JPH07274953A - 細胞培養基材及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】細胞の接着効率を向上させることができる、正
電荷を有する細胞培養基材、およびその簡便な製造方法
を提供すること。 【構成】重合性感応基及び炭素数１０以上３０未満の炭
化水素鎖を２本または３本有する４級アンモニウム塩モ
ノマーの重合体から成る細胞培養基材、またはその重合
体が、疎水性材料表面に吸着している細胞培養基材、お
よび、上記４級アンモニウム塩モノマーの溶液を疎水性
材料表面に接触させてその表面に吸着させ、次に吸着し
た該モノマーを重合させる工程から成る、細胞培養基材
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞培養に適した基材
に関する。また、本発明は細胞培養基材の製造方法にも
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、細胞培養技術は、１）細胞産生物
の生産、２）生体病変部や欠損部への補綴材、３）薬剤
の毒性及び薬理活性評価用のシュミレーターなどの分野
で、研究、応用されている。

【０００３】今日、細胞培養に用いられている動物細胞
は２種類に分類される。即ち、接着非依存性細胞（anch
orage independent cells）と接着依存性細胞（anchora
ge dependent cells）である。前者の接着非依存性細胞
は、生存、増殖、物質産生能などの細胞機能が細胞の足
場である基質が存在しなくても正常に発現される細胞で
ある。典型的な例としてミエローマ細胞、リンホーマ細
胞などから形成されるハイブリドーマがあげられる。

【０００４】一方、後者の接着依存性細胞は、生存、増
殖、物質産生などの細胞機能が細胞の足場である基質が
存在しなくては正常に発現されない細胞である。初代培
養細胞をはじめとした正常二倍体細胞の大部分は接着依
存性である。さらに無限に増殖可能な樹立細胞系にも、
接着依存性を示すものが数多く知られている。例えば、
インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイ
ン類、エリスロポエチン、コロニー・スティミュレイテ
ィング・ファクター、トロンボポエチンなどの各種分化
成長ホルモン、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチ
ベーター、ワクチンなどの有用な細胞産生物を産生する
樹立細胞系にも接着依存性を示すものが多く知られてい
る。従って、これら有用な細胞産生物の生産のためにも
接着依存性細胞の培養技術の確立は非常に重要である。

【０００５】一般に細胞を物質生産のために利用する場
合、細胞の機能を生体内の状態と同じレベルで維持し、
かつ高密度に培養することが重要である。このような分
野において、従来接着依存性動物細胞の培養は、ガラ
ス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養ビンなど
を用いて行われてきた。また、最近マイクロキャリアー
や中空糸を培養基材として用い、より高密度の培養や、
長期の培養を行う試みがなされつつある。接着依存性動
物細胞を培養基材上に接着させ、増殖させるには、該基
材表面と細胞の接着性が良好であると共に、接着した細
胞の形態、配列が、細胞の伸展、増殖に適した状態にな
っていることが必要である。しかしながら、従来から細
胞培養基材として用いられている高分子材料、特にポリ
スチレンは、賦形性、耐久性、透明性、無毒性、低コス
トの点で優れているものの、ポリスチレン表面は疎水性
のため、上記接着性の点に関して不適当であった。そこ
で、ポリスチレン表面をコロナ放電処理することにより
表面にのみ陰イオン基を導入し、親水性を付与すること
により、細胞の接着性、増殖性を改善した細胞培養基材
が開発され広く用いられている。また、細胞外マトリク
スを培養基材表面に固定した培養基材が開発された。例
えば、細胞外マトリクスの主成分であるコラーゲン、細
胞外マトリクスの第２成分である、フィブロネクチン、
ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコ
サミノグリカンなどは、コラーゲンおよび細胞膜に対し
て特異的な結合部位を有し、細胞基質への接着に重要な
役割を果たしている。上記の細胞の接着、増殖を制御す
る因子を培養基材に組み合わせた例としては、コラーゲ
ンをコートした培養基材（K.Yoshizato, et al., Annal
sof Plastic Surgery, Vol 13, No.1, July 1984）、ま
たフィブロネクチンをコートした基材（F.Grinnell, Ex
pl. Cell Res., 102, 51, 1984）、また、イガイから得
られた細胞接着タンパク質をコートした基材（P.T.Picc
iano, et al., InVitro Cellular and Developmental B
iology, 22(3), 24A, 1986）、などが開発され、細胞接
着及び増殖の効果の改善が認められている。

【０００６】しかしながら、マイクロキャリアーや、中
空糸のように細胞接着面が平面（２次元）でなく、丸み
を帯びた３次元体の場合は、上記のような改良では細胞
の接着性を十分に改良することはできず、何か細胞を積
極的に引きつける手段が必要であった。細胞膜は負電荷
を帯びているために、基材に正電荷を導入することによ
り、電荷の力で細胞を引きつける方法が開発された。一
般には、ジメチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−ハイドロキシアミノプロピル
基を直接マイクロキャリアーに導入する方法、または、
ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリエチレンイ
ミンをコートする方法がある。しかしながら、多量の正
電荷を導入することは、細胞に毒性を与えることが知ら
れており、適当な電荷密度が必要である。例えば、マイ
クロキャリアーの場合は、約２．０（ｍｅｑ／ｇｍ）が
適当なことが知られている（D.W.Levin, et al., Biote
chnol. Bioeng. 21, 821, 1979）。

【０００７】以上に示した方法はどれも細胞の接着の改
良には有効な手段ではあるが、正電荷導入操作が煩雑で
あったり、コートする基材の形状が中空糸のように複雑
な場合、コートむらが出来、性能にばらつきがでる欠点
を有していた。

【０００８】前にも述べたように、中空糸やマイクロキ
ャリアーの場合、細胞接着面が３次元であるので、ディ
ッシュやフラスコのような平面（２次元）の接着面と比
較すると、細胞の接着効率が良くなかった。従って、こ
れを改良するには、細胞を播種した後、直ちに細胞が接
着面に接着できるような改良が必要とされていた。

【０００９】また、上記モノマーやポリマーをコートす
る場合、一般的に有機溶媒を用いると、コートの均一性
や乾燥工程の経済性が向上するが、作業環境が悪化する
欠点があった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の培養
基材における問題点を解決した、正電荷を有する培養基
材を提供することを目的とする。また、正電荷を有する
培養基材の簡便な製造方法を提供することも目的として
いる。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的は、本発明の重
合性感応基及び炭素数１０以上３０未満の炭化水素鎖を
２本または３本有する４級アンモニウム塩モノマーの重
合体から成ることを特徴とする細胞培養基材によって達
成される。または、上記４級アンモニウム塩モノマーの
重合体が、疎水性材料表面に吸着していることを特徴と
する細胞培養基材によっても達成することができる。

【００１２】また、本発明は、上記４級アンモニウム塩
モノマーを疎水性材料表面に接触させ、その表面に吸着
させた後、吸着した該モノマーを重合させることを特徴
とする細胞培養基材の製造方法を提供する。

【００１３】本発明に用いられる４級アンモニウム塩モ
ノマーは、その分子内に少なくとも１個の重合性官能基
と炭素数１０以上３０未満の炭化水素鎖を２本または３
本有することが必要である。

【００１４】炭素数１０以上３０未満の炭化水素鎖は４
級アンモニウム塩モノマーを水相中で材料表面に吸着さ
せるために必要であり、さらに１分子中にこれが２本ま
たは３本存在することで、４級アンモニウム塩モノマー
は材料表面において該疎水性炭化水素基が材料表面側に
吸着し、親水性の４級窒素が水相側を向いて緻密に配列
するので、材料表面に２次元的に高密度の正電荷を導入
することができる。このような性質を付与できる炭化水
素鎖の炭素数は１０以上３０未満であるがより好ましく
は１４以上２３未満である。また、炭化水素鎖の構造
は、枝分かれを持たない構造が緻密な配列には望ましい
が、不飽和結合を有していても良い。好ましい炭化水素
鎖として例えば、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタ
デシル等のアルキル基やステアロイル、オレイル等のア
シル基などがあげられる。これらの長鎖炭化水素基は直
接４級窒素に結合していても良いし、グリセリン脂肪酸
エステル等として間接的に４級窒素に結合していても良
い。

【００１５】重合性官能基は、材料表面に吸着した４級
アンモニウム塩モノマーを重合させて培養液中への溶出
を防止するために必要である。重合性官能基としては、
例えば、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル
基等の、二重結合を有する官能基が用いられる。本発明
の４級アンモニウム塩モノマーは、それ単独で重合させ
ても良いし、他の重合性モノマーと共重合させても良
い。重合の手段としては、通常のラジカル重合開始剤を
使用しても良いし、電子線やγ線を照射して重合させて
も良い。

【００１６】４級アンモニウム塩モノマーの重合体を吸
着させる疎水性材料は、培養する細胞に毒性を与えるも
のでなければどんなものでも良い。例えば、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポ
リエステル、などの疎水性高分子材料をあげることがで
きる。しかしながら、これらの材料に限定されるもので
はないが、成型加工性を考慮に入れるならば、上記高分
子材料が望ましい。疎水性材料の形状は、特に限定され
るものではないが、一般に、ディッシュ、フラスコ、チ
ューブ、中空糸、マイクロスフェアーの形状をもってい
る。

【００１７】次に本発明の細胞培養基材の製造方法につ
いて説明する。本発明は、上記４級アンモニウム塩モノ
マーを疎水性材料表面に接触させ、その表面に吸着させ
る工程と、吸着した該モノマーを重合させる工程からな
ることを特徴とする。本発明に用いられる４級アンモニ
ウム塩モノマーは、単分子での水への溶解度は極めて低
いが、ミセルあるいは二分子膜ベシクル等の微細な分子
集合体として水中に均一に分散させることができる。従
って、４級アンモニウム塩モノマーは、溶液または分散
液または懸濁液として使用される。ここに疎水的な性質
をもつ材料表面が共存すると、４級アンモニウム塩モノ
マーは疎水性相互作用によって自発的に材料表面に吸着
する。従って該分散液中の４級アンモニウム塩モノマー
濃度は、材料の表面積によって決められるが、通常０．
００１ｗｔ％〜１ｗｔ％の範囲である。そのまま該分散
液を窒素バブリング等によって脱酸素化し、重合開始剤
を添加して、あるいは電子線やγ線を照射して４級アン
モニウム塩モノマーを材料表面に吸着させた状態のまま
重合させる。この場合は分散液中に残存するミセルある
いは二分子膜ベシクル内でも重合が起こる。また、４級
アンモニウム塩モノマーが表面に吸着した材料を分散液
から取り出し、窒素等の不活性ガス雰囲気下で電子線や
γ線を照射して材料表面に吸着した４級アンモニウム塩
モノマーのみを重合させることもできる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明する。本発明の範囲は特許請求の範囲により限定
されるものであり、以下の実施例により限定されるもの
ではない。［４級アンモニウム塩モノマーの合成］ジオ
レイルアミン（日本油脂（株）製、アミン２−ＯＬＲ）
１０ｇをクロロホルム２０ｍｌに溶解し、臭化アリル１
０ｇおよび炭酸ナトリウム５ｇを加え、室温で終夜、撹
拌反応させた。濾過後、溶媒を減圧除去してジアリル
（ジオレイル）アンモニウムブロマイド（ＤＡＤＯＡ）
１３ｇを得た。

【００１９】［ＤＡＤＯＡのコーティング］合成したＤ
ＡＤＯＡ １ｇを蒸留水１０００ｍｌに超音波照射して
分散させた。ポリスチレンディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ
１００８，日本ベクトン・ディッキンソン製）またはポ
リスルホンフィルム（スミライトＦＳ−１２００，厚み
０．２ｍｍ，住友ベークライト製）をＤＡＤＯＡ分散液
に浸し、ＤＡＤＯＡモノマーをポリスチレンディッシュ
またはポリスルホンフィルム表面に吸着させた。窒素通
気により分散液を脱酸素化した後、１０ｗｔ％の過硫酸
アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液１７６μｌとＮ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥ
Ｄ）１８μｌを加え、室温で終夜、窒素下で振とうし、
ＤＡＤＯＡを重合させた。ＤＡＤＯＡ分散液からポリス
チレンディッシュまたはポリスルホンフィルムを取り出
し、蒸留水で十分洗浄後、乾燥して培養実験に使用し
た。

【００２０】［培養実験］ 実施例１、比較例１ ヒト真皮由来の線維芽細胞をダルベッコ改変イーグル培
地（Ｄ−ＭＥＭ．１０％牛胎児血清含有、ＧＩＢＣＯ社
製）を用いて、最終細胞濃度が約２×１０⁵細胞／ｍｌ
になるように細胞分散液を調製し、ＤＡＤＯＡをコート
した疎水性培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ １００８，
日本ベクトン・ディッキンソン製）に細胞分散液を２ｍ
ｌずつ注入した。これを素早く３７℃の炭酸ガスインキ
ュベーター（５％炭酸ガス）内に移し１５分後、３０分
後、６０分後、及び１２０分経過後、各ディッシュから
培養液を回収し、これに含まれる未接着の細胞数をトリ
パンブルー染色法を用い血球計算板（ＴＡＴＡＩ型．萓
垣製作所製）で計測した。

【００２１】この方法により得られた未接着の細胞数と
当初ディッシュに播種した細胞数からコート面への細胞
接着率を以下の式を用い算出した。

【００２２】

【化１】 また、比較例としてＤＡＤＯＡコートディッシュの代わ
りに未コートの上記疎水性培養ディッシュを用い実施例
１と同様の操作を行った。

【００２３】結果を図１に示す。ＤＡＤＯＡをコートす
ることにより、培養開始初期（１５分、３０分）の細胞
の接着率を改良することができた。

【００２４】実施例２、比較例２ ポリスルホンフィルム（スミライト ＦＳ−１２００，
厚み０．２ｍｍ，住友ベークライト製）をφ２２ｍｍの
円に打ち抜き、ＤＡＤＯＡをコート、浮遊培養用１２ウ
ェルプレート（ＭＳ−８０１２Ｒ，住友ベークライト
製）の各ウェルに装着し細胞分散液を上記実施例１に従
い調製、０．８ｍｌずつ各ウェルに注入した。

【００２５】比較例としてＤＡＤＯＡコートポリスルホ
ンフィルムの代わりに未コートの上記ポリスルホンフィ
ルムを上記浮遊培養用１２ウェルプレートの各ウェルに
装着し同様の操作を行った。

【００２６】結果を図２に示す。ＤＡＤＯＡをコートす
ることにより、培養開始初期（１５分）の細胞の接着率
を改良することができた。特に、ポリスルホン中空糸の
ように細胞接着面が平面でなく、丸みを帯びた３次元体
の場合には効果があるように思われた。

【００２７】実施例３、比較例３ 肝実質細胞は、雄性ＳＤ系ラットから、Ｓｅｇｌｅｎの
コラゲナーゼ灌流法（Ｓｅｇｌｅｎ，Ｐ．Ｏ．：Ｍｅｔ
ｈ．Ｂｉｏｌ．１３：２９−８３，１９７６）に準じて
分離した。こうして得た細胞は、ウィリアムＥ培地（Ｗ
Ｅ、１％牛胎児血清含有、ＧＩＢＣＯ社製）を用いて最
終細胞濃度が約６×１０⁴細胞／ｍｌになるように細胞
分散液を調製した。培養基材は上記実施例２に従い調製
し、各ウェルに細胞分散液を１ｍｌずつ注入した。以降
の操作は上記実施例２と同様に行った。

【００２８】比較例として未コートのポリスルホンフィ
ルムを浮遊培養用１２ウェルプレートの各ウェルに装着
し実施例３と同様の操作を行った。

【００２９】結果を図３に示す。ＤＡＤＯＡをコートす
ることにより、肝細胞の接着率を改良することができ
た。特に、ポリスルホン中空糸のように細胞接着面が平
面でなく、丸みを帯びた３次元体の場合には効果がある
ように思われた。

【００３０】

【発明の効果】以上、詳しく述べたように、本発明の細
胞培養基材は、正電荷を有しているので、培養する細胞
の接着を改良することができる。特に、培養開始初期の
細胞の接着率を改良することができるため、疎水性のマ
イクロキャリアーや中空糸のように細胞接着面が平面で
なく、丸みを帯びた３次元体の場合には効果がある。本
発明の細胞培養基材の製造方法は、従来法に比べて操作
が簡便で、また４級アンモニウム塩モノマー中の長鎖炭
化水素基が疎水性相互作用により材料表面に吸着する性
質に基づくので、有機溶媒を使用せず広範な素材に適用
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１および比較例１における、培
養時間と線維芽細胞の接着率の変化を示す。

【図２】図２は、実施例２および比較例２における、培
養時間と線維芽細胞の接着率の変化を示す。

【図３】図３は、実施例３および比較例３における、培
養時間と肝細胞の接着率の変化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ａ (72)発明者 吉岡 浩 神奈川県小田原市小竹815−452 (72)発明者 森 有一 神奈川県横浜市金沢区釜利谷町1642−212 Ｂ−４ (72)発明者 窪田 倭 東京都国立市東３−21−24

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】重合性感応基及び炭素数１０以上３０未満
   の炭化水素鎖を２本または３本有する４級アンモニウム
   塩モノマーの重合体から成る細胞培養基材。
2. 【請求項２】重合性感応基及び炭素数１０以上３０未満
   の炭化水素鎖を２本または３本有する４級アンモニウム
   塩モノマーの重合体が、疎水性材料表面に吸着している
   細胞培養基材。
3. 【請求項３】請求項２に記載された細胞培養基材におい
   て、該疎水性材料が、疎水性高分子材料である細胞培養
   基材。
4. 【請求項４】請求項３に記載された細胞培養基材におい
   て、該疎水性高分子材料が、ポリスチレン、ポリエチレ
   ン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリエステルのい
   ずれかである細胞培養基材。
5. 【請求項５】重合性感応基及び炭素数１０以上３０未満
   の炭化水素鎖を２本または３本有する４級アンモニウム
   塩モノマーが、ジアリル（ジオレイル）アンモニウムブ
   ロマイドである、請求項１から４のいずれかに記載の細
   胞培養基材。
6. 【請求項６】（ａ）上記４級アンモニウム塩モノマーを
   疎水性材料表面に接触させ、その表面に吸着させる工
   程、および（ｂ）吸着した該モノマーを重合させる工程
   から成る、請求項２から５のいずれかに記載の細胞培養
   基材の製造方法。