JPH07224092A - グルタミン酸遊離阻害活性及びカルシウムチャネル阻害活性を有するペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 グルタミン酸遊離阻害活性および／またはカ
ルシウムチャネル阻害活性を有する新規ペプチドを提供
する。 【構成】 ＦＴＸと呼ばれる蜘蛛の毒液より、４８アミ
ノ酸残基を包含する新規ペプチドを単離した。該ペプチ
ドは、グルタミン酸遊離阻害活性および／またはカルシ
ウムチャネル阻害活性を有し、脳神経系の疾患の予防・
治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グルタミン酸遊離阻害
活性及び／またはカルシウムチャネル阻害活性を有す
る、医薬として有用な新規ペプチドに関する。

【０００２】

【発明の背景及び従来技術】近年興奮性アミノ酸に関す
る研究は、虚血後の遅延性神経細胞壊死および記憶とも
密接に関連しているという点からますます興味深い領域
になっている。特に脳虚血による神経細胞壊死には、神
経終末より遊離されるグルタミン酸が重要な役割を果た
していると考えられており［S.M.Rothman et al., Ann.
Neurol.,19 ,105-111(1986) , D.W.Choi,Neuron, 1 ,62
3-634(1988)]、グルタミン酸レセプターおよびグルタミ
ン酸の遊離の過程に神経終末に存在するＰ型カルシウム
チャネルが重要な役割をしていることが明らかにされ注
目されている［T.J.Turner et al.,Science, 258 ,310-
313(1992)]。

【０００３】カルシウムチャネルには、現在までで４つ
のサブタイプ（Ｔタイプ、Ｌタイプ、Ｎタイプ、Ｐタイ
プ）の存在が知られている[M.Spedding et al.,Pharmac
ol.Rev.,44,363-376(1992)] 。Ｐタイプカルシウムチャ
ネルは、小脳のプルキンエ細胞（purkinje cell)カルシ
ウムチャネルの主たるもので、Ｌタイプカルシウムチャ
ネルブロッカーであるジヒドロピリジン系薬剤及びＮタ
イプカルシウムチャネルブロッカーであるω−コノトキ
シン GVIA(ω−conotoxin GVIA) に抵抗性のあるチャネ
ルとして同定され、現在では、ほとんどすべての神経細
胞にその存在が認められているものである[I.M.Mintz e
t al.,Neuron, 9 ,85-95(1992)] 。１９８９年、このＰ
タイプカルシウムチャネルは、蜘蛛[ funnel web spide
r;Agelenopsis aperta(Spider Pharm)] 由来の毒液（以
下これをＦＴＸと略記する）によって阻害されることが
見いだされた[R.Llinas et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,
86,1689-1693(1989)]。

【０００４】１９９２年Mintz らは、ＦＴＸの成分中か
らＰタイプチャネルを選択的に阻害するペプチドである
ω−アゴトキシン IVA （ω−Agotoxin IVA 以下単に
アゴトキシンと略記する。）がラット神経終末からのカ
ルシウム依存性のグルタミン酸の遊離を抑制することを
明らかにした。更にターナーらは、グルタミン酸の遊離
にＰタイプカルシウムチャネルが重要な役割を果たして
いることを初めて明らかにした[T.J.Turner et al.,Sci
ence,258,310-313(1992)] 。

【０００５】一方、これに先立ち、１９８６年に、やは
りＦＴＸ由来の物質であるω−アガトキシン Ｋ（ω−
アガトキシン ＩＶＢとも呼ばれるアミノ酸配列が決定
され、（US Patent ５１２２５９６）、またこの物質
は、カルシウムチャネルを遮断することが示唆された。
ついで、１９９３年にω−アガトキシン Ｋが、Ｐタイ
プカルシウムチャネルを遮断することが明らかとされた
（L.D. Hirning.et.al.,"Biological Characterrzation
of a P-type Calucium Channel Blocker.ω -Aga-K ，
from Agelenopsis aperta Spider venom.",Society for
Neuroscience,23rd Annual Meeting,Washington,D.C.,
Novenber 7-12,1993）。このＰタイプ選択的阻害作用を
持つアゴトキシンは、脳神経系解明試薬として、更に、
脳疾患治療剤として期待されているが、グルタミン酸阻
害作用を有する物質は知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ＦＴＸ
中のグルタミン酸遊離阻害物質について詳細な検討を行
った結果、アガトキシンと同様の活性を有する新規ペプ
チドを見いだすに至った。従って、本発明の目的は、グ
ルタミン酸遊離阻害活性及び／またはカルシウムチャネ
ル阻害活性が有効な疾患の治療・予防に有用である、新
規ペプチドを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は配列
番号１及び配列番号２記載のアミノ酸配列を含有するペ
プチド並びにこれを有効成分とするグルタミン酸阻害作
用が有効な疾患の予防・治療剤及びカルシウムチャネル
阻害作用が有効な疾患の予防・治療剤を提供するもので
ある。

【０００８】本発明者等は、まず第１にグルタミン酸遊
離を阻害する粗画分ＦＴＸから、活性物質の分離・精製
を試みた。第２にその活性本体の構造解析を行った。そ
の結果、ＦＴＸ中よりラットシナプトソームからのグル
タミン酸の遊離を著明に阻害する活性物質を見いだし、
更に、これが、ラット交感神経節細胞（ＤＲＧニューロ
ン）のカルシウムチャネルを阻害する活性をも有するこ
とを見いだした。本発明者らは、更に該ペプチドの構造
解析を行い、アミノ酸配列を決定し、本発明を完成し
た。

【０００９】本発明にかかるペプチドは、ブラウンリー
RP-4,RP-8,RP-18と同様、既知の方法でＦＴＸから分離
・精製することができる。例えば、疎水性基修飾したシ
リカゲル担体を使用し、濃度勾配のある親水性有機溶媒
で溶出させ、目的画分を集める方法によって行うことが
できる。この場合の疎水性有機溶媒は、通常この分野で
使用し得るあらゆるものが用いられるが、例としては、
メタノール、エタノール、プロピルアルコールなどの低
級脂肪族アルコールや、アセトニトリルの様な低級脂肪
族ニトリルを挙げることができる。また、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水
クロマトグラフィー等で精製することも可能である。こ
のように本発明のペプチドは、ＦＴＸを原料として、分
離、精製することによって製造することも可能である。
更に、既知の方法による遺伝子組み換え技術によって製
造してもよいし、従来用いられているペプチドの合成技
術を用いても得ることができる。

【００１０】分離・精製における目的画分の追跡は、調
製したシナプトソームからのカルシウム依存性のグルタ
ミン酸の遊離を抑制する活性を指標にして行えばよい。
すなわち、後述実施例に示される様に、検体にラット前
脳からのシナプトソーム画分、ＮＡＤＰ⁺ およびグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと略記する。）を
添加し、３７℃で２０分間インキュベート後、３０ｍＭ
塩化カリウムで脱分極させ、シナプトソームから遊離さ
れるグルタミン酸によって精製されるＮＡＤＰＨとして
測定するものである。

【００１１】次に、本発明のペプチドの有する第２の活
性である、カルシウムチャネル阻害活性の測定について
説明する。具体的には、後述の実施例に示された如く、
電気生理学的手法を用いたアッセイ系により行えばよ
い。すなわち、神経細胞として、ラット後根神経節（do
rsal root ganglion：ＤＲＧ）ニューロンを用い、これ
を調製培養し、パッチクランプ(patch-clamp) 法を用い
て、電位固定を行うことにより、全細胞(whole-cell)カ
ルシウム電流を測定することにより行うことができる。

【００１２】電位固定の条件は、検出したいサブタイプ
のカルシウム電流が最も大きく検出できる電位に固定す
ればよい。すなわち、保持電位−８０ミリボルトから試
験電位−２０ミリボルトまで２００ミリ秒で行う電位固
定を、０．１ヘルツの頻度で行えばよい。検体は、急速
灌流システムにより細胞外液から添加し、その時に変化
するカルシウム電流を観察する。

【００１３】本発明のペプチドの構造解析は、通常の方
法で行うことができるが、例えば、アミノ酸配列自動分
析装置を使用し、エドマン分解法によるＮ末端からの逐
次分解、酵素消化ペプチドのアミノ酸配列分析並びにカ
ルボキシペプチダーゼを用いたＣ末端アミノ酸分析など
を組み合わせることにより行うことができる。この結果
を配列番号１及び配列番号２に示した。

【００１４】本発明にかかるペプチドを医薬として使用
する場合は、非経口投与により投与されるが、通常は、
注射剤などとして投与される。投与量は、症状の程度、
患者の年齢、性別、体重、薬剤に対する感受性差、投与
の時期、投与の間隔、医薬製剤の性質などによって異な
り、特に限定されないが、通常成人１回０．１μｇ／ｋ
ｇ〜３００μｇ／ｋｇが好ましい。

【００１５】注射剤を調製する場合には、主薬に必要に
よりｐＨ調製剤、緩衝剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定
化剤、等張化剤、保存剤などを添加し、常法により静
脈、皮下、筋肉内注射剤とする。その際必要により、常
法により凍結乾燥物とすることも可能である。

【００１６】懸濁化剤としての例を挙げれば、メチルセ
ルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセル
ロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート等を挙げることができる。

【００１７】溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン
酸アミド、ポリオキシエチレンソルベタンモノラウレー
ト、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を
挙げることができる。

【００１８】また安定化剤としては例えば、亜硫酸ナト
リウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテルなどが、保存
剤としては、例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオ
キシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾ
ール、クロロクレゾール等を挙げることができる。

【００１９】

【実施例】本発明を更に詳述するために、以下に本発明
の実施例を掲げるが、本発明は、これに限定されないこ
とは言うまでもない。

【００２０】実施例１ （１） 本発明にかかるペプチドの精製 ＦＴＸ２０μｌに１％トリフルオロ酢酸２μｌを加え酸
性とした後、これを高速クロマトグラフィーに供し、
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したブラウン
リーＲＰ−８カラム（４．６mm径×２５cm長）に吸着さ
せた。溶出は、同溶液と６０％アセトニトリル水溶液に
よる濃度勾配溶出法により活性成分を溶出した。以下に
示した図１はその溶出パターンであり、横軸は濃度勾配
溶出後の経過時間、縦軸は、吸光度を示した。図１で黒
く塗りつぶしたグルタミン酸遊離阻害活性を有する画分
を集め、凍結乾燥により溶媒を除去した。

【００２１】次いで、上記活性画分を１％トリフルオロ
酢酸水溶液で平衡化したスフェリソルブＣ８カラム
（４．６mm径×１５cm長）に吸着させ、同溶液と６０％
アセトニトリル水溶液による濃度勾配溶出法により活性
成分を溶出した。本発明のグルタミン酸遊離阻害活性を
有する物質は、以下に示す図１の溶出パターンのうち、
黒く塗りつぶすことによって示した位置に溶出された。
得られた物質についてレザーデソープション飛行時間型
質量分析計により測定を行ったところ、分子量約５３０
０ダルトンの単一成分として認められた。以下の表１に
この単一成分のアミノ酸組成を示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】（２） 構造解析 上記方法で得られたペプチド約５００ピコモルを用いて
気相プロテインシークエンサー（島津製作所製）によ
り、アミノ末端側からのアミノ酸配列解析を行った。そ
の結果、配列番号２に示す様にペプチドのアミノ酸の配
列を決定した。以上の如く単離精製ならびに構造解析を
行い、本発明にかかるペプチドが得られたことを確認し
た。

【００２４】実施例２ グルタミン酸遊離阻害活性

【００２５】ｉ）実験方法 本発明にかかるペプチドのグルタミン酸の遊離阻害活性
をみるために、以下の方法で実験した。蛍光測定用９６
穴マイクロプレートの各ウェルに実施例１で得られたペ
プチドおよび以下の方法で調製したシナプトソームを８
０μｌ（終濃度 １．４mg protein /ml ）添加し、更
に、１ｍＭ ＮＡＤＰ⁺ 、５０Ｕ ＧＤＨを加え、最終
容量２００μｌとして、３７℃で２０分間インキュベー
トした。なおカルシウム添加試料には１．３ｍＭとなる
ように塩化カルシウムを更に添加し、カルシウム無添加
試料には、０．２ｍＭ ＥＧＴＡを添加した。

【００２６】次に、３０ｍＭ塩化カリウムを加え脱分極
させ、その１０分後に９６穴マイクロプレート用自動蛍
光光度計（タイターテック フルオロスキャンII 大日
本製薬株式会社）を用いて、３５５ｎｍで励起し、４６
０ｎｍでの相対蛍光強度を測定した。実験系において、
カルシウム添加試料とカルシウム無添加試料０．２ｍＭ
ＥＧＴＡとの蛍光値の差が、カルシウム依存性のグル
タミン酸の遊離量となるため、検体のグルタミン酸遊離
の阻害率は、下記に示した数式により算定した。

【００２７】

【数１】

【００２８】シナプトソーム画分の調製 調製は、常法[E.G.Gray et al.,J.Anat.,96,79-88(196
2)]に従った。なおシナプトソームの調製に使用する溶
液は、すべて実験使用前に９５％Ｏ₂ ＋５％ＣＯ₂ 混合
ガスで十分飽和させたものを用いた。

【００２９】６週令のウィスター系雄性ラットを屠殺し
た後、速やかに脳を摘出し、冷カルシウムフリー タイ
ロード溶液［組成（ｍＭ）：NaCl 140,KCl 5,MgCl₂ 1,D
-glucose 24,Na-HEPES 10,pH 7.4] で冷却し、下丘と小
脳の間で２分し、その前脳を用いた。脳組織に２０倍容
量の０．３２Ｍショ糖液を加え、ガラスホモジナイザー
で氷冷下ゆっくりとホモジナイズした。１０００×ｇ、
４℃で１０分間遠心後その上清を２００００×ｇ、４℃
で２０分間遠心した。沈渣に、カルシウムフリータイロ
ード溶液を加え、攪拌後、再び２００００×ｇ、４℃で
２０分間遠心した。沈渣にカルシウムフリー タイロー
ド溶液を加え、３．５mg protein/ml の濃度に懸濁させ
た。これに１００μＭとなるように塩化カルシウムを添
加したカルシウム添加試料並びに塩化カルシウムを添加
しないカルシウム無添加試料を調製し、それぞれ３７℃
で１時間インキュベートした。

【００３０】ii）実験結果 上記の方法で行った結果を表１に示した。精製したペプ
チドは、ＦＴＸ換算で１００００倍希釈液及び１０００
倍希釈液相当濃度において、カルシウム依存性グルタミ
ン酸の遊離を著明に抑制し、その抑制は、濃度依存的で
あった。

【００３１】

【表２】

【００３２】実施例３ カルシウムチャネル阻害活性 ｉ）実験方法 ラットＤＲＧニューロンのカルシウムチャネルに対する
薬物の作用をみるために、以下の方法によって得られた
ＤＲＧニューロンのカルシウムチャネルを通るバリウム
電流を指標として検出した。記録用電極としては、５〜
１０メガオームのガラスピペットを用いた。また、細胞
内液には、［組成（ｍＭ）：ＣｓＣｌ１３０，ＭｇＣｌ
₂ １，ＡＴＰ−Ｎａ₂ ５，ＥＧＴＡ １，Ｃｓ−Ｈ
ＥＰＥＳ ５；ｐＨ ７．２］のものを用い、細胞外液
には、［組成（ｍＭ）：ＴＥＡ−Ｃｌ １３５，ＢａＣ
ｌ₂ １０，Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ ２４，Ｃｓ−ＨＥＰ
ＥＳ １０；ｐＨ ７．４］のものを用いた。実験は、
２３〜２５℃で行い、薬物は、実施例１で得られた本発
明にかかるペプチドのＦＴＸ換算で１００００倍希釈液
相当の濃度のもの、３３３３倍希釈液相当の濃度のも
の、ニフェジピン１０μＭ＋ω−コノトキシン３μＭの
順で、急速灌流システムより累積的に添加した。

【００３３】パッチクランプの装置としては、Ａｘｏｐ
ａｔｃｈ−１Ｄを用い、電流電圧シグナルは、ビデオテ
ープ上にＰＣＭ方式で記録した。またデータは、Ａ−Ｄ
／Ｄ−Ａコンバーター（ＴＬ−１ ＤＭＡ Ｉｎｔｅｒ
ｆａｃｅ）を介し、コンピューター（Ｄｅｓｋｐｒｏ
３８６ｓ）上に記録し、実験終了後解析した。

【００３４】実験の最後に、１ｍＭ 塩化カドミウムを
処置して、カルシウム電流を抑制し、リーク電流及びキ
ャパシティブ電流を求め、これらの電流をもとの電流か
ら差し引くことによりカルシウム電流とした。電位固定
は、０．１ヘルツの頻度で、保持電位−８０ミリボルト
から試験電位−２０ミリボルトへ２００ミリ秒の脱分極
をかけた。

【００３５】ＤＲＧニューロンの調製培養 ウィスター系ラット１７日目胎仔を断頭後速やかにＤＲ
Ｇを摘出し、Ｃａ²⁺，Ｍｇ²⁺フリーハンク塩溶液（C
a²⁺,Mg²⁺ free Hank salt solution(ＣＭＦ−ＨＢＳ
Ｓ））［組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １３７，ＫＣｌ
５．４０，ＫＨ₂ ＰＯ₄０．４４，Ｎａ₂ ＨＰＯ₄
０．３４，ＮａＨＣＯ₃ ４．２０，Ｄ−ｇｌｕｃｏｓ
ｅ ３９］中で氷冷した。次に摘出したＤＲＧを０．０
１％コラーゲナーゼ、０．１％トリプシン含有ＣＭＦ
ＨＢＳＳ 溶液中３７℃で１２分間インキュベートし
た。次いで、ＤＲＧを培地Ａ[Nissui.SFM101培地10% Fe
tal bovine serum（ＦＢＳ）．10% horse serum （Ｈ
Ｓ）含有］に移し、ピペッティングにより細胞をばらば
らにした。

【００３６】更に細胞を２００×ｇ，室温で５分間遠心
後、上清を除去し培地Ａを加え、１×１０⁵ 個／mlとな
るように調製した。この細胞浮遊液に１０μｇ／ml Ｎ
ＧＦを添加し、あらかじめポリリジンで被覆したカバー
ガラスの入った２４穴細胞培養クラスターに５００μｌ
／wellずつ蒔いた。

【００３７】神経細胞を蒔いたクラスターを５％ＣＯ₂
−９５％Ｏ₂ エアインキュベーター中、３７℃で８時間
培養した後、培養液を培地Ｂ［Nissui,SFM101,1% FBS,1
0ng／ml NGF含有］に交換した。培養２日目にＤＮＡ合
成阻害剤である、シトシン−β−Ｄ−アルビノフラノサ
イド（以下Ａｒａ．ｃと記す）を０．２μＭ培養液中に
添加し、更に３日目に０．２μＭ添加することにより、
ニューロン以外の増殖性細胞を除去した。次いで４日後
に培養液の半量を交換し、以後４〜５日間おきに培養液
の半量を交換した。実験には、培養７日目以降の細胞を
用いた。

【００３８】ii) 実験結果 ＤＲＧニューロンは、すべてカルシウムチャネルを発現
していることが知られており、Ｌ型カルシウムチャネル
ブロッカーである、ニフェジピン（１０μＭ）及びＮ型
カルシウムチャネルブロッカーであるω−コノトキシン
（３μＭ）を同時に添加した時に更に、電流が抑制され
たことより、本ペプチドは、Ｐ型カルシウムチャネルを
阻害していることが示唆された。これらの結果を図３に
示した。なお、この図に示したコントロールとは、検体
添加前に、上記条件で脱分極をかけたものを示した。

【００３９】実施例４ カルシウムチャネルサブタイプ
に対する選択性 ｉ）実験方法 Ａ．本願発明にかかるペプチドのＰタイプカルシウムチ
ャネルに対する作用細胞として以下の方法で得られた培
養ラット大脳皮質ニューロンを用いた。電位固定プロト
コールとしては、保持電位−８０ミリボルトから試験電
位−１０ミリボルトへ２００ミリ秒の脱分極条件で膜電
位固定を行い、全細胞カルシウム電流を検出した。この
時の細胞内溶液は、［組成 （ｍＭ）：CsCl(130),MgCl
₂ (1),ATPN a₂(5),EGTA(1),HEPES(5)］であり、水酸化セシウムを加
えてｐＨを７．２に調製したものを用いた。細胞外溶液
としてのバリウム−テトラエチルアンモニウム（ＴＥ
Ａ）溶液は、［組成 （ｍＭ）：TEA-Cl(145),BaCl
₂(5),D-glucose(24),HEPES(10)] であり、テトラエチル
アンモニウム水酸化物を加え、ｐＨ７．４に調製したも
のを用いた。コントロールは検体添加前を示し、検体と
してニフェジピン、ω−コノトキシン及び実施例１で得
られた本発明にかかるペプチドの順番に累積的に添加し
た。図４にはそれぞれの検体投与後の電流波形を示し
た。

【００４０】大脳皮質ニューロンの調製 ラット胎仔（Ｅ１７；ウィスター系；日本チャールスリ
バー）脳から大脳皮質および海馬を分離し、０．２５％
トリプシン−０．２ｎｇ／mlＤＮＡｓｅ−Ｉ中で１５分
間（３７℃）インキュベートした。細胞をパスツールピ
ペットによって単一に分離した後、遠心的に集めた。こ
れを培地Ｃ（ＤＭＥＭ，１０％ＨＳ，１０％ＦＢＳ）で
洗浄した後に、ポリーＬ−リジンでコートしたカバーガ
ラス（直径１３ミリメートル）にまき、培地Ａ中で５−
６時間二酸化炭素インキュベーター（５％二酸化炭素）
中でインキュベートし、細胞接着させた。その後、カバ
ーガラスは培地Ｄ（ＤＭＥＭ、５％Fetal Calf Serum
（ＦＣＳ））中の一層に生育したアストログリア細胞の
上に置き、二酸化炭素インキュベーター中で１４−１７
日間培養した。

【００４１】アストログリア細胞は、ラット新生仔（Ｐ
１；ウィスター系；日本チャールスリバー）の大脳皮質
を培地Ｅ（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ）中に懸濁したもの
を１２ウェルの培養用プレートにまき、１０〜１４日間
培養して、細胞がプレート面を一層に被覆するまで生育
したものを、実験に使用した。

【００４２】Ｂ．本発明にかかるペプチドのＬタイプカ
ルシウムチャネルに対する作用 細胞として以下の方法で得られたＬタイプ発現細胞を用
いた。電位固定プロトコールとしては、保持電位−８０
ミリボルトから試験電位−１０ミリボルトへ２００ミリ
秒の脱分極条件で膜電位固定を行い、全細胞カルシウム
電流を検出した。コントロールは検体添加前を示し、検
体としてニフェジピン、ニフェジピン＋本発明ペプチド
の順番に添加した。図５に電流波形を示した。

【００４３】Ｌタイプカルシウムチャネル発現細胞の調
製 チミジンキナーゼ欠損Baby Hamster Kidney 株（ＢＨＫ
tk−株、Dr.Mulrihill E, ZymoGenetics社，Ｕ．Ｓ．
Ａ．より配布）をＦ２５に２×１０⁵ 個まき、５％ＦＣ
Ｓ含有αＭＥＭ培地（Gibco)で３７℃、１２時間培養し
た。一方、α₁ 、α₂ 、β−サブユニットの３種の発現
プラスミドを各々５μｇずつ混合し、これに蒸留水を加
えて１５０μｌとした。次に緩衝液Ａ(0.5 CaCl₂,0.1M
HEPES,pH7.4)と緩衝液Ｂ(0.28M NaCl,0.05M HEPES,0.75
mM NaH₂PO₄,0.75mMNa₂HPO₄,pH7.4)を加えることによっ
て、ＤＮＡ−リン酸カルシウム複合体を得た。ＤＮＡ−
リン酸カルシウム複合体を上記細胞培養液に１滴ずつ添
加し、３７℃で６時間培養後、グリセロールショックを
与えてから３日間培養し、トリプシン処理をした。

【００４４】トリプシン処理した細胞を薬剤Ｇ４１８
（３００μｇ／ml，Gibco)とＭＸＴ（２５０nM，シグ
マ）含有選択培地にした。約２週間培養した後、１７ク
ローンを拾い、Ｆ７５まで増殖させた後、一部をキャラ
クタリゼーション用に使用した。１７個のクローンにつ
いて、ＤＨＰ結合実験を行ったところ、４個のクローン
（Ｌ５、６、８、１２）について明らかなＤＨＰ結合活
性が認められた。このうち、Ｌ８とＬ１２について電圧
固定実験を行ったところ、Ｌ１２にカルシウムチャネル
活性が認められ、Ｌタイプカルシウムチャネル発現細胞
が選択できた。これを実験に使用した。

【００４５】Ｃ．本発明にかかるペプチドのＮタイプカ
ルシウムチャネルに対する作用 本発明にかかるペプチドのＮタイプに対する作用を調べ
るために、細胞として以下の方法で得られた交感神経節
ニューロンを用いた。電位固定プロトコールは上記同一
条件で行った。コントロールは、ニフェジピン添加後を
示し、検体として以下、本発明ペプチド、コノトキシン
の順番に累積的に添加した。以下の図６に電流波形を示
した。

【００４６】交感神経節ニューロンの調製 ウィスター系ラット１７日目胎仔を断頭後、速やかに交
感神経節を摘出し、以下、上述の実験で使用したＤＲＧ
ニューロンの調製の方法に準じて調製した。なお培養液
中には、ニワトリ胚抽出物２％を添加し、培養３日目に
実験に用いた。またAra.c は添加せず培養した。

【００４７】Ｄ．本発明にかかるペプチドのＴタイプカ
ルシウムチャネルに対する作用 本発明にかかるペプチドのＴタイプに対する作用を調べ
た。細胞として上記実験例２で得られたものと同様のＤ
ＲＧニューロンを用い、電位固定プロトコールは保持電
位−１００ミリボルトから試験電位−７０ミリボルトへ
３００ミリボルトの脱分極条件で全細胞カルシウム電流
を検出した。以下の図７に電流波形を示した。

【００４８】ii) 実験結果 Ａ．図４に、それぞれの検体投与後の電流波形を示し
た。ニフェジピン、ω−コノトキシンとカルシウム電流
は、順番に抑制され、本発明ペプチド１μＭの添加によ
り更にカルシウム電流は抑制された。

【００４９】Ｂ．図５に検体投与後の電流波形を示し
た。本発明ペプチドは１μＭの濃度でＬタイプカルシウ
ム電流を全く抑制しなかった。一方、ニフェジピンは１
μＭの濃度で、このカルシウム電流を完全に抑制した。

【００５０】Ｃ．図６に検体投与後の電流波形を示し
た。本発明ペプチドは１μＭの濃度でＮタイプカルシウ
ム電流を全く抑制しなかった。一方、ω−コノトキシン
は３μＭの濃度で、このカルシウム電流を完全に抑制し
た。

【００５１】Ｄ．図７に検体投与後の電流波形を示し
た。本発明ペプチドは１μＭの濃度で、このカルシウム
電流を全く抑制しなかった。一方、アミロライドは３０
０μＭの濃度でこのカルシウム電流を完全に抑制した。

【００５２】上述の実験からもわかるように、ニフェジ
ピンはＬタイプ、ω−コノトキシンはＮタイプのカルシ
ウム電流を選択的に抑制し、また本発明にかかるペプチ
ドはＬタイプ、Ｎタイプ及びＴタイプ以外のカルシウム
電流を抑制することが明らかとなった。そこで本発明に
かかるペプチドが、選択的にＰタイプカルシウムチャネ
ルのみを抑制するのか、それともＬタイプ、Ｎタイプ及
びＴタイプ以外のカルシウムチャネルを抑制するのか調
べるために、以下の実験を行った。

【００５３】実施例５ カルシウムチャネルＰタイプに対する選択的抑制 ｉ）実験方法 細胞として上記実験例３で得られた大脳皮質ニューロン
を用いた。電位固定プロトコールは保持電位−１００ミ
リボルトから試験電位−７０ミリボルト、３００ミリ秒
の脱分極条件で全細胞カルシウム電流を検出した。コン
トロールは検体添加前を示し、検体として、ニフェジピ
ン＋ω−コノトキシン＋ω−アガトキシン−IVA を添加
した後、本発明にかかるペプチド１μＭを更に添加し
た。結果を図８に電流波形を示した。

【００５４】ii) 実験結果 図８から明らかなように、カルシウム電流は約７０％抑
制されたが、本発明にかかるペプチド１μＭを更に添加
してもカルシウム電流はこれ以上は抑制されなかった。
すなわち、本発明にかかるペプチドは、Ｌタイプを選択
的に抑制するニフェジピン、Ｎタイプを選択的に抑制す
るω−コノトキシンによって抑制されたカルシウム電流
を更に抑制しないことから、本発明にかかるペプチド
は、Ｐタイプを選択的に阻害する活性を有することが明
らかとなった。

【００５５】実施例６ 本発明にかかる２種のペプチドのＰタイプカルシウムチ
ャネルに対する作用の比較 ｉ）実験方法 細胞として、以下の方法で得られた培養ラット小脳プル
キンエ細胞を用いた。電位固定プロトコールは、保持電
位−８０ミリボルトから試験電位−１０ミリボルトま
で、１００ミリ秒の脱分極条件で脱電位固定を行い、全
細胞カルシウム電流を２０秒ごとに検出するというもの
である。このときの細胞内液は、ＣｓＣｌ１３０ｍＭ，
ＭｇＣｌ₂ １ｍＭ，ＡＴＰ−Ｎａ₂ ５ｍＭ，ＢＡＰ
ＴＡ １０ｍＭ，ＨＥＰＥＳ ５ｍＭの組成で、水酸化
セシウムを添加することによって、ｐＨを７．２に調整
したものを用い、細胞外液には、ＴＥＡ−Ｃｌ １４５
ｍＭ，ＢａＣｌ₂ ５ｍＭ，Ｄ−グルコース ２４ｍ
Ｍ，ＨＥＰＥＳ １０ｍＭの組成のもので、テトラエチ
ルアンモニウム水酸化物の添加によって、ｐＨ７．４に
調整したものを用いた。活性測定は、Ｐタイプカルシウ
ムチャネルのみが検出される条件下、すなわち、ニフェ
ジピン３μＭ及びω−コノトキシン３μＭ存在下で行っ
た。なお、本発明にかかる２種のペプチドとして、４６
残基目のセリンがＤ体のものは、実施例１で得たもの
を、また、４６残基目のセリンがＬ体であるペプチド
は、固相合成法により作成したものを用いた。小脳プルキンエ細胞の調整 ラット新生仔（０日目；ウィスター系；日本チャールス
リバー製）脳から小脳を分離し、０．２５％ トリプシ
ン−０．２ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ−Ｉ中で、１５分間
３７℃でインキュベートした。細胞をパスツールピペッ
トでばらばらにした後、２００×ｇで５分間室温により
遠心分離を行った。これによって集められた細胞を培地
Ｆ（ＤＭＥＭ培地、１００ＨＳ、１０％ＦＢＳ及び２０
ｍＭ塩化カリウム含有）で洗浄した後に、あらかじめポ
リ−Ｌ−リジンで被覆されたカバーガラス（直径１３ミ
リメートル）にまいた。これを二酸化炭素インキュベー
ター（５％二酸化炭素）中で２４時間インキュベート
し、細胞を接着させた。その後、細胞が接着したカバー
ガラスを培地Ｇ（ＤＭＥＭ培地、５％ＨＳ及び２０ｍＭ
塩化カリウム含有）中で一層に成育したアストログリア
細胞の上に起き、その状態で、二酸化炭素インキュベー
ター中で１４〜２１日間培養した。なお、上記実験に供
したアストログリア細胞は、ラット新生仔（０日目；ウ
ィスター系；日本チャールスリバー製）の大脳皮質を培
地Ｈ（ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＢＳ含有）中に懸濁した
ものを１２ウェルの培養用プレートにまき、１０〜１４
日間培養し、細胞がプレート面を一層に被覆するまで生
育させたものである。 ii）実験結果 第９図及び第１０図に上記方法により検体投与前及び投
与後のカルシウム電流の大きさを測定した結果を示し
た。第９図から明らかなように、Ｐタイプカルシウム電
流は、４６残基目のセリン残基がＤ体である本発明ペプ
チドの添加より、当該ペプチド濃度０．１μＭで約７０
％、０．３μＭで１００％抑制された。他方、第１０図
から明らかなように、４６残基目のセリン残基がＬ体で
ある本発明にかかる合成ペプチドの添加によるＰタイプ
カルシウム電流の抑制は、当該ペプチド濃度０．３μＭ
で約１０％、１μＭで約７０％に過ぎなかった。この実
験結果より、４６残基目のセリン残基をＬ体で合成した
ペプチドは４６残基目のセリン残基がＤ体であるペプチ
ドに比べ、Ｐ型カルシウムチャネルを阻害する活性が著
しく弱いことが判明した。以上の実験結果より、本発明
にかかるペプチドはグルタミン酸遊離抑制作用およびカ
ルシウムチャネル阻害作用を有することが明らかになっ
た。よって、本発明にかかるペプチドは、グルタミン酸
遊離抑制作用またはカルシウムチャネル阻害作用が有効
な疾患の予防・治療などに用いることができる。具体例
を挙げると、脳虚血やてんかん重積状態等の病態で発生
する急性の脳障害またはアルツハイマー、ハンチントン
舞踏症などの慢性疾患等に代表される脳神経疾患予防・
治療剤として用いることができるほか、脳神経生理の解
明医薬としても非常に有用なものであるということがで
きる。

【００５６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 1 5 10 15 Glu Asp Asn Cys Ile Ala Glu Asp Tyr Gly Lys Cys Thr Trp Gly 20 25 30 Gly Thr Lys Cys Cys Arg Gly Arg Pro Cys Arg Cys Ser Met Ile 35 40 45 Gly Thr Asn Cys Glu Cys Thr Pro Arg Leu Ile Met Glu Gly Leu 48 Ser Phe Ala 配列番号：２ 配列の長さ：４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 1 5 10 15 Glu Asp Asn Cys Ile Ala Glu Asp Tyr Gly Lys Cys Thr Trp Gly 20 25 30 Gly Thr Lys Cys Cys Arg Gly Arg Pro Cys Arg Cys Ser Met Ile 35 40 45 Gly Thr Asn Cys Glu Cys Thr Pro Arg Leu Ile Met Glu Gly Leu 48 D-Ser Phe Ala

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明にかかるペプチドの第１段階精製クロ
マトパターンを示す。縦軸の吸光度は、２７９nmで測定
しており、１．０ＡｕＦＳで示してある。

【図２】 本発明にかかるペプチドの第２段階精製クロ
マトパターンを示す。

【図３】 本発明にかかるペプチドのカルシウムチャネ
ル阻害活性を示す。

【図４】 ニフェジピン、ω−コノトキシン、本発明に
かかるペプチドの順に添加した時の、培養ラット大脳皮
質ニューロンの全細胞カルシウム電流を示す。

【図５】 本発明にかかるペプチドまたはニフェジピン
を添加した時のＬタイプ発現細胞の全細胞カルシウム電
流を示す。

【図６】 ニフェジピン、本発明にかかるペプチド、ω
−コノトキシンの順に添加した時の、培養ラット交感神
経節ニューロンの全細胞カルシウム電流を示す。

【図７】 本発明にかかるペプチドまたはアミロライド
を添加した時の、ＤＥＧニューロンの全細胞カルシウム
電流を示す。

【図８】 ニフェジピン、ω−コノトキシン、ω−Aga-
IVA および本発明にかかるペプチドを添加した時の、大
脳皮質ニューロンの全細胞カルシウム電流を示す。

【図９】 本発明にかかるペプチドのうち４６残基目の
セリンがＤ体のペプチドのカルシウムチャネル阻害活性
を示す。

【図１０】 本発明にかかるぺぷちどのうち４６残基目
のセリンがＬ体のペプチドのカルシウムチャネル阻害活
性を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１記載のアミノ酸配列を含有す
   るペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号２記載のアミノ酸配列を含有す
   るペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１及び請求項２記載のアミノ酸配
   列を含有するペプチドを有効成分とするグルタミン酸遊
   離阻害作用が有効な疾患の予防・治療剤。
4. 【請求項４】 請求項１及び請求項２記載のアミノ酸配
   列を含有するペプチドを有効成分とするカルシウムチャ
   ネル阻害作用が有効な疾患の予防・治療剤。
5. 【請求項５】 請求項１及び請求項２記載のアミノ酸配
   列を含有するペプチドを有効成分とするカルシウムチャ
   ネルＰタイプ選択的阻害作用が有効な疾患の予防・治療
   剤。