JPH07280789A - 液体クロマトグラフ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ステップグラジエント方式を利用した液体ク
ロマトグラフであって、分離性能を維持したまま測定時
間の短縮化、装置の小型化及び低価格化を図り得るもの
を得る。 【構成】 流路２に、送液ポンプ４、インジエクタ５、
分離カラム６及び検出器７を順に連結し、上記インジェ
クタ５として、試料または第２の移動相を吸引するサン
プリングノズル８と、六方切り換え弁９と、六方切り換
え弁９に接続された液体保持用配管１０とを有し、切り
換え弁９の第１の切り換え状態において第１の移動相に
より目的成分を溶出し、第２の切り換え状態において、
液体保持用配管１０に保持されていた第２の移動相を流
路に導き非目的成分を溶出・分離する液体クロマトグラ
フ１。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体クロマトグラフに
関し、特に、複数の移動相をステップ的に切り替えて測
定するステップグラジエント方式の測定方法に適した液
体クロマトグラフに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、液体クロマトグラフィーにおい
て、複数の移動相を使用して測定する方法として、ステ
ップグラジエント方式、リニアグラジエント方式等のグ
ラジエント方式が用いられている。グラジエント方式の
測定方法の中でも、もっとも簡便な方法は、移動相を所
定のタイミングで切り換えるステップグラジエント方式
である。上記ステップグラジエント方式で測定するため
の液体クロマトグラフとしては、低圧グラジエント方式
のものを及び高圧グラジエント方式のものが知られてい
る。

【０００３】低圧グラジエント方式の液体クロマトグラ
フ装置では、移動相の流れる方向において、移動相切換
え部、送液ポンプ、インジェクタ、分離カラム及び検出
器の順に各構成部材が連結されている。低圧グラジエン
ト方式では、移動相の切り換えは、送液ポンプの上流側
に設けられた上記移動相切り換え部に使用されている電
磁弁の開閉により制御されている。

【０００４】他方、高圧グラジエント方式の液体クロマ
トグラフ装置では、移動相の数に応じて複数の送液ポン
プを用意し、各送液ポンプの下流側に移動相切り換え部
が設けられている。

【０００５】ところで、上記低圧グラジエント方式の液
体クロマトグラフでは、（ａ）移動相切り換え部が送液
ポンプよりも上流側に設けられているため、移動相切り
換え部において移動相を切り換えてから、実際に分離カ
ラムにおいて移動相が切り換わるまでに時間的な遅れが
生じざるを得ないという欠点があった。加えて、前に流
れていた移動相と置換される新たな移動相の容量が多い
ため、移動相同士の拡散が進みやすく、従って移動相が
ステップ的に切り換わり難いという欠点もあった。

【０００６】図１は、高圧グラジエント方式及び低圧グ
ラジエント方式における溶出力の時間的変化を模式的に
示すものである。図１に模式的に示すように、高圧グラ
ジエント法では、移動相Ｉから移動相ＩＩに切り換わる
際に、実線で示すように、ステップ的にかつ時間的な遅
れがさほど生じずに切り換えが行われるのに対し、低圧
グラジエント法では、破線で示す高圧グラジエント法の
場合の変化と比べて、移動相ＩＩへの切り換え開始時点
Ｐ _c が遅れ、しかも、ステップ的に切り換わらない。

【０００７】他方、高圧グラジエント方式では、上記の
ような欠点は生じないが、移動相の種類に応じて送液ポ
ンプを多数用意しなければならないという欠点があっ
た。また、特開平２−１３０４６６号公報には、上記高
圧グラジエント方式の液体クロマトグラフの簡略化を図
るものとして、移動相を送液する送液ポンプと分析用分
離カラムとを連結してなる流路に、グラジエント用溶媒
を保持する保持配管と、移動相を分離カラムに送給する
バイパス配管と並列に設け、さらに上記バイパス配管と
保持配管との接続を切り換える切り換え弁を設けた液体
クロマトグラフが開示されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開平
２−１３０４６６号公報に開示されている液体クロマト
グラフでは、上記のような保持配管、バイパス配管及び
切り換え弁をさらに用意しなければならず、これらを上
記のように接続しなければないならない。加えて、実際
に上記装置を実現するには、移動相を切り換えるのにの
み必要な専用の切り換え弁、及び該切り換え弁に接続さ
れた保持配管に移動相を挿入するためのポンプ等が別途
必要となる。

【０００９】一般に、液体クロマトグラフィーを利用し
た測定装置では、測定時間の短縮化、測定装置の小型化
及び低価格化が強く求められている。また、ステップグ
ラジエント方式では、測定時間の短縮を図るために、目
的成分までのピークを移動相Ｉによって溶出した後、以
後に溶出される幾つかの非目的成分のピークを、移動相
ＩＩにより一本のピークとして溶出する方法が多用され
ている。

【００１０】この場合、第１の移動相Ｉの溶出力に比べ
て、第２の移動相ＩＩの溶出力が高くされている。さら
に、この方法において、分離カラム及び移動相を変更せ
ずに測定時間を一層短縮するには、（ａ）流速を速くす
る方法、及び（ｂ）非目的成分を短時間に溶出させる方
法が存在する。しかしながら、分離性能を維持したまま
測定時間を短縮しようとした場合に、流速を速くする方
法では対応が難しくなり、従って結局は、後者の方法
（ｂ）を用いなければならない。

【００１１】他方、（ｂ）非目的成分を短時間に溶出す
る条件としては、低圧グラジエント方式に比べて高圧グ
ラジエント方式の方が適している。これは、非目的成分
を溶出させるための移動相ＩＩにステップ的に切り換わ
ること、並びに第２の移動相ＩＩの第１の移動相Ｉへの
拡散が少ないため、非目的成分のピークがシャープに現
れることによる。

【００１２】より詳しく説明すると、移動相の切り換え
がステップ的に行われない場合には、分離カラム中に残
存している移動相ＩＩの影響により、次回の測定の目的
成分の溶出時間が速くなり過ぎることになる。すなわ
ち、次回の測定が開始されるまでに、分離カラムが移動
相Ｉで平衡化されていないければならない。

【００１３】他方、測定装置の小型化及び低価格化を図
るには、高圧グラジエント方式に比べて低圧グラジエン
ト方式の方が適している。当然のことながら、低圧グラ
ジエント方式では送液ポンプを１台用意するだけでよい
のに対し、高圧グラジエント方式では移動相の種類に応
じて送液ポンプを用意しなければならないからである。

【００１４】上記のように、低圧グラジエント方式及び
高圧グラジエント方式の何れの方式においても、測定時
間の短縮化並びに測定器の小型化及び低価格化を同時に
満たすのは非常に困難である。

【００１５】さらに、上述した特開平２−１３０４６６
号公報に開示されている装置では、移動相を切り換える
ための切り換え弁、及び切り換え弁に接続された保持配
管に移動相を導入するためにポンプ等が別途必要となる
ため、やはり測定器の十分な小型化及び一層の低価格化
を達成し得るものではない。

【００１６】本発明の目的は、グラジエント方式の液体
クロマトグラフであって、測定時間の短縮化並びに測定
器の小型化及び低価格化を図り得る新規な液体クロマト
グラフを提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明は、第１，第２の
移動相を用いる液体クロマトグラフであって、第１の移
動相を送液する送液ポンプと分析用の分離カラムとを連
結してなる流路において、前記送液ポンプと分離カラム
との間に試料及び第２の移動相を前記流路に導くための
インジェクタを接続してなり、前記インジェクタは、試
料または第２の移動相を吸引するサンプリングノズル
と、前記サンプリングノズルに連結された切り換え弁
と、前記切り換え弁に両端が連結されており、かつ試料
または第２の移動相を保持する液体保持流路とを有し、
前記切り換え弁は、第１の移動相が前記流路に流され、
かつ前記試料または第２の移動相が前記液体保持流路に
導かれる第１の切り換え状態と、第１の移動相を前記液
体保持流路に導入し、かつ前記試料または第２の移動相
を前記液体保持流路から前記流路に導く第２の切り換え
状態との間で切り換えられるように構成されていること
を特徴とする、液体クロマトグラフである。

【００１８】

【作用】本発明では、上記切り換え弁が第１の状態に切
り換えられているときには、第１の移動相が送液ポンプ
により上記流路に流され、分離カラムに与えられるとと
もに、サンプリングノズルからの吸引により上記試料ま
たは第２の移動相が液体保持流路に導かれる。他方、第
２の切り換え状態では、試料または第２の移動相が液体
保持流路から流路に導かれ、分離カラムに与えられる。

【００１９】従って、上記切り換え弁を第１の状態と第
２の状態とで切り換えることにより、第１の移動相から
第２の移動相に、ステップ的に移動相を切り換えること
ができる。すなわち、第２の移動相が速やかに分離カラ
ムに到達し得るため、従来の高圧グラジエント方式の場
合と同様に、移動相の切り換えに際しての時間的な遅れ
がほとんどなく、移動相をステップ的に確実に切り換え
ることができる。

【００２０】また、上記インジェクタを利用してステッ
プグラジエントを行うものであるため、第２の移動相を
流路に導くための構成として、別途送液ポンプを必要と
せず、さらに追加的な配管としても、切り換え弁に接続
される上記液体保持流路を構成するための配管を用意す
るだけでよい。

【００２１】

【実施例】以下、図面を参照しつつ本発明の一実施例に
かかる液体クロマトグラフを説明することにより、本発
明を明らかにする。

【００２２】図１は、本発明の一実施例にかかる液体ク
ロマトグラフの構成を示す概略ブロック図である。本実
施例の液体クロマトグラフ１は、流路２に沿って設けら
れている。流路２の最も上流には、第１の移動相Ｉが収
納された容器３が配置されている。容器３の下流には、
送液ポンプ４が配置されている。送液ポンプ４は、第１
の移動相Ｉを送液するために設けられており、この目的
に応じた種々の形式のポンプ例えば、ローラーポンプ等
のポンプにより構成することができる。送液ポンプとし
て用い得るポンプの具体的な例としては、島津製作所
製、商品名ＬＣ−９Ａ等が挙げられる。ポンプ４の下流
には、インジェクタ５、分離カラム６及び検出器７がこ
の順序で流路２に沿って連結されている。

【００２３】インジェクタ５は、試料または第２の移動
相を吸引するサンプリングノズル８と、切り換え弁９
と、液体保持流路を構成するための液体保持配管１０と
を有する。

【００２４】サンプリングノズル８は、第２の移動相や
試料を吸引し得る適宜のサンプリングノズルを用いて構
成することができ、該サンプリングノズル８が用いられ
ているため、本実施例の液体クロマトグラフ１では、第
２の移動相を導入するのに大掛かりな送液ポンプ等の装
置を必要としない。

【００２５】切り換え弁９は、本実施例では、略図的に
示されている六方切り換え弁により構成されている。こ
の切り換え弁９は、６個のポート９ａ〜９ｆを有し、各
ポート間は、図示の実線で示す第１の切り換え状態と、
図示の破線で示す第２の切り換え状態との間で切り換え
られるように構成されている。すなわち、第１の切り換
え状態では、ポート９ａ−ポート９ｂ間、ポート９ｃ−
ポート９ｄ間及びポート９ｅ−ポート９ｆ間が連結され
ている。他方、第２の切り換え状態では、ポート９ｂ−
ポート９ｃ間、ポート９ｄ−ポート９ｅ間及びポート９
ｆ−ポート９ａ間が接続される。

【００２６】上記サンプリングノズル８は、ポート９ａ
に接続されている。また、ポート９ｂとポート９ｅとの
間に上記液体保持用配管１０が接続されている。さら
に、ポート９ｃ，ポート９ｄが、上記流路２に接続され
ている。また、ポート９ｆには、廃液部１１が接続され
ている。廃液部１１は、試料または第２の移動相を貯溜
し得る適宜の容器で構成してもよいが、特にこのような
容器からなる廃液部１１を設けずともよい。すなわち、
ポート９ｆに、単に廃液管を接続した構成であってもよ
い。

【００２７】液体保持用配管１０は、本発明における液
体保持流路を構成するために設けられているが、本実施
例では図示のようなループ配管で構成されている。もっ
とも、上述のように第２の移動相や試料を保持し得る限
り、ループ配管に限らず、第２の移動相や試料５を目的
の量だけ保持させ得る適宜の形状の配管を用いることが
できる。

【００２８】なお、上記液体保持用配管１０の容量とし
ては、注入する試料や第２の移動相ＩＩのうち、注入量
の最も多いものよりも、大きくする必要がある。また、
本実施例では、切り換え弁として、六方切り換え弁９を
用いているが、上記第１の切り換え状態と第２の切り換
え状態とを実現し得る限り、六方切り換え弁９以外の他
の構造の切り換え弁により、本発明の切り換え弁を構成
してもよい。

【００２９】上記のように、本実施例の液体クロマトグ
ラフ１では、インジェタク５は、サンプリングノズル
８、切り換え弁９及び液体保持用配管１０のみを備えて
おればよく、第２の移動相を導くために、送液ポンプ等
の大掛かりな装置を必要としない。

【００３０】インジェクタ５の下流に接続されている分
離カラム６は、試料を分離するための従来より液体クロ
マトグラフに用いられている適宜のカラムにより構成す
ることができる。

【００３１】また、分離カラム６の下流に接続されてい
る検出器７は、分離カラム６から溶出された成分を検出
するための適宜の検出器により構成される。次に、上記
実施例の液体クロマトグラフを用いた測定方法につき説
明する。

【００３２】まず、切り換え弁９を第１の切り換え状態
にしておく。この状態で、ポンプ４により、第１の移動
相Ｉが容器３から流路２に送液される。この送液ポンプ
４による移動相Ｉの送液は、測定工程の全段階にわたり
常時行われている。

【００３３】次に、インジェクタ５のサンプリングノズ
ル８から、試料部１２の試料１３を吸引し、ポート９ａ
−９ｂを経て液体保持用配管１０に導く。しかる後、切
り換え弁９を第２の切り換え状態に切り換える。第２の
切り換え状態に切り換えられると、ポート９ｃ−ポート
９ｂ間が連結されるため、第１の移動相Ｉが液体保持用
配管１０に導かれ、それによって試料が液体保持用配管
１０からポート９ｅ及びポート９ｄを介して流路２に排
出され、分離カラム６に導かれる。

【００３４】従って、試料が分離カラム６に与えられ、
第１の移動相Ｉにより各目的成分が分離・溶出される。
液体保持用配管１０から試料が全て押し出された後に、
切り換え弁９を第１の切り換え状態に切り換える。次
に、図示しない洗浄機構により、サンプリングノズル８
及び液体保持用配管１０を洗浄する。この洗浄機構とし
ては、従来よりサンプリングノズルの洗浄に慣用されて
いる適宜のものを用いることができる。

【００３５】次に、インジェクタ５において、サンプリ
ングノズル８により、第２の移動相ＩＩを、容器１４か
ら吸引し、第２の移動相ＩＩをポート９ａ及びポート９
ｂを介して液体保持用配管１０に導く。さらに、液体保
持用配管１０内に第２の移動相ＩＩが閉鎖された段階以
降に、切り換え弁９を第２の切り換え状態に切り換え
る。なお、この切り換え弁９が切り換えられるまでの間
は、送液ポンプ４により第１の移動相１が流路２に送液
されている。

【００３６】上記第２の切り換え状態に切り換え弁９を
切り換え、第１の移動相Ｉをポート９ｃ及びポート９ｂ
を介して液体保持用配管１０側に送液することにより、
液体保持用配管１０に保持されていた第２の移動相ＩＩ
がポート９ｅ及びポート９ｄを介して流路２に流され、
分離カラム６に送られる。従って、分離カラム６におい
て、第２の移動相ＩＩにより非目的成分が溶出される。
溶出された非目的成分は、検出器７において検出され
る。

【００３７】所定量の第２の移動相ＩＩが液体保持用配
管１０から押し出された後に、六方切り換え弁９を第１
の状態に切り換え、再度ポート９ｃ−ポート９ｄ間を連
結することにより、流路２に第１の移動相Ｉが流され
る。また、図示しない洗浄機構により、上記サンプリン
グノズル８及び液体保持用配管１０を洗浄する。

【００３８】上記工程を繰り返すことにより、第１の移
動相Ｉを送液し、途中で切り換え弁９の切り換え及びサ
ンプリングノズル８からの移動相ＩＩの注入により、第
２の移動相ＩＩを流路２に流すことができ、しかも上記
説明から明らかなように、第１の移動相Ｉから第２の移
動相ＩＩへの切り換えはステップ的に行われる。

【００３９】また、本実施例の液体クロマトグラフにお
ける時間的な条件としては、試料の流路への注入から第
２の移動相ＩＩの液体保持用配管１０への吸引までの操
作は、測定開始（試料注入と同時）から第２の移動相Ｉ
Ｉへの切り換えまでの時間よりも短く行わねばならな
い。

【００４０】また、連続測定に際しては、サンプルリン
グノズル８、液体保持用配管１０の洗浄から次回の測定
における試料の液体保持用配管１０までの吸引までの操
作が、第２の移動相ＩＩから第１の移動相Ｉへの切り換
えから次回の測定開始時点までの時間よりも短いことが
必要である。

【００４１】次に、具体的な実験例につき説明する。糖
尿病の臨床検査項目であるグリコヘモグロビンの分析
を、上記実施例の液体クロマトグラフ及び図３及び図４
に示す比較例の液体クロマトグラフを用いて行った。実
施例及び比較例の装置では、送液ポンプとして、島津製
作所製、商品名：ＬＣ−９Ａ、カラム恒温槽として、積
水化学工業社製、商品名：ＣＯＵ−８２０、低圧グラジ
エンターとてし、積水化学工業社製、商品名：ＳＣＲ−
７２０、分離カラムとして、積水化学工業社製、商品
名：ＭＩＣＲＯＮＥＸ−Ａ１ｃを用いた。

【００４２】また、移動相としては、第１の移動相Ｉ
（りん酸緩衝液ｐＨ＝６．０、塩濃度＝１４０ｍＭ）
と、第２の移動相ＩＩ（りん酸緩衝液ｐＨ＝７．２、塩
濃度＝３２０ｍＭ）を用いた。なお、グリコヘモグロビ
ンに対する溶出能は、第２の移動相の方が第１の移動相
に比べて大きくされている。

【００４３】さらに、試料として、国際試薬社製コント
ロール血液を２００倍に希釈したものを用いた。図１に
示した実施例の装置において、下記の条件にて測定を行
った。得られたクロマトグラフを図５に示す。

【００４４】流速：１．５ｍｆ／分 カラム温度：４０℃ 試料注入量：１０μｌ 第２の移動相注入量：１５０μｌ また、比較例１として、図３に示した測定系を構成し、
実施例の装置を用いた測定方法と測定条件を同様とし、
グリコヘモグロビンの測定を行った。

【００４５】図３における装置は、第１の移動相Ｉが収
納された容器２１と、第２の移動相ＩＩが収納された容
器２２の下流に低圧グラジエンター２３、送液ポンプ２
４、試料注入用インジェクタ２５、分離カラム２６及び
検出器２７を順に接続した構造を有する。すなわち、従
来の低圧グラジエント方式の測定系に当たるものであ
る。なお、第２の移動相ＩＩは、実施例の場合と同容量
となるように、低圧グラジエンターにおける第２の移動
相の通液時間を０．１分とし、第２の移動相の注入量を
１５０μｌとした。得られたクロマトグラフを図６に示
す。

【００４６】さらに、比較例２として、図４に示した測
定系を構成し、同様にグリコヘモグロビンの測定を行っ
た。図４に示す装置では、上流に第１の移動相Ｉ及び第
２の移動相ＩＩをそれぞれ収納してなる容器２１，２２
が配置されており、その下流に送液ポンプ２４，２４が
それぞれ接続されている。送液ポンプ２４，２４の下流
において、流路が結合されており、さらにその下流に試
料注入用インジェクタ２５、分離カラム２６及び検出器
２７がその順序で接続されている。すなわち、図４に示
した測定系は、従来の高圧グラジエント方式の装置に当
たる。図４に示した装置を用いた測定に際しても第２の
移動相ＩＩの注入量が実施例の場合と同容量となるよう
に、第２の移動相ＩＩの送液のためのポンプの作動時間
を０．１分とした。得られたクロマトグラフを図７に示
す。

【００４７】図５〜図７から明らかなように、低圧グラ
ジエント方式に比べて、実施例の液体クロマトグラフを
用いた場合には、ＨｂＡ０を溶出するための第２の移動
相ＩＩの拡散が少なくなる。従って、ＨｂＡ０のピーク
がシャープになることがわかる。よって、測定時間の短
縮を図り得ることがわかる。

【００４８】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、インジ
ェクタ内に設けられた上記切り換え弁を第１の切り換え
状態から第２の切り換え状態に切り換えることにより液
体保持流路に蓄えられていた第２の移動相を分離カラム
に与えるものであるため、従来の高圧グラジエント方式
の場合と同様に移動相をステップ的に切り換えることが
できる。従って、複数の移動相を用いたグラジエント方
式の液体クロマトグラフにおいて、測定性能を低下させ
ることなく測定時間を短縮することができる。

【００４９】しかも、従来の高圧グラジエント方式では
移動相の種類に応じて多数の送液ポンプを用意しなけれ
ばならず、また特開平２−１３０４６６号公報に記載の
装置では、流路内に保持配管及びバイパス配管を並列に
接続しなければならず、かつ第２の移動相を注入するた
めに送液ポンプを必要とする。これに対して、本発明の
液体クロマトグラフでは、上記のような多数の部品を必
要としないため、液体クロマトグラフの小型化及び低価
格化も図り得る。

【００５０】なお、上記実施例では、第１，第２の２種
類の移動相を用いた場合の液体クロマトグラフ及び測定
方法につき説明したが、さらに多くの種類の移動相を用
いた場合でも、同様に移動相の切り換えをステップ的に
行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】高圧グラジエント及び低圧グラジエント方式に
おける溶出力の時間的変化を説明するための模式図。

【図２】本発明の一実施例にかかる液体クロマトグラフ
の概略構成を示すブロック図。

【図３】比較のために用意した従来の低圧グラジエント
方式の液体クロマトグラフの構成を説明するためのブッ
ロク図。

【図４】比較のために用意した従来の高圧グラジエント
方式の液体クロマトグラフの構成を説明するためのブロ
ック図。

【図５】実施例の液体クロマトグラフを用いて得られた
クロマトグラムを示す図。

【図６】図３に示した液体クロマトグラフを用いて得ら
れたクロマトグラムを示す図。

【図７】図４に示した液体クロマトグラフを用いて得ら
れたクロマトグラムを示す図。

【符号の説明】

１…液体クロマトグラフ ２…流路 ４…送液ポンプ ５…インジェクタ ６…分離カラム ７…検出器 ８…サンプリングノズル ９…切り換え弁 １０…液体保持流路を構成する液体保持用配管

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第１，第２の移動相を用いる液体クロマ
   トグラフであって、 第１の移動相を送液する送液ポンプと分析用の分離カラ
   ムとを連結してなる流路において、 前記送液ポンプと分離カラムとの間に試料及び第２の移
   動相を前記流路に導くためのインジェクタを接続してな
   り、 前記インジェクタは、試料または第２の移動相を吸引す
   るサンプリングノズルと、前記サンプリングノズルに連
   結された切り換え弁と、前記切り換え弁に両端が連結さ
   れており、かつ試料または第２の移動相を保持する液体
   保持流路とを有し、 前記切り換え弁は、第１の移動相が前記流路に流され、
   かつ前記試料または第２の移動相が前記液体保持流路に
   導かれる第１の切り換え状態と、第１の移動相を前記液
   体保持流路に導入し、かつ前記試料または第２の移動相
   を前記液体保持流路から前記流路に導く第２の切り換え
   状態との間で切り換えられるように構成されていること
   を特徴とする、液体クロマトグラフ。