JPH07236488A - 可溶性インターフェロンα−受容体およびその調製法 - Google Patents
可溶性インターフェロンα−受容体およびその調製法Info
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- JPH07236488A JPH07236488A JP6284046A JP28404694A JPH07236488A JP H07236488 A JPH07236488 A JP H07236488A JP 6284046 A JP6284046 A JP 6284046A JP 28404694 A JP28404694 A JP 28404694A JP H07236488 A JPH07236488 A JP H07236488A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明により、天然に存在するｍＲＮＡから
えられる可溶性インターフェロンα−受容体１型および
２型ならびにそれらをコードするＤＮＡ分子を提供す
る。 【構成】 哺乳動物の可溶性、膜非結合性型のインター
フェロンα−受容体をコードする単離されたＤＮＡ分
子、前記受容体またはその類似体、それらの調製法、そ
れらを含有する組成物ならびに薬剤。
えられる可溶性インターフェロンα−受容体１型および
２型ならびにそれらをコードするＤＮＡ分子を提供す
る。 【構成】 哺乳動物の可溶性、膜非結合性型のインター
フェロンα−受容体をコードする単離されたＤＮＡ分
子、前記受容体またはその類似体、それらの調製法、そ
れらを含有する組成物ならびに薬剤。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な型のインターフェ
ロンα−受容体（以下、ＩＦＮα−受容体またはＩＦＮ
ＡＲともいう）をコードするＤＮＡ分子、前記受容体ま
たはその類似体、それらの調製法およびそれらを含む組
成物ならびに診断および治療に用いる組成物および薬剤
に関する。
ロンα−受容体（以下、ＩＦＮα−受容体またはＩＦＮ
ＡＲともいう）をコードするＤＮＡ分子、前記受容体ま
たはその類似体、それらの調製法およびそれらを含む組
成物ならびに診断および治療に用いる組成物および薬剤
に関する。
【０００２】
【従来の技術】インターフェロンはサイトカインのファ
ミリーに属し、標的細胞表面に存在する特異的な形質膜
受容体を介して標的細胞に対して特徴的に作用する細胞
分泌タンパク質である。これら受容体の一般的な性質
は、細胞の外膜に受容体をつなぎ止める膜貫通（ＴＭ）
ドメインを形成している疎水性アミノ酸の内部配列が存
在することである（バザン、ジェー・エフ(Bazan, J.
F.) 、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー(Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA)８７巻、６９３４〜６９３８頁（１９
９０年））。ヒトタイプＩインターフェロン受容体（Ｉ
ＦＮα−受容体（ＩＦＮＡＲ）タンパク質と表される）
は、そのｃＤＮＡをクローニングすることにより特性が
明らかにされた（ウゼ、ジー(Uze, G.) およびグレッサ
ー、アイ(Gresser, I.) 、セル(Cell)６０巻、２２５〜
２３４頁（１９９０年））。このｃＤＮＡは４３６のア
ミノ酸のＮ−末端細胞外（ＥＣ）ドメインと１００のア
ミノ酸のＣ−末端細胞内（ＩＣ）ドメインとを分ける２
１アミノ酸長の疎水性膜貫通領域を有するＩＦＮＡＲタ
ンパク質をコードする（図１ａ参照）。ＥＣドメインは
リガンドの結合に関与していることが示されている（ベ
ノイト、ピー(Benoit, P.)ら、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー(J. Immunol.) １５０巻、７０７〜７１６頁
（１９９３年）；ノビック、ディー(Novick, D.)ら、フ
ェブス・レターズ(FEBS Letters)３１４巻、４４５〜４
４８頁（１９９２年））。
ミリーに属し、標的細胞表面に存在する特異的な形質膜
受容体を介して標的細胞に対して特徴的に作用する細胞
分泌タンパク質である。これら受容体の一般的な性質
は、細胞の外膜に受容体をつなぎ止める膜貫通（ＴＭ）
ドメインを形成している疎水性アミノ酸の内部配列が存
在することである（バザン、ジェー・エフ(Bazan, J.
F.) 、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー(Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA)８７巻、６９３４〜６９３８頁（１９
９０年））。ヒトタイプＩインターフェロン受容体（Ｉ
ＦＮα−受容体（ＩＦＮＡＲ）タンパク質と表される）
は、そのｃＤＮＡをクローニングすることにより特性が
明らかにされた（ウゼ、ジー(Uze, G.) およびグレッサ
ー、アイ(Gresser, I.) 、セル(Cell)６０巻、２２５〜
２３４頁（１９９０年））。このｃＤＮＡは４３６のア
ミノ酸のＮ−末端細胞外（ＥＣ）ドメインと１００のア
ミノ酸のＣ−末端細胞内（ＩＣ）ドメインとを分ける２
１アミノ酸長の疎水性膜貫通領域を有するＩＦＮＡＲタ
ンパク質をコードする（図１ａ参照）。ＥＣドメインは
リガンドの結合に関与していることが示されている（ベ
ノイト、ピー(Benoit, P.)ら、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー(J. Immunol.) １５０巻、７０７〜７１６頁
（１９９３年）；ノビック、ディー(Novick, D.)ら、フ
ェブス・レターズ(FEBS Letters)３１４巻、４４５〜４
４８頁（１９９２年））。
【０００３】可溶性で膜非結合型の受容体の存在が認め
られている（フェルナンデス−ボトラン、アール(Ferna
ndez -Botran, R.) 、ファセブ・ジャーナル(FASEB Jou
rnal) ５巻、２５６７〜２５７４頁（１９９１年））。
このような受容体は細胞外ドメインと膜貫通領域との間
で起こるタンパク質分解性切断によりしばしば形成さ
れ、それによる結果として切除された(truncated) 受容
体の脱離が生じる（ノファー、ワイ（Nophar, Y.) ら、
エンボジャーナル(EMBO J.) ９巻、３２６９〜３２７８
頁（１９９０年）；ムルバーグ、ジェー(Mullberg, J.)
ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Eur. J. Immunol.) ２３巻、４７３〜４８０頁（１９
９３年））。さらに細胞はまた、膜貫通ドメインおよび
細胞内ドメインを欠いたサイトカイン受容体の他の型を
合成していることも見出されたが、これはタンパク質分
解性切断の結果ではなく受容体遺伝子転写物の特異な(d
ifferential)プロセシングのために生じるものである
（ラインズ、エム・エー(Raines,M.A.) ら、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユー・エス・エー、８８巻、８２０３〜８２０
７頁（１９９１年）；ルスト、ジェー・エー(Lust, J.
A.)ら、サイトカイン(Cytokine)４巻、９６〜１００頁
（１９９２年））。これらの非膜貫通型すなわち「可溶
性」型は、Ｃ−末端における新規なアミノ酸配列により
特徴づけられ、それによりおそらくは別個の機能を有す
る別個のタンパク質となる。これまでに非膜貫通型すな
わち「可溶性」ＩＦＮα−受容体は記載されていない。
られている（フェルナンデス−ボトラン、アール(Ferna
ndez -Botran, R.) 、ファセブ・ジャーナル(FASEB Jou
rnal) ５巻、２５６７〜２５７４頁（１９９１年））。
このような受容体は細胞外ドメインと膜貫通領域との間
で起こるタンパク質分解性切断によりしばしば形成さ
れ、それによる結果として切除された(truncated) 受容
体の脱離が生じる（ノファー、ワイ（Nophar, Y.) ら、
エンボジャーナル(EMBO J.) ９巻、３２６９〜３２７８
頁（１９９０年）；ムルバーグ、ジェー(Mullberg, J.)
ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Eur. J. Immunol.) ２３巻、４７３〜４８０頁（１９
９３年））。さらに細胞はまた、膜貫通ドメインおよび
細胞内ドメインを欠いたサイトカイン受容体の他の型を
合成していることも見出されたが、これはタンパク質分
解性切断の結果ではなく受容体遺伝子転写物の特異な(d
ifferential)プロセシングのために生じるものである
（ラインズ、エム・エー(Raines,M.A.) ら、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユー・エス・エー、８８巻、８２０３〜８２０
７頁（１９９１年）；ルスト、ジェー・エー(Lust, J.
A.)ら、サイトカイン(Cytokine)４巻、９６〜１００頁
（１９９２年））。これらの非膜貫通型すなわち「可溶
性」型は、Ｃ−末端における新規なアミノ酸配列により
特徴づけられ、それによりおそらくは別個の機能を有す
る別個のタンパク質となる。これまでに非膜貫通型すな
わち「可溶性」ＩＦＮα−受容体は記載されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明において、受容
体遺伝子の転写物の特異なプロセシングにより産生され
る膜非結合型(non-membranal) のＩＦＮα−受容体が細
胞に存在することが予測せぬことに見出された。したが
って本発明は、ウゼ（前出）によりクローン化されたＩ
ＦＮα−受容体とは異なるアミノ酸配列を有する新規な
ＩＦＮα−受容体タンパク質を提供することを目的とす
る。これらの受容体は、細胞の非膜画分(non-membranal
compartment) におけるＩＦＮα−受容体に特異的なモ
ノクローナル抗体によって認識される。これら可溶性Ｉ
ＦＮ受容体は、リガンド結合について細胞膜受容体と競
合することにより、さもなければ細胞内でＩＦＮが媒介
する機能を担うことによりヒト細胞のＩＦＮに対する応
答を調節するであろう。
体遺伝子の転写物の特異なプロセシングにより産生され
る膜非結合型(non-membranal) のＩＦＮα−受容体が細
胞に存在することが予測せぬことに見出された。したが
って本発明は、ウゼ（前出）によりクローン化されたＩ
ＦＮα−受容体とは異なるアミノ酸配列を有する新規な
ＩＦＮα−受容体タンパク質を提供することを目的とす
る。これらの受容体は、細胞の非膜画分(non-membranal
compartment) におけるＩＦＮα−受容体に特異的なモ
ノクローナル抗体によって認識される。これら可溶性Ｉ
ＦＮ受容体は、リガンド結合について細胞膜受容体と競
合することにより、さもなければ細胞内でＩＦＮが媒介
する機能を担うことによりヒト細胞のＩＦＮに対する応
答を調節するであろう。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳動物の可
溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコー
ドする単離されたＤＮＡ分子、および原核細胞または真
核細胞宿主での発現によるポリペプチド産物をコードす
る単離されたＤＮＡ分子であって、該産物が哺乳動物の
可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体の一
次構造コンフォーメーションのすべてまたは一部を有し
かつ哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロン
α−受容体の生物学的活性を有するものであるＤＮＡ分
子に関する。
溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコー
ドする単離されたＤＮＡ分子、および原核細胞または真
核細胞宿主での発現によるポリペプチド産物をコードす
る単離されたＤＮＡ分子であって、該産物が哺乳動物の
可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体の一
次構造コンフォーメーションのすべてまたは一部を有し
かつ哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロン
α−受容体の生物学的活性を有するものであるＤＮＡ分
子に関する。
【０００６】前記ＤＮＡ分子は、好ましくはａ）哺乳動
物の天然インターフェロンα−受容体遺伝子のコード領
域に由来するヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクロー
ン、 ｂ）前記ａ）のクローンとハイブリダイズすることがで
き、生物学的に活性な可溶性、膜非結合型のインターフ
ェロンα−受容体をコードするＤＮＡ分子ならびに ｃ）遺伝コードの結果前記ａ）およびｂ）に定義される
ＤＮＡ分子に対して縮重を有し、生物学的に活性な可溶
性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコード
するＤＮＡ分子からなる群より選ばれる。
物の天然インターフェロンα−受容体遺伝子のコード領
域に由来するヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクロー
ン、 ｂ）前記ａ）のクローンとハイブリダイズすることがで
き、生物学的に活性な可溶性、膜非結合型のインターフ
ェロンα−受容体をコードするＤＮＡ分子ならびに ｃ）遺伝コードの結果前記ａ）およびｂ）に定義される
ＤＮＡ分子に対して縮重を有し、生物学的に活性な可溶
性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコード
するＤＮＡ分子からなる群より選ばれる。
【０００７】また前記ＤＮＡ分子は好ましくは、配列番
号１で示されるスプライス欠失されたインターフェロン
α−受容体１型のアミノ酸残基１〜４３４の配列のすべ
てまたは一部と実質的に同一なアミノ酸配列をコードす
る前記ＤＮＡ分子、および配列番号２で示されるスプラ
イス欠失されたインターフェロンα−受容体２型のアミ
ノ酸残基１〜４９６の配列のすべてまたは一部と実質的
に同一なアミノ酸配列をコードする前記ＤＮＡ分子であ
る。
号１で示されるスプライス欠失されたインターフェロン
α−受容体１型のアミノ酸残基１〜４３４の配列のすべ
てまたは一部と実質的に同一なアミノ酸配列をコードす
る前記ＤＮＡ分子、および配列番号２で示されるスプラ
イス欠失されたインターフェロンα−受容体２型のアミ
ノ酸残基１〜４９６の配列のすべてまたは一部と実質的
に同一なアミノ酸配列をコードする前記ＤＮＡ分子であ
る。
【０００８】さらに本発明は前記ＤＮＡ分子を含んでな
る組換え発現ベクターに関する。
る組換え発現ベクターに関する。
【０００９】本発明はまた、前記ベクターを含んでなる
宿主細胞を培養することからなる、哺乳動物の可溶性、
膜非結合型のインターフェロンα−受容体またはその類
似体の調製法に関する。
宿主細胞を培養することからなる、哺乳動物の可溶性、
膜非結合型のインターフェロンα−受容体またはその類
似体の調製法に関する。
【００１０】さらに本発明は哺乳動物の可溶性、膜非結
合型の生物学的に活性型であるインターフェロンα−受
容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘
導体または活性画分に関する。
合型の生物学的に活性型であるインターフェロンα−受
容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘
導体または活性画分に関する。
【００１１】前記インターフェロンα−受容体、そのム
テイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活
性画分において、インターフェロンα受容体は好ましく
はヒトが起源であり、約５５キロダルトンの分子量、お
よび配列番号１に示されるアミノ酸残基１〜４３４の配
列のすべてまたは一部と約８０％より大きく類似するア
ミノ酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェ
ロンα−受容体１型であり、もしくは約９５キロダルト
ンの分子量、および配列番号２に示されるアミノ酸残基
１〜４９６の配列のすべてまたは一部と約８０％より大
きく類似するアミノ酸配列を有するスプライス欠失され
たインターフェロンα−受容体２型である。
テイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活
性画分において、インターフェロンα受容体は好ましく
はヒトが起源であり、約５５キロダルトンの分子量、お
よび配列番号１に示されるアミノ酸残基１〜４３４の配
列のすべてまたは一部と約８０％より大きく類似するア
ミノ酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェ
ロンα−受容体１型であり、もしくは約９５キロダルト
ンの分子量、および配列番号２に示されるアミノ酸残基
１〜４９６の配列のすべてまたは一部と約８０％より大
きく類似するアミノ酸配列を有するスプライス欠失され
たインターフェロンα−受容体２型である。
【００１２】また本発明は希釈剤、担体および／または
賦形剤ならびに有効成分として均質で生物学的に活性な
前記の型のインターフェロンα−受容体、そのムテイン
体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分
を含んでなる組成物に関する。
賦形剤ならびに有効成分として均質で生物学的に活性な
前記の型のインターフェロンα−受容体、そのムテイン
体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分
を含んでなる組成物に関する。
【００１３】前記組成物は好ましくは、細胞または組織
においてインターフェロン−βおよび／またはインター
フェロン−αのサブタイプの活性を阻害、変更または修
飾するために用いられ、有効成分として前記インターフ
ェロンα−受容体１型、そのムテイン体、融合タンパク
質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有するか、あ
るいは有効成分として前記インターフェロンα−受容体
２型、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘
導体または活性画分を含有し、好ましくは生体内でまた
は生体外でインターフェロン−αまたはインターフェロ
ン−βのサブタイプの種類を質的および／または量的に
診断判定(diagnostic determination)するために用いら
れる。
においてインターフェロン−βおよび／またはインター
フェロン−αのサブタイプの活性を阻害、変更または修
飾するために用いられ、有効成分として前記インターフ
ェロンα−受容体１型、そのムテイン体、融合タンパク
質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有するか、あ
るいは有効成分として前記インターフェロンα−受容体
２型、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘
導体または活性画分を含有し、好ましくは生体内でまた
は生体外でインターフェロン−αまたはインターフェロ
ン−βのサブタイプの種類を質的および／または量的に
診断判定(diagnostic determination)するために用いら
れる。
【００１４】本発明はさらに、前記組成物および薬学的
に許容しうる希釈剤、担体および／または賦形剤から処
方された薬剤であって生体内でまたは生体外でインター
フェロン−αまたはインターフェロン−βのサブタイプ
の活性を阻害、変更または修飾するための薬剤に関す
る。
に許容しうる希釈剤、担体および／または賦形剤から処
方された薬剤であって生体内でまたは生体外でインター
フェロン−αまたはインターフェロン−βのサブタイプ
の活性を阻害、変更または修飾するための薬剤に関す
る。
【００１５】前記薬剤は好ましくは、大量のインターフ
ェロン−αおよび／またはインターフェロン−βが与え
られた結果または内在性に過剰のインターフェロン−α
および／またはインターフェロン−βが産生された結果
もたらされる、インターフェロン−αおよび／またはイ
ンターフェロン−βの過剰状態を治療するために用いら
れる。
ェロン−αおよび／またはインターフェロン−βが与え
られた結果または内在性に過剰のインターフェロン−α
および／またはインターフェロン−βが産生された結果
もたらされる、インターフェロン−αおよび／またはイ
ンターフェロン−βの過剰状態を治療するために用いら
れる。
【００１６】
【実施例】本発明は、択一的スプライシング(alternati
ve splicing)機構によってヒト細胞において合成される
ことにより特徴づけられる、新規な型のヒトＩＦＮα−
受容体のｍＲＮＡおよびタンパク質に関する。新規な型
のＩＦＮα−受容体のｃＤＮＡに対して確立された配列
により、対応するｍＲＮＡが膜貫通領域を欠いたタンパ
ク質を特定する新規なポリペプチド配列をコードするこ
とが示唆された。このような膜非結合型ＩＦＮＡＲの存
在がヒト細胞の可溶性細胞質画分内に示された。前記タ
ンパク質は細胞から細胞外の空間へも分泌されうるが、
他の可溶性受容体の型、すなわちタンパク質分解性切断
によりその細胞外ドメインを遊離する膜結合型の受容体
に由来するものとは区別される。
ve splicing)機構によってヒト細胞において合成される
ことにより特徴づけられる、新規な型のヒトＩＦＮα−
受容体のｍＲＮＡおよびタンパク質に関する。新規な型
のＩＦＮα−受容体のｃＤＮＡに対して確立された配列
により、対応するｍＲＮＡが膜貫通領域を欠いたタンパ
ク質を特定する新規なポリペプチド配列をコードするこ
とが示唆された。このような膜非結合型ＩＦＮＡＲの存
在がヒト細胞の可溶性細胞質画分内に示された。前記タ
ンパク質は細胞から細胞外の空間へも分泌されうるが、
他の可溶性受容体の型、すなわちタンパク質分解性切断
によりその細胞外ドメインを遊離する膜結合型の受容体
に由来するものとは区別される。
【００１７】サイトカイン活性の調節剤(regulators)と
しての可溶性受容体の潜在的な機能が報告されている
（フェルナンデス−ボトラン、１９９１年、前出）。細
胞が２つの膜非結合型すなわち可溶性型のＩＦＮα−受
容体をコードするｍＲＮＡを産生する機構が存在するこ
とは、その２つの型がそれぞれ細胞に対する何らかの機
能を有することを示唆している。これらの型は膜につな
ぎ留められず、細胞外に分泌されうるかまたはサイトゾ
ル（可溶性細胞画分）内に見出されうる。細胞内−細胞
質ドメインが膜貫通（ＴＭ）ドメインなしに直接続いて
いる、リガンドが結合する細胞外（ＥＣ）ドメインを含
む１つの型（図１ｃ）は、たとえば細胞内部でサイトカ
インの結合により発生するようなシグナルトランスダク
ションにおいて機能することがなお可能であろう。ＥＣ
ドメインにＳ（可溶性）−ドメインが続き膜貫通ドメイ
ンおよび細胞内−細胞質ドメインの両方を欠く他の型
（図１ｂ）は、シグナルトランスダクションにおいて機
能しないであろう。ＩＦＮＡＲのＥＣドメイン（残基２
２〜４２７）に、ＩＦＮ結合活性が含まれることが知ら
れている（ベノイト、ピーら、（１９９３年）、ノビッ
ク、ディーら（１９９２年）、いずれも前出、参照）。
したがって、本発明の細胞ｍＲＮＡにおいてコードされ
る可溶性ＩＦＮＡＲ型は、ＩＦＮと結合して細胞表面上
のＩＦＮ結合活性について競合しＩＦＮ拮抗剤として作
用するか、または多種多様のＩＦＮサブタイプの活性を
他の経路で調節することができるであろう。細胞内で合
成されて、これらのタンパク質はＩＦＮへの生物学的応
答に関与する他の細胞性タンパク質とも相互作用するこ
ともできる。このようなことは、正常の膜結合受容体の
細胞形質膜の外側でタンパク質分解性切断されることに
より産生された可溶性ＩＦＮα−受容体のばあいにはな
いであろう。
しての可溶性受容体の潜在的な機能が報告されている
（フェルナンデス−ボトラン、１９９１年、前出）。細
胞が２つの膜非結合型すなわち可溶性型のＩＦＮα−受
容体をコードするｍＲＮＡを産生する機構が存在するこ
とは、その２つの型がそれぞれ細胞に対する何らかの機
能を有することを示唆している。これらの型は膜につな
ぎ留められず、細胞外に分泌されうるかまたはサイトゾ
ル（可溶性細胞画分）内に見出されうる。細胞内−細胞
質ドメインが膜貫通（ＴＭ）ドメインなしに直接続いて
いる、リガンドが結合する細胞外（ＥＣ）ドメインを含
む１つの型（図１ｃ）は、たとえば細胞内部でサイトカ
インの結合により発生するようなシグナルトランスダク
ションにおいて機能することがなお可能であろう。ＥＣ
ドメインにＳ（可溶性）−ドメインが続き膜貫通ドメイ
ンおよび細胞内−細胞質ドメインの両方を欠く他の型
（図１ｂ）は、シグナルトランスダクションにおいて機
能しないであろう。ＩＦＮＡＲのＥＣドメイン（残基２
２〜４２７）に、ＩＦＮ結合活性が含まれることが知ら
れている（ベノイト、ピーら、（１９９３年）、ノビッ
ク、ディーら（１９９２年）、いずれも前出、参照）。
したがって、本発明の細胞ｍＲＮＡにおいてコードされ
る可溶性ＩＦＮＡＲ型は、ＩＦＮと結合して細胞表面上
のＩＦＮ結合活性について競合しＩＦＮ拮抗剤として作
用するか、または多種多様のＩＦＮサブタイプの活性を
他の経路で調節することができるであろう。細胞内で合
成されて、これらのタンパク質はＩＦＮへの生物学的応
答に関与する他の細胞性タンパク質とも相互作用するこ
ともできる。このようなことは、正常の膜結合受容体の
細胞形質膜の外側でタンパク質分解性切断されることに
より産生された可溶性ＩＦＮα−受容体のばあいにはな
いであろう。
【００１８】本発明の新規な可溶性型のＩＦＮＡＲは、
細胞、組織および生物体においてＩＦＮ−αおよび／ま
たはＩＦＮ−βのサブタイプの活性を阻害、変更または
修飾するために適用されうる。ＩＦＮは、抗ウイルス、
抗増殖および免疫調節機能を有する（バロン、エス(Bar
on, S.) ら（編）、インターフェロン(Interferon)；プ
リンシプルズ・アンド・メディカル・アプリケーション
ズ(Principles and Medical Applications) 、ザ・ユニ
バーシティ・オブ・テキサス・メディカル・ブランチ・
アット・ガルベストン(The University of Texas Medic
al Branch at Galveston) 、（１９９２年））。ＩＦＮ
はウイルス性疾患（たとえばパピロマトーゼ(papilloma
toses)、肝炎など）、悪性疾患（たとえば白血病、ホル
モン依存性癌など）および免疫学的機能不全（たとえば
多発性硬化症）を処置するために臨床的に用いられる。
ＩＦＮのこれらの有益な効果は、本発明の型のＩＦＮα
−受容体などの異なる型のＩＦＮα−受容体によって自
然に変えられうる。他方、ＩＦＮの過剰は有害であり
え、ある自己免疫疾患に、（移植組織拒絶および造血系
欠陥(hematopoietic deficiences) に）関わっている
（前出のバロン、エス）ら（編）、インターフェロン；
プリンシプルズ・アンド・メディカル・アプリケーショ
ンズ参照）。このような状態においては、ＩＦＮの作用
の阻害剤が有益でありうる。さらに、細胞はＩＦＮ−α
および／またはＩＦＮ−βのサブタイプへの応答におい
て異なることがありえ（ローゼンブラム、エム、ジー(R
osenblum,M.G.) ら、ジャーナル・オブ・インターフェ
ロン・リサーチ(J. Interferon Res.)１０巻、１４１〜
１５１頁（１９９０年））、ＩＦＮサブタイプに対する
細胞の応答が、細胞で合成された可溶性ＩＦＮＡＲ型の
いくつかによって変えられる。本発明の新規なＩＦＮＡ
ＲのｃＤＮＡの単離および同定によって、細胞で合成さ
れる天然の可溶性ＩＦＮα−受容体型の組換えＤＮＡ技
術による製造が可能となり、またトランスフェクトされ
た細胞における過剰発現によりまたは細胞培養物への添
加によりそれらの機能を研究することが可能となるであ
ろう。
細胞、組織および生物体においてＩＦＮ−αおよび／ま
たはＩＦＮ−βのサブタイプの活性を阻害、変更または
修飾するために適用されうる。ＩＦＮは、抗ウイルス、
抗増殖および免疫調節機能を有する（バロン、エス(Bar
on, S.) ら（編）、インターフェロン(Interferon)；プ
リンシプルズ・アンド・メディカル・アプリケーション
ズ(Principles and Medical Applications) 、ザ・ユニ
バーシティ・オブ・テキサス・メディカル・ブランチ・
アット・ガルベストン(The University of Texas Medic
al Branch at Galveston) 、（１９９２年））。ＩＦＮ
はウイルス性疾患（たとえばパピロマトーゼ(papilloma
toses)、肝炎など）、悪性疾患（たとえば白血病、ホル
モン依存性癌など）および免疫学的機能不全（たとえば
多発性硬化症）を処置するために臨床的に用いられる。
ＩＦＮのこれらの有益な効果は、本発明の型のＩＦＮα
−受容体などの異なる型のＩＦＮα−受容体によって自
然に変えられうる。他方、ＩＦＮの過剰は有害であり
え、ある自己免疫疾患に、（移植組織拒絶および造血系
欠陥(hematopoietic deficiences) に）関わっている
（前出のバロン、エス）ら（編）、インターフェロン；
プリンシプルズ・アンド・メディカル・アプリケーショ
ンズ参照）。このような状態においては、ＩＦＮの作用
の阻害剤が有益でありうる。さらに、細胞はＩＦＮ−α
および／またはＩＦＮ−βのサブタイプへの応答におい
て異なることがありえ（ローゼンブラム、エム、ジー(R
osenblum,M.G.) ら、ジャーナル・オブ・インターフェ
ロン・リサーチ(J. Interferon Res.)１０巻、１４１〜
１５１頁（１９９０年））、ＩＦＮサブタイプに対する
細胞の応答が、細胞で合成された可溶性ＩＦＮＡＲ型の
いくつかによって変えられる。本発明の新規なＩＦＮＡ
ＲのｃＤＮＡの単離および同定によって、細胞で合成さ
れる天然の可溶性ＩＦＮα−受容体型の組換えＤＮＡ技
術による製造が可能となり、またトランスフェクトされ
た細胞における過剰発現によりまたは細胞培養物への添
加によりそれらの機能を研究することが可能となるであ
ろう。
【００１９】本発明の可溶性ＩＦＮＡＲ型は、ＩＦＮ−
αおよび／またはＩＦＮ−βサブタイプの活性を阻害、
変更または修飾するための医薬組成物（薬剤）を調製す
るのに用いることができうる。このような医薬組成物
は、たとえば前記したような、治療において大量のＩＦ
Ｎが与えられた結果もしくはＩＦＮが内在的に異常に高
く産生された結果として患者が過剰のＩＦＮを有するよ
うな種々の障害(disorders) の治療のために用いられる
ことができうる。前記医薬組成物は既知のいかなる方法
によって調製されてよく、その方法において、有効成分
である可溶性ＩＦＮＡＲが薬学的に許容しうる希釈剤、
担体または賦形剤と混合される。前記医薬組成物の実際
の投与量および投与の態様は、専門の実務者により決定
されるであろう。
αおよび／またはＩＦＮ−βサブタイプの活性を阻害、
変更または修飾するための医薬組成物（薬剤）を調製す
るのに用いることができうる。このような医薬組成物
は、たとえば前記したような、治療において大量のＩＦ
Ｎが与えられた結果もしくはＩＦＮが内在的に異常に高
く産生された結果として患者が過剰のＩＦＮを有するよ
うな種々の障害(disorders) の治療のために用いられる
ことができうる。前記医薬組成物は既知のいかなる方法
によって調製されてよく、その方法において、有効成分
である可溶性ＩＦＮＡＲが薬学的に許容しうる希釈剤、
担体または賦形剤と混合される。前記医薬組成物の実際
の投与量および投与の態様は、専門の実務者により決定
されるであろう。
【００２０】本発明の可溶性ＩＦＮＡＲは、たとえば生
体内でのまたは生体外での診断分析においてＩＦＮ−α
およびＩＦＮ−βのサブタイプの種類を定性的におよび
／または定量的に決定するための、診断目的用の組成物
を調製するために用いられうる。これらの組成物におい
て可溶性ＩＦＮＡＲは、たとえば放射ラベル、蛍光ラベ
ル、酵素結合、抗体結合などの確立されたラベリング法
のいかなるものによってラベルされてもよい。前記組成
物の調製ならびに前記組成物の診断分析における適用
は、すでに確立されているいかなる方法によってもよ
い。
体内でのまたは生体外での診断分析においてＩＦＮ−α
およびＩＦＮ−βのサブタイプの種類を定性的におよび
／または定量的に決定するための、診断目的用の組成物
を調製するために用いられうる。これらの組成物におい
て可溶性ＩＦＮＡＲは、たとえば放射ラベル、蛍光ラベ
ル、酵素結合、抗体結合などの確立されたラベリング法
のいかなるものによってラベルされてもよい。前記組成
物の調製ならびに前記組成物の診断分析における適用
は、すでに確立されているいかなる方法によってもよ
い。
【００２１】また、本発明の可溶性ＩＦＮＡＲはＩＦＮ
−αおよび／またはＩＦＮ−βのサブタイプの精製のた
めのアフィニティークロマトグラフィー法においても適
用しうる。このような適用においては、たとえば化学的
交差結合(chemical cross-linking)などの標準法のいず
れかを用いて、既知のアフィニティークロマトグラフィ
ー支持マトリックスのいずれかに可溶性ＩＦＮＡＲが付
けられるとよい。
−αおよび／またはＩＦＮ−βのサブタイプの精製のた
めのアフィニティークロマトグラフィー法においても適
用しうる。このような適用においては、たとえば化学的
交差結合(chemical cross-linking)などの標準法のいず
れかを用いて、既知のアフィニティークロマトグラフィ
ー支持マトリックスのいずれかに可溶性ＩＦＮＡＲが付
けられるとよい。
【００２２】本明細書で用いられる「ムテイン体」の語
は、えられる産物の活性を大いに変えることなく、天然
の可溶性ＩＦＮＡＲの１または複数のアミノ酸残基が異
なるアミノ酸残基により置換されたかもしくは欠失し
た、または可溶性ＩＦＮＡＲの天然の配列に１または複
数のアミノ酸残基が加えられた、可溶性ＩＦＮＡＲタン
パク質の類似体をいう。これらムテイン体は既知の合成
技術によりおよび／または部位特異的変異誘発技術によ
って、もしくはそれに好適ないかなる他の既知の技術に
よっても調製されうる。
は、えられる産物の活性を大いに変えることなく、天然
の可溶性ＩＦＮＡＲの１または複数のアミノ酸残基が異
なるアミノ酸残基により置換されたかもしくは欠失し
た、または可溶性ＩＦＮＡＲの天然の配列に１または複
数のアミノ酸残基が加えられた、可溶性ＩＦＮＡＲタン
パク質の類似体をいう。これらムテイン体は既知の合成
技術によりおよび／または部位特異的変異誘発技術によ
って、もしくはそれに好適ないかなる他の既知の技術に
よっても調製されうる。
【００２３】「融合タンパク質」の語は、たとえば体液
中での滞留時間が長い他のタンパク質と融合された本発
明の可溶性ＩＦＮＡＲを含んでなるポリペプチドまたは
そのムテイン体をいう。可溶性ＩＦＮＡＲはこのように
他のタンパク質、ポリペプチドなど、たとえば免疫グロ
ブリンまたはその断片と融合されうる。
中での滞留時間が長い他のタンパク質と融合された本発
明の可溶性ＩＦＮＡＲを含んでなるポリペプチドまたは
そのムテイン体をいう。可溶性ＩＦＮＡＲはこのように
他のタンパク質、ポリペプチドなど、たとえば免疫グロ
ブリンまたはその断片と融合されうる。
【００２４】本明細書における「塩」の語は、可溶性Ｉ
ＦＮＡＲタンパク質、そのムテイン体および融合タンパ
ク質のカルボキシル基の両方の塩ならびにアミノ基の酸
付加塩をいう。カルボキシル基の塩は当該技術分野で知
られている手段で形成されてもよく、無機塩、たとえば
ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛
塩など、ならびにたとえばトリエタノールアミン、アル
ギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのア
ミンなどと形成された有機塩基との塩が含まれる。酸付
加塩には、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩な
らびにたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩
が含まれる。
ＦＮＡＲタンパク質、そのムテイン体および融合タンパ
ク質のカルボキシル基の両方の塩ならびにアミノ基の酸
付加塩をいう。カルボキシル基の塩は当該技術分野で知
られている手段で形成されてもよく、無機塩、たとえば
ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛
塩など、ならびにたとえばトリエタノールアミン、アル
ギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのア
ミンなどと形成された有機塩基との塩が含まれる。酸付
加塩には、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩な
らびにたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩
が含まれる。
【００２５】本明細書に用いられる「機能性誘導体」の
語は、可溶性ＩＦＮＡＲならびにその融合タンパク質お
よびムテイン体の誘導体をカバーし、残基またはＮ−も
しくはＣ−末端基の側鎖として生じる官能基から当該技
術分野において知られている手段によって調製されると
よく、またそれらが薬学的に許容しうるままである限
り、すなわちタンパク質の活性を損わずそれを含む組成
物に毒性を付与しない限り、本発明に包含される。これ
ら誘導体は、たとえば抗原部位を遮蔽し、体液中での可
溶性ＩＦＮＡＲの滞留を遅延させうるポリエチレングリ
コール側鎖を含んでいてもよい。他の誘導体としてはた
とえばカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアま
たは第一級もしくは第二級アミンとの反応によるカルボ
キシル基のアミド、アシル部分（たとえばアルカノイル
基または炭素環式アロイル基）とで形成されたアミノ酸
残基のフリーのアミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシ
ル部分とで形成されたフリーの水酸基（たとえばセリン
またはスレオニン残基のフリーの水酸基）のＯ−アシル
誘導体が含まれる。
語は、可溶性ＩＦＮＡＲならびにその融合タンパク質お
よびムテイン体の誘導体をカバーし、残基またはＮ−も
しくはＣ−末端基の側鎖として生じる官能基から当該技
術分野において知られている手段によって調製されると
よく、またそれらが薬学的に許容しうるままである限
り、すなわちタンパク質の活性を損わずそれを含む組成
物に毒性を付与しない限り、本発明に包含される。これ
ら誘導体は、たとえば抗原部位を遮蔽し、体液中での可
溶性ＩＦＮＡＲの滞留を遅延させうるポリエチレングリ
コール側鎖を含んでいてもよい。他の誘導体としてはた
とえばカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアま
たは第一級もしくは第二級アミンとの反応によるカルボ
キシル基のアミド、アシル部分（たとえばアルカノイル
基または炭素環式アロイル基）とで形成されたアミノ酸
残基のフリーのアミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシ
ル部分とで形成されたフリーの水酸基（たとえばセリン
またはスレオニン残基のフリーの水酸基）のＯ−アシル
誘導体が含まれる。
【００２６】可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質お
よびそのムテイン体の「活性画分」として、本発明はタ
ンパク質分子単独またはそれに結合した分子またはそれ
に連結した残基（たとえば糖もしくはホスフェート残
基）を含めたもののポリペプチド鎖のいかなる断片また
は前駆体も、あるいはタンパク質分子または糖残基の自
己凝集物をもカバーする。ただし前記画分は可溶性ＩＦ
ＮＡＲ、その融合タンパク質およびそのムテイン体と同
様の生物学的活性および／または医薬活性を有するもの
である。
よびそのムテイン体の「活性画分」として、本発明はタ
ンパク質分子単独またはそれに結合した分子またはそれ
に連結した残基（たとえば糖もしくはホスフェート残
基）を含めたもののポリペプチド鎖のいかなる断片また
は前駆体も、あるいはタンパク質分子または糖残基の自
己凝集物をもカバーする。ただし前記画分は可溶性ＩＦ
ＮＡＲ、その融合タンパク質およびそのムテイン体と同
様の生物学的活性および／または医薬活性を有するもの
である。
【００２７】本発明にしたがう可溶性ＩＦＮＡＲタンパ
ク質、その融合産物、断片およびムテイン体の組換え製
造法を以下に説明する。
ク質、その融合産物、断片およびムテイン体の組換え製
造法を以下に説明する。
【００２８】後述の実施例５（ａ）の部分において、可
溶性ＩＦＮＡＲ１型および２型の遺伝情報を担うＳＶ−
４０由来の発現ベクター（たとえば、ｐＳＶＬ）の特定
の調製法を記載する。前記ベクターはＣＯＳ−７宿主細
胞に導入された（トランスフェクションされた）ときに
組換えＩＦＮＡＲ１型および２型の発現が成功する。標
準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のように他のベ
クター（およびそれでトランスフェクトされた宿主細
胞）は組換え可溶性ＩＦＮＡＲ融合タンパク質、その断
片およびムテイン体の製造のために生産されうる。
溶性ＩＦＮＡＲ１型および２型の遺伝情報を担うＳＶ−
４０由来の発現ベクター（たとえば、ｐＳＶＬ）の特定
の調製法を記載する。前記ベクターはＣＯＳ−７宿主細
胞に導入された（トランスフェクションされた）ときに
組換えＩＦＮＡＲ１型および２型の発現が成功する。標
準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のように他のベ
クター（およびそれでトランスフェクトされた宿主細
胞）は組換え可溶性ＩＦＮＡＲ融合タンパク質、その断
片およびムテイン体の製造のために生産されうる。
【００２９】本発明の単離されたｃＤＮＡを、終止コド
ンおよびポリアデニレーション部位が可溶性ＩＦＮＡＲ
の最後の必須コドンの後に挿入されるように、適切なオ
リゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異誘発に供す
る。ついで、この構築物を当該技術分野においてよく知
られている技術によってふさわしく構築された発現ベク
ターに挿入する（マニアチスら、モレキュラー・クロー
ニン グ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cl
oning:A Laboratory Manua l ）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８２
年）。合成ＤＮＡリンカーまたは平滑末端化(blunt-end
ed) 連結技術を用いることを含むホモポリマーテイリン
グ(homopolymer tailing) または制限結合(restriction
linking) によって、２本鎖ｃＤＮＡをプラスミドベク
ターに連結させる。ＤＮＡ分子を連結させるためにＤＮ
Ａリガーゼを用い、アルカリホスファターゼを用いてＤ
ＮＡ鎖を処置することにより望ましくない接合(joinin
g) を回避する。
ンおよびポリアデニレーション部位が可溶性ＩＦＮＡＲ
の最後の必須コドンの後に挿入されるように、適切なオ
リゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異誘発に供す
る。ついで、この構築物を当該技術分野においてよく知
られている技術によってふさわしく構築された発現ベク
ターに挿入する（マニアチスら、モレキュラー・クロー
ニン グ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cl
oning:A Laboratory Manua l ）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８２
年）。合成ＤＮＡリンカーまたは平滑末端化(blunt-end
ed) 連結技術を用いることを含むホモポリマーテイリン
グ(homopolymer tailing) または制限結合(restriction
linking) によって、２本鎖ｃＤＮＡをプラスミドベク
ターに連結させる。ＤＮＡ分子を連結させるためにＤＮ
Ａリガーゼを用い、アルカリホスファターゼを用いてＤ
ＮＡ鎖を処置することにより望ましくない接合(joinin
g) を回避する。
【００３０】可溶性ＩＦＮＡＲおよび、たとえばＩｇＧ
1 重鎖の定常部とからなる融合タンパク質の製造は、以
下のように行なう。コード配列の直後に特有な制限部位
を導入するように、適切なオリゴヌクレオチドを用いて
可溶性ＩＦＮＡＲのＤＮＡを部位特異的変異誘発に供す
る。ＩｇＧ1 重鎖の定常部の遺伝情報を担うプラスミ
ド、たとえばｐＲＫＣＯ４2 Ｆｃ1 （バイルン・アール
・エーら(Byrn R.A.) ら、ネイチャー(Nature)、３４４
巻、６６７〜６７０頁（１９９０年））を同様の部位特
異的変異誘発に供し、融合タンパク質がイン・フェーズ
(in-phase)に翻訳されうるようにＩｇＧ1 重鎖のＡｓｐ
２１６にできる限り近接して前記と同じ特有な制限部位
を導入する。前記の特有な制限部位で消化することによ
り、５´非翻訳配列および可溶性ＩＦＮＡＲをコードす
る配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片を調製する。変異させ
たｐＲＫＣＤ４2 Ｆｃ1 を同様に消化し、プラスミドお
よびＩｇＧ1 配列を含む大きな断片をつくる。ついで２
つの断片を連結させ、Ｎ−末端可溶性ＩＦＮＡＲおよび
ＩｇＧ1 重鎖の約２２７のＣ−末端アミノ酸（ヒンジ領
域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）からなるポリ
ペプチド前駆体をコードする新しいプラスミドをつく
る。融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切な制限酵
素を用いた消化によりプラスミドから単離し、ついで効
率のよい発現ベクターに挿入する。
1 重鎖の定常部とからなる融合タンパク質の製造は、以
下のように行なう。コード配列の直後に特有な制限部位
を導入するように、適切なオリゴヌクレオチドを用いて
可溶性ＩＦＮＡＲのＤＮＡを部位特異的変異誘発に供す
る。ＩｇＧ1 重鎖の定常部の遺伝情報を担うプラスミ
ド、たとえばｐＲＫＣＯ４2 Ｆｃ1 （バイルン・アール
・エーら(Byrn R.A.) ら、ネイチャー(Nature)、３４４
巻、６６７〜６７０頁（１９９０年））を同様の部位特
異的変異誘発に供し、融合タンパク質がイン・フェーズ
(in-phase)に翻訳されうるようにＩｇＧ1 重鎖のＡｓｐ
２１６にできる限り近接して前記と同じ特有な制限部位
を導入する。前記の特有な制限部位で消化することによ
り、５´非翻訳配列および可溶性ＩＦＮＡＲをコードす
る配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片を調製する。変異させ
たｐＲＫＣＤ４2 Ｆｃ1 を同様に消化し、プラスミドお
よびＩｇＧ1 配列を含む大きな断片をつくる。ついで２
つの断片を連結させ、Ｎ−末端可溶性ＩＦＮＡＲおよび
ＩｇＧ1 重鎖の約２２７のＣ−末端アミノ酸（ヒンジ領
域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）からなるポリ
ペプチド前駆体をコードする新しいプラスミドをつく
る。融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切な制限酵
素を用いた消化によりプラスミドから単離し、ついで効
率のよい発現ベクターに挿入する。
【００３１】可溶性ＩＦＮＡＲ、そのムテイン体または
融合タンパク質を発現することができるために、発現ベ
クターはまた、遺伝子発現およびタンパク質の産生を可
能とするような方法で所望のタンパク質をコードするＤ
ＮＡに結合させた転写および翻訳調節情報を含む特異的
なヌクレオチド配列を含む。まず、遺伝子が転写される
ためには、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる、そ
してそのポリメラーゼが結合しかくして転写プロセスが
開始されるプロモーターが前記遺伝子の前になければな
らない。用いられる種々のこのようなプロモーターがあ
り、異なる効率で働く（強いおよび弱いプロモータ
ー）。それらは原核細胞と真核細胞とで異なる。
融合タンパク質を発現することができるために、発現ベ
クターはまた、遺伝子発現およびタンパク質の産生を可
能とするような方法で所望のタンパク質をコードするＤ
ＮＡに結合させた転写および翻訳調節情報を含む特異的
なヌクレオチド配列を含む。まず、遺伝子が転写される
ためには、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる、そ
してそのポリメラーゼが結合しかくして転写プロセスが
開始されるプロモーターが前記遺伝子の前になければな
らない。用いられる種々のこのようなプロモーターがあ
り、異なる効率で働く（強いおよび弱いプロモータ
ー）。それらは原核細胞と真核細胞とで異なる。
【００３２】本発明において用いられうるプロモーター
は、たとえばバクテリオファージラムダのｉｎｔプロモ
ーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌ
ａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロ
モーターなどの構成性のものでも、またはバクテリオフ
ァージラムダの主たる右および左プロモーター（ＰL お
よびＰR ）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌ
ａｃＩ、ｏｍｐＦおよびｇａｌまたはｔｒｐ−ｌａｃハ
イブリッドプロモーターなどを含む原核細胞性プロモー
ターなど（グリック、ビー・アール(Glick, B.R.) 、ジ
ェー・インド・ミクロバイオル（J.Ind.Microbiol. ）
１巻、２７７〜２８２頁（１９８７年）の誘導可能なプ
ロモーターのいずれでもよい。
は、たとえばバクテリオファージラムダのｉｎｔプロモ
ーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌ
ａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロ
モーターなどの構成性のものでも、またはバクテリオフ
ァージラムダの主たる右および左プロモーター（ＰL お
よびＰR ）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌ
ａｃＩ、ｏｍｐＦおよびｇａｌまたはｔｒｐ−ｌａｃハ
イブリッドプロモーターなどを含む原核細胞性プロモー
ターなど（グリック、ビー・アール(Glick, B.R.) 、ジ
ェー・インド・ミクロバイオル（J.Ind.Microbiol. ）
１巻、２７７〜２８２頁（１９８７年）の誘導可能なプ
ロモーターのいずれでもよい。
【００３３】原核細胞における高レベルの遺伝子発現を
達成するために、大量のｍＲＮＡをつくるように強いプ
ロモーターを用いることに加えて、ｍＲＮＡが効率良く
翻訳されることを確実にするためにリボソーム結合部位
も用いることが必要である。１つの例は、概ね開始コド
ンに位置し、１６Ｓ ＲＮＡの３´−末端配列に相補的
なシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）である。
達成するために、大量のｍＲＮＡをつくるように強いプ
ロモーターを用いることに加えて、ｍＲＮＡが効率良く
翻訳されることを確実にするためにリボソーム結合部位
も用いることが必要である。１つの例は、概ね開始コド
ンに位置し、１６Ｓ ＲＮＡの３´−末端配列に相補的
なシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）である。
【００３４】真核細胞宿主に対しては、宿主の性質に応
じて異なる転写および翻訳調節配列を用いることができ
る。それらはアデノウイルス、ウシパピローマウイル
ス、シミアンウイルスなどのウイルスソースから由来
し、調節シグナルが高レベルに発現する特定の遺伝子に
関係するものであることができる。例としてはヘルペス
ウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどがあげられ
る。転写開始調節シグナルは、抑制および活性化を可能
としその結果遺伝子の発現を変えうるものを選択するこ
とができる。
じて異なる転写および翻訳調節配列を用いることができ
る。それらはアデノウイルス、ウシパピローマウイル
ス、シミアンウイルスなどのウイルスソースから由来
し、調節シグナルが高レベルに発現する特定の遺伝子に
関係するものであることができる。例としてはヘルペス
ウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどがあげられ
る。転写開始調節シグナルは、抑制および活性化を可能
としその結果遺伝子の発現を変えうるものを選択するこ
とができる。
【００３５】本発明の可溶性ＩＦＮＡＲ、その断片もし
くはムテイン体または融合タンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含んでなるＤＮＡ分子ならびに作動可能
に結合された転写および翻訳調節シグナルを、宿主細胞
の染色体の中へと所望の遺伝子配列を組込むことができ
るベクター内に挿入する。細胞の染色体の中に導入され
たＤＮＡが安定に組込まれた細胞を選択することができ
るように、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能と
する１または複数のマーカーが用いられる。マーカー
は、栄養要求性の宿主に栄養を供給するものでも、たと
えば抗生物質、銅などの重金属などのような殺細胞物質
への抵抗性(biocide resistance)を提供するものであっ
てもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＤ
ＮＡ遺伝子配列に直接結合させることもまたは同じ細胞
にコトランスフェクションにより導入することもでき
る。至適な合成のため、さらなるエレメントも要しう
る。これらエレメントは転写プロモーター、エンハンサ
ー、および終止シグナルのみならず、スプライスシグナ
ルも含みうる。このようなエレメントを組込んだｃＤＮ
Ａ発現ベクターには、たとえばオカヤマ、エイチ(Okaya
ma, H.) （１９８３年）により記載されたもの（モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell. B
iol) ３巻、２８０頁）が含まれる。
くはムテイン体または融合タンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含んでなるＤＮＡ分子ならびに作動可能
に結合された転写および翻訳調節シグナルを、宿主細胞
の染色体の中へと所望の遺伝子配列を組込むことができ
るベクター内に挿入する。細胞の染色体の中に導入され
たＤＮＡが安定に組込まれた細胞を選択することができ
るように、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能と
する１または複数のマーカーが用いられる。マーカー
は、栄養要求性の宿主に栄養を供給するものでも、たと
えば抗生物質、銅などの重金属などのような殺細胞物質
への抵抗性(biocide resistance)を提供するものであっ
てもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＤ
ＮＡ遺伝子配列に直接結合させることもまたは同じ細胞
にコトランスフェクションにより導入することもでき
る。至適な合成のため、さらなるエレメントも要しう
る。これらエレメントは転写プロモーター、エンハンサ
ー、および終止シグナルのみならず、スプライスシグナ
ルも含みうる。このようなエレメントを組込んだｃＤＮ
Ａ発現ベクターには、たとえばオカヤマ、エイチ(Okaya
ma, H.) （１９８３年）により記載されたもの（モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell. B
iol) ３巻、２８０頁）が含まれる。
【００３６】好ましい実施態様において、導入されたＤ
ＮＡ分子はレシピエント宿主での自律的な複製が可能な
プラスミドまたはウイルスベクターの中に組込まれる。
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際
に重要な因子は以下のとおり：ベクターを含むレシピエ
ント細胞が認識され前記ベクターを含まないレシピエン
ト細胞から選択されるのが容易であること、特定の宿主
において所望されるベクターのコピー数、ならびに異な
る種の宿主細胞間でベクターが「シャトル」（“shuttl
e ”）しうることが望ましいかどうか、である。
ＮＡ分子はレシピエント宿主での自律的な複製が可能な
プラスミドまたはウイルスベクターの中に組込まれる。
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際
に重要な因子は以下のとおり：ベクターを含むレシピエ
ント細胞が認識され前記ベクターを含まないレシピエン
ト細胞から選択されるのが容易であること、特定の宿主
において所望されるベクターのコピー数、ならびに異な
る種の宿主細胞間でベクターが「シャトル」（“shuttl
e ”）しうることが望ましいかどうか、である。
【００３７】好ましい原核細胞ベクターには、たとえば
ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ
１８４などの大腸菌において複製可能なプラスミド（マ
ニアチスら、前掲参照）、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐ
Ｔ１２７などのバシラス(Baccillus) プラスミド（グリ
クザン、ティー(Gryczan, T.) 、「ザ・モレキュラー・
バイオロジー・オブ・ザ・バシリ」（“The Molecular
Biology of the Bacilli”）、アカデミック・プレス(A
cademic Press)、ニューヨーク、３０７〜３２９頁（１
９８２年）参照）、ｐＩＪ１０１を含むストレプトマイ
セス(Streptomyces)プラスミド（ケンダール、ケー・ジ
ェー(Kendall, K.J.) ら、ジャーナル・オブ・バクテリ
オジー(J.Bacteriol.)１６９巻、４１７７〜４１８３頁
（１９８７年））、φＣ３１などのストレプトマイセス
・バクテリオファージ（チャター、ケーエフ(Chater, K
F)ら、「シックス・インターナショナル・シンポジウム
・オン・アクチノマイセタールス・バイオロジー」
（“Sixth International Symposium on Actinomycetal
es Biology”）、アカデミアイ・カイドー(Akademiai K
aido) 、ブダペスト、ハンガリー、４５〜５４頁（１９
８６年）参照）、ならびにシュードモナス・プラスミド
（ジョン、ジェー・エフ(John, J.F.)ら、レェブ、イン
フェクト、ディス(Rev. Infect. Dis.) ８巻、６９３〜
７０４頁およびイザキ、ケー(Izaki, K.) ジャパニーズ
・ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Jpn. J. Bacte
riol.)３３巻、７２９〜７４２頁（１９７８年））が含
まれる。
ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ
１８４などの大腸菌において複製可能なプラスミド（マ
ニアチスら、前掲参照）、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐ
Ｔ１２７などのバシラス(Baccillus) プラスミド（グリ
クザン、ティー(Gryczan, T.) 、「ザ・モレキュラー・
バイオロジー・オブ・ザ・バシリ」（“The Molecular
Biology of the Bacilli”）、アカデミック・プレス(A
cademic Press)、ニューヨーク、３０７〜３２９頁（１
９８２年）参照）、ｐＩＪ１０１を含むストレプトマイ
セス(Streptomyces)プラスミド（ケンダール、ケー・ジ
ェー(Kendall, K.J.) ら、ジャーナル・オブ・バクテリ
オジー(J.Bacteriol.)１６９巻、４１７７〜４１８３頁
（１９８７年））、φＣ３１などのストレプトマイセス
・バクテリオファージ（チャター、ケーエフ(Chater, K
F)ら、「シックス・インターナショナル・シンポジウム
・オン・アクチノマイセタールス・バイオロジー」
（“Sixth International Symposium on Actinomycetal
es Biology”）、アカデミアイ・カイドー(Akademiai K
aido) 、ブダペスト、ハンガリー、４５〜５４頁（１９
８６年）参照）、ならびにシュードモナス・プラスミド
（ジョン、ジェー・エフ(John, J.F.)ら、レェブ、イン
フェクト、ディス(Rev. Infect. Dis.) ８巻、６９３〜
７０４頁およびイザキ、ケー(Izaki, K.) ジャパニーズ
・ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Jpn. J. Bacte
riol.)３３巻、７２９〜７４２頁（１９７８年））が含
まれる。
【００３８】好ましい真核細胞プラスミドには、ＢＰ
Ｖ、ワクシニア(vaccinia)、ＳＶ４０、２−ミクロンサ
ークルなど、またはそれらの誘導体が含まれる。このよ
うなプラスミドは当該技術分野においてよく知られてい
る（ボットシュタイン、ディー(Botstein, D.)ら、マイ
アミ・ウイント・シンプ(Miami Wint. Symp.）１９巻、
２６５〜２７４頁（１９８２年）、ブローチ、ジェーア
ール(Broach, JR.) 「ザ・モレキュラー・バイオロジー
・オブ・ザ・イースト・サッカロマイセス：ライフ・サ
イクル・アンド・インヘリタンス(The Molecular Biolo
gy of the YeastSaccharomyces:Life Cycle and Inheri
tance）」中、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク、４４５〜４７０頁（１９８１年）；ブローチ、ジ
ェー・アール、セル２８巻、２０３〜２０４頁（１９８
２年）；ボロン、ディー・ピー(Bollon, D.P.)ら、ジェ
ー・クリニク・ヘマトル・オンコル(J. Clin. Hematol.
Oncol.)１０巻、３９〜４８頁（１９８０年）；マニア
チス、ティー、「セル・バイオロジー・ア・コンプリヘ
ンシブ・トリティセ (Cell Biology: A Comprehensive
Treatise”）」中３巻、ジーン・エクスプレッション(G
ene Expression) 、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク州、５６３〜６０８頁（１９８０年））。
Ｖ、ワクシニア(vaccinia)、ＳＶ４０、２−ミクロンサ
ークルなど、またはそれらの誘導体が含まれる。このよ
うなプラスミドは当該技術分野においてよく知られてい
る（ボットシュタイン、ディー(Botstein, D.)ら、マイ
アミ・ウイント・シンプ(Miami Wint. Symp.）１９巻、
２６５〜２７４頁（１９８２年）、ブローチ、ジェーア
ール(Broach, JR.) 「ザ・モレキュラー・バイオロジー
・オブ・ザ・イースト・サッカロマイセス：ライフ・サ
イクル・アンド・インヘリタンス(The Molecular Biolo
gy of the YeastSaccharomyces:Life Cycle and Inheri
tance）」中、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク、４４５〜４７０頁（１９８１年）；ブローチ、ジ
ェー・アール、セル２８巻、２０３〜２０４頁（１９８
２年）；ボロン、ディー・ピー(Bollon, D.P.)ら、ジェ
ー・クリニク・ヘマトル・オンコル(J. Clin. Hematol.
Oncol.)１０巻、３９〜４８頁（１９８０年）；マニア
チス、ティー、「セル・バイオロジー・ア・コンプリヘ
ンシブ・トリティセ (Cell Biology: A Comprehensive
Treatise”）」中３巻、ジーン・エクスプレッション(G
ene Expression) 、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク州、５６３〜６０８頁（１９８０年））。
【００３９】ベクターすなわちＤＮＡ配列を含む構築物
がいったん発現用に調製されれば、発現ベクターをたと
えば形質転換、トランスフェクション、リポフェクショ
ン、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレク
トロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイク
ロインジェクションなどの種々の好適な手段のいかなる
ものによっても適切な宿主細胞の中に導入することがで
きる。
がいったん発現用に調製されれば、発現ベクターをたと
えば形質転換、トランスフェクション、リポフェクショ
ン、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレク
トロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイク
ロインジェクションなどの種々の好適な手段のいかなる
ものによっても適切な宿主細胞の中に導入することがで
きる。
【００４０】本発明において用いられる宿主細胞は、原
核細胞でも真核細胞でもよい。好ましい原核細胞宿主に
は、大腸菌、バシラス、ストレプトマイセス、シュード
モナス、サルモネラ、セラチア(Serratia)などが含まれ
る。もっとも好ましい原核細胞宿主は大腸菌である。と
くに重大な細菌性宿主には、大腸菌Ｋ１２株２９４（Ａ
ＴＣＣ ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ
３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ- 、ラムダ- 、原
栄養性(prototropic) 、（ＡＴＣＣ ２７３２５））、
およびサルモネラ ティフィムリウム(Salmonella typh
imurium)またはセラチア ナルセシェンズ(Serratia na
rcescens) などの他の腸内細菌ならびに種々のシュード
モナス種が含まれる。このような条件のもとでは発現さ
れるタンパク質はグリコシル化されないであろう。原核
細胞宿主はレプリコンおよび発現プラスミド内の調節配
列に適合可能でなければならない。
核細胞でも真核細胞でもよい。好ましい原核細胞宿主に
は、大腸菌、バシラス、ストレプトマイセス、シュード
モナス、サルモネラ、セラチア(Serratia)などが含まれ
る。もっとも好ましい原核細胞宿主は大腸菌である。と
くに重大な細菌性宿主には、大腸菌Ｋ１２株２９４（Ａ
ＴＣＣ ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ
３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ- 、ラムダ- 、原
栄養性(prototropic) 、（ＡＴＣＣ ２７３２５））、
およびサルモネラ ティフィムリウム(Salmonella typh
imurium)またはセラチア ナルセシェンズ(Serratia na
rcescens) などの他の腸内細菌ならびに種々のシュード
モナス種が含まれる。このような条件のもとでは発現さ
れるタンパク質はグリコシル化されないであろう。原核
細胞宿主はレプリコンおよび発現プラスミド内の調節配
列に適合可能でなければならない。
【００４１】好ましい真核細胞宿主は、たとえばヒト、
サル、マウスおよびチャイニーズハムスター子宮（ＣＨ
Ｏ）細胞などの哺乳動物細胞である。なぜならそれら細
胞は正しい部位でのグリコシル化のみならず正しい折り
畳み、正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分
子への翻訳後の修飾を提供するからである。酵母細胞お
よび昆虫細胞もまた高いマンノースグリコシル化を含む
翻訳後のペプチド修飾を行なうことができる。酵母およ
び昆虫細胞において所望のタンパク質を産生させるため
に利用されうる強いプロモーター配列ならびにプラスミ
ドの多数のコピー数を利用する、多くの組換えＤＮＡス
トラテジーが存在する。酵母細胞はクローン化された哺
乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー
配列をもつペプチドを分泌することができる。
サル、マウスおよびチャイニーズハムスター子宮（ＣＨ
Ｏ）細胞などの哺乳動物細胞である。なぜならそれら細
胞は正しい部位でのグリコシル化のみならず正しい折り
畳み、正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分
子への翻訳後の修飾を提供するからである。酵母細胞お
よび昆虫細胞もまた高いマンノースグリコシル化を含む
翻訳後のペプチド修飾を行なうことができる。酵母およ
び昆虫細胞において所望のタンパク質を産生させるため
に利用されうる強いプロモーター配列ならびにプラスミ
ドの多数のコピー数を利用する、多くの組換えＤＮＡス
トラテジーが存在する。酵母細胞はクローン化された哺
乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー
配列をもつペプチドを分泌することができる。
【００４２】ベクターを導入したのち、宿主細胞はベク
ターを含む細胞の成長について選択を行なう選択培地中
で選択される。クローン化された遺伝子配列の発現の結
果、可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質、ムテイン
体または断片が産生される。発現されたタンパク質はつ
いで単離し、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳
動などを含む通例の手法のいずれかによって、またはカ
ラム内に入れたゲルマトリックス上に固定化された抗−
可溶性ＩＦＮＡＲモノクローナル抗体を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製される。可溶性
ＩＦＮＡＲを含む粗調製物をカラムにとおし、ここで可
溶性ＩＦＮＡＲが特異的な抗体によりカラムに結合さ
れ、一方不純物はカラムを通過する。洗浄ののちたとえ
ばｐＨ１１またはｐＨ２などの高ｐＨまたは低ｐＨにて
ゲルからタンパク質を溶出させる。
ターを含む細胞の成長について選択を行なう選択培地中
で選択される。クローン化された遺伝子配列の発現の結
果、可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質、ムテイン
体または断片が産生される。発現されたタンパク質はつ
いで単離し、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳
動などを含む通例の手法のいずれかによって、またはカ
ラム内に入れたゲルマトリックス上に固定化された抗−
可溶性ＩＦＮＡＲモノクローナル抗体を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製される。可溶性
ＩＦＮＡＲを含む粗調製物をカラムにとおし、ここで可
溶性ＩＦＮＡＲが特異的な抗体によりカラムに結合さ
れ、一方不純物はカラムを通過する。洗浄ののちたとえ
ばｐＨ１１またはｐＨ２などの高ｐＨまたは低ｐＨにて
ゲルからタンパク質を溶出させる。
【００４３】本発明を以下の実施例および図面によりさ
らに詳細に説明するが本発明はもとよりこれら実施例に
限定されるものではない。とくに示さない限り、実施例
に記載された方法は標準のよく確立された方法であって
遺伝子工学において広く用いられるものであることは注
意されるべきである。したがって、それら方法が充分に
詳説された種々の報告(publications)が本明細書におい
て参照され、それによって本明細書に組込まれる。さら
に製造業者に関する詳細が提供されているばあい、関連
する方法は製造業者のプロトコルにしたがうものである
と理解されるべきである。
らに詳細に説明するが本発明はもとよりこれら実施例に
限定されるものではない。とくに示さない限り、実施例
に記載された方法は標準のよく確立された方法であって
遺伝子工学において広く用いられるものであることは注
意されるべきである。したがって、それら方法が充分に
詳説された種々の報告(publications)が本明細書におい
て参照され、それによって本明細書に組込まれる。さら
に製造業者に関する詳細が提供されているばあい、関連
する方法は製造業者のプロトコルにしたがうものである
と理解されるべきである。
【００４４】実施例１ 複数のＩＦＮα−受容体遺伝子転写物 ヒトミエローマ細胞Ｕ２６６S は成長阻害および（２´
−５´）Ａシンセターゼの誘導についてＩＦＮ−αおよ
びＩＦＮ−βに対する感受性がある。Ｕ２６６ S 細胞
を、前記ＩＦＮにより成長が阻害されないＵ２６６R 変
異体と比較した。グアニジンチオシアネート法（チャー
ウィン・ジェー・ジェー(Chirgwin J. J.)ら、バイオケ
ミストリー(Biochemistry)、１８巻、５２９４〜５３０
０頁（１９７９年））により総ＲＮＡを調製した。ＩＦ
ＮＡＲのｃＤＮＡのヌクレオチド１７２９〜１７４９に
相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマー
として用い（このプライマーは図１ａの膜貫通ＩＦＮＡ
ＲのｃＤＮＡのコーディングフレームの端部に近接して
いるものである）逆転写酵素によりＵ２６６S およびＵ
２６６R 細胞のＲＮＡからｃＤＮＡを製造した。図１
に、欠失によりつくり出された新しいジャンクションの
位置とともに終止コドンの位置を示した。ついでポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、確立された方法
（エーリッヒ・エイチ・エー(Ehrich H. A.)、編者、ピ
ー・シー・アール・テクノロジー(PCR Technology)、ス
トックトン・プレス(Stockton Press)、ニューヨーク、
（１９８９年））にしたがい、前記ｃＤＮＡ産物のＤＮ
Ａ断片を増幅した。膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの以下
のヌクレオチド（番号づけについては図２ａを参照）に
対応する、センス／アンチセンスプライマーの３種のペ
アを用いた： ・ＰＣＲ反応Ａ：１３４２〜１３６１／１４９８〜１５
１５ ・ＰＣＲ反応Ｂ：１３３１〜１３４２／１７３３〜１７
５２ ・ＰＣＲ反応Ｃ：１５２２〜１５４２／１７２９〜１７
４９。
−５´）Ａシンセターゼの誘導についてＩＦＮ−αおよ
びＩＦＮ−βに対する感受性がある。Ｕ２６６ S 細胞
を、前記ＩＦＮにより成長が阻害されないＵ２６６R 変
異体と比較した。グアニジンチオシアネート法（チャー
ウィン・ジェー・ジェー(Chirgwin J. J.)ら、バイオケ
ミストリー(Biochemistry)、１８巻、５２９４〜５３０
０頁（１９７９年））により総ＲＮＡを調製した。ＩＦ
ＮＡＲのｃＤＮＡのヌクレオチド１７２９〜１７４９に
相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマー
として用い（このプライマーは図１ａの膜貫通ＩＦＮＡ
ＲのｃＤＮＡのコーディングフレームの端部に近接して
いるものである）逆転写酵素によりＵ２６６S およびＵ
２６６R 細胞のＲＮＡからｃＤＮＡを製造した。図１
に、欠失によりつくり出された新しいジャンクションの
位置とともに終止コドンの位置を示した。ついでポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、確立された方法
（エーリッヒ・エイチ・エー(Ehrich H. A.)、編者、ピ
ー・シー・アール・テクノロジー(PCR Technology)、ス
トックトン・プレス(Stockton Press)、ニューヨーク、
（１９８９年））にしたがい、前記ｃＤＮＡ産物のＤＮ
Ａ断片を増幅した。膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの以下
のヌクレオチド（番号づけについては図２ａを参照）に
対応する、センス／アンチセンスプライマーの３種のペ
アを用いた： ・ＰＣＲ反応Ａ：１３４２〜１３６１／１４９８〜１５
１５ ・ＰＣＲ反応Ｂ：１３３１〜１３４２／１７３３〜１７
５２ ・ＰＣＲ反応Ｃ：１５２２〜１５４２／１７２９〜１７
４９。
【００４５】図２に、ＰＣＲ反応に用いたプライマーの
位置、ならびに欠失および新しいジャンクションの位置
を示した。
位置、ならびに欠失および新しいジャンクションの位置
を示した。
【００４６】反応Ｂにおいて用いたセンスおよびアンチ
センスプライマーは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩサイトを含むテイルを有した。これらの制限酵素で
消化したのち、えられる産物は予想されるより１０ｂｐ
長いものであった。アガロースゲルでの電気泳動に続き
エチジウムブロマイド染色によって分析したＰＣＲ産物
を図３に示す。図３の各レーンのサンプルは以下のとお
りである。
センスプライマーは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩサイトを含むテイルを有した。これらの制限酵素で
消化したのち、えられる産物は予想されるより１０ｂｐ
長いものであった。アガロースゲルでの電気泳動に続き
エチジウムブロマイド染色によって分析したＰＣＲ産物
を図３に示す。図３の各レーンのサンプルは以下のとお
りである。
【００４７】レーン１および２：図２に記載のプライマ
ー２の近傍のプライマーとプライマー３を用いた前記反
応Ａの産物 レーン３および４：図２に記載のプライマー２と５を用
いた前記反応Ｂの産物（この産物に矢印を付した） レーン５および６：図２に記載のプライマー４とプライ
マー５の近傍のプライマーを用いた前記反応Ｃの産物 反応Ａにおいて、Ｕ２６６S 細胞からのＲＮＡを用いた
ばあい、予想された１７３ｂｐの産物が観察され（レー
ン１）、一方Ｕ２６６R 細胞からのＲＮＡを用いたばあ
い産物は観察されなかった（レーン２）。この結果によ
りＵ２６６R 細胞のＩＦＮ受容体の転写産物はヌクレオ
チド１３４２と１５１５とのあいだの領域に何らかの欠
失があり、その欠失のためプライマーのうちの１つがＰ
ＣＲ反応の開始を妨げることが示唆された。
ー２の近傍のプライマーとプライマー３を用いた前記反
応Ａの産物 レーン３および４：図２に記載のプライマー２と５を用
いた前記反応Ｂの産物（この産物に矢印を付した） レーン５および６：図２に記載のプライマー４とプライ
マー５の近傍のプライマーを用いた前記反応Ｃの産物 反応Ａにおいて、Ｕ２６６S 細胞からのＲＮＡを用いた
ばあい、予想された１７３ｂｐの産物が観察され（レー
ン１）、一方Ｕ２６６R 細胞からのＲＮＡを用いたばあ
い産物は観察されなかった（レーン２）。この結果によ
りＵ２６６R 細胞のＩＦＮ受容体の転写産物はヌクレオ
チド１３４２と１５１５とのあいだの領域に何らかの欠
失があり、その欠失のためプライマーのうちの１つがＰ
ＣＲ反応の開始を妨げることが示唆された。
【００４８】反応ＢにおいてＵ２６６S 細胞からのＲＮ
Ａで、予想された４２０ｂｐのサイズの産物（図２のプ
ライマー２および５で限定されるように）が観察され
た。加えて、サイズが２６０ｂｐであると見積もられる
新しいＤＮＡのバンドが見出された（レーン３）。Ｕ２
６６R 細胞のＲＮＡでは、小さい方の産物は観察された
が大きい方のバンドはなかった（レーン４）。この結果
によりＵ２６６S 細胞およびＵ２６６R 細胞の両方にお
いておよそ１６０ｂｐ欠失した転写産物の存在が明らか
になった。
Ａで、予想された４２０ｂｐのサイズの産物（図２のプ
ライマー２および５で限定されるように）が観察され
た。加えて、サイズが２６０ｂｐであると見積もられる
新しいＤＮＡのバンドが見出された（レーン３）。Ｕ２
６６R 細胞のＲＮＡでは、小さい方の産物は観察された
が大きい方のバンドはなかった（レーン４）。この結果
によりＵ２６６S 細胞およびＵ２６６R 細胞の両方にお
いておよそ１６０ｂｐ欠失した転写産物の存在が明らか
になった。
【００４９】反応ＣにおいてＵ２６６S 細胞およびＵ２
６６R 細胞のＲＮＡの両方に同じ産物が観察され、図２
のプライマー４およびプライマー５の近傍のあいだの領
域では修飾がなされていないことが示唆された。
６６R 細胞のＲＮＡの両方に同じ産物が観察され、図２
のプライマー４およびプライマー５の近傍のあいだの領
域では修飾がなされていないことが示唆された。
【００５０】反応ＡおよびＢにおいて用いられたプライ
マーの位置を調べることにより、観察された欠失がＩＦ
ＮＡＲのｃＤＮＡの膜貫通領域に影響することが示唆さ
れた（図２参照）。
マーの位置を調べることにより、観察された欠失がＩＦ
ＮＡＲのｃＤＮＡの膜貫通領域に影響することが示唆さ
れた（図２参照）。
【００５１】実施例２ スプライス欠失されたＩＦＮα−受容体１型 ＩＦＮＡＲの新規な型のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を
決定するために、実施例１における反応Ｂと同様のＰＣ
Ｒ反応をＵ２６６S 細胞からのＲＮＡを用いて行なっ
た。用いたプライマー（図２のプライマー２および５）
は、プライマー１３３１〜１３４２に対しＥｃｏＲＩ制
限サイト（図４）およびプライマー１７３３〜１７５２
に対しＢａｍＨＩサイトを含むテイルを有した。ＰＣＲ
反応ののち、産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩとイン
キュベートし、アガロースゲル電気泳動により分離し
た。２６０ｂｐの小さい産物をゲルから切り出し、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断しておいたブルースクリ
プト(Bluescript)ベクターＫＳ＋（ストラタジーン・ク
ローニング・システム(Stratagene Cloning System）
社、（ラジョラ(Lajolla) 、カリフォルニア、製）に連
結した(ligated) 。連結されたプラスミドを、コンピテ
ント大腸菌(E.Coli)細胞中へトランスフェクトし、トラ
ンスフェクトされたコロニーを単離しプラスミドＤＮＡ
を調製した。２６０ｂｐのＤＮＡが存在することをＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断することによって証明し
た。切断しなかったプラスミドＤＮＡをブルースクリプ
トベクター（ストラタジーン・クローニング・システム
社製、前出）のＴ３プライマーからダイデオキシヌクレ
オチド法により配列決定した。アンチセンスプライマー
１６０１〜１６１９から相補的なストランドを配列決定
した。図４にその小さいＰＣＲ産物に対してえられた配
列を膜貫通ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの配列と比較して示す。
図４において、番号が付された各ブロックの１列目に部
分的な膜貫通型ＩＦＮα−受容体のｃＤＮＡを示し、そ
のプライマー部分に下線を、膜貫通ドメインの配列の上
に線を付した。スプライス欠失された１型のｃＤＮＡに
特有な７のＣ−末端残基を形成するクレーム番号が付さ
れた各ブロックの２列目においてフレームシフトが示さ
れる。エキソンの境界はすでに報告されている（ルトホ
ーラ・ジー(Lutfalla, G.)ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)２６７巻、２
８０２〜２８０９頁（１９９２年））ように示してい
る。図４中、膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ番号づけに
したがって配列を比較した。ヌクレオチド１３６２から
１５１８まで（１５７ｂｐ）の欠失が観察され、膜貫通
領域が完全に除去されていた（図２参照）。
決定するために、実施例１における反応Ｂと同様のＰＣ
Ｒ反応をＵ２６６S 細胞からのＲＮＡを用いて行なっ
た。用いたプライマー（図２のプライマー２および５）
は、プライマー１３３１〜１３４２に対しＥｃｏＲＩ制
限サイト（図４）およびプライマー１７３３〜１７５２
に対しＢａｍＨＩサイトを含むテイルを有した。ＰＣＲ
反応ののち、産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩとイン
キュベートし、アガロースゲル電気泳動により分離し
た。２６０ｂｐの小さい産物をゲルから切り出し、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断しておいたブルースクリ
プト(Bluescript)ベクターＫＳ＋（ストラタジーン・ク
ローニング・システム(Stratagene Cloning System）
社、（ラジョラ(Lajolla) 、カリフォルニア、製）に連
結した(ligated) 。連結されたプラスミドを、コンピテ
ント大腸菌(E.Coli)細胞中へトランスフェクトし、トラ
ンスフェクトされたコロニーを単離しプラスミドＤＮＡ
を調製した。２６０ｂｐのＤＮＡが存在することをＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断することによって証明し
た。切断しなかったプラスミドＤＮＡをブルースクリプ
トベクター（ストラタジーン・クローニング・システム
社製、前出）のＴ３プライマーからダイデオキシヌクレ
オチド法により配列決定した。アンチセンスプライマー
１６０１〜１６１９から相補的なストランドを配列決定
した。図４にその小さいＰＣＲ産物に対してえられた配
列を膜貫通ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの配列と比較して示す。
図４において、番号が付された各ブロックの１列目に部
分的な膜貫通型ＩＦＮα−受容体のｃＤＮＡを示し、そ
のプライマー部分に下線を、膜貫通ドメインの配列の上
に線を付した。スプライス欠失された１型のｃＤＮＡに
特有な７のＣ−末端残基を形成するクレーム番号が付さ
れた各ブロックの２列目においてフレームシフトが示さ
れる。エキソンの境界はすでに報告されている（ルトホ
ーラ・ジー(Lutfalla, G.)ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)２６７巻、２
８０２〜２８０９頁（１９９２年））ように示してい
る。図４中、膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ番号づけに
したがって配列を比較した。ヌクレオチド１３６２から
１５１８まで（１５７ｂｐ）の欠失が観察され、膜貫通
領域が完全に除去されていた（図２参照）。
【００５２】Ｕ２６６R 細胞のＲＮＡを用いてえられた
ＰＣＲ産物（図３、レーン４参照）を同様にブルースク
リプトベクターにおいてクローニングし、ついで配列決
定した。えられたプラスミドよりＵ２６６S 細胞の小さ
いＰＣＲ産物のばあいと同じ配列がもたらされた。
ＰＣＲ産物（図３、レーン４参照）を同様にブルースク
リプトベクターにおいてクローニングし、ついで配列決
定した。えられたプラスミドよりＵ２６６S 細胞の小さ
いＰＣＲ産物のばあいと同じ配列がもたらされた。
【００５３】えられた新規の配列から、膜貫通領域を含
むエキソンＸ全体がスプライスされて除かれ、エキソン
ＩＸの最後の４つのコドンもまた失われていることが示
唆された。この択一的スプライシングにより、細胞外ド
メインのコドン４２７（Ｇｌｕ）の後でフレームシフト
が起こりかつ、７のアミノ酸（Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ）をもつ（図５参
照）、すでに知られていたＩＦＮＡＲタンパク質におい
ては見出されなかった切除されたタンパク質が予測され
た。この新規な型のＩＦＮα−受容体をスプライス欠失
された１型と表し、これは新しいＳドメインに端部が欠
失したＥＣドメインが続くことで特徴づけられる。
むエキソンＸ全体がスプライスされて除かれ、エキソン
ＩＸの最後の４つのコドンもまた失われていることが示
唆された。この択一的スプライシングにより、細胞外ド
メインのコドン４２７（Ｇｌｕ）の後でフレームシフト
が起こりかつ、７のアミノ酸（Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ）をもつ（図５参
照）、すでに知られていたＩＦＮＡＲタンパク質におい
ては見出されなかった切除されたタンパク質が予測され
た。この新規な型のＩＦＮα−受容体をスプライス欠失
された１型と表し、これは新しいＳドメインに端部が欠
失したＥＣドメインが続くことで特徴づけられる。
【００５４】Ｕ２６６S 細胞のＲＮＡを用いてえられた
大きいＰＣＲ産物（図３、レーン３の４２０ｂｐ）は、
図４に示すように膜貫通ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの膜貫通領
域および通常のエキソンＸ／エキソンＸＩ境界を含むこ
とが証明された。
大きいＰＣＲ産物（図３、レーン３の４２０ｂｐ）は、
図４に示すように膜貫通ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの膜貫通領
域および通常のエキソンＸ／エキソンＸＩ境界を含むこ
とが証明された。
【００５５】実施例３ スプライス欠失されたＩＦＮα−受容体２型 二重の欠失をともなうＩＦＮＡＲのもう１つの型が発見
された。このスプライス欠失された２型は、ＩＦＮＡＲ
ｃＤＮＡのヌクレオチド１２７０〜１２９０に対応す
る、さらに上流のプライマーを用いて行なわれたＰＣＲ
反応において検出された（図６におけるプライマー
１）。ＥｃｏＲＩサイトを含む５′テイルをもつこのセ
ンスプライマーは、ＢａｍＨＩサイトをもつ１７３３〜
１７５２のアンチセンスプライマーとともに用いた（図
６におけるプライマー５）。Ｕ２６６R細胞のＲＮＡを
用いてえられたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、およそ３
００ｂｐで観察されるＤＮＡバンドをゲルから切り出し
た。実施例２におけると同様にブルースクリプトベクタ
ーにてクローニングしたのち、プラスミドＤＮＡを配列
決定した。えられた配列（図７）により再度、膜貫通領
域の欠失が示唆された。図７は、既知の膜貫通型ＩＦＮ
ＡＲのｃＤＮＡ（番号が付された各ブロックの１列目）
と、択一的にスプライスされた、本発明の短くなったＩ
Ｃ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡ
（番号が付された各ブロックの２列目）のヌクレオチド
配列の一部を、膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの番号づ
けにしたがって比較した図である。３列目に短くなった
ＩＣ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のアミノ酸
配列を示す。空所は欠失された配列を示す。番号づけは
膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡにしたがう。プライマー
の位置には下線を付し、膜貫通型ドメインの配列の上に
線を付す。図４におけると同様にエキソンの境界を示
す。膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと比較して認められう
るように、このスプライス欠失された２型はエキソンＩ
Ｘにおける１３１８から１３４１まで（２４ｂｐ）のヌ
クレオチドならびに１３６０から１５１８まで（１５９
ｂｐ、すなわちエキソンＩＸの端部およびエキソンＸの
すべて）のヌクレオチドにおいて２つのイン・フェーズ
の欠失を有していた。
された。このスプライス欠失された２型は、ＩＦＮＡＲ
ｃＤＮＡのヌクレオチド１２７０〜１２９０に対応す
る、さらに上流のプライマーを用いて行なわれたＰＣＲ
反応において検出された（図６におけるプライマー
１）。ＥｃｏＲＩサイトを含む５′テイルをもつこのセ
ンスプライマーは、ＢａｍＨＩサイトをもつ１７３３〜
１７５２のアンチセンスプライマーとともに用いた（図
６におけるプライマー５）。Ｕ２６６R細胞のＲＮＡを
用いてえられたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、およそ３
００ｂｐで観察されるＤＮＡバンドをゲルから切り出し
た。実施例２におけると同様にブルースクリプトベクタ
ーにてクローニングしたのち、プラスミドＤＮＡを配列
決定した。えられた配列（図７）により再度、膜貫通領
域の欠失が示唆された。図７は、既知の膜貫通型ＩＦＮ
ＡＲのｃＤＮＡ（番号が付された各ブロックの１列目）
と、択一的にスプライスされた、本発明の短くなったＩ
Ｃ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡ
（番号が付された各ブロックの２列目）のヌクレオチド
配列の一部を、膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの番号づ
けにしたがって比較した図である。３列目に短くなった
ＩＣ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のアミノ酸
配列を示す。空所は欠失された配列を示す。番号づけは
膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡにしたがう。プライマー
の位置には下線を付し、膜貫通型ドメインの配列の上に
線を付す。図４におけると同様にエキソンの境界を示
す。膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと比較して認められう
るように、このスプライス欠失された２型はエキソンＩ
Ｘにおける１３１８から１３４１まで（２４ｂｐ）のヌ
クレオチドならびに１３６０から１５１８まで（１５９
ｂｐ、すなわちエキソンＩＸの端部およびエキソンＸの
すべて）のヌクレオチドにおいて２つのイン・フェーズ
の欠失を有していた。
【００５６】図６に、既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤ
ＮＡ（ａ）と比べて短くなったＩＣ´ドメインを有する
可溶性ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ（ｂ）を示す。ＰＣＲ反応
に用いられたプライマーの位置ならびに欠失および新し
いジャンクションを示す。この新規なＩＦＮＡＲｃＤＮ
Ａによりコードされるタンパク質において、膜貫通型の
残基４１３（Ｇｌｕ）の次の８コドンが細胞外ドメイン
から失われており、６アミノ酸（依然としてエキソンＩ
Ｘ内の４２２〜４２７残基）で続き、さらにＴｙｒ−４
８１からの細胞質内ドメインに５３アミノ酸（膜貫通領
域を含む）の欠失が続いている。予測されたＩＣドメイ
ンは、膜貫通型における１００アミノ酸に代わって７７
アミノ酸長である。
ＮＡ（ａ）と比べて短くなったＩＣ´ドメインを有する
可溶性ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ（ｂ）を示す。ＰＣＲ反応
に用いられたプライマーの位置ならびに欠失および新し
いジャンクションを示す。この新規なＩＦＮＡＲｃＤＮ
Ａによりコードされるタンパク質において、膜貫通型の
残基４１３（Ｇｌｕ）の次の８コドンが細胞外ドメイン
から失われており、６アミノ酸（依然としてエキソンＩ
Ｘ内の４２２〜４２７残基）で続き、さらにＴｙｒ−４
８１からの細胞質内ドメインに５３アミノ酸（膜貫通領
域を含む）の欠失が続いている。予測されたＩＣドメイ
ンは、膜貫通型における１００アミノ酸に代わって７７
アミノ酸長である。
【００５７】このスプライス欠失されたＩＦＮα−受容
体２型のアミノ酸配列を図１０（本発明の短くなったＩ
Ｃ´ドメインをもつ２カ所欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ
２型のアミノ酸配列を示す。２つの欠失の間で保持され
ている、システインを含む６アミノ酸長の細胞外領域に
下線を付す。）に切除された１型（図９、スプライス欠
失された可溶性ＩＦＮＡＲ１型のアミノ酸配列を示し、
新規のＳ−ドメインには下線を付す）、および膜貫通型
（図８、既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのアミノ酸配列を示
し、その膜貫通ドメインには下線を付す）と比較して示
す。２型において２つの欠失の間に見出だされる６アミ
ノ酸（図１０における下線部）が１つのシステインを含
むことは注目に値する。膜貫通型およびスプライス欠失
された１型の細胞外ドメインに見出される８システイン
残基がそのシステインによって２型においても保存(con
serve)される。
体２型のアミノ酸配列を図１０（本発明の短くなったＩ
Ｃ´ドメインをもつ２カ所欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ
２型のアミノ酸配列を示す。２つの欠失の間で保持され
ている、システインを含む６アミノ酸長の細胞外領域に
下線を付す。）に切除された１型（図９、スプライス欠
失された可溶性ＩＦＮＡＲ１型のアミノ酸配列を示し、
新規のＳ−ドメインには下線を付す）、および膜貫通型
（図８、既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのアミノ酸配列を示
し、その膜貫通ドメインには下線を付す）と比較して示
す。２型において２つの欠失の間に見出だされる６アミ
ノ酸（図１０における下線部）が１つのシステインを含
むことは注目に値する。膜貫通型およびスプライス欠失
された１型の細胞外ドメインに見出される８システイン
残基がそのシステインによって２型においても保存(con
serve)される。
【００５８】本発明の新規の型のＩＦＮα−受容体はそ
れぞれ４３４ならびに４９６アミノ酸からなるが、一方
膜貫通型（図８）は５５７アミノ酸からなる。２つの新
規の型は図１のｂおよびｃに示されている。
れぞれ４３４ならびに４９６アミノ酸からなるが、一方
膜貫通型（図８）は５５７アミノ酸からなる。２つの新
規の型は図１のｂおよびｃに示されている。
【００５９】実施例４ 膜非結合型ＩＦＮα−受容体タンパク質 ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの新規の型によりコードされるタン
パク質をＵ２６６R 細胞において調べた。このＵ２６６
R 細胞はＩＦＮＡＲの膜貫通型に対するＲＮＡ転写産物
を含まず択一的にスプライス欠失された型に対するＲＮ
Ａ転写産物のみを含む。この目的のために組換え膜貫通
型ＩＦＮＡＲタンパク質に対する種々のモノクローナル
抗体（ＭｃＡＢ）を用いてイムノブロットを行なった。
示した結果は２つの抗体すなわちＭｃＡＢ＃１すなわち
６４Ｇ１２（ベノイトら、１９９３年、前出）、ならび
にＭｃＡＢ＃２すなわち２１．４（ノビックら、１９９
２年、前出）を用いてえられた。前記Ｕ２６６細胞から
の総タンパク質は１０ｍＭＣＨＡＰＳ界面活性剤（３−
｛（３−コラミド−プロピル）−ジメチル−アンモニ
オ｝−１−プロパン−スルフォネート）を含む緩衝液で
抽出し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ルにおける電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、ニト
ロセルロ−ス上にブロットし、さらに前記ＭｃＡＢと反
応させ、引続きラベルされたヤギ抗マウス−イムノグロ
ブリン抗体と反応させた。タンパク質の細胞内局在を決
定するため細胞を低張性ショックにより溶解し細胞のサ
イトゾル画分（可溶性細胞質画分）を、報告されたよう
に（チェバス、ジェー(ChebathJ.)ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２巻、３８５２
〜３８５７頁（１９８７年））調製された膜画分と比較
した。比較の目的で、Ｕ２６６S 細胞もまた溶解し、サ
イトゾルならびに膜画分を前記の方法で単離した。
パク質をＵ２６６R 細胞において調べた。このＵ２６６
R 細胞はＩＦＮＡＲの膜貫通型に対するＲＮＡ転写産物
を含まず択一的にスプライス欠失された型に対するＲＮ
Ａ転写産物のみを含む。この目的のために組換え膜貫通
型ＩＦＮＡＲタンパク質に対する種々のモノクローナル
抗体（ＭｃＡＢ）を用いてイムノブロットを行なった。
示した結果は２つの抗体すなわちＭｃＡＢ＃１すなわち
６４Ｇ１２（ベノイトら、１９９３年、前出）、ならび
にＭｃＡＢ＃２すなわち２１．４（ノビックら、１９９
２年、前出）を用いてえられた。前記Ｕ２６６細胞から
の総タンパク質は１０ｍＭＣＨＡＰＳ界面活性剤（３−
｛（３−コラミド−プロピル）−ジメチル−アンモニ
オ｝−１−プロパン−スルフォネート）を含む緩衝液で
抽出し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ルにおける電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、ニト
ロセルロ−ス上にブロットし、さらに前記ＭｃＡＢと反
応させ、引続きラベルされたヤギ抗マウス−イムノグロ
ブリン抗体と反応させた。タンパク質の細胞内局在を決
定するため細胞を低張性ショックにより溶解し細胞のサ
イトゾル画分（可溶性細胞質画分）を、報告されたよう
に（チェバス、ジェー(ChebathJ.)ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２巻、３８５２
〜３８５７頁（１９８７年））調製された膜画分と比較
した。比較の目的で、Ｕ２６６S 細胞もまた溶解し、サ
イトゾルならびに膜画分を前記の方法で単離した。
【００６０】図１１ａにＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ＃
２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６６S 細胞か
らの総ＣＨＡＰＳ抽出タンパク質のウェスタンイムノブ
ロットの結果を示す。左側の上部の矢印は１１０Ｋｄの
膜貫通型ＩＦＮＡＲを示し、左側の下部の矢印は５５Ｋ
ｄのタンパク質を示す。右側の矢印は９５Ｋｄのタンパ
ク質を示す。
２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６６S 細胞か
らの総ＣＨＡＰＳ抽出タンパク質のウェスタンイムノブ
ロットの結果を示す。左側の上部の矢印は１１０Ｋｄの
膜貫通型ＩＦＮＡＲを示し、左側の下部の矢印は５５Ｋ
ｄのタンパク質を示す。右側の矢印は９５Ｋｄのタンパ
ク質を示す。
【００６１】図１１ｂにはＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ
＃２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６６S 細胞
からの総ＣＨＡＰＳ抽出タンパク質（ＴＯＴ）、可溶性
細胞質画分（ＣＹＴ）タンパク質、細胞膜（ＭＥＭ）タ
ンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を示す。左
側の上部の矢印は１１０Ｋｄの膜貫通型ＩＦＮＡＲを示
す。右側の矢印は９５Ｋｄの細胞質画分タンパク質を示
す。Ｕ２６６R およびＵ２６６S 細胞タンパク質抽出物
の比較によりＵ２６６S においてＭｃＡＢ＃１により認
識される約１１０ＫｄのＩＦＮα−受容体タンパク質は
Ｕ２６６R 細胞ではまったく存在しないことが示された
（図１１ａ，レーン１、２）。このタンパク質は、膜貫
通型ＩＦＮＡＲｍＲＮＡの産物と予測されるように膜結
合型（図１１ｂ、レーン３）であった。加えて、ＭｃＡ
Ｂ＃１は約５５Ｋｄのタンパク質を認識した。このタン
パク質はＵ２６６R 細胞に存在し（図１１ａ，レーン
１、２）、したがってＵ２６６R 細胞に見出される膜貫
通領域を欠いたスプライス欠失されたｍＲＮＡの産物で
あると思われた。事実、５５Ｋｄタンパク質は膜に存在
しないが、Ｕ２６６S 細胞およびＵ２６６R 細胞の両方
のサイトゾルにのみ検出された（図１１ｂ、レーン２〜
５）。
＃２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６６S 細胞
からの総ＣＨＡＰＳ抽出タンパク質（ＴＯＴ）、可溶性
細胞質画分（ＣＹＴ）タンパク質、細胞膜（ＭＥＭ）タ
ンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を示す。左
側の上部の矢印は１１０Ｋｄの膜貫通型ＩＦＮＡＲを示
す。右側の矢印は９５Ｋｄの細胞質画分タンパク質を示
す。Ｕ２６６R およびＵ２６６S 細胞タンパク質抽出物
の比較によりＵ２６６S においてＭｃＡＢ＃１により認
識される約１１０ＫｄのＩＦＮα−受容体タンパク質は
Ｕ２６６R 細胞ではまったく存在しないことが示された
（図１１ａ，レーン１、２）。このタンパク質は、膜貫
通型ＩＦＮＡＲｍＲＮＡの産物と予測されるように膜結
合型（図１１ｂ、レーン３）であった。加えて、ＭｃＡ
Ｂ＃１は約５５Ｋｄのタンパク質を認識した。このタン
パク質はＵ２６６R 細胞に存在し（図１１ａ，レーン
１、２）、したがってＵ２６６R 細胞に見出される膜貫
通領域を欠いたスプライス欠失されたｍＲＮＡの産物で
あると思われた。事実、５５Ｋｄタンパク質は膜に存在
しないが、Ｕ２６６S 細胞およびＵ２６６R 細胞の両方
のサイトゾルにのみ検出された（図１１ｂ、レーン２〜
５）。
【００６２】同様のイムノブロットで、ＭｃＡＢ＃２は
およそ９５Ｋｄタンパク質のところに移動しＵ２６６S
細胞およびＵ２６６R 細胞の両方に存在する、他の型の
ＩＦＮα−受容体を認識した（図１１ａ、レーン３、
４）。この９５Ｋｄタンパク質はサイトゾル内に明瞭に
多く存在し、膜には存在しなかった（図１１ｂ、レーン
６〜１０）。この約９５Ｋｄのタンパク質をまずＭｃＡ
Ｂ＃２により免疫沈降して濃縮したばあいにイムノブロ
ット上でＭｃＡＢ＃１によっても認識されることが証明
された。このことによりこのサイトゾルのタンパク質は
ＭｃＡＢ＃１に対する方がＭｃＡＢ＃２に対するより低
い親和性を有する型のＩＦＮα−受容体であることが示
された。９５Ｋｄのタンパク質がスプライス欠失された
ＩＦＮＡＲのｍＲＮＡの産物であることは、それがＵ２
６６S およびＵ２６６R 細胞の両方に存在することなら
びに膜結合タンパク質でないという事実により支持され
た。
およそ９５Ｋｄタンパク質のところに移動しＵ２６６S
細胞およびＵ２６６R 細胞の両方に存在する、他の型の
ＩＦＮα−受容体を認識した（図１１ａ、レーン３、
４）。この９５Ｋｄタンパク質はサイトゾル内に明瞭に
多く存在し、膜には存在しなかった（図１１ｂ、レーン
６〜１０）。この約９５Ｋｄのタンパク質をまずＭｃＡ
Ｂ＃２により免疫沈降して濃縮したばあいにイムノブロ
ット上でＭｃＡＢ＃１によっても認識されることが証明
された。このことによりこのサイトゾルのタンパク質は
ＭｃＡＢ＃１に対する方がＭｃＡＢ＃２に対するより低
い親和性を有する型のＩＦＮα−受容体であることが示
された。９５Ｋｄのタンパク質がスプライス欠失された
ＩＦＮＡＲのｍＲＮＡの産物であることは、それがＵ２
６６S およびＵ２６６R 細胞の両方に存在することなら
びに膜結合タンパク質でないという事実により支持され
た。
【００６３】ＩＦＮＡＲタンパク質の異なる型が前記の
ＩＦＮＡＲに対するＭｃＡＢにより認識されうるという
事実は、一方で異なる型が密接に関連している、すなわ
ち配列の同一性を有していることを示し、さらに他方で
受容体タンパク質に異型(heterogeneity) が存在するこ
とを示唆する。９５Ｋｄのサイトゾル型は実施例３に記
載されたスプライス欠失された２型のｃＤＮＡの産物で
ありうる。このタンパク質は細胞質内でＵ２６６R 細胞
のＩＦＮに対する残余の応答(residual response) にお
いて機能しうる。細胞のＩＦＮに対する初期の応答は、
ＩＦＮで活性化される多くの遺伝子のＩＦＮ反応性(res
ponsive)エンハンサーに結合する転写因子ＩＳＧＦ３お
よびＩＲＦ−１の活性化である。（レビー、ディー・イ
ー(Levy,D. E.) ら、ジーンズ・デブ(Genes Dev.)３
巻、１３６２〜１３７１頁（１９８９年）；ハラダ、エ
イチ(Harada, H.)、セル、５８巻、７２９〜７３９頁
（１９８７年））。ＩＦＮがＵ２６６S 細胞におけると
同様にＵ２６６R 細胞においてもＩＲＦ−１を活性化す
ることが観察された（アブラモビッチ・シー(Abramvich
C.)、ピーエイチ・ディー・シーシス(Ph. D. Thesi
s）、ワイズマン・インスティテュート・オブ・サイエ
ンス(Weizmann Institute of Science) （１９９３
年））。ＩＦＮに対するこの応答は、Ｕ２６６R 細胞中
のスプライス欠失されたＩＦＮＡＲｃＤＮＡの産物によ
り媒介されうる。対照的にＩＳＧＦ３はＵ２６６S細胞
においてのみ誘導され、膜結合型ＩＦＮＡＲタンパク質
を必要とすることが示唆される。
ＩＦＮＡＲに対するＭｃＡＢにより認識されうるという
事実は、一方で異なる型が密接に関連している、すなわ
ち配列の同一性を有していることを示し、さらに他方で
受容体タンパク質に異型(heterogeneity) が存在するこ
とを示唆する。９５Ｋｄのサイトゾル型は実施例３に記
載されたスプライス欠失された２型のｃＤＮＡの産物で
ありうる。このタンパク質は細胞質内でＵ２６６R 細胞
のＩＦＮに対する残余の応答(residual response) にお
いて機能しうる。細胞のＩＦＮに対する初期の応答は、
ＩＦＮで活性化される多くの遺伝子のＩＦＮ反応性(res
ponsive)エンハンサーに結合する転写因子ＩＳＧＦ３お
よびＩＲＦ−１の活性化である。（レビー、ディー・イ
ー(Levy,D. E.) ら、ジーンズ・デブ(Genes Dev.)３
巻、１３６２〜１３７１頁（１９８９年）；ハラダ、エ
イチ(Harada, H.)、セル、５８巻、７２９〜７３９頁
（１９８７年））。ＩＦＮがＵ２６６S 細胞におけると
同様にＵ２６６R 細胞においてもＩＲＦ−１を活性化す
ることが観察された（アブラモビッチ・シー(Abramvich
C.)、ピーエイチ・ディー・シーシス(Ph. D. Thesi
s）、ワイズマン・インスティテュート・オブ・サイエ
ンス(Weizmann Institute of Science) （１９９３
年））。ＩＦＮに対するこの応答は、Ｕ２６６R 細胞中
のスプライス欠失されたＩＦＮＡＲｃＤＮＡの産物によ
り媒介されうる。対照的にＩＳＧＦ３はＵ２６６S細胞
においてのみ誘導され、膜結合型ＩＦＮＡＲタンパク質
を必要とすることが示唆される。
【００６４】５５Ｋｄのタンパク質は実施例２に記載の
切除されてスプライス欠失された１型の産物であるかも
しれない。このより短い切除された型は細胞から分泌さ
れるかもしれず、ＩＦＮ結合の競合的阻害剤として働き
うる。
切除されてスプライス欠失された１型の産物であるかも
しれない。このより短い切除された型は細胞から分泌さ
れるかもしれず、ＩＦＮ結合の競合的阻害剤として働き
うる。
【００６５】実施例５ 可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、その融合タンパク質、断
片およびムテイン体の組換えによる製造 （ａ）可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、１型および２型の
組換えによる製造 前記実施例１〜４で述べたように、膜貫通領域を欠いた
ＩＦＮＡＲタンパク質の新規の型、１型および２型をコ
ードする特異にスプライスされたｍＲＮＡの２つの型が
存在する。組換えＤＮＡ技術の標準法を用いて（たとえ
ばマニアチスら、前出；サンブルーク(Sambrook)ら、モ
レキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュ
アル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、ニューヨーク（１９８９年））、それらｍＲＮＡか
らｃＤＮＡ分子をつくり、引続き単離した。これらｃＤ
ＮＡは可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質の１型および２型を
コードする。
片およびムテイン体の組換えによる製造 （ａ）可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、１型および２型の
組換えによる製造 前記実施例１〜４で述べたように、膜貫通領域を欠いた
ＩＦＮＡＲタンパク質の新規の型、１型および２型をコ
ードする特異にスプライスされたｍＲＮＡの２つの型が
存在する。組換えＤＮＡ技術の標準法を用いて（たとえ
ばマニアチスら、前出；サンブルーク(Sambrook)ら、モ
レキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュ
アル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、ニューヨーク（１９８９年））、それらｍＲＮＡか
らｃＤＮＡ分子をつくり、引続き単離した。これらｃＤ
ＮＡは可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質の１型および２型を
コードする。
【００６６】可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質の１型および
２型をコードする単離されたｃＤＮＡを、前記した標準
法によりｐＳＶＥ３またはｐＳＶＬ構築物を提供するた
めにそれぞれ初期ＳＶ４０プロモーターまたは後期ＳＶ
４０プロモーターをもつ発現ベクター内へと導入した。
２型をコードする単離されたｃＤＮＡを、前記した標準
法によりｐＳＶＥ３またはｐＳＶＬ構築物を提供するた
めにそれぞれ初期ＳＶ４０プロモーターまたは後期ＳＶ
４０プロモーターをもつ発現ベクター内へと導入した。
【００６７】２つの可溶性ＩＦＮＡＲの型の発現を、ｐ
ＳＶＬ構築物でＣＯＳ−７細胞（サル腎細胞）にトラン
スフェクトすることにより実証した。これら発現実験の
結果から、１型および２型タンパク質の異なる構造が大
いにタンパク質産物の挙動に影響することが明らかにな
った。ＩＦＮＡＲタンパク質の４２７アミノ酸に７アミ
ノ酸末端テールがつき、膜貫通および細胞内ドメインを
欠く１型は、ＣＯＳ−７細胞培養の培地中に効率的に分
泌されていることが見出された。これに対して膜貫通ド
メインの欠失を有するが細胞内ドメインのほとんどすべ
てを保持している２型は、細胞内にとどまっていること
が見出された。これら発現実験の結果を図１２ａおよび
ｂに示す。
ＳＶＬ構築物でＣＯＳ−７細胞（サル腎細胞）にトラン
スフェクトすることにより実証した。これら発現実験の
結果から、１型および２型タンパク質の異なる構造が大
いにタンパク質産物の挙動に影響することが明らかにな
った。ＩＦＮＡＲタンパク質の４２７アミノ酸に７アミ
ノ酸末端テールがつき、膜貫通および細胞内ドメインを
欠く１型は、ＣＯＳ−７細胞培養の培地中に効率的に分
泌されていることが見出された。これに対して膜貫通ド
メインの欠失を有するが細胞内ドメインのほとんどすべ
てを保持している２型は、細胞内にとどまっていること
が見出された。これら発現実験の結果を図１２ａおよび
ｂに示す。
【００６８】図１２ａにＣＯＳ−７細胞の培養培地から
えられたサンプルで行なった、免疫染色されたウェスタ
ンブロットの結果を示す。この分析において可溶性ＩＦ
ＮＡＲ１型タンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクタ
ーにより形質転換されたＣＯＳ−７細胞を、標準培養培
地中で成育させ、細胞により分泌された種々のタンパク
質を含む培養培地のサンプルをとった。ついでこれらの
サンプルを標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そ
ののちこのようにして分離されたタンパク質を標準ウェ
スタンブロット法によってニトロセルロースフィルター
上にブロットした。つぎにそのウェスタンブロットをモ
ノクローナル抗体、ＭｃＡＢ＃１（ＭｃＡＢ６４Ｇ１
２、実施例４参照）を用いて染色した。各ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルに対して、したがって各ウェスタンブロットに
ついて以下のサンプルを分析した。
えられたサンプルで行なった、免疫染色されたウェスタ
ンブロットの結果を示す。この分析において可溶性ＩＦ
ＮＡＲ１型タンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクタ
ーにより形質転換されたＣＯＳ−７細胞を、標準培養培
地中で成育させ、細胞により分泌された種々のタンパク
質を含む培養培地のサンプルをとった。ついでこれらの
サンプルを標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そ
ののちこのようにして分離されたタンパク質を標準ウェ
スタンブロット法によってニトロセルロースフィルター
上にブロットした。つぎにそのウェスタンブロットをモ
ノクローナル抗体、ＭｃＡＢ＃１（ＭｃＡＢ６４Ｇ１
２、実施例４参照）を用いて染色した。各ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルに対して、したがって各ウェスタンブロットに
ついて以下のサンプルを分析した。
【００６９】（ｉ）１型ＩＦＮＡＲの遺伝情報を担うｐ
ＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞
から分泌された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培
養培地１２μｌから調製されたタンパク質（図１２ａに
おけるサンプル「ｐＳＶＬＳαＲ１型」） （ｉｉ）陰性コントロールとなる、ｐＳＶＬベクターの
み（すなわち１型の配列を含まない）で形質転換された
ＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００
倍に濃縮した培養培地１２μｌから調製されたタンパク
質、（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬ」） （ｉｉｉ）１型ＩＦＮＡＲの遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞から分泌
された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培養培地８
μｌから調製されたタンパク質（図１２ａにおけるサン
プル「ｐＳＶＬＳαＲ１型」） （ｉｖ）陰性コントロールとなる、ｐＳＶＬベクターの
み（すなわち１型の配列を含まない）で形質転換された
ＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００
倍に濃縮した培養培地８μｌから調製されたタンパク質
（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬ」） （ｖ）ブロットのＭｃＡＢ＃１を用いた免疫染色につい
て陽性コントロールとなり、またＩＦＮＡＲに対する分
子量スタンダードとなる、細胞表面結合性ＩＦＮ受容体
およびその可溶性型を産生しているダウディ（ＤＡＵＤ
Ｉ）細胞（ヒトバーキット(Burkitt) リンパ腫細胞、Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）から抽出したタンパク質（図
１２ａにおけるサンプル「ＤＡＵＤＩ」）、ならびに （ｖｉ）放射ラベルした分子量マーカータンパク質（図
１２ａにおける最も右側のサンプル）。
ＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞
から分泌された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培
養培地１２μｌから調製されたタンパク質（図１２ａに
おけるサンプル「ｐＳＶＬＳαＲ１型」） （ｉｉ）陰性コントロールとなる、ｐＳＶＬベクターの
み（すなわち１型の配列を含まない）で形質転換された
ＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００
倍に濃縮した培養培地１２μｌから調製されたタンパク
質、（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬ」） （ｉｉｉ）１型ＩＦＮＡＲの遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞から分泌
された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培養培地８
μｌから調製されたタンパク質（図１２ａにおけるサン
プル「ｐＳＶＬＳαＲ１型」） （ｉｖ）陰性コントロールとなる、ｐＳＶＬベクターの
み（すなわち１型の配列を含まない）で形質転換された
ＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００
倍に濃縮した培養培地８μｌから調製されたタンパク質
（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬ」） （ｖ）ブロットのＭｃＡＢ＃１を用いた免疫染色につい
て陽性コントロールとなり、またＩＦＮＡＲに対する分
子量スタンダードとなる、細胞表面結合性ＩＦＮ受容体
およびその可溶性型を産生しているダウディ（ＤＡＵＤ
Ｉ）細胞（ヒトバーキット(Burkitt) リンパ腫細胞、Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）から抽出したタンパク質（図
１２ａにおけるサンプル「ＤＡＵＤＩ」）、ならびに （ｖｉ）放射ラベルした分子量マーカータンパク質（図
１２ａにおける最も右側のサンプル）。
【００７０】このように図１２ａのウェスタンブロット
の結果から、可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質１型の遺伝情
報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換したＣＯＳ
−７細胞がこのタンパク質を首尾よく発現し分泌しうる
ことが明らかであり、分泌されたタンパク質は予測され
たように約７３Ｋｄの分子量を有していた。
の結果から、可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質１型の遺伝情
報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換したＣＯＳ
−７細胞がこのタンパク質を首尾よく発現し分泌しうる
ことが明らかであり、分泌されたタンパク質は予測され
たように約７３Ｋｄの分子量を有していた。
【００７１】図１２ｂにＩＦＮＡＲ１型および２型のタ
ンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形
質転換されたＣＯＳ−７細胞からえられたサンプルにつ
いて行なったウェスタンブロットの結果を示す。この分
析において形質転換されたＣＯＳ−７細胞からえたサン
プルは以下のとおりであった：培養培地サンプル、すな
わち細胞により分泌されたタンパク質を含むサンプル；
細胞膜サンプル、すなわち細胞により産生され膜内に取
込まれたタンパク質；サイトゾルサンプル、すなわち細
胞により産生され細胞の細胞内画分（サイトゾル）に存
在するタンパク質；ならびに核サンプル、すなわち細胞
により産生され核または核膜に結合しているタンパク
質。これらサンプルのすべての調製は前記実施例４に記
載されている。また核サンプルは、トライトンＸ−１０
０を用いた核サンプルの洗浄の工程をも含む標準法によ
り細胞抽出サンプル（膜およびサイトゾルを分離し単離
したサンプル）からえたことは注目されるべきである。
つぎに前記サンプルすべてをＳＤＳ−ＰＡＧＥの標準法
により分離しさらに標準のウェスタンブロットを行なっ
た。ウェスタンブロットはついで前記したようにＭｃＡ
Ｂ＃１を用いて免疫染色し、図１２ｂに示されるブロッ
トをえた。図１２ｂにおけるサンプルは以下のとおりで
ある： レーン１：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培養
培地、陰性コントロール； レーン２：ＩＦＮＡＲ１型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培
養培地； レーン３：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培
養培地； レーン４：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの膜、
陰性コントロール； レーン５：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの
膜； レーン６：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からのサイ
トゾル、陰性コントロール； レーン７：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からのサ
イトゾル； レーン８：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの核、
陰性コントロール；ならびに レーン９：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの
核。
ンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形
質転換されたＣＯＳ−７細胞からえられたサンプルにつ
いて行なったウェスタンブロットの結果を示す。この分
析において形質転換されたＣＯＳ−７細胞からえたサン
プルは以下のとおりであった：培養培地サンプル、すな
わち細胞により分泌されたタンパク質を含むサンプル；
細胞膜サンプル、すなわち細胞により産生され膜内に取
込まれたタンパク質；サイトゾルサンプル、すなわち細
胞により産生され細胞の細胞内画分（サイトゾル）に存
在するタンパク質；ならびに核サンプル、すなわち細胞
により産生され核または核膜に結合しているタンパク
質。これらサンプルのすべての調製は前記実施例４に記
載されている。また核サンプルは、トライトンＸ−１０
０を用いた核サンプルの洗浄の工程をも含む標準法によ
り細胞抽出サンプル（膜およびサイトゾルを分離し単離
したサンプル）からえたことは注目されるべきである。
つぎに前記サンプルすべてをＳＤＳ−ＰＡＧＥの標準法
により分離しさらに標準のウェスタンブロットを行なっ
た。ウェスタンブロットはついで前記したようにＭｃＡ
Ｂ＃１を用いて免疫染色し、図１２ｂに示されるブロッ
トをえた。図１２ｂにおけるサンプルは以下のとおりで
ある： レーン１：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培養
培地、陰性コントロール； レーン２：ＩＦＮＡＲ１型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培
養培地； レーン３：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培
養培地； レーン４：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの膜、
陰性コントロール； レーン５：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの
膜； レーン６：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からのサイ
トゾル、陰性コントロール； レーン７：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からのサ
イトゾル； レーン８：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの核、
陰性コントロール；ならびに レーン９：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベ
クターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの
核。
【００７２】したがって図１２ｂより可溶性ＩＦＮＡＲ
１型（約７３Ｋｄ）が首尾よく発現され、形質転換され
たＣＯＳ−７細胞培養培地内へと分泌されていることが
明らかであり、一方可溶性ＩＦＮＡＲ２型タンパク質は
ＣＯＳ−７細胞で首尾よく発現されているものの、培地
中には分泌されておらず（おそらくゴルジ膜に存在）さ
らに細胞核により多く結合していることが明らかであ
る。可溶性ＩＦＮＡＲ２型は可溶性ＩＦＮＡＲ１型より
大きく、およそ８０および１００Ｋｄの２つの成分(com
ponents)として示される。１型および２型のｃＤＮＡ産
物がこのように異なる局在性を示すことにより、細胞で
産生されたこれらの可溶性受容体が別個の機能を有する
という知見が支持される。たとえば実施例４に明示され
るように、膜貫通型ＩＦＮＡＲタンパク質を欠くＵ２６
６R 細胞はＩＳＧＦ３の活性化能は喪失しているがＩＲ
Ｆ−１の活性化によりなお応答することができる。この
ように可溶性１型および２型タンパク質により演じられ
る役割は、シグナルトランスダクションを含めてさらに
解明されよう。
１型（約７３Ｋｄ）が首尾よく発現され、形質転換され
たＣＯＳ−７細胞培養培地内へと分泌されていることが
明らかであり、一方可溶性ＩＦＮＡＲ２型タンパク質は
ＣＯＳ−７細胞で首尾よく発現されているものの、培地
中には分泌されておらず（おそらくゴルジ膜に存在）さ
らに細胞核により多く結合していることが明らかであ
る。可溶性ＩＦＮＡＲ２型は可溶性ＩＦＮＡＲ１型より
大きく、およそ８０および１００Ｋｄの２つの成分(com
ponents)として示される。１型および２型のｃＤＮＡ産
物がこのように異なる局在性を示すことにより、細胞で
産生されたこれらの可溶性受容体が別個の機能を有する
という知見が支持される。たとえば実施例４に明示され
るように、膜貫通型ＩＦＮＡＲタンパク質を欠くＵ２６
６R 細胞はＩＳＧＦ３の活性化能は喪失しているがＩＲ
Ｆ−１の活性化によりなお応答することができる。この
ように可溶性１型および２型タンパク質により演じられ
る役割は、シグナルトランスダクションを含めてさらに
解明されよう。
【００７３】１型タンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬ
ベクターにより形質転換（すなわち前記ベクターを用い
てトランスフェクト）されたＣＯＳ−７細胞のさらなる
実験においてこれら細胞で産生される１型タンパク質は
ＩＦＮに結合できることが示された。すなわち組換えに
より産生されたタンパク質はそのＩＦＮ結合活性を保持
していた。この実験においては、放射ラベルされたＩＦ
Ｎ−α−２（ジンザイム(Genzyme) 社製）を可溶性ＩＦ
ＮＡＲ１型に対するｃＤＮＡを用いてトランスフェクト
されたＣＯＳ−７細胞からの濃縮培地と反応させた。交
差結合(cross-linking) ののち、ＩＦＮ−αに対する抗
体およびＩＦＮＡＲに対する抗体（ＭｃＡＢ＃２＝Ｍｃ
ＡＢ２１．４、実施例４参照）を用いて免疫沈降を行な
った。この分析ではヒトＵ２６６R 細胞（膜貫通型ＩＦ
ＮＡＲを欠く、ＩＦＮＡＲ１型のｍＲＮＡを含む細胞、
実施例４参照）から分泌されたタンパク質もまたコント
ロールサンプルとして調べた。この分析の結果を図１３
に示す。図１３は前記したように免疫沈降され交差結合
されたサンプルを分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果
を示す。図１３に示すサンプルは以下のとおりである： レーン１：可溶性ＩＦＮＡＲ１型の遺伝情報を担うｐＳ
ＶＬベクターを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−
７細胞からの培養培地、抗ＩＦＮ−α−２ モノクロナ
ール抗体を用いて免疫沈降しついで［ 125Ｉ］−ＩＦＮ
α−２で交差結合させたもの； レーン２：レーン１と同じサンプルで、ラベルされてい
ない（コールドの）ＩＦＮ−α−２（×５０）存在下で
交差結合させたもの； レーン３：レーン１と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を
用いて免疫沈降を行ないコールドのＩＦＮ−α−２（×
５０）存在下で交差結合させたもの； レーン４：レーン１と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を
用いて免疫沈降を行なったもの； レーン５：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞か
らの培養培地、抗ＩＦＮ−α−２ モノクロナール抗体
を用いて免疫沈降をおこなったもの、陰性コントロー
ル； レーン６：レーン５と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を
用いて免疫沈降を行なったもの、陰性コントロール； レーン７：Ｕ２６６R 細胞からの培養培地、ＭｃＡＢ＃
２を用いて免疫沈降を行ないラベルした［ 125Ｉ］−Ｉ
ＦＮ−α−２を用いてコールドのＩＦＮα−２（×５
０）存在下にて交差結合させたもの；ならびに レーン８：レーン７と同じサンプルで、ラベルされたＩ
ＦＮ−α−２のみで交差結合させたもの（レーン「Ｍ」
はゲルに流した分子量スタンダードを示す）。
ベクターにより形質転換（すなわち前記ベクターを用い
てトランスフェクト）されたＣＯＳ−７細胞のさらなる
実験においてこれら細胞で産生される１型タンパク質は
ＩＦＮに結合できることが示された。すなわち組換えに
より産生されたタンパク質はそのＩＦＮ結合活性を保持
していた。この実験においては、放射ラベルされたＩＦ
Ｎ−α−２（ジンザイム(Genzyme) 社製）を可溶性ＩＦ
ＮＡＲ１型に対するｃＤＮＡを用いてトランスフェクト
されたＣＯＳ−７細胞からの濃縮培地と反応させた。交
差結合(cross-linking) ののち、ＩＦＮ−αに対する抗
体およびＩＦＮＡＲに対する抗体（ＭｃＡＢ＃２＝Ｍｃ
ＡＢ２１．４、実施例４参照）を用いて免疫沈降を行な
った。この分析ではヒトＵ２６６R 細胞（膜貫通型ＩＦ
ＮＡＲを欠く、ＩＦＮＡＲ１型のｍＲＮＡを含む細胞、
実施例４参照）から分泌されたタンパク質もまたコント
ロールサンプルとして調べた。この分析の結果を図１３
に示す。図１３は前記したように免疫沈降され交差結合
されたサンプルを分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果
を示す。図１３に示すサンプルは以下のとおりである： レーン１：可溶性ＩＦＮＡＲ１型の遺伝情報を担うｐＳ
ＶＬベクターを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−
７細胞からの培養培地、抗ＩＦＮ−α−２ モノクロナ
ール抗体を用いて免疫沈降しついで［ 125Ｉ］−ＩＦＮ
α−２で交差結合させたもの； レーン２：レーン１と同じサンプルで、ラベルされてい
ない（コールドの）ＩＦＮ−α−２（×５０）存在下で
交差結合させたもの； レーン３：レーン１と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を
用いて免疫沈降を行ないコールドのＩＦＮ−α−２（×
５０）存在下で交差結合させたもの； レーン４：レーン１と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を
用いて免疫沈降を行なったもの； レーン５：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクター
のみを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞か
らの培養培地、抗ＩＦＮ−α−２ モノクロナール抗体
を用いて免疫沈降をおこなったもの、陰性コントロー
ル； レーン６：レーン５と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を
用いて免疫沈降を行なったもの、陰性コントロール； レーン７：Ｕ２６６R 細胞からの培養培地、ＭｃＡＢ＃
２を用いて免疫沈降を行ないラベルした［ 125Ｉ］−Ｉ
ＦＮ−α−２を用いてコールドのＩＦＮα−２（×５
０）存在下にて交差結合させたもの；ならびに レーン８：レーン７と同じサンプルで、ラベルされたＩ
ＦＮ−α−２のみで交差結合させたもの（レーン「Ｍ」
はゲルに流した分子量スタンダードを示す）。
【００７４】図１３に示されるように、組換えにより産
生された可溶性ＩＦＮＡＲ１型へのＩＦＮの結合が首尾
よく起こっていることが明らかであり（レーン１および
４）、組換え可溶性ＩＦＮＡＲ１型のＩＦＮ−結合活性
が立証される。。さらに、Ｕ２６６R 細胞はこれら細胞
に存在する対応するｍＲＮＡによりコードされるＩＦＮ
ＡＲ１型を分泌することができることが明らかであり
（レーン８）、少なくともこれらの細胞においては膜結
合型受容体の切断から可溶性受容体が生じるのではなく
むしろ、特異的にスプライスされたｍＲＮＡ（実施例
４）から生じることが確認された。さらにＭｃＡＢ＃２
は可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質を免疫沈降させることが
できるが、細胞表面膜から界面活性剤によって抽出され
た膜結合型受容体については沈降させえない（実施例４
参照）。
生された可溶性ＩＦＮＡＲ１型へのＩＦＮの結合が首尾
よく起こっていることが明らかであり（レーン１および
４）、組換え可溶性ＩＦＮＡＲ１型のＩＦＮ−結合活性
が立証される。。さらに、Ｕ２６６R 細胞はこれら細胞
に存在する対応するｍＲＮＡによりコードされるＩＦＮ
ＡＲ１型を分泌することができることが明らかであり
（レーン８）、少なくともこれらの細胞においては膜結
合型受容体の切断から可溶性受容体が生じるのではなく
むしろ、特異的にスプライスされたｍＲＮＡ（実施例
４）から生じることが確認された。さらにＭｃＡＢ＃２
は可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質を免疫沈降させることが
できるが、細胞表面膜から界面活性剤によって抽出され
た膜結合型受容体については沈降させえない（実施例４
参照）。
【００７５】可溶性ＩＦＮＡＲ１型がＩＦＮに結合する
能力について、ＣＯＳ−７細胞が分泌した産物をダウデ
ィ細胞に添加しついでそれに対するヨウ素化したＩＦＮ
−αの結合を測定することにより、ＣＨＯ細胞における
可溶性ＩＦＮＡＲの発現のための可溶性ＩＦＮＡＲの遺
伝情報を担う発現ベクターの調製も同様に、定量的な実
験を含めて予備的に実験を行なっている（結果は本明細
書には示さない）。
能力について、ＣＯＳ−７細胞が分泌した産物をダウデ
ィ細胞に添加しついでそれに対するヨウ素化したＩＦＮ
−αの結合を測定することにより、ＣＨＯ細胞における
可溶性ＩＦＮＡＲの発現のための可溶性ＩＦＮＡＲの遺
伝情報を担う発現ベクターの調製も同様に、定量的な実
験を含めて予備的に実験を行なっている（結果は本明細
書には示さない）。
【００７６】（ｂ）可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、その
融合産物、断片およびムテイン体の組換え製造 法 前記（ａ）の部分において、可溶性ＩＦＮＡＲ１型およ
び２型の遺伝情報を担うＳＶ−４０由来の発現ベクター
（たとえば、ｐＳＶＬ）の特定の調製法が記載されてい
る。前記ベクターはＣＯＳ−７宿主細胞に導入された
（トランスフェクションされた）ときに組換えＩＦＮＡ
Ｒ１型および２型の発現が成功した。標準的な組換えＤ
ＮＡ技術を用いて、以下のように他のベクター（および
それでトランスフェクトされた宿主細胞）は組換え可溶
性ＩＦＮＡＲ融合タンパク質、その断片およびムテイン
体の製造のために生産されうる。
融合産物、断片およびムテイン体の組換え製造 法 前記（ａ）の部分において、可溶性ＩＦＮＡＲ１型およ
び２型の遺伝情報を担うＳＶ−４０由来の発現ベクター
（たとえば、ｐＳＶＬ）の特定の調製法が記載されてい
る。前記ベクターはＣＯＳ−７宿主細胞に導入された
（トランスフェクションされた）ときに組換えＩＦＮＡ
Ｒ１型および２型の発現が成功した。標準的な組換えＤ
ＮＡ技術を用いて、以下のように他のベクター（および
それでトランスフェクトされた宿主細胞）は組換え可溶
性ＩＦＮＡＲ融合タンパク質、その断片およびムテイン
体の製造のために生産されうる。
【００７７】本発明の単離されたｃＤＮＡを、終止コド
ンおよびポリアデニレーション部位が可溶性ＩＦＮＡＲ
の最後の必須コドンの後に挿入されるように、適切なオ
リゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異誘発に供し
た。ついで、この構築物を当該技術分野においてよく知
られている技術によってふさわしく構築された発現ベク
ターに挿入した（マニアチスら、前出）。合成ＤＮＡリ
ンカーまたは平滑末端化連結技術を用いることを含むホ
モポリマーテイリングまたは制限結合によって、２本鎖
ｃＤＮＡをプラスミドベクターに連結させた。ＤＮＡ分
子を連結させるためにＤＮＡリガーゼを用い、アルカリ
ホスファターゼを用いてＤＮＡ鎖を処置することにより
望ましくない接合を回避した。
ンおよびポリアデニレーション部位が可溶性ＩＦＮＡＲ
の最後の必須コドンの後に挿入されるように、適切なオ
リゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異誘発に供し
た。ついで、この構築物を当該技術分野においてよく知
られている技術によってふさわしく構築された発現ベク
ターに挿入した（マニアチスら、前出）。合成ＤＮＡリ
ンカーまたは平滑末端化連結技術を用いることを含むホ
モポリマーテイリングまたは制限結合によって、２本鎖
ｃＤＮＡをプラスミドベクターに連結させた。ＤＮＡ分
子を連結させるためにＤＮＡリガーゼを用い、アルカリ
ホスファターゼを用いてＤＮＡ鎖を処置することにより
望ましくない接合を回避した。
【００７８】可溶性ＩＦＮＡＲおよび、たとえばＩｇＧ
1 重鎖の定常部とからなる融合タンパク質の製造は、以
下のように行なった。コード配列の直後に特有な制限部
位を導入するように、適切なオリゴヌクレオチドを用い
て可溶性ＩＦＮＡＲのＤＮＡを部位特異的変異誘発に供
した。ＩｇＧ1 重鎖の定常部の遺伝情報を担うプラスミ
ド、たとえばｐＲＫＣＯ４2 Ｆｃ1 （バイルン・アール
・エーら、ネイチャー、３４４巻、６６７〜６７０頁
（１９９０年））を同様の部位特異的変異誘発に供し、
融合タンパク質がイン・フェーズに翻訳されうるように
ＩｇＧ1 重鎖のＡｓｐ２１６にできる限り近接して前記
と同じ特有な制限部位を導入した。前記の特有な制限部
位で消化することにより、５´非翻訳配列および可溶性
ＩＦＮＡＲをコードする配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片
を調製した。変異させたｐＲＫＣＤ４2 Ｆｃ1 を同様に
消化し、プラスミドおよびＩｇＧ1 配列を含む大きな断
片をつくった。ついで２つの断片を連結させ、Ｎ−末端
可溶性ＩＦＮＡＲおよびＩｇＧ1 重鎖の約２２７のＣ−
末端アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３
ドメイン）からなるポリペプチド前駆体をコードする新
しいプラスミドをつくった。融合タンパク質をコードす
るＤＮＡを適切な制限酵素を用いた消化によりプラスミ
ドから単離し、ついで、遺伝子発現およびタンパク質の
産生を可能とするような方法で所望のタンパク質をコー
ドするＤＮＡに結合させた転写および翻訳調節情報を含
む特異的なヌクレオチド配列を含む効率のよい発現ベク
ターに挿入した。
1 重鎖の定常部とからなる融合タンパク質の製造は、以
下のように行なった。コード配列の直後に特有な制限部
位を導入するように、適切なオリゴヌクレオチドを用い
て可溶性ＩＦＮＡＲのＤＮＡを部位特異的変異誘発に供
した。ＩｇＧ1 重鎖の定常部の遺伝情報を担うプラスミ
ド、たとえばｐＲＫＣＯ４2 Ｆｃ1 （バイルン・アール
・エーら、ネイチャー、３４４巻、６６７〜６７０頁
（１９９０年））を同様の部位特異的変異誘発に供し、
融合タンパク質がイン・フェーズに翻訳されうるように
ＩｇＧ1 重鎖のＡｓｐ２１６にできる限り近接して前記
と同じ特有な制限部位を導入した。前記の特有な制限部
位で消化することにより、５´非翻訳配列および可溶性
ＩＦＮＡＲをコードする配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片
を調製した。変異させたｐＲＫＣＤ４2 Ｆｃ1 を同様に
消化し、プラスミドおよびＩｇＧ1 配列を含む大きな断
片をつくった。ついで２つの断片を連結させ、Ｎ−末端
可溶性ＩＦＮＡＲおよびＩｇＧ1 重鎖の約２２７のＣ−
末端アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３
ドメイン）からなるポリペプチド前駆体をコードする新
しいプラスミドをつくった。融合タンパク質をコードす
るＤＮＡを適切な制限酵素を用いた消化によりプラスミ
ドから単離し、ついで、遺伝子発現およびタンパク質の
産生を可能とするような方法で所望のタンパク質をコー
ドするＤＮＡに結合させた転写および翻訳調節情報を含
む特異的なヌクレオチド配列を含む効率のよい発現ベク
ターに挿入した。
【００７９】遺伝子が転写されるために、ＲＮＡポリメ
ラーゼにより認識されうる、そしてそのポリメラーゼが
結合しかくして転写プロセスが開始されるプロモーター
を前記遺伝子の前に挿入した。
ラーゼにより認識されうる、そしてそのポリメラーゼが
結合しかくして転写プロセスが開始されるプロモーター
を前記遺伝子の前に挿入した。
【００８０】細胞の染色体の中に導入されたＤＮＡが安
定に組込まれた細胞を選択することができるように、発
現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする１または
複数のマーカーを用いた。マーカーは、栄養要求性の宿
主に栄養を供給するものでも、たとえば抗生物質、銅な
どの重金属などのような殺細胞物質への抵抗性を提供す
るものであってもよい。
定に組込まれた細胞を選択することができるように、発
現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする１または
複数のマーカーを用いた。マーカーは、栄養要求性の宿
主に栄養を供給するものでも、たとえば抗生物質、銅な
どの重金属などのような殺細胞物質への抵抗性を提供す
るものであってもよい。
【００８１】前記ベクターはレシピエント宿主での自律
的な複製が可能である。
的な複製が可能である。
【００８２】前記発現ベクターを形質転換、トランスフ
ェクション、リポフェクション、コンジュゲーション、
プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸
カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどの
好適な手段によって適切な宿主細胞の中に導入した。
ェクション、リポフェクション、コンジュゲーション、
プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸
カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどの
好適な手段によって適切な宿主細胞の中に導入した。
【００８３】前記ベクターを導入したのち、宿主細胞は
ベクターを含む細胞の成長について選択を行なう選択培
地中で選択した。クローン化された遺伝子配列の発現の
結果、可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質、ムテイ
ン体または断片が産生された。発現されたタンパク質は
ついで単離し、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気
泳動などを含む通例の手法のいずれかによって、または
カラム内に入れたゲルマトリックス上に固定化された抗
−可溶性ＩＦＮＡＲモノクローナル抗体を用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製した。すなわ
ち、可溶性ＩＦＮＡＲを含む粗調製物をカラムにとお
し、ここで可溶性ＩＦＮＡＲが特異的な抗体によりカラ
ムに結合され、一方不純物はカラムを通過した。洗浄の
のち約ｐＨ１１または約ｐＨ２にてゲルからタンパク質
を溶出することにより前記タンパク質を製造した。
ベクターを含む細胞の成長について選択を行なう選択培
地中で選択した。クローン化された遺伝子配列の発現の
結果、可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質、ムテイ
ン体または断片が産生された。発現されたタンパク質は
ついで単離し、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気
泳動などを含む通例の手法のいずれかによって、または
カラム内に入れたゲルマトリックス上に固定化された抗
−可溶性ＩＦＮＡＲモノクローナル抗体を用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製した。すなわ
ち、可溶性ＩＦＮＡＲを含む粗調製物をカラムにとお
し、ここで可溶性ＩＦＮＡＲが特異的な抗体によりカラ
ムに結合され、一方不純物はカラムを通過した。洗浄の
のち約ｐＨ１１または約ｐＨ２にてゲルからタンパク質
を溶出することにより前記タンパク質を製造した。
【００８４】
【発明の効果】本発明によれば、天然に存在するｍＲＮ
Ａからえられる可溶性インターフェロンα−受容体１型
および２型ならびにそれらをコードするＤＮＡ分子を提
供することが可能となる。
Ａからえられる可溶性インターフェロンα−受容体１型
および２型ならびにそれらをコードするＤＮＡ分子を提
供することが可能となる。
【００８５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４３４ 配列の型：アミノ酸 起源：ホモサピエンス 配列 Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala 5 10 15 Val Gly Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu 20 25 30 Lys Ser Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe 35 40 45 Ile Leu Arg Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr 50 55 60 Phe Ser Phe Asp Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys 65 70 75 Leu Ser Gly Cys Gln Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser 80 85 90 Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg 95 100 105 Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe 110 115 120 Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile Gly Pro Pro Glu Val His Leu 125 130 135 Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile His Ile Ser Pro Gly Thr 140 145 150 Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly Leu Ser Phe Thr Tyr 155 160 165 Ser Leu Leu Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val Glu Glu Arg Ile 170 175 180 Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu Ser Pro Glu 185 190 195 Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Trp 200 205 210 Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr Val 215 220 225 Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln 230 235 240 Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met 245 250 255 Thr Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro 260 265 270 Gly Asn His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn 275 280 285 Val Lys Thr Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys 290 295 300 Gly Ile Tyr Leu Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr 305 310 315 Ser Phe Trp Ser Glu Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala 320 325 330 Phe Leu Leu Pro Pro Val Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser 335 340 345 Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro 350 355 360 Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu 365 370 375 Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Lys Lys Thr Asp 380 385 390 Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr Val Tyr Cys Val Lys 395 400 405 Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Lys Leu Asn Lys Ser Ser Val 410 415 420 Phe Ser Asp Ala Val Cys Glu Asn Ile Ser Leu Asn Ser His 425 430
【００８６】配列番号：２ 配列の長さ：４９６ 配列の型：アミノ酸 起源：ホモサピエンス 配列 Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala 5 10 15 Val Gly Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu 20 25 30 Lys Ser Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe 35 40 45 Ile Leu Arg Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr 50 55 60 Phe Ser Phe Asp Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys 65 70 75 Leu Ser Gly Cys Gln Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser 80 85 90 Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg 95 100 105 Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe 110 115 120 Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile Gly Pro Pro Glu Val His Leu 125 130 135 Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile His Ile Ser Pro Gly Thr 140 145 150 Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly Leu Ser Phe Thr Tyr 155 160 165 Ser Leu Leu Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val Glu Glu Arg Ile 170 175 180 Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu Ser Pro Glu 185 190 195 Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Trp 200 205 210 Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr Val 215 220 225 Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln 230 235 240 Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met 245 250 255 Thr Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro 260 265 270 Gly Asn His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn 275 280 285 Val Lys Thr Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys 290 295 300 Gly Ile Tyr Leu Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr 305 310 315 Ser Phe Trp Ser Glu Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala 320 325 330 Phe Leu Leu Pro Pro Val Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser 335 340 345 Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro 350 355 360 Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu 365 370 375 Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Lys Lys Thr Asp 380 385 390 Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr Val Tyr Cys Val Lys 395 400 405 Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Ser Asp Ala Val Cys Glu Tyr 410 415 420 Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu 425 430 435 Glu Gln Ile Glu Lys Cys Phe Ile Ile Glu Asn Ile Ser Thr Ile 440 445 450 Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Asp Glu Asp His Lys Lys 455 460 465 Tyr Ser Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Asn Glu 470 475 480 Asp Glu Ser Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln Gln Asp Phe 485 490 495 Val
【図１】ａ）既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲ、 ｂ）本発明の新規な可溶性（Ｓ）−ドメインをもつ切除
された型のＩＦＮＡＲおよび ｃ）本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ２カ所欠
失された型のＩＦＮＡＲのための、実施例１に記載のｃ
ＤＮＡの概略説明図である。
された型のＩＦＮＡＲおよび ｃ）本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ２カ所欠
失された型のＩＦＮＡＲのための、実施例１に記載のｃ
ＤＮＡの概略説明図である。
【図２】実施例１および２に記載の ａ）既知の膜貫通ＩＦＮＡＲ１型のｃＤＮＡと、 ｂ）本発明の新規なＳ−ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡ
Ｒ１型のｃＤＮＡを比較した概略説明図である。
Ｒ１型のｃＤＮＡを比較した概略説明図である。
【図３】実施例１および２に記載のＵ２６６R 細胞およ
びＵ２６６S 細胞からのＰＣＲ産物のサイズを分析し
た、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲル電
気泳動の結果を示す図である。
びＵ２６６S 細胞からのＰＣＲ産物のサイズを分析し
た、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲル電
気泳動の結果を示す図である。
【図４】既知の膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと、本発明
の新規なＳ−ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲのｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列の一部を比較した図である。
の新規なＳ−ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲのｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列の一部を比較した図である。
【図５】本発明の新規なＩＦＮＡＲ１型のｃＤＮＡに対
するアミノ酸配列を部分的に示す図である。
するアミノ酸配列を部分的に示す図である。
【図６】実施例３に記載の ａ）既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと、 ｂ）本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ可溶性Ｉ
ＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡを比較した概略説明図である。
ＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡを比較した概略説明図である。
【図７】既知の膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと、択一的
にスプライスされた、本発明の短くなったＩＣ´ドメイ
ンをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列の一部を比較した図である。
にスプライスされた、本発明の短くなったＩＣ´ドメイ
ンをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列の一部を比較した図である。
【図８】既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのアミノ酸配列を示
す図である。
す図である。
【図９】実施例３に記載のスプライス欠失された可溶性
ＩＦＮＡＲ１型のアミノ酸配列を示す図である。
ＩＦＮＡＲ１型のアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】実施例３に記載の短くなったＩＣ´ドメイン
をもつ２カ所欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ２型のアミノ
酸配列を示す図である。
をもつ２カ所欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ２型のアミノ
酸配列を示す図である。
【図１１】ａ）実施例４に記載の、ＭｃＡＢ＃１および
ＭｃＡＢ＃２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６
６S 細胞からの総抽出タンパク質のウェスタンイムノブ
ロットの結果を示す図である。 ｂ）実施例４に記載の、ＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ＃
２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６６S 細胞か
らの総抽出タンパク質、可溶性細胞質画分タンパク質、
細胞膜タンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を
示す図である。
ＭｃＡＢ＃２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６
６S 細胞からの総抽出タンパク質のウェスタンイムノブ
ロットの結果を示す図である。 ｂ）実施例４に記載の、ＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ＃
２と反応させたＵ２６６R 細胞およびＵ２６６S 細胞か
らの総抽出タンパク質、可溶性細胞質画分タンパク質、
細胞膜タンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を
示す図である。
【図１２】ａ）実施例５（ａ）に記載の、トランスフェ
クトされたＣＯＳ−７細胞から分泌された組換えにより
製造された可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質のウェスタンブ
ロットの結果を示す図である。 ｂ）実施例５（ａ）に記載の、トランスフェクトされた
ＣＯＳ−７細胞から分泌された、ならびに細胞膜、細胞
内画分（サイトゾル）および細胞核に結合した、組換え
により製造された可溶性のＩＦＮＡＲタンパク質のウェ
スタンブロットの結果を示す図である。
クトされたＣＯＳ−７細胞から分泌された組換えにより
製造された可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質のウェスタンブ
ロットの結果を示す図である。 ｂ）実施例５（ａ）に記載の、トランスフェクトされた
ＣＯＳ−７細胞から分泌された、ならびに細胞膜、細胞
内画分（サイトゾル）および細胞核に結合した、組換え
により製造された可溶性のＩＦＮＡＲタンパク質のウェ
スタンブロットの結果を示す図である。
【図１３】実施例５（ａ）に記載の組換えにより製造さ
れた可溶性ＩＦＮＡＲ１型と放射ラベルされたＩＦＮと
の交差結合し、免疫沈降された産物を分離したＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果を示す図である。
れた可溶性ＩＦＮＡＲ１型と放射ラベルされたＩＦＮと
の交差結合し、免疫沈降された産物を分離したＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/715 8318−4Ｈ (72)発明者 エドワード ラトビツキ イスラエル国、ガン ヤブネ、ムジン ス トリート 22 (72)発明者 マイクル レベル イスラエル国、レホボト、ワイズマン イ ンスティテュート オブ サイエンス、ベ イト ブラジル ５
Claims (18)
- 【請求項１】 哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインタ
ーフェロンα−受容体をコードする単離されたＤＮＡ分
子。 - 【請求項２】 原核細胞または真核細胞宿主での発現に
よるポリペプチド産物をコードする単離されたＤＮＡ分
子であって、該産物が哺乳動物の可溶性、膜非結合型の
インターフェロンα−受容体の一次構造コンフォーメー
ションのすべてまたは一部を有しかつ哺乳動物の可溶
性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体の生物学
的活性を有するものであるＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 ａ）哺乳動物の天然インターフェロンα
−受容体遺伝子のコード領域に由来するヌクレオチド配
列を有するｃＤＮＡクローン、 ｂ）前記ａ）のクローンとハイブリダイズすることがで
き、生物学的に活性な可溶性、膜非結合型のインターフ
ェロンα−受容体をコードするＤＮＡ分子ならびに ｃ）遺伝コードの結果前記ａ）およびｂ）に定義される
ＤＮＡ分子に対して縮重を有し、生物学的に活性な可溶
性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコード
するＤＮＡ分子からなる群より選ばれる請求項１または
２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 配列番号１で示されるスプライス欠失さ
れたインターフェロンα−受容体１型のアミノ酸残基１
〜４３４の配列のすべてまたは一部と実質的に同一なア
ミノ酸配列をコードする請求項１、２または３記載のＤ
ＮＡ分子。 - 【請求項５】 配列番号２で示されるスプライス欠失さ
れたインターフェロンα−受容体２型のアミノ酸残基１
〜４９６の配列のすべてまたは一部と実質的に同一なア
ミノ酸配列をコードする請求項１、２または３記載のＤ
ＮＡ分子。 - 【請求項６】 請求項１、２、３、４または５記載のＤ
ＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクター。 - 【請求項７】 請求項６記載のベクターを含んでなる宿
主細胞を培養することからなる、哺乳動物の可溶性、膜
非結合型のインターフェロンα−受容体またはその類似
体の調製法。 - 【請求項８】 哺乳動物の可溶性、膜非結合型の生物学
的に活性型であるインターフェロンα−受容体、そのム
テイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活
性画分。 - 【請求項９】 ヒトが起源である請求項８記載の型のイ
ンターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タン
パク質、塩、機能性誘導体または活性画分。 - 【請求項１０】 約５５キロダルトンの分子量、および
配列番号１に示されるアミノ酸残基１〜４３４の配列の
すべてまたは一部と約８０％より大きく類似するアミノ
酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェロン
α−受容体１型である請求項９記載の型のインターフェ
ロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、
塩、機能性誘導体または活性画分。 - 【請求項１１】 約９５キロダルトンの分子量、および
配列番号２に示されるアミノ酸残基１〜４９６の配列の
すべてまたは一部と約８０％より大きく類似するアミノ
酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェロン
α−受容体２型である請求項９記載の型のインターフェ
ロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、
塩、機能性誘導体または活性画分。 - 【請求項１２】 希釈剤、担体および／または賦形剤な
らびに有効成分として均質で生物学的に活性な請求項
８、９、１０または１１記載の型のインターフェロンα
−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能
性誘導体または活性画分を含んでなる組成物。 - 【請求項１３】 細胞または組織においてインターフェ
ロン−βおよび／またはインターフェロン−αのサブタ
イプの活性を阻害、変更または修飾するための請求項１
２記載の組成物。 - 【請求項１４】 有効成分として請求項１０記載のイン
ターフェロンα−受容体１型、そのムテイン体、融合タ
ンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有する
請求項１３記載の組成物。 - 【請求項１５】 有効成分として請求項１１記載のイン
ターフェロンα−受容体２型、そのムテイン体、融合タ
ンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有する
請求項１３記載の組成物。 - 【請求項１６】 生体内でまたは生体外でインターフェ
ロン−αまたはインターフェロン−βのサブタイプの種
類を質的および／または量的に診断判定するための請求
項１２、１３、１４または１５記載の組成物。 - 【請求項１７】 請求項１２、１３、１４または１５記
載の組成物および薬学的に許容しうる希釈剤、担体およ
び／または賦形剤から処方された薬剤であって、生体内
でまたは生体外でインターフェロン−αまたはインター
フェロン−βのサブタイプの活性を阻害、変更または修
飾するための薬剤。 - 【請求項１８】 大量のインターフェロン−αおよび／
またはインターフェロン−βが与えられた結果または内
在性に過剰のインターフェロン−αおよび／またはイン
ターフェロン−βが産生された結果もたらされる、イン
ターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−β
の過剰状態を治療するための請求項１７記載の薬剤。
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