキュベ
ートし、培養液を翌朝希釈し、最後にＩＰＴＧで誘導し
た。次いで細胞培養液をＬブロス／アンピシリンで１：
１００希釈し（全サンプル容量２５０μｌ）、その後１
％ Tween２０および異なる濃度の遊離ＭＡｂ１４４／１
５８（１０〜１００μg/mlサンプル）の存在下、４℃で
１時間インキュベートした。次いで磁気粒子を結合ＭＡ
ｂ１４４／１５８と共に加え、混合液を再度４℃で１時
間インキュベートした。次いで磁気分離装置を用いて細
胞を再度単離した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次い
で細胞をＬブロス／アンピシリン５００μｌにいれ、各
場合においてこの懸濁液２０μｌをＬブロス寒天／アン
ピシリン上に塗布した。それと平行して、一連の実験を
遊離ＭＡｂ１４４／１５８の添加なしに行った（陽性コ
ントロール）。加えて、いかなるインサートも含まない
ベクターｐＨＳ１６４‐Ｌで形質転換された細胞を用い
た実験も行った（陰性コントロール）。その実験では、
磁気粒子に結合されたＭＡｂ１４４／１５８への細胞の
結合が反応サンプルへの遊離ＭＡｂ１４４／１５８の添
加により５０〜１００倍減少することが証明された。逆
に、磁気粒子への細胞の結合は陽性コントロールで損な
われず、予想通りに細胞結合は陰性コントロールで生じ
なかった。
ートし、培養液を翌朝希釈し、最後にＩＰＴＧで誘導し
た。次いで細胞培養液をＬブロス／アンピシリンで１：
１００希釈し（全サンプル容量２５０μｌ）、その後１
％ Tween２０および異なる濃度の遊離ＭＡｂ１４４／１
５８（１０〜１００μg/mlサンプル）の存在下、４℃で
１時間インキュベートした。次いで磁気粒子を結合ＭＡ
ｂ１４４／１５８と共に加え、混合液を再度４℃で１時
間インキュベートした。次いで磁気分離装置を用いて細
胞を再度単離した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次い
で細胞をＬブロス／アンピシリン５００μｌにいれ、各
場合においてこの懸濁液２０μｌをＬブロス寒天／アン
ピシリン上に塗布した。それと平行して、一連の実験を
遊離ＭＡｂ１４４／１５８の添加なしに行った（陽性コ
ントロール）。加えて、いかなるインサートも含まない
ベクターｐＨＳ１６４‐Ｌで形質転換された細胞を用い
た実験も行った（陰性コントロール）。その実験では、
磁気粒子に結合されたＭＡｂ１４４／１５８への細胞の
結合が反応サンプルへの遊離ＭＡｂ１４４／１５８の添
加により５０〜１００倍減少することが証明された。逆
に、磁気粒子への細胞の結合は陽性コントロールで損な
われず、予想通りに細胞結合は陰性コントロールで生じ
なかった。
【００５３】ウエスタンブロット分析 ＭＡｂ１４４／１５８によるスクリーニングにより見出
され、それらの結合が阻害実験において遊離ＭＡｂ１４
４／１５８により阻害された細胞クローンを、次にウエ
スタンブロット分析に付した。この分析において、すべ
てのクローンは膜タンパク質ＯｍｐＡのサイズに相当す
る陽性反応タンパク質バンドを示した。
され、それらの結合が阻害実験において遊離ＭＡｂ１４
４／１５８により阻害された細胞クローンを、次にウエ
スタンブロット分析に付した。この分析において、すべ
てのクローンは膜タンパク質ＯｍｐＡのサイズに相当す
る陽性反応タンパク質バンドを示した。
【００５４】ＤＮＡ配列分析 次いで、前記分析で陽性に反応したすべての細胞クロー
ンをＤＮＡ配列分析に付した。そのため、ベクターＤＮ
Ａを慣用的方法により二本鎖ＤＮＡとして単離し、サン
ガーの方法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,74,5463-5467) によりベクター特異性オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて配列決定した。その分析によ
れば、１つの例外を除き、ＭＡｂ１４４／１５８が認識
する原ペプチド配列、即ちＴ‐Ｐ‐Ｐ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ、を
コードするＤＮＡ配列をすべての陽性クローンが含でい
ることが証明された。１つの細胞クローンの対応ＤＮＡ
配列はこの原配列とは異なり、代わりに下記アミノ酸配
列配列番号４をコードするヌクレオチド配列を有してい
た。 配列番号４ Leu Pro Pro Ala Phe Arg
ンをＤＮＡ配列分析に付した。そのため、ベクターＤＮ
Ａを慣用的方法により二本鎖ＤＮＡとして単離し、サン
ガーの方法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,74,5463-5467) によりベクター特異性オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて配列決定した。その分析によ
れば、１つの例外を除き、ＭＡｂ１４４／１５８が認識
する原ペプチド配列、即ちＴ‐Ｐ‐Ｐ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ、を
コードするＤＮＡ配列をすべての陽性クローンが含でい
ることが証明された。１つの細胞クローンの対応ＤＮＡ
配列はこの原配列とは異なり、代わりに下記アミノ酸配
列配列番号４をコードするヌクレオチド配列を有してい
た。 配列番号４ Leu Pro Pro Ala Phe Arg
【００５５】４ｂ）陽性クローンの分析：ＭＡｂ９１‐
１９５／０３９（ＨＴＬＶ）によるスクリーニング 次に、モノクローナル抗体ＭＡｂ９１‐１９５／０３９
によるスクリーニングで単離することができた陽性クロ
ーンを分析するために、３つの異なる方法を用いた。阻
害実験を、遊離ＭＡｂ９１‐１９５／０３９を加えるこ
とでＭＡｂ９１‐１９５／０３９にカップリングされた
磁気粒子への陽性クローンの結合を妨げることができる
かどうかについて試験するために実施した。ＯｍｐＡタ
ンパク質中に組み込まれたエピトープ領域へのモノクロ
ーナル抗体９１‐１９５／０３９の結合をウエスタンブ
ロット分析によって調べ、対応エピトープ領域の核酸配
列を配列分析により最後に決定した。その配列が、免疫
抗原のＰＹＶＥＰＹＡＰＱＶＬ領域とは異なるペプチド
が、もっぱら見出だされた(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,19
83,80,3618-3622)。
１９５／０３９（ＨＴＬＶ）によるスクリーニング 次に、モノクローナル抗体ＭＡｂ９１‐１９５／０３９
によるスクリーニングで単離することができた陽性クロ
ーンを分析するために、３つの異なる方法を用いた。阻
害実験を、遊離ＭＡｂ９１‐１９５／０３９を加えるこ
とでＭＡｂ９１‐１９５／０３９にカップリングされた
磁気粒子への陽性クローンの結合を妨げることができる
かどうかについて試験するために実施した。ＯｍｐＡタ
ンパク質中に組み込まれたエピトープ領域へのモノクロ
ーナル抗体９１‐１９５／０３９の結合をウエスタンブ
ロット分析によって調べ、対応エピトープ領域の核酸配
列を配列分析により最後に決定した。その配列が、免疫
抗原のＰＹＶＥＰＹＡＰＱＶＬ領域とは異なるペプチド
が、もっぱら見出だされた(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,19
83,80,3618-3622)。
【００５６】実行：阻害実験 スクリーニングからの個々のクローンを一夜インキュベ
ートし、培養液を翌朝希釈し、最後にＩＰＴＧで誘導し
た。次いで細胞培養液をＬブロス／アンピシリンで１：
１００希釈し（全サンプル容量２５０μｌ）、その後１
％ Tween２０および異なる濃度の遊離ＭＡｂ９１‐１９
５／０３９（１０〜１００μg/mlサンプル）の存在下、
４℃で１時間インキュベートした。次いで、磁気粒子を
結合ＭＡｂ９１‐１９５／０３９と共に加え、混合液を
再度４℃で１時間インキュベートした。その後、磁気分
離装置を用いて細胞を再度単離し、洗浄緩衝液で３回洗
浄した。次いで細胞をＬブロス／アンピシリン５００μ
ｌにいれ、各場合においてこの懸濁液２０μｌをＬブロ
ス寒天／アンピシリン上に塗布した。それと平行して、
一連の実験を遊離ＭＡｂ９１‐１９５／０３９の添加な
しに行った（陽性コントロール）。加えて、いかなるイ
ンサートも含まないベクターｐＨＳ１６４‐Ｌで形質転
換された細胞を用いた実験も行った（陰性コントロー
ル）。この実験では、磁気粒子に結合されたＭＡｂ９１
‐１９５／０３９への細胞の結合が反応サンプルへの遊
離ＭＡｂ９１‐１９５／０３９の添加により２０〜３０
倍減少することが証明された。逆に、磁気粒子への細胞
の結合は陽性コントロールで損なわれず、予想通りに細
胞結合は陰性コントロールで生じなかった。
ートし、培養液を翌朝希釈し、最後にＩＰＴＧで誘導し
た。次いで細胞培養液をＬブロス／アンピシリンで１：
１００希釈し（全サンプル容量２５０μｌ）、その後１
％ Tween２０および異なる濃度の遊離ＭＡｂ９１‐１９
５／０３９（１０〜１００μg/mlサンプル）の存在下、
４℃で１時間インキュベートした。次いで、磁気粒子を
結合ＭＡｂ９１‐１９５／０３９と共に加え、混合液を
再度４℃で１時間インキュベートした。その後、磁気分
離装置を用いて細胞を再度単離し、洗浄緩衝液で３回洗
浄した。次いで細胞をＬブロス／アンピシリン５００μ
ｌにいれ、各場合においてこの懸濁液２０μｌをＬブロ
ス寒天／アンピシリン上に塗布した。それと平行して、
一連の実験を遊離ＭＡｂ９１‐１９５／０３９の添加な
しに行った（陽性コントロール）。加えて、いかなるイ
ンサートも含まないベクターｐＨＳ１６４‐Ｌで形質転
換された細胞を用いた実験も行った（陰性コントロー
ル）。この実験では、磁気粒子に結合されたＭＡｂ９１
‐１９５／０３９への細胞の結合が反応サンプルへの遊
離ＭＡｂ９１‐１９５／０３９の添加により２０〜３０
倍減少することが証明された。逆に、磁気粒子への細胞
の結合は陽性コントロールで損なわれず、予想通りに細
胞結合は陰性コントロールで生じなかった。
【００５７】ウエスタンブロット分析 ＭＡｂ９１‐１９５／０３９によるスクリーニングで見
出され、それらの結合が阻害実験において遊離ＭＡｂ９
１‐１９５／０３９により明らかに阻害された細胞クロ
ーンを、次にウエスタンブロット分析に付した。１つの
例外を除き、すべてのクローンはこの分析において膜タ
ンパク質ＯｍｐＡのサイズに相当する陽性反応タンパク
質バンドを示した。
出され、それらの結合が阻害実験において遊離ＭＡｂ９
１‐１９５／０３９により明らかに阻害された細胞クロ
ーンを、次にウエスタンブロット分析に付した。１つの
例外を除き、すべてのクローンはこの分析において膜タ
ンパク質ＯｍｐＡのサイズに相当する陽性反応タンパク
質バンドを示した。
【００５８】ＤＮＡ配列分析 次いで、抗体スクリーニングにより見出された細胞クロ
ーンをＤＮＡ配列分析に付した。そのため、ベクターＤ
ＮＡを慣用的方法により二本鎖ＤＮＡとして単離し、サ
ンガーの方法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,74,5463-5467) により、ベクター特異性オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて配列決定した。その分析
では例外なしにすべてのクローンがＭＡｂ９１‐１９５
／０３９が認識する野生型配列Pro-Tyr-Val-Glu-Pro-Th
r-Ala-Pro-Gln-Val-Leu に対応しないＤＮＡ配列を含む
ことが証明された。確かに全部で８種の異なるペプチド
配列が陽性クローンでみられ、その配列はウエスタンブ
ロット分析、阻害実験または双方の操作で陽性に反応し
た。下記ペプチド配列が見出だされた： 配列番号５ Phe Leu Phe Pro Thr Ser クローン５ 配列番号６ Met Asn Phe Asn Ser Ser クローン８ 配列番号７ Ser Leu Ala Ala Thr Trp クローン９ 配列番号８ Val Asn Ile Asn Ser Gln クローン１２ 配列番号９ Val Asn Tyr Asn Ser Ser クローン１３ 配列番号１０ Phe Ile Ala Pro Met Gly クローン３０ 配列番号１１ Tyr Ile Leu Ala Thr Leu クローン３１ 配列番号１２ Tyr Leu Ser Pro Phe Gly クローン３３
ーンをＤＮＡ配列分析に付した。そのため、ベクターＤ
ＮＡを慣用的方法により二本鎖ＤＮＡとして単離し、サ
ンガーの方法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,74,5463-5467) により、ベクター特異性オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて配列決定した。その分析
では例外なしにすべてのクローンがＭＡｂ９１‐１９５
／０３９が認識する野生型配列Pro-Tyr-Val-Glu-Pro-Th
r-Ala-Pro-Gln-Val-Leu に対応しないＤＮＡ配列を含む
ことが証明された。確かに全部で８種の異なるペプチド
配列が陽性クローンでみられ、その配列はウエスタンブ
ロット分析、阻害実験または双方の操作で陽性に反応し
た。下記ペプチド配列が見出だされた： 配列番号５ Phe Leu Phe Pro Thr Ser クローン５ 配列番号６ Met Asn Phe Asn Ser Ser クローン８ 配列番号７ Ser Leu Ala Ala Thr Trp クローン９ 配列番号８ Val Asn Ile Asn Ser Gln クローン１２ 配列番号９ Val Asn Tyr Asn Ser Ser クローン１３ 配列番号１０ Phe Ile Ala Pro Met Gly クローン３０ 配列番号１１ Tyr Ile Leu Ala Thr Leu クローン３１ 配列番号１２ Tyr Leu Ser Pro Phe Gly クローン３３
【００５９】４ｃ）陽性クローンの分析：ＭＡｂ８７‐
５５／０２／２（ＣＭＶ）によるスクリーニング ３つの異なる方法を、モノクローナル抗体ＭＡｂ８７‐
５５／０２／２によるスクリーニングで単離することが
できた陽性クローンを分析するために用いた。阻害実験
を、遊離ＭＡｂ８７‐５５／０２／２を加えることでＭ
Ａｂ８７‐５５／０２／２にカップリングされた磁気粒
子への陽性クローンの結合を妨げることができるかどう
かについて試験するために実施した。ＯｍｐＡタンパク
質中に組み込まれたエピトープ領域へのモノクローナル
抗体８７‐５５／０２／２の結合をウエスタンブロット
分析によって調べ、対応エピトープ領域の核酸配列を配
列分析により最後に決定した。ｐｐ１５０エピトープの
ＣＭＶ野生型配列と相同的であるかまたはそれに類似し
たペプチドが見出された。そのエピトープはアミノ酸配
列Asp-Met-Asn-Pro-Ala-Asn-Trp-Pro-Arg-Glu-Arg-Ala-
Trp-Ala-Leu を有することが、詳細な地図化による常法
でStuberら（ＥＰ‐Ａ‐０ ５３４ １０２）により既
に決定されていた。
５５／０２／２（ＣＭＶ）によるスクリーニング ３つの異なる方法を、モノクローナル抗体ＭＡｂ８７‐
５５／０２／２によるスクリーニングで単離することが
できた陽性クローンを分析するために用いた。阻害実験
を、遊離ＭＡｂ８７‐５５／０２／２を加えることでＭ
Ａｂ８７‐５５／０２／２にカップリングされた磁気粒
子への陽性クローンの結合を妨げることができるかどう
かについて試験するために実施した。ＯｍｐＡタンパク
質中に組み込まれたエピトープ領域へのモノクローナル
抗体８７‐５５／０２／２の結合をウエスタンブロット
分析によって調べ、対応エピトープ領域の核酸配列を配
列分析により最後に決定した。ｐｐ１５０エピトープの
ＣＭＶ野生型配列と相同的であるかまたはそれに類似し
たペプチドが見出された。そのエピトープはアミノ酸配
列Asp-Met-Asn-Pro-Ala-Asn-Trp-Pro-Arg-Glu-Arg-Ala-
Trp-Ala-Leu を有することが、詳細な地図化による常法
でStuberら（ＥＰ‐Ａ‐０ ５３４ １０２）により既
に決定されていた。
【００６０】実行：阻害実験 スクリーニングからの個々のクローンを一夜インキュベ
ートし、培養液を翌朝希釈し、最後にＩＰＴＧで誘導し
た。次いで、細胞培養液をＬブロス／アンピシリンで
１：１００希釈し（全サンプル容量２５０μｌ）、その
後１％ Tween２０および異なる濃度の遊離ＭＡｂ８７‐
５５／０２／２（１０〜１００μg/mlサンプル）の存在
下において４℃で１時間インキュベートした。次いで、
磁気粒子を結合ＭＡｂ８７‐５５／０２／２と共に加
え、混合液を再度４℃で１時間インキュベートした。次
いで、磁気分離装置を用いて細胞を再度単離し、洗浄緩
衝液で３回洗浄した。次に細胞をＬブロス／アンピシリ
ン５００μｌにいれ、各場合においてこの懸濁液２０μ
ｌをＬブロス寒天／アンピシリン上に塗布した。それと
平行して、一連の実験を遊離ＭＡｂ８７‐５５／０２／
２の添加なしに行った（陽性コントロール）。加えて、
いかなるインサートも含まないベクターｐＨＳ１６４‐
Ｌで形質転換された細胞を用いた実験も行った（陰性コ
ントロール）。この実験では、磁気粒子に結合されたＭ
Ａｂ８７‐５５／０２／２への細胞の結合が反応サンプ
ルへの遊離ＭＡｂ８７‐５５／０２／２の添加により３
０〜２００倍減少することが証明された。逆に、磁気粒
子への細胞の結合は陽性コントロールで損なわれず、予
想通りに細胞結合は陰性コントロールで生じなかった。
ートし、培養液を翌朝希釈し、最後にＩＰＴＧで誘導し
た。次いで、細胞培養液をＬブロス／アンピシリンで
１：１００希釈し（全サンプル容量２５０μｌ）、その
後１％ Tween２０および異なる濃度の遊離ＭＡｂ８７‐
５５／０２／２（１０〜１００μg/mlサンプル）の存在
下において４℃で１時間インキュベートした。次いで、
磁気粒子を結合ＭＡｂ８７‐５５／０２／２と共に加
え、混合液を再度４℃で１時間インキュベートした。次
いで、磁気分離装置を用いて細胞を再度単離し、洗浄緩
衝液で３回洗浄した。次に細胞をＬブロス／アンピシリ
ン５００μｌにいれ、各場合においてこの懸濁液２０μ
ｌをＬブロス寒天／アンピシリン上に塗布した。それと
平行して、一連の実験を遊離ＭＡｂ８７‐５５／０２／
２の添加なしに行った（陽性コントロール）。加えて、
いかなるインサートも含まないベクターｐＨＳ１６４‐
Ｌで形質転換された細胞を用いた実験も行った（陰性コ
ントロール）。この実験では、磁気粒子に結合されたＭ
Ａｂ８７‐５５／０２／２への細胞の結合が反応サンプ
ルへの遊離ＭＡｂ８７‐５５／０２／２の添加により３
０〜２００倍減少することが証明された。逆に、磁気粒
子への細胞の結合は陽性コントロールで損なわれず、予
想通りに細胞結合は陰性コントロールで生じなかった。
【００６１】ウエスタンブロット分析 ＭＡｂ８７‐５５／０２／２によるスクリーニングで見
出され、その結合が阻害実験において遊離ＭＡｂ８７‐
５５／０２／２により明らかに阻害された細胞クローン
を、次にウエスタンブロット分析に付した。この分析に
おいて、すべてのクローンは膜タンパク質ＯｍｐＡのサ
イズに相当する陽性反応タンパク質バンドを示した。
出され、その結合が阻害実験において遊離ＭＡｂ８７‐
５５／０２／２により明らかに阻害された細胞クローン
を、次にウエスタンブロット分析に付した。この分析に
おいて、すべてのクローンは膜タンパク質ＯｍｐＡのサ
イズに相当する陽性反応タンパク質バンドを示した。
【００６２】ＤＮＡ配列分析 次いで、前記分析で陽性に反応したすべての細胞クロー
ンをＤＮＡ配列分析に付した。そのため、ベクターＤＮ
Ａを慣用的方法により二本鎖ＤＮＡとして単離し、サン
ガーの方法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,74,5463-5467) により、ベクター特異性オリゴヌク
レオチドプライマーを用いて配列決定した。その分析で
は、陽性クローンが領域Asp-Met-Asn-Pro-Ala-Asn-Trp-
Pro-Argにおいて原ペプチド配列と非常に類似したペプ
チド配列を含むことが証明された。野生型配列とは異な
る全部で５種の異なるヘキサペプチドが見出された： 配列番号１３ Leu Val Asn Pro Ala Asn クローン４ 配列番号１４ Phe Asn Pro Ala Asn Phe クローン７ 配列番号１５ Asp Arg Asn Pro Ala Asn クローン８ 配列番号１６ Asp Tyr Asn Ala Ala Asn クローン９ 配列番号１７ Phe Asn Pro Ala Asn Asn クローン１１
ンをＤＮＡ配列分析に付した。そのため、ベクターＤＮ
Ａを慣用的方法により二本鎖ＤＮＡとして単離し、サン
ガーの方法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,74,5463-5467) により、ベクター特異性オリゴヌク
レオチドプライマーを用いて配列決定した。その分析で
は、陽性クローンが領域Asp-Met-Asn-Pro-Ala-Asn-Trp-
Pro-Argにおいて原ペプチド配列と非常に類似したペプ
チド配列を含むことが証明された。野生型配列とは異な
る全部で５種の異なるヘキサペプチドが見出された： 配列番号１３ Leu Val Asn Pro Ala Asn クローン４ 配列番号１４ Phe Asn Pro Ala Asn Phe クローン７ 配列番号１５ Asp Arg Asn Pro Ala Asn クローン８ 配列番号１６ Asp Tyr Asn Ala Ala Asn クローン９ 配列番号１７ Phe Asn Pro Ala Asn Asn クローン１１
【００６３】
配列番号：１ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：CGCCAGGACC CCCGCCTNNK NNKNNKNNKN NKNNKCCTCC
TCCGCCACC
TCCGCCACC
【００６４】 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GGTCCTGGGG GCGGA
【００６５】 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数： トポロジー： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GGAGGCGGTG GGGCC
【００６６】 配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００６７】 配列番号：５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００６８】 配列番号：６ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００６９】 配列番号：７ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７０】 配列番号：８ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７１】 配列番号：９ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７２】 配列番号：１０ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７３】 配列番号：１１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７４】 配列番号：１２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７５】 配列番号：１３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７６】 配列番号：１４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７７】 配列番号：１５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７８】 配列番号：１６ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
【００７９】 配列番号：１７ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 配列の種類：ペプチド
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゲルト、ツェットルマイスル ドイツ連邦共和国ウェッター、エルビンガ ーシュトラーセ、３
Claims (25)
- 【請求項１】既定の特異的結合パートナーと結合するペ
プチドの製造法であって、 ａ）ヌクレオチド配列が確率論的に変化した領域を含ん
でなるオリゴヌクレオチドを単離または合成し、 ｂ）微生物の外被のタンパク質を発現するベクターコー
ド遺伝子中に前記オリゴヌクレオチドが挿入されるよ
う、ベクター分子による前記オリゴヌクレオチドの組換
えを行い、ここでオリゴヌクレオチドは各ベクター分子
中に挿入され、それによりそれらヌクレオチド配列の領
域において互いに異なる様々なベクター分子、すなわち
オリゴヌクレオチドバンク、を生じるようにし、 ｃ）前記組換えベクター分子によって微生物を形質転換
し、 ｄ）組換えＤＮＡ配列を発現させ対応する組換えタンパ
ク質を微生物の表面上に存在させるような条件下におい
て、前記形質転換微生物を培養し、 ｅ）前記微生物と、固相に結合された既定の特異的結合
パートナーとをインキュベーションし、所望のペプチド
を発現した微生物を結合させ、 ｆ）未結合微生物を除去し、 ｇ）前記結合微生物を複製し、 ｈ）前記結合微生物をクローニングおよびび単離し、 ｉ）対応ＤＮＡ配列の配列決定またはペプチド配列決定
によって、前記確率論的に変化したアミノ酸配列を決定
し、そして ｊ）前記微生物から組換えタンパク質を単離するか、ま
たは、対応ペプチドの化学合成により、所望のペプチド
を得る工程を含んでなり、微生物が細菌および哺乳動物
細胞からなる群から選択されるものである、方法。 - 【請求項２】工程ｅ〜ｇ）で単離された生物が再度結合
パートナーと接触させられ、選択および増幅工程が繰返
される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】生物の表面上における組換えタンパク質お
よび選択されたレセプターの濃度が、一価結合反応のみ
可能である濃度である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】微生物が細菌である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項５】微生物が懸濁状態における哺乳動物細胞で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】微生物が大腸菌である、請求項４に記載の
方法。 - 【請求項７】コートタンパク質がＯｍｐＡである、請求
項４または６に記載の方法。 - 【請求項８】工程ｅ）における固相が粒状である、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項９】固相が磁気誘引性である、請求項８に記載
の方法。 - 【請求項１０】ベクターがプラスミドである、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１１】ヌクレオチドが（ＮＮＫ）ｘ（ここで、
ＮはヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴを表し、Ｋはヌク
レオチドＧおよびＴを表し、Ｘは４〜２５の数である）
で表されるコドンを含んでなる、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１２】Ｘが６である、請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１３】Ｘが８であり、かつ、ヌクレオチドが可
能性あるオクタペプチドのフラクションのみをコードす
る、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】Ｘが１０であり、かつ、ヌクレオチドが
可能性あるデカペプチドのフラクションのみをコードす
る、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】オリゴヌクレオチドが、アミノ酸のラン
ダムな組合せをコードする一連のコドンを含み、かつ、
そのコドンの５´および３´領域において同様にコート
タンパク質配列と同一でない配列を含むものである、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】合成オリゴヌクレオチドが、アミノ酸の
ランダムな組合せをコードする一連のコドンを含み、か
つ、そのコドンの５´および３´領域において抗体領域
をコードする配列を含むものである、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１７】合成オリゴヌクレオチドが、アミノ酸の
ランダムな組合せをコードする一連のコドンを含み、か
つ、そのコドンの５´および３´領域においてスペーサ
ーをコードする配列を含むものである、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１８】スペーサーがプロリン残基を含むもので
ある、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】微生物が電気穿孔により形質転換され
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２０】ヌクレオチドバンクが少くとも１０６を
含むものである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】請求項１〜２０で記載された方法の少く
とも一つにより製造された、ペプチド。 - 【請求項２２】所望によりキャリアタンパク質にカップ
リングされた請求項２１記載のペプチドを用いて産生さ
れた、抗体。 - 【請求項２３】ペプチド４〜１７のアミノ酸配列を有す
る、請求項２１に記載のペプチド。 - 【請求項２４】所望によりキャリアタンパク質にカップ
リングされた請求項２２記載のプチドを用いて産生され
た、抗体。 - 【請求項２５】所望によりキャリアタンパク質にカップ
リングされた請求項２３記載のペプチドを用いて産生さ
れた、抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4243770.9 | 1992-12-23 | ||
| DE4243770A DE4243770A1 (de) | 1992-12-23 | 1992-12-23 | Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=6476332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| DE (2) | DE4243770A1 (ja) |
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| CN1311082C (zh) * | 2001-08-10 | 2007-04-18 | 生物领先公司 | 具有编码多聚－γ－谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表达载体以及利用该载体在微生物表面表达目的蛋白的方法 |
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| KR20200000972A (ko) | 2018-06-26 | 2020-01-06 | 주식회사 바이오리더스 | 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산 합성유전자를 이용한 표면발현벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물표면 발현 방법 |
| US20220033812A1 (en) | 2018-10-10 | 2022-02-03 | Bioleaders Corporation | Surface expression vector for constitutive high-expression using promoter of galactose mutarotase gene derived from lactobacillus casei, and use thereof |
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| US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
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- 1992-12-23 DE DE4243770A patent/DE4243770A1/de not_active Withdrawn
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- 1993-12-10 AT AT93119921T patent/ATE190653T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1993-12-10 ES ES93119921T patent/ES2144438T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-21 AU AU52557/93A patent/AU669947B2/en not_active Ceased
- 1993-12-22 CA CA002112193A patent/CA2112193A1/en not_active Abandoned
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