JPH07284391A - Oligonucleotide for detecting human herpes virus and its use - Google Patents

Oligonucleotide for detecting human herpes virus and its use

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JPH07284391A
JPH07284391A JP6080488A JP8048894A JPH07284391A JP H07284391 A JPH07284391 A JP H07284391A JP 6080488 A JP6080488 A JP 6080488A JP 8048894 A JP8048894 A JP 8048894A JP H07284391 A JPH07284391 A JP H07284391A
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nucleic acid
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human herpesvirus
seq
homology
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弘一 山西
Toru Mukai
徹 向井
Toshiya Aono
利哉 青野
Motohiro Kondo
元宏 近藤
Yutaka Takarada
裕 宝田
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Abstract

PURPOSE:To obtain an oligonucleotide useful for simple and rapid detection of human herpes virus 6 type A. CONSTITUTION:This oligonucleotide has >=70% homology to the nucleic acid sequences GTGCCTATTA TACAGTTCCAGA, GTTAATGTTT GTCGAACCGGGG or CTCTTGGGTT GTGGGGCGATTT or >=70% homology to these complementary sequences. The oligonucleotide can be prepared by a chemical synthesis.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明はヒトヘルペスウイルス
(Human Herpesvirus:HHVと略す
ことがある)6型タイプA(HHV−6A)、同タイプ
B(HHV−6B)およびヒトヘルペスウイルス7型
(HHV−7)を簡便かつ迅速に検出するオリゴヌクレ
オチドおよびその用途に関する。
FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to human herpesvirus (sometimes abbreviated as HHV) type 6 type A (HHV-6A), type B (HHV-6B) and human herpesvirus type 7 (HHV). -7) Oligonucleotides for simple and rapid detection and uses thereof.

【0002】[0002]

【従来の技術】HHV−6は1986年以来、米国、英
国でAIDSやリンパ球の疾患患者より分離されてき
た。また、突発性発疹の起因ウイルスもやはりHHV−
6であることが本発明者らにより証明された。その後の
ゲノム構造の解析等により、HHV−6はAとBの2つ
のタイプに分けられることがわかった。一方、HHV−
7は1990年に初めて分離された新しいヘルペスウイ
ルスであるが、疫学的な研究やゲノム構造の解析等によ
りHHV−6と近縁関係にあることが示された。これら
のウイルスはいずれもAIDS患者や臓器移植後の免疫
抑制状態の患者より高頻度に分離されること、また、免
疫抑制状態の管理の指標としての利用も考えられること
などにより急速にその診断意義が高まってきており、簡
便、迅速な診断方法の確立が急務となっている。
HHV-6 has been isolated from patients with AIDS and lymphocyte diseases in the United States and the United Kingdom since 1986. In addition, the virus causing sudden rash is also HHV-
It was proved to be 6 by the present inventors. Subsequent analysis of the genomic structure revealed that HHV-6 can be divided into two types, A and B. On the other hand, HHV-
7 is a new herpesvirus isolated for the first time in 1990, but it was shown to be related to HHV-6 by epidemiological studies and analysis of genome structure. All of these viruses are rapidly isolated from AIDS patients and immunosuppressed patients after organ transplantation, and can be used as an index for the management of immunosuppressed conditions. There is an urgent need to establish a simple and quick diagnostic method.

【0003】これらのHHVを検出する方法としては、
患者の血液中のリンパ球を培養した後、抗血清で反応さ
せて蛍光抗体法で抗原となるHHVを検出する方法が報
告されている。しかしながら、この方法ではリンパ球を
培養するために数日間を要し、迅速な診断はできない。
また、患者血清中の抗体を測定する方法もあるが、この
場合、患者に抗体が産生される回復期まで少なくとも1
週間かかり、やはり迅速な診断はできない。近年の遺伝
子診断技術の進歩に伴い、HHVの遺伝子診断法による
検出も試みられているが、これらのウイルスの遺伝子配
列に関する情報は乏しく、同時に分別検出できる系は未
だに報告されていない。
As a method of detecting these HHV,
A method has been reported in which lymphocytes in the blood of a patient are cultured and then reacted with antiserum to detect HHV serving as an antigen by a fluorescent antibody method. However, this method requires several days for culturing lymphocytes, and rapid diagnosis cannot be performed.
There is also a method of measuring the antibody in the patient's serum, in which case at least 1 is used until the convalescent period when the antibody is produced in the patient.
It takes a week, and I still can't make a quick diagnosis. Although the detection of HHV by a gene diagnostic method has been attempted with the recent progress of gene diagnostic techniques, information on the gene sequences of these viruses is scarce and a system capable of differential detection at the same time has not yet been reported.

【0004】[0004]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は簡便、迅速、特異的且つ高感度にHHV−6A,HH
V−6B,HHV−7を検出可能なオリゴヌクレオチド
を提供することである。
Accordingly, the object of the present invention is to provide HHV-6A, HH in a simple, rapid, specific and highly sensitive manner.
It is to provide an oligonucleotide capable of detecting V-6B, HHV-7.

【0005】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らはHHVの遺
伝子配列の決定を行い、さらに種々の検討を重ねた結
果、簡便、迅速、特異的かつ高感度にHHVを分別検出
できる配列を有するオリゴヌクレオチドを得、それを用
いた検出方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention have determined the gene sequence of HHV and, as a result of further various studies, have a sequence capable of differentially detecting HHV in a simple, rapid, specific and highly sensitive manner. The present invention was completed by obtaining an oligonucleotide, establishing a detection method using the oligonucleotide.

【0006】本発明は、HHV−6A,HHV−6B,
HHV−7に特異的なオリゴヌクレオチド、すなわち、
配列表・配列番号1〜12(但し、Aはアデニン、Cは
シトシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。また、任
意の位置のTはウラシル(U)と置換されてもよい)に
示す核酸配列と70%以上の相同性を有するか、または
それらに相補的な配列と70%以上の相同性を有するH
HV検出用オリゴヌクレオチドである。
The present invention relates to HHV-6A, HHV-6B,
An oligonucleotide specific for HHV-7, ie,
Sequence Listing ・ Sequence Nos. 1 to 12 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position may be replaced with uracil (U)) H having 70% or more homology with a nucleic acid sequence or 70% or more homology with a sequence complementary thereto
It is an oligonucleotide for HV detection.

【0007】また本発明は配列表・配列番号3,7また
は8(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニ
ン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシ
ル(U)と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%
以上の相同性を有するか、またはそれらの相補的配列と
70%以上の相同性を有することを特徴とするヒトヘル
ペスウイルス−6A特異検出用オリゴヌクレオチドであ
る。
In the present invention, the sequence listing: SEQ ID NO: 3, 7 or 8 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)). 70% with the nucleic acid sequence shown in FIG.
An oligonucleotide for detecting human herpesvirus-6A specificity, which has the above homology or has 70% or more homology with the complementary sequence thereof.

【0008】また本発明は配列表・配列番号4,9また
は10(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグア
ニン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラ
シル(U)と置換されてもよい)に示す核酸配列と70
%以上の相同性を有するか、またはそれらの相補的配列
と70%以上の相同性を有することを特徴とするヒトヘ
ルペスウイルス−6B特異検出用オリゴヌクレオチドで
ある。
In the present invention, the sequence listing is SEQ ID NO: 4, 9 or 10 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)). And the nucleic acid sequence shown in FIG.
An oligonucleotide for human herpesvirus-6B-specific detection, which has a homology of not less than 70% or has a homology of not less than 70% with a complementary sequence thereof.

【0009】さらに本発明は配列表・配列番号5,11
または12(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gは
グアニン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTは
ウラシル(U)と置換されてもよい)に示す核酸配列と
70%以上の相同性を有するか、またはそれらの相補的
配列と70%以上の相同性を有することを特徴とするヒ
トヘルペスウイルス−7特異検出用オリゴヌクレオチド
である。
Further, the present invention provides a sequence listing / SEQ ID NO: 5,11.
Or 70% or more with the nucleic acid sequence shown in 12 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position may be replaced with uracil (U)) Or a human herpesvirus-7-specific detection oligonucleotide having a homology of 70% or more with the complementary sequence thereof.

【0010】さらに本発明は配列表・配列番号1,2ま
たは6(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグア
ニン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラ
シル(U)と置換されてもよい)に示す核酸配列と70
%以上の相同性を有するか、またはそれらの相補的配列
と70%以上の相同性を有することを特徴とするヒトヘ
ルペスウイルス−6A,6Bおよび7共通検出用オリゴ
ヌクレオチドである。
Further, the present invention provides the sequence listing: SEQ ID NO: 1, 2 or 6 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)). And the nucleic acid sequence shown in FIG.
Oligonucleotides for human herpesvirus-6A, 6B and 7 common detection, characterized by having a homology of at least 70% or having a homology of at least 70% with their complementary sequences.

【0011】また本発明は、上記HHV検出用オリゴヌ
クレオチドを標識化した標識核酸プローブを試料中のD
NAまたはRNAと交雑させ、交雑した結合体の標識を
測定することを特徴とする試料中のHHVの検出法であ
る。
The present invention also provides a labeled nucleic acid probe obtained by labeling the above-mentioned HHV detection oligonucleotide with D in a sample.
A method for detecting HHV in a sample, which comprises hybridizing with NA or RNA and measuring the label of the hybridized conjugate.

【0012】さらに本発明は上記HHV検出用オリゴヌ
クレオチドである核酸プライマー、または該オリゴヌク
レオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料中のD
NAまたはRNAと交雑させ、プライマーを伸長させ、
得られたプライマー伸長物を測定することを特徴とする
試料中のHHVの検出法である。
Further, the present invention provides a nucleic acid primer which is the above-mentioned HHV detection oligonucleotide, or a labeled nucleic acid primer obtained by labeling the oligonucleotide, in a sample.
Hybridize with NA or RNA, extend the primer,
A method for detecting HHV in a sample, which comprises measuring the obtained primer extension product.

【0013】また本発明は上記HHV検出用オリゴヌク
レオチドを標識化した標識核酸プローブを含むことを特
徴とする試料中のHHV検出用試薬キットである。
The present invention also provides a reagent kit for detecting HHV in a sample, which comprises a labeled nucleic acid probe labeled with the above-mentioned oligonucleotide for detecting HHV.

【0014】さらに本発明は上記HHV検出用オリゴヌ
クレオチドである核酸プライマー、または該オリゴヌク
レオチドを標識化した標識核酸プライマーを含むことを
特徴とする試料中のHHVの検出用試薬キットである。
Further, the present invention is a reagent kit for detecting HHV in a sample, which comprises a nucleic acid primer which is the above-mentioned oligonucleotide for detecting HHV, or a labeled nucleic acid primer obtained by labeling the oligonucleotide.

【0015】本発明のHHV検出用オリゴヌクレオチド
は、配列表・配列番号1〜12(但し、Aはアデニン、
Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。ま
た、任意の位置のTはウラシル(U)と置換されてもよ
い)に示す核酸配列と70%以上の相同性を有するか、
またはそれらの相補的配列と70%以上の相同性を有す
るものであり、HHVに特異的に反応する。一般にオリ
ゴヌクレオチドは化学合成により調製できるので、クロ
ーン化したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
に比べ容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオ
チドを得ることが可能である。
The HHV detection oligonucleotide of the present invention has the sequence listing: SEQ ID NOS: 1 to 12 (A is adenine,
C represents cytosine, G represents guanine, and T represents thymine. Further, T at an arbitrary position may have a homology of 70% or more with the nucleic acid sequence represented by uracil (U), or
Alternatively, it has 70% or more homology with their complementary sequences and specifically reacts with HHV. In general, since oligonucleotides can be prepared by chemical synthesis, compared to cloned oligonucleotides or polynucleotides, it is possible to obtain oligonucleotides of constant quality in a large amount and at low cost.

【0016】本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリ
ボ核酸(DNA)でもリボ核酸(RNA)でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基(T)をウリジン残基
(U)と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のTをUに変えて合成を行ない、ウリ
ジン残基を含むDNAであってもよい。同様に任意のU
をTに変えたチミジン残基を含むRNAであってもよ
い。また、オリゴヌクレオチド中に数塩基の欠失、挿入
あるいは置換といった変異や、修飾ヌクレオチドがあっ
てもよい。
The oligonucleotide of the present invention may be deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). In the case of ribonucleic acid, it goes without saying that the thymidine residue (T) is read as the uridine residue (U). Alternatively, a DNA containing a uridine residue may be used by synthesizing by changing T at any position to U at the time of synthesis. Similarly, any U
It may be RNA containing a thymidine residue in which is changed to T. Further, the oligonucleotide may have a mutation such as deletion, insertion or substitution of several bases, or a modified nucleotide.

【0017】本発明の標識核酸プローブは、上記HHV
検出用オリゴヌクレオチドに標識を結合したものであ
り、標識物としては放射性物質や酵素、蛍光物質、発光
物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの公
知の標識を用いることができる。標識の仕方は末端標識
でも、配列の途中に標識してもよい。また、糖、リン酸
基、塩基部分への標識であってもよい。
The labeled nucleic acid probe of the present invention is the above HHV
A label is bound to the detection oligonucleotide, and as the label, known labels such as radioactive substances, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, antigens, haptens, enzyme substrates, insoluble carriers and the like can be used. The labeling method may be end labeling or labeling in the middle of the sequence. It may also be a label on the sugar, phosphate group, or base moiety.

【0018】本発明の核酸プライマーは、上記HHV検
出用オリゴヌクレオチドをそのまま使用するか、あるい
は該オリゴヌクレオチドを標識化したものを使用する。
本発明のHHV検出用オリゴヌクレオチドを用いてHH
Vを検出する場合、(1)本発明オリゴヌクレオチドを
プローブとして検出する方法、(2)本発明オリゴヌク
レオチドをプライマーとしてDNAポリメラーゼ等によ
り伸長反応させて検出する方法がある。上記(2)の場
合、上記オリゴヌクレオチドに標識を導入することによ
り検出が容易に可能となる。
As the nucleic acid primer of the present invention, the above HHV detection oligonucleotide is used as it is, or the oligonucleotide is labeled.
Using the HHV detection oligonucleotide of the present invention, HH
When detecting V, there are (1) a method of detecting the oligonucleotide of the present invention as a probe, and (2) a method of performing an extension reaction with the oligonucleotide of the present invention as a primer using a DNA polymerase or the like. In the case of the above (2), detection can be easily performed by introducing a label into the above oligonucleotide.

【0019】上記(1)の場合、本発明のオリゴヌクレ
オチドを標識化した標識核酸プローブを試料中のDNA
またはRNAと交雑させ、交雑した結合体の標識を適当
な検出法で検出することで達成される。一方、上記
(2)の場合、本発明のオリゴヌクレオチドをそのまま
核酸プライマーとするか、または該オリゴヌクレオチド
を標識化した標識核酸プライマーを試料中のDNAまた
はRNAと交雑させ、DNAポリメラーゼ等によりプラ
イマーを伸長させ、得られたプライマー伸長物を直接測
定するか、標識プローブを用いて測定する。
In the case of (1) above, the labeled nucleic acid probe labeled with the oligonucleotide of the present invention is used as a DNA in a sample.
Alternatively, it can be achieved by hybridizing with RNA and detecting the label of the hybridized conjugate by an appropriate detection method. On the other hand, in the case of the above (2), the oligonucleotide of the present invention is used as a nucleic acid primer as it is, or a labeled nucleic acid primer obtained by labeling the oligonucleotide is hybridized with DNA or RNA in a sample, and the primer is treated with DNA polymerase or the like. Extend and measure the resulting primer extension directly or with a labeled probe.

【0020】本発明のオリゴヌクレオチドをプライマー
として用いる場合、DNAポリメラーゼ等を使用する遺
伝子増幅(PCR等)を行なうことにより、HHVの遺
伝子のみを特異的に増幅することができる。増幅反応に
際しては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌク
レオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動に
より分画して特異なバンドを検出することにより、容易
にHHVを検出することができる。さらに本発明の型特
異的オリゴヌクレオチドを用いることにより、電気泳動
後、増幅産物のサイズにより容易に型の判別も行うこと
ができる。また前述の標識オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いれば増幅産物を直接検出することも可能
である。
When the oligonucleotide of the present invention is used as a primer, it is possible to specifically amplify only the HHV gene by carrying out gene amplification (PCR etc.) using DNA polymerase or the like. In the amplification reaction, HHV can be easily detected by a method of incorporating a labeled nucleotide such as a radioactive substance during the reaction, or by fractionating the amplification product by electrophoresis and detecting a specific band. Furthermore, by using the type-specific oligonucleotide of the present invention, the type can be easily determined by the size of the amplification product after electrophoresis. Further, the amplification product can be directly detected by using the above-mentioned labeled oligonucleotide as a primer.

【0021】本発明のHHV検出用試薬キットは、本発
明のHHV検出用オリゴヌクレオチド、もしくはこのオ
リゴヌクレオチドを適当な標識剤で標識化した標識オリ
ゴヌクレオチドを含むものである。核酸プライマーを含
む試薬キットには標識プローブを含んでいてもよい。ま
た、その他の成分としては、標識検出物質や緩衝液など
を含む。さらに核酸プライマー、または標識核酸プライ
マーを含む本発明の試薬キットには、他の成分として、
核酸合成酵素(DNAポリメラーゼ、RNAポリメラー
ゼ、逆転写酵素など)、酵素に応じた基質(dNTP,
rNTPなど)、標識検出物質や緩衝液などを含む。
The HHV detection reagent kit of the present invention comprises the HHV detection oligonucleotide of the present invention or a labeled oligonucleotide obtained by labeling this oligonucleotide with an appropriate labeling agent. The reagent kit containing the nucleic acid primer may contain a labeled probe. Further, other components include a labeled detection substance, a buffer solution and the like. Furthermore, in the reagent kit of the present invention containing a nucleic acid primer or a labeled nucleic acid primer, as other components,
Nucleic acid synthetase (DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, etc.), substrate (dNTP,
rNTP, etc.), a labeled detection substance, a buffer solution and the like.

【0022】また、本発明のオリゴヌクレオチドを固相
担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもでき
る。この場合、捕捉プローブと、標識(核酸)プローブ
の組み合わせでサンドイッチアッセイを行ってもよい
し、標的核酸を標識して捕捉する方法もある。また、オ
リゴヌクレオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼ
ーション後、アビジン結合担体で捕捉する方法もある。
サンドイッチアッセイにおいてはどちらか一方に本発明
のオリゴヌクレオチドを用いれば、該オリゴヌクレオチ
ドの特異性により特異的な測定が可能となり、他方のオ
リゴヌクレオチドの特異性は若干低くてもなんら問題は
ない。
Further, the oligonucleotide of the present invention can be bound to a solid phase carrier and used as a capture probe. In this case, the sandwich assay may be performed with a combination of a capture probe and a labeled (nucleic acid) probe, or there is a method of labeling and capturing a target nucleic acid. There is also a method in which an oligonucleotide is labeled with biotin, and after hybridization, it is captured with an avidin-binding carrier.
In the sandwich assay, if the oligonucleotide of the present invention is used for either one of them, specific measurement becomes possible due to the specificity of the oligonucleotide, and there is no problem even if the specificity of the other oligonucleotide is slightly low.

【0023】[0023]

【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。 実施例1 各種オリゴヌクレオチドの調製 ABI社DNAシンセサイザー391型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号1〜12示される
配列を有するオリゴヌクレオチドを各種合成した。以
下、配列表・配列番号1〜12に示される各種オリゴヌ
クレオチドを、それぞれオリゴヌクレオチド(1)〜(12)
と呼ぶ。手法はABI社マニュアルに従い、0.2μM
スケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護
はアンモニア水で55℃一夜実施した。精製はファルマ
シア社製FPLCでMonoQカラムにて実施した。な
お合成したオリゴヌクレオチドは必要によりJablonski
らの方法(Nucl. Acid Res. 14:6115-6128, 1986)に従
って、アルカリフォスファターゼ(Alp)を結合させ
た。
EXAMPLES The effects of the present invention will be further clarified by exemplifying the examples of the present invention. Example 1 Preparation of Various Oligonucleotides Using ABI DNA Synthesizer Model 391, various oligonucleotides having the sequences shown in the sequence listing and SEQ ID NOs: 1 to 12 were synthesized by the phosphoamidite method. The oligonucleotides shown in the sequence listing and SEQ ID NOs: 1 to 12 are respectively oligonucleotides (1) to (12)
Call. The method is 0.2 μM according to the ABI company manual.
Performed on a scale. Deprotection of various oligonucleotides was carried out with ammonia water at 55 ° C. overnight. Purification was carried out by FPLC manufactured by Pharmacia on a MonoQ column. If necessary, the synthesized oligonucleotide may be Jablonski.
Alkaline phosphatase (Alp) was bound according to the method of the same group (Nucl. Acid Res. 14: 6115-6128, 1986).

【0024】実施例2 HHVの増幅 (1)ウイルス核酸の調製 本発明のオリゴヌクレオチドを用いてHHVの増幅反応
を行った。特異性を調べるために、これまで知られてい
る他のヒトヘルペスウイルスも同時に調べた。本実験に
使用したHHV標準株を下記に示す。 ・HSV−1 : Seibert株 ・HSV−2 : UW268株 ・VZV : 河口株 ・EBV : B95−8株 ・CMV : AD169株 ・HHV−6A: U1102株 ・HHV−6B: 橋本株 ・HHV−7 : RK株 ウイルス核酸は常法により調製した。
Example 2 Amplification of HHV (1) Preparation of viral nucleic acid An HHV amplification reaction was carried out using the oligonucleotide of the present invention. Other hitherto known human herpesviruses were also examined simultaneously to determine their specificity. The HHV standard strains used in this experiment are shown below. -HSV-1: Seivert strain-HSV-2: UW268 strain-VZV: Kawaguchi strain-EBV: B95-8 strain-CMV: AD169 strain-HHV-6A: U1102 strain-HHV-6B: Hashimoto strain-HHV-7: RK strain The viral nucleic acid was prepared by a conventional method.

【0025】(2)HHV核酸の増幅 反応液94μlに前記核酸溶液もしくはヒト胎盤DNA
溶液5μl、実施例1のオリゴヌクレオチド(1) と(6)
、または(3) 、(4) 、(5) と(6) の混合液1μlをプ
ライマーとして加え、核酸の増幅反応を行った。反応液
組成は以下の通りである。 反応液組成 KCl 50 mM Tris−HCl(pH8.3) 10 mM MgCl2 1.5 mM ゼラチン 0.01 % dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各0.2 mM Tth DNA ポリメラーゼ 40 単位/ml 反応条件は次の通りである。 熱変性: 94℃、1分、 アニーリング:55℃、2分 重合反応: 75℃、1.5分 を30回行った。
(2) Amplification of HHV nucleic acid The above nucleic acid solution or human placental DNA was added to 94 μl of the reaction solution.
5 μl of solution, oligonucleotides (1) and (6) of Example 1
Alternatively, 1 μl of the mixed solution of (3), (4), (5) and (6) was added as a primer to carry out a nucleic acid amplification reaction. The composition of the reaction solution is as follows. Reaction solution composition KCl 50 mM Tris-HCl (pH 8.3) 10 mM MgCl 2 1.5 mM Gelatin 0.01% dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0.2 mM Tth DNA polymerase 40 units / ml The reaction conditions are as follows. Heat denaturation: 94 ° C., 1 minute, annealing: 55 ° C., 2 minutes Polymerization reaction: 75 ° C., 1.5 minutes 30 times.

【0026】これらの操作はパーキン−エルマー/シー
タス(Perkin-Elmer/Cetus)社のDNAサーマルサイクラ
ーを用いて行った。検出は10μl の反応液を2%アガ
ロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した
後、紫外線下での蛍光を検出することにより行った。泳
動の電気的条件は定電圧100Vで、時間は30分行っ
た。操作方法並びに他の条件はManiatisらのMolecular
Cloning(1982) に記載の方法に従った。反応液の他に分
子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動度の比較によ
り、検出された増幅産物のサイズを算出した。その結
果、増幅産物は、HHV−6A、HHV−6B、もしく
はHHV−7を用いたときのみ検出された(表1)。
These operations were carried out using a DNA thermal cycler manufactured by Perkin-Elmer / Cetus. The detection was carried out by subjecting 10 μl of the reaction solution to 2% agarose gel electrophoresis, staining with ethidium bromide, and then detecting fluorescence under ultraviolet light. The electrophoretic conditions were a constant voltage of 100 V and a time of 30 minutes. The procedure and other conditions are described in Maniatis et al., Molecular.
The method described in Cloning (1982) was followed. In addition to the reaction solution, a molecular weight marker was also electrophoresed at the same time, and the size of the detected amplification product was calculated by comparing the relative mobilities. As a result, the amplification product was detected only when HHV-6A, HHV-6B, or HHV-7 was used (Table 1).

【0027】[0027]

【表1】 [Table 1]

【0028】実施例3 HHVのプローブによる分別検
出 (1)HHV核酸の増幅 反応液94μlに前記HHV核酸溶液もしくはヒト胎盤
DNA溶液5μl、実施例1のオリゴヌクレオチド(2)
と(6)の混合液1μlをプライマーとして加え、核酸の
増幅反応を行った。反応液組成、反応条件等は実施例2
に準ずる。 (2)ドット・ブロット。ハイブリダイゼーションによ
る分別検出 上記増幅反応の結果生じた増幅産物がどのヒトヘルペス
ウイルスに由来するものか特定するためにドット・ブロ
ット・ハイブリダイゼーションを行った。プローブとし
ては実施例1の(7) 、(8) 、(9) 、(10)、(11)、(12)の
オリゴヌクレオチドをアルカリホスファターゼ(Al
p)標識したものを用いた。上記の増幅産物1μlに
0.3規定のNaOH、100μlを加え、室温で15
分間変性し、ドットブロッター(BRL社製)を用いて
5×SSCで湿潤したナイロン膜(ハイボンドNプラ
ス,アマシャム社製)にブロットした。なおSSCとは
15mMクエン酸三ナトリウム、15mM塩化ナトリウ
ム溶液を示し、5×SSCとはSSCの5倍濃厚液を示
す。この膜を80℃、30分間加熱処理して核酸を固定
化したものを8枚用意し、各Alp標識プローブを用い
てハイブリダイゼーションを行った。
Example 3 Differential Detection with HHV Probe (1) Amplification of HHV Nucleic Acid 5 μl of the HHV Nucleic Acid Solution or Human Placental DNA Solution in 94 μl of Reaction Solution, Oligonucleotide (2) of Example 1
1 μl of the mixed solution of (6) and (6) was added as a primer to carry out a nucleic acid amplification reaction. The composition of the reaction solution, the reaction conditions, etc. are shown in Example 2.
According to. (2) Dot blot. Fractional Detection by Hybridization Dot blot hybridization was performed to identify which human herpesvirus the amplification product resulting from the amplification reaction was derived from. As a probe, the oligonucleotides of (7), (8), (9), (10), (11) and (12) of Example 1 were treated with alkaline phosphatase (Al).
p) Labeled one was used. Add 100 μl of 0.3N NaOH to 1 μl of the above amplification product, and add at room temperature for 15
It was denatured for a minute and blotted on a nylon membrane (Hybond N Plus, Amersham) wetted with 5 × SSC using a dot blotter (BRL). SSC is a 15 mM trisodium citrate and 15 mM sodium chloride solution, and 5 × SSC is a 5-fold concentrated solution of SSC. Eight sheets were prepared by immobilizing nucleic acid by heating this membrane at 80 ° C. for 30 minutes, and hybridization was carried out using each Alp-labeled probe.

【0029】まず、乾燥した膜(1×8cm)を5×S
SCに5分間浸した。次にハイブリダイゼーションバッ
ク(BRL社製)に膜を移し、ハイブリダイゼーション
バッファー(5×SSC、0.5%ウシ血清アルブミ
ン、0.5%ポリビニルピロリドン、1%ドデシル硫酸
ナトリウム)5mlを加えてポリシーラーでシールし、
50℃、15分間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。次に、上記のいずれかのプローブ5μl を含むハイ
ブリダイゼーションバッファー5mlで55℃、15分
間ハイブリダイゼーションを行った。膜をポリバックか
ら取り出し、洗浄液−1(1×SSC、1%ドデシル硫
酸ナトリウム)で55℃、5分間、2回の振とう洗浄を
行った。さらに洗浄液−2(1×SSC)で室温、5分
間、2回の振とう洗浄した後、膜を乾燥させた。
First, the dried film (1 × 8 cm) is treated with 5 × S.
Immerse in SC for 5 minutes. Next, the membrane was transferred to a hybridization bag (manufactured by BRL), and 5 ml of a hybridization buffer (5 × SSC, 0.5% bovine serum albumin, 0.5% polyvinylpyrrolidone, 1% sodium dodecylsulfate) was added to the policyr. Seal with
Prehybridization was performed at 50 ° C. for 15 minutes. Next, hybridization was carried out at 55 ° C. for 15 minutes with 5 ml of a hybridization buffer containing 5 μl of any of the above probes. The membrane was taken out from the polybag, and washed with Shake Solution-1 (1 × SSC, 1% sodium dodecyl sulfate) at 55 ° C. for 5 minutes with shaking twice. Further, the membrane was dried after washing with Washing solution-2 (1 × SSC) twice at room temperature for 5 minutes with shaking.

【0030】各々、1mlの発色液(200mM Tr
is−HCl(pH8.5), 0.58% NaC
l, 1% MgCl2 , 0.00136% ZnC
2 ,0.02% NaN3 , 75mg/ml NB
T(nitro bluetetrazolium),
50mg/ml BCIP(5−bromo−4−c
hloro−3−indolyl phosphat
e))を添加し、37℃で30分間発色反応させること
によりヒトヘルペスウイルスの検出を行った。その結
果、HHV−6A、HHV−6B、およびHHV−7に
特異的なオリゴヌクレオチド・プローブはそれぞれのウ
イルス由来の増幅産物とのみ特異的に反応し、他のウイ
ルス由来やヒト胎盤DNA由来の増幅産物との反応は観
察されなかった(表2)。
1 ml of color developing solution (200 mM Tr
is-HCl (pH 8.5), 0.58% NaC
1, 1% MgCl 2 , 0.00136% ZnC
l 2 , 0.02% NaN 3 , 75 mg / ml NB
T (nitro bluetetrazolium),
50 mg / ml BCIP (5-bromo-4-c
hloro-3-indolyl phosphat
e)) was added and the color reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes to detect human herpesvirus. As a result, the oligonucleotide probes specific to HHV-6A, HHV-6B, and HHV-7 specifically react with the amplification products derived from the respective viruses, and the amplification from other viruses or human placenta DNA is amplified. No reaction with the product was observed (Table 2).

【0031】[0031]

【表2】 [Table 2]

【0032】[0032]

【発明の効果】本発明により、従来培養に時間のかかっ
ていたHHVを迅速、簡便に特異的且つ高感度で型別に
測定することが可能となった。本発明のオリゴヌクレオ
チドは増幅反応のプライマーとしても、直接検出用のプ
ローブとしても用いることが可能である。また。プライ
マーにより増幅した増幅産物をプローブで検出すること
により、感度、特異性をさらに高く検出することも可能
で、その臨床的意義は大きい。
EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, it has become possible to measure HHV, which has conventionally required a long time for culturing, by type, quickly, simply and specifically and with high sensitivity. The oligonucleotide of the present invention can be used both as a primer for amplification reaction and as a probe for direct detection. Also. By detecting the amplification product amplified by the primer with a probe, it is possible to detect with higher sensitivity and specificity, which is of great clinical significance.

【0033】[0033]

【配列表】[Sequence list]

配列番号:1 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..22 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6A、HHV−6B、HHV−7に
共通の配列。 配列 ATAATTGGCA ATGAACACCG TT 22
SEQ ID NO: 1 Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..22 Method for determining features : S Other features: Sequence common to HHV-6A, HHV-6B, HHV-7. Array ATAATTGGCA ATGAACACCG TT 22

【0034】配列番号:2 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..24 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6A、HHV−6B、HHV−7に
共通の配列。 配列 TTTTGATATG GGTTTAGGTT TTAG 24
SEQ ID NO: 2 Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..24 Method determined: S Other features: Sequence common to HHV-6A, HHV-6B, HHV-7. Sequence TTTTGATATG GGTTTAGGTT TTAG 24

【0035】配列番号:3 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..22 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6Aに特異的な配列。 配列 GTGCCTATTA TACAGTTCCA GA 22SEQ ID NO: 3 Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..22 Features Method determined: S Other features: HHV-6A specific sequence. Sequence GTGCCTATTA TACAGTTCCA GA 22

【0036】配列番号:4 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..24 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6Bに特異的な配列。 配列 GTCAACAAGC TATCTGCGAA GTCG 24SEQ ID NO: 4 Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..24 Method determined: S Other features: HHV-6B specific sequence. Array GTCAACAAGC TATCTGCGAA GTCG 24

【0037】配列番号:5 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..24 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−7に特異的な配列。 配列 TACACCAACC CTACTGTAAA TAGT 24SEQ ID NO: 5 Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..24 Method determined: S Other features: HHV-7 specific sequence. Array TACACCAACC CTACTGTAAA TAGT 24

【0038】配列番号:6 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..23 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6A、HHV−6B、HHV−7C
MVに共通の配列。 配列 GATCCTTTTT GAGATGCCCA AGG 23
SEQ ID NO: 6 Sequence length: 23 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..23 Determined method: S Other characteristics: HHV-6A, HHV-6B, HHV-7C
Sequence common to MV. Sequence GATCCTTTTT GAGATGCCCA AGG 23

【0039】配列番号:7 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..23 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6Aに特異的な配列。 配列 GTTAATGTTT GTCGTAACCG GGG 23SEQ ID NO: 7 Sequence length: 23 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1.23 Method determined: S Other features: HHV-6A specific sequence. Array GTTAATGTTT GTCGTAACCG GGG 23

【0040】配列番号:8 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..22 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6Aに特異的な配列。 配列 CTCTTGGGTT GTGGGGCGAT TT 22SEQ ID NO: 8 Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..22 Features Method determined: S Other features: HHV-6A specific sequence. Array CTCTTGGGTT GTGGGGCGAT TT 22

【0041】配列番号:9 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..23 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6Bに特異的な配列。 配列 GTTAATATTT GTCGTGACCG GAG 23SEQ ID NO: 9 Sequence length: 23 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..23 Method determined: S Other features: HHV-6B specific sequence. Array GTTAATATTT GTCGTGACCG GAG 23

【0042】配列番号:10 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..22 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−6Bに特異的な配列。 配列 CTCTGGGGTT ATGGGGCAAT TT 22SEQ ID NO: 10 Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..22 Features Method determined: S Other features: HHV-6B specific sequence. Sequence CTCTGGGGTT ATGGGGCAAT TT 22

【0043】配列番号:11 配列の長さ:31 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..31 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−7に特異的な配列。 配列 TCATTACTCC AGTGACTTCC GATATTAATT T 31SEQ ID NO: 11 Sequence length: 31 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..31 Features Method determined: S Other features: HHV-7 specific sequence. Sequence TCATTACTCC AGTGACTTCC GATATTAATT T 31

【0044】配列番号:12 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..30 特徴を決定した方法:S 他の特徴:HHV−7に特異的な配列。 配列 CTTTCGGTAA GATAAATAAG CAATCACAAT 30SEQ ID NO: 12 Sequence length: 30 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..30 Method determined: S Other features: HHV-7 specific sequence. Array CTTTCGGTAA GATAAATAAG CAATCACAAT 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/569 J (72)発明者 宝田 裕 滋賀県大津市堅田二丁目1番1号 東洋紡 績株式会社総合研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication location G01N 33/569 J (72) Inventor Yutaka Takarada 1-1-1 Katata, Otsu, Shiga Prefecture Toyobo Co., Ltd. Research Institute, Inc.

Claims (19)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 配列表・配列番号1〜12(但し、Aは
アデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを
表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)と置換さ
れてもよい)に示す核酸配列と70%以上の相同性を有
するか、またはそれらの相補的配列と70%以上の相同
性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイルス検出
用オリゴヌクレオチド。
1. SEQ ID NO: 1 to 12 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is replaced with uracil (U). 70% or more homology with the nucleic acid sequence shown in the above), or 70% or more homology with the complementary sequence thereof, an oligonucleotide for detecting human herpesvirus.
【請求項2】 配列表・配列番号3,7または8(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以上の相
同性を有するか、またはそれらの相補的配列と70%以
上の相同性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイ
ルス−6A特異検出用オリゴヌクレオチド。
2. Sequence Listing: SEQ ID NO: 3, 7 or 8 (wherein A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)).
Which has a homology of 70% or more with the nucleic acid sequence shown in (or may be substituted with) or has a homology of 70% or more with a complementary sequence thereof, for the detection of human herpesvirus-6A specificity. Oligonucleotides.
【請求項3】 配列表・配列番号4,9または10(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以上の相
同性を有するか、またはそれらの相補的配列と70%以
上の相同性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイ
ルス−6B特異検出用オリゴヌクレオチド。
3. Sequence Listing: SEQ ID NO: 4, 9 or 10 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)).
May have a 70% or higher homology with the nucleic acid sequence shown in (or may be replaced with) or a 70% or higher homology with a complementary sequence thereof. Oligonucleotides.
【請求項4】 配列表・配列番号5,11または12
(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、
Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル
(U)と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以
上の相同性を有するか、またはそれらの相補的配列と7
0%以上の相同性を有することを特徴とするヒトヘルペ
スウイルス−7特異検出用オリゴヌクレオチド。
4. Sequence listing / SEQ ID NO: 5, 11 or 12
(However, A is adenine, C is cytosine, G is guanine,
T represents thymine. In addition, T at any position has 70% or more homology with the nucleic acid sequence shown in uracil (U), or its complementary sequence 7
An oligonucleotide for human herpesvirus-7-specific detection, which has 0% or more homology.
【請求項5】 配列表・配列番号3,7または8(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以上の相
同性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイルス−
6A特異検出用オリゴヌクレオチド。
5. Sequence Listing: SEQ ID NO: 3, 7 or 8 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)).
Human herpesvirus having a homology of 70% or more with the nucleic acid sequence shown in
6A specific detection oligonucleotide.
【請求項6】 配列表・配列番号4,9または10(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以上の相
同性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイルス−
6B特異検出用オリゴヌクレオチド。
6. Sequence Listing: SEQ ID NO: 4, 9 or 10 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)).
Human herpesvirus having a homology of 70% or more with the nucleic acid sequence shown in
6B Specific detection oligonucleotide.
【請求項7】 配列表・配列番号5,11または12
(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、
Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル
(U)と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以
上の相同性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイ
ルス−7特異検出用オリゴヌクレオチド。
7. Sequence listing / SEQ ID NO: 5, 11 or 12
(However, A is adenine, C is cytosine, G is guanine,
T represents thymine. In addition, T at an arbitrary position has a homology of 70% or more with the nucleic acid sequence shown in uracil (U)), and a human herpesvirus-7 specific detection oligonucleotide.
【請求項8】 配列表・配列番号3,7または8(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列であることを特徴
とするヒトヘルペスウイルス−6A特異検出用オリゴヌ
クレオチド。
8. Sequence Listing: SEQ ID NO: 3, 7 or 8 (A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U).
Which may be replaced with). The oligonucleotide for human-herpesvirus-6A specific detection, which is
【請求項9】 配列表・配列番号4,9または10(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列であることを特徴
とするヒトヘルペスウイルス−6B特異検出用オリゴヌ
クレオチド。
9. Sequence Listing: SEQ ID NO: 4, 9 or 10 (A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U).
Which may be replaced with). An oligonucleotide for human-herpesvirus-6B-specific detection, which is
【請求項10】 配列表・配列番号5,11または12
(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、
Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル
(U)と置換されてもよい)に示す核酸配列であること
を特徴とするヒトヘルペスウイルス−7特異検出用オリ
ゴヌクレオチド。
10. Sequence listing / SEQ ID NO: 5, 11 or 12
(However, A is adenine, C is cytosine, G is guanine,
T represents thymine. In addition, T at an arbitrary position is a nucleic acid sequence represented by uracil (U)), and a human herpesvirus-7 specific detection oligonucleotide.
【請求項11】 配列表・配列番号1,2または6(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以上の相
同性を有するか、またはそれらの相補的配列と70%以
上の相同性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイ
ルス−6A,6Bおよび7共通検出用オリゴヌクレオチ
ド。
11. Sequence Listing: SEQ ID NO: 1, 2 or 6 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)).
May have a 70% or higher homology with the nucleic acid sequence shown in Table 1 or a 70% or higher homology with a complementary sequence thereof, and a human herpesvirus-6A, 6B and 7 Common detection oligonucleotides.
【請求項12】 配列表・配列番号1,2または6(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列と70%以上の相
同性を有することを特徴とするヒトヘルペスウイルス−
6A,6および7共通検出用オリゴヌクレオチド。
12. Sequence Listing: SEQ ID NO: 1, 2 or 6 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)).
Human herpesvirus having a homology of 70% or more with the nucleic acid sequence shown in
6A, 6 and 7 Common detection oligonucleotides.
【請求項13】 配列表・配列番号1,2または6(但
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tは
チミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)
と置換されてもよい)に示す核酸配列であることを特徴
とするヒトヘルペスウイルス−6A,6Bおよび7特異
検出用オリゴヌクレオチド。
13. Sequence Listing: SEQ ID NO: 1, 2 or 6 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U)).
Which may be substituted with), the human herpesvirus-6A, 6B and 7-specific detection oligonucleotide.
【請求項14】 請求項1〜13に記載されるヒトヘル
ペスウイルス検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得
られた標識核酸プローブを試料中のDNAまたはRNA
と交雑させ、交雑した結合体の標識を測定することを特
徴とする試料中のヒトヘルペスウイルスの検出法。
14. A human herpesvirus detection oligonucleotide according to any one of claims 1 to 13 is labeled, and the obtained labeled nucleic acid probe is used as a DNA or RNA in a sample.
A method for detecting human herpesvirus in a sample, which comprises hybridizing with and measuring the label of the hybridized conjugate.
【請求項15】 請求項1〜13に記載されるヒトヘル
ペスウイルス検出用オリゴヌクレオチドである核酸プラ
イマーまたは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核
酸プライマーを試料中のDNAまたはRNAと交雑さ
せ、プライマー伸長させ、得られたプライマー伸長物を
測定することを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイル
スの検出法。
15. A nucleic acid primer which is the oligonucleotide for detecting human herpesvirus according to any one of claims 1 to 13 or a labeled nucleic acid primer obtained by labeling the oligonucleotide is hybridized with DNA or RNA in a sample to extend the primer. A method for detecting human herpesvirus in a sample, which comprises measuring the obtained primer extension product.
【請求項16】 請求項1〜13に記載されるヒトヘル
ペスウイルス検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標
識核酸プローブを含むことを特徴とする試料中のヒトヘ
ルペスウイルスの検出用試薬キット。
16. A reagent kit for detecting human herpesvirus in a sample, which comprises a labeled nucleic acid probe labeled with the oligonucleotide for detecting human herpesvirus according to any one of claims 1 to 13.
【請求項17】 請求項1〜13に記載されるヒトヘル
ペスウイルス検出用オリゴヌクレオチドである核酸プラ
イマーまたは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核
酸プライマーを含むことを特徴とする試料中のヒトヘル
ペスウイルスの検出用試薬キット。
17. A human herpesvirus in a sample, which comprises a nucleic acid primer which is the oligonucleotide for detecting human herpesvirus according to any one of claims 1 to 13 or a labeled nucleic acid primer obtained by labeling the oligonucleotide. Reagent kit for detection.
【請求項18】 請求項1〜13に記載されるヒトヘル
ペスウイルス検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標
識核酸プローブおよび請求項1に記載されるヒトヘルペ
スウイルス検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライ
マーまたは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸
プライマーを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペ
スウイルスの検出用試薬キット。
18. A labeled nucleic acid probe obtained by labeling the oligonucleotide for detecting human herpesvirus according to any one of claims 1 to 13, and a nucleic acid primer or the oligo that is the oligonucleotide for detecting human herpesvirus according to claim 1. A reagent kit for detecting human herpesvirus in a sample, which comprises a labeled nucleic acid primer labeled with a nucleotide.
【請求項19】 さらに核酸合成酵素およびdNTPお
よび/またはrNTPおよび緩衝液を含有することを特
徴とする請求項16〜18に記載される試料中のヒトヘ
ルペスウイルスの検出用試薬キット。
19. The reagent kit for detecting human herpesvirus in a sample according to claim 16, which further contains a nucleic acid synthesizing enzyme and dNTP and / or rNTP and a buffer solution.
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