JPH0727980A - 蛍光顕微鏡用のストロボ光源 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 短時間に大きなエネルギーが集中するのを防
ぐとともに、十分な光量の励起光を与えうる光源を提供
する。 【構成】 本発明の蛍光顕微鏡用のストロボ光源は、大
出力のパルス発振レーザ（Ｑ−スイッチＮｄ：ＹＡＧレ
ーザなど）を用いて発生したレーザ光を顕微鏡試料の励
起光として出力する蛍光顕微鏡用のストロボ光源であっ
て、レーザ光の光路に、相対向する２のハーフミラー
と、これらのハーフミラーの間に１または複数のハーフ
ミラーとを有し、ハーフミラーを通したレーザ光を励起
光として出力することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大出力のパルス発振レ
ーザを用いた蛍光顕微鏡用ストロボ光源に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛍光顕微鏡は、試料の発する蛍光を分光
・定量を行って、蛍光色素による試料の分別染色や蛍光
抗体法による細胞や組織の特定部位の検出など、試料の
分析、細胞、組織の診断に用いられる。図６は、この装
置の構成例についてその概要を示したものである。この
図を用いて蛍光顕微鏡による測定を説明するとつぎのよ
うになる。

【０００３】予め蛍光色素で標識した試料１０６に、励
起光源１０５から励起光を照射する。試料の蛍光色素は
励起光によって蛍光を発し、ダイクロイックミラー１０
３及びバンドパスフィルタ１０２によって励起光の成分
が除かれて、試料からの蛍光がカメラ１０４で検出され
る。このカメラ１０４で得られた蛍光像から試料の分
析、細胞、組織の診断がなされる。試料からの蛍光はプ
リズムによって直接観察できるようになっている。

【０００４】試料内部の変化を観察するには、励起光源
１０５をパルス状の励起光を発生しうるものとし、パル
ス状の励起光に応じて得られる蛍光像を撮影することに
よりなされる。このようなストロボ法による撮影を行う
場合、イメージの時間分解能は、励起光のパルス幅にな
り、パルス幅の短い励起光源１０５を用いるほど向上す
る。また、時間分解能が上がるほど、つまり、より短い
パルスを使用するほど、撮影するのに十分な光量の蛍光
像を得るために強いパルスを必要とする。これらのこと
から、励起光源１０５には大出力のパルスレーザが用い
られ、特に、パルス幅が狭く、大出力がえられることか
ら、例えば、ＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザが用いられ
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のパルスレーザで
は、数ｎｓのパルス幅でエネルギー１０ｍＪ／パルス程
度が得られるのであるが、パルスレーザーのパルス波形
は矩形でなく、ガウシアン型を基本としているのでピー
ク値における光量が非常に大きい。この点は、非線形光
学素子を用いて高調波を発生しやすいという利点はある
が、顕微鏡の光学系および試料におけるダメージを大き
くすることになる。励起光は、発生した蛍光像を撮影す
るのに十分な強度で足りるので、上述のダメージを抑え
るという観点からパルス幅をもう少し広くしてピーク値
を小さくするほうが望ましい。このようなことから、パ
ルスレーザからのレーザ光或いは非線形光学素子を経た
高調波のレーザ光といったピーク値が大きく幅の狭いパ
ルス光を何等かの方法で、相対的にピーク強度を下げて
パルス幅を伸長するようにコントロールする、つまり、
ピーク強度とパルス幅についてパルス波形をコントロー
ルすることが必要になる。

【０００６】まず、これを解決するのに、平行平面間の
反射の繰り返しを利用したエタロンを用いる方法につい
て本件発明者は検討を行った。図７（ａ）はこの光学系
を示すもので、これは、平行平面単独で、あるいは、平
行平面板、ウェッジ板およびスペーサー等を組み合わせ
ることにより構成され、励起光源からの光ｇ0 の光路
に、距離Ｌだけ離して相対向する２のハーフミラーＭ1
，Ｍ2 を配置する。光ｇ0 は、まず、ハーフミラーＭ1
を透過した成分ｇ1 のうち、ハーフミラーＭ2 の反射
率Ｒ2 をかけたものが反射され、残りｇ2 が透過する。
２枚のハーフミラーＭ1 ，Ｍ2 の距離が十分に離れてい
る時（Ｌ＞＞ｃ×Ｐｗ、ｃは光速、Ｐｗはパルス光のパ
ルス幅）、内部での反射が無視できるとすると入力光強
度ｇ０に対し、最初に出力される成分の光強度ｇ（１）
は、２枚のハーフミラーＭ1 ，Ｍ2 の透過率Ｔ1 、Ｔ2
の積を掛けたものになる。

【０００７】ｇ2 ＝ｇ0 ×（Ｔ1 ×Ｔ2 ）… （式１） そして、ハーフミラーＭ2 の反射した成分は、反射率Ｒ
1 のハーフミラーＭ1で反射し、その一部が遅れてハー
フミラーＭ2 から強度ｇ（２）の光が透過する。ミラー
間の距離がパルス幅Ｐｗ程度に小さくなるとハーフミラ
ーＭ1 ，Ｍ2 間の光の反射による時間的な遅れ「２Ｌ×
ｃ（ｎ−１）」をもった成分が積算されることになる。
同様にして成分ｇ（３）が透過し、成分ｇ（１）から遅
れた成分ｇ（ｎ）が順次ハーフミラーＭ2 から透過する
（図７（ｂ））。成分ｇ（１）、ｇ（２）…ｇ（ｎ）は
時間的にはそれぞれ「２Ｌ×ｃ（ｎ−１）」遅れて出力
されるので、パルス幅に対し適当な距離Ｌを選べば出力
はそれらの積算になる。

【０００８】エタロンにより作られるパルスの立ち上が
りにおいて元の光パルスと同じ波形の成分ｇ2 （１）と
なっており、時間「２Ｌ×ｃ（ｎ−１）」遅れた成分ｇ
（ｎ）はＲ1 （１−Ｒ2 ）をかけた指数関数的な減衰を
する。即ち、エタロンにより作られる励起光は、指数関
数的な減衰をする波形になっており、光強度はそのピー
ク付近に集中することになる。ピーク値を下げようとす
ると、ハーフミラーＭ1 の透過率Ｔ1 をさげる必要があ
り、十分な出力を得られないことになる。そのため、十
分な光量、パルス幅の双方を同時に達成させることが困
難であることが分かった。

【０００９】このように、エタロンでパルス波形をコン
トロールすることは、出力は指数関数的な減衰となるた
め、出力のピーク付近に総出力が集中する、という問題
点があり、この問題点を解決しようとしても、励起光に
十分な光量を持たせないのである。そこで、本発明は、
短時間に大きなエネルギーが集中するのを防ぐととも
に、十分な光量の励起光を与えうることを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の蛍光顕微鏡用のストロボ光源は、大出力の
パルス発振レーザ（Ｑ−スイッチＮｄ：ＹＡＧレーザな
ど）を用いて発生したレーザ光を顕微鏡試料の励起光と
して出力する蛍光顕微鏡用のストロボ光源であって、レ
ーザ光の光路に、相対向する２のハーフミラーと、これ
らのハーフミラーの間に１または複数のハーフミラーと
を有し、ハーフミラーを通したレーザ光を励起光として
出力することを特徴とする。

【００１１】ここで、パルス発振レーザは、Ｑスイッチ
レーザ発振器と、この出力光を周波数変換して前記レー
ザ光を発生する非線形素子とを有することを特徴として
も良い。

【００１２】また、ハーフミラーの間隔は、略等しく、
レーザ光がその半値幅だけ進む距離の１／２程度である
ことを特徴としても良い。

【００１３】

【作用】本発明では、パルス発振レーザを用いて発生し
たレーザ光は、その光路に配置された複数のハーフミラ
ーを透過・反射をした後、励起光として出力される。こ
こで、レーザ光は、透過する成分の他に反射する成分が
あり、ハーフミラー間の反射が繰り返され遅れて出力さ
れる。そして、レーザ光の入射時にそのままハーフミラ
ーを透過する成分よりもハーフミラーの間で反射される
成分を多くすることができ、これによって、励起光は、
ハーフミラーに入射するレーザ光よりも立上がりが緩や
かでパルス幅が広がったものになる。

【００１４】ハーフミラーの間隔は、略等しく、レーザ
光がその半値幅だけ進む距離の１／２程度にすると、ハ
ーフミラーの間で反射される成分が重なりあうので、励
起光をなだらかで連続したものにすることができる。

【００１５】

【実施例】本発明の実施例を図面を参照して説明する。
図１は、本発明の蛍光顕微鏡用のストロボ光源の構成例
を示したものである。この装置は、パルスレーザ１２０
と、このパルスレーザ１２０のレーザ光の光軸上に、ア
イソレータ１３０及びビームエキスパンダ１４０と、複
数のハーフミラーＭ1 〜Ｍ10からなるパルス幅コントロ
ール部１１０とで構成したものである。

【００１６】パルスレーザー１２０には、Ｑ−ｓｗｉｔ
ｃｈＮｄ：ＹＡＧレーザー１２２を用い、１０６４ｎｍ
のレーザ光を非線形素子で構成された光パラメトリック
発振器１２４で５３２ｎｍのレーザ光として出力される
ようになっている。このようなパルスレーザー１２０の
構成は周知であり、非線形素子の角度をかえることで光
パラメトリック発振器１２４で発生するレーザ光の波長
を変えることができる。パルスレーザー１２０からは、
例えば、図２に示すようなパルス半値幅７ナノ秒のレー
ザ光が出力される（なお、縦軸は相対強度、横軸は時間
（ｎｓ）である）。

【００１７】アイソレータ１３０は、パルス幅コントロ
ール部１１０からの直接の反射光（戻り光）を防ぐため
に挿入したものであり、ビームエキスパンダ１４０は長
距離の平行ビームを作成するのと同時に単位面積あたり
をパワーを下げるためのものである。これによって、パ
ルス幅コントロール部１１０や蛍光顕微鏡（図６）の光
学系の保護がなされる。

【００１８】パルス幅コントロール部１１０は、各種の
透過率（反射率）を持つように制作された基板（ハーフ
ミラー）により構成され、微調節が可能なミラーホルダ
ーに設置されている。この場合は１０枚のハーフミラー
Ｍ1 〜Ｍ10により構成されている。各ミラーＭ1 〜Ｍ10
間の距離Ｌは、レーザ光がその半値幅（７ナノ秒）だけ
進む距離の１／２程度である１ｍの間隔としている。こ
れによって、パルス幅コントロール部１１０から遅れて
出力される成分が重なりあってなだらかで連続したもの
になる。

【００１９】図３は、ハーフミラーＭ1 の透過率を０．
７（反射率０．３）とし、残りのハーフミラーＭ2 から
Ｍ10の透過率を０．５（反射率０．５）とした場合にお
いて、パルス幅コントロール部１１０から出力される励
起光の波形（点線）と、遅れて出力される各成分ｇ
（１）、ｇ（２）…ｇ（ｎ）（実線）の光強度を示した
ものである（コンピュータシュミレーションの結果）。
パルス幅コントロール部１１０から出力される励起光の
全光量は、全入射強度の約１０％であるが、そのピーク
強度は入射強度の０．６７％に抑えられている。また、
半値幅は、９０ナノ秒程度に広がったものになってい
る。このことから明らかなように、相対的にピーク強度
を下げ、パルス幅を伸長することが可能になっている。

【００２０】図４は、パルス幅コントロール部１１０を
ハーフミラーＭ1 ，Ｍ2 の２枚で構成した場合につい
て、図２の光パルス波形とし、Ｍ１の透過率を０．１
（反射率０．９）、Ｍ２の透過率を０．５（反射率０．
５）と設定し、距離Ｌを図２の時間軸上で８としたとき
の励起光の波形（点線）を示したものである。このミラ
ーの構成は図７と同様であり、ミラー間の距離がパルス
幅Ｐｗ程度に小さくなるとＭ１、Ｍ２間の光の反射によ
る時間的な遅れ「２Ｌ×ｃ（ｎ−１）」をもった各成分
ｇ（１）、ｇ（２）…ｇ（ｎ）（実線）が積算されるこ
とになる。

【００２１】図７のようなハーフミラーが２枚という構
成においては、初期値から指数関数的に減少する波形と
なり、これが最大の欠点になっている。しかし、図３と
図４との比較から明らかなように、ハーフミラーＭ1 ，
Ｍ10の間にさらにハーフミラーを配置することにより、
ピーク値に対してパルス幅が広がったものになる。即
ち、ミラーの距離を適当に調節することにより、励起光
は成分ｇ（１）、ｇ（２）…ｇ（ｎ）の和となって結果
として長いパルスを得ることができる。こうして、励起
光の立上がりがなだらかになってパルス幅を広げること
ができる。

【００２２】図５は、この原理を説明するために、ハー
フミラーが３枚という最も基本的な構成例を示したもの
である。この構成において成分ｇ（１），ｇ（２）は、
各ミラーＭ1 ，Ｍ2 ，Ｍ3 の反射率Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 を
用いて次の式２，３で示される。

【００２３】 ｇ（１）＝ｇ0 （１−Ｒ1 ）（１−Ｒ2 ）（１−Ｒ3 ） （式２） ｇ（２）＝ｇ0 （１−Ｒ1 ）（１−Ｒ2 ）（１−Ｒ3 ）Ｒ2 （Ｒ1 ＋Ｒ3 ） （式３） これから成分ｇ（１），ｇ（２）の比は、「Ｒ2 （Ｒ1
＋Ｒ3 ）」で表される。反射率Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 は独立
であるから、（Ｒ1 ＋Ｒ3 ）を適当に大きくすれば、成
分ｇ（２）を成分ｇ（１）よりも大きくすることができ
る。即ち、励起光の立上がりをなだらかにすることがで
きる。これが、図７のように、立ち上がりが元の光パル
スと同じ波形を持ち、指数関数的な減衰をするのと異な
る点であり、励起光の立上がりをなだらかにすることに
よって、光強度をそのピーク付近に集中することを抑
え、十分な光量、パルス幅の双方を同時に達成させるこ
とが可能になる。

【００２４】なお、３枚の場合は、成分ｇ（３）は、次
の式４で示され、これから成分ｇ（３）と成分ｇ（１）
との比は式５で示される。

【００２５】 ｇ（２）＝ｇ0 （１−Ｒ1 ）（１−Ｒ2 ）（１−Ｒ3 ）｛（１−Ｒ2 ）² ＋Ｒ1 ² ・Ｒ2 ² ＋Ｒ2 ² ・Ｒ3 ² ｝ （式４） ｇ（３）／ｇ（１）＝（１−Ｒ2 ）² ＋Ｒ1 ² ・Ｒ2 ² ＋Ｒ2 ² ・Ｒ3 ² ｝ （式５） この式５から、成分ｇ（３）は成分ｇ（２）よりも小さ
いものになり、成分ｇ（２）で励起光は最大値を示すこ
とになる。したがって、パルス幅を広げるには、図１の
ようにハーフミラーが多いほうが望ましい。

【００２６】このように、立ち上がりの波形は平行に並
べたハーフミラーにより透過率、反射率に応じてパルス
波形を時間的にコントロールできるので、ピークの光強
度が低くとも光量を得ることができる。また、多数枚の
ハーフミラーを用いるので光エネルギーを分散できるこ
とになりミラーの破損等の対パワー対策が容易になる。
また、付随的な効果として、レーザーと顕微鏡の間に拡
散板を挿入したのと同じ効果、つまり、レーザーのコヒ
ーレンシーが失われ干渉縞が現われない等、良質の光源
として用いることができる。

【００２７】

【発明の効果】以上の通り本発明によれば、レーザ光の
光路に配置されたハーフミラーによって、励起光である
レーザ光を立上がりが緩やかでパルス幅が広がったもの
にすることができるため、短時間に大きなエネルギーが
集中するのを防ぐことができ、顕微鏡試料に与える損傷
を抑えるとともに、顕微鏡試料に十分な光量の励起光を
与えることができるので、蛍光顕微鏡を用いたより良好
な観察が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の構成例を示す図。

【図２】パルスレーザからのレーザ光の波形を示す図。

【図３】図１の構成における出力波形の例を示す図。

【図４】ハーフミラーが２枚の場合の波形の例を示す
図。

【図５】ハーフミラーが３枚の場合の構成例を示す図。

【図６】蛍光顕微鏡の構成の概要を示す図。

【図７】ハーフミラーが２枚の場合の例を示す図。

【符号の説明】

１２０…パルスレーザ、１２２…Ｑ−ｓｗｉｔｃｈＮ
ｄ：ＹＡＧレーザー、１１２４…光パラメトリック発振
器、１３０…アイソレータ、１４０…ビームエキスパン
ダ、Ｍ1 〜Ｍ10…ハーフミラー

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大出力のパルス発振レーザを用いて発生
   したレーザ光を顕微鏡試料の励起光として出力する蛍光
   顕微鏡用のストロボ光源であって、 前記レーザ光の光路に、相対向する２のハーフミラー
   と、これらのハーフミラーの間に１または複数のハーフ
   ミラーとを有し、 前記ハーフミラーを通した前記レーザ光を前記励起光と
   して出力することを特徴とする蛍光顕微鏡用のストロボ
   光源。
2. 【請求項２】 前記パルス発振レーザは、Ｑスイッチレ
   ーザ発振器と、この出力光を周波数変換して前記レーザ
   光を発生する非線形素子とを有することを特徴とする請
   求項１記載の蛍光顕微鏡用のストロボ光源。
3. 【請求項３】 前記ハーフミラーの間隔は、略等しく、
   前記レーザ光がその半値幅だけ進む距離の１／２程度で
   あることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡用のス
   トロボ光源。