JPH0720998B2 - 膵腺からのグルカゴンの回収法 - Google Patents
膵腺からのグルカゴンの回収法Info
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- JPH0720998B2 JPH0720998B2 JP61152589A JP15258986A JPH0720998B2 JP H0720998 B2 JPH0720998 B2 JP H0720998B2 JP 61152589 A JP61152589 A JP 61152589A JP 15258986 A JP15258986 A JP 15258986A JP H0720998 B2 JPH0720998 B2 JP H0720998B2
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- carrier
- solution
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 グルカゴンは、29個のアミノ酸からなる小さいポリペプ
チドホルモンである。このホルモンは膵島で合成され、
インシユリンと逆の生物活性を示し、したがつて、グリ
コゲンの分解および新生の両者によつて血中のグルコー
ス濃度がコントロールされている。
チドホルモンである。このホルモンは膵島で合成され、
インシユリンと逆の生物活性を示し、したがつて、グリ
コゲンの分解および新生の両者によつて血中のグルコー
ス濃度がコントロールされている。
豚のグルカゴンのアミノ酸配列はブローマー（Bromer,
W.W.）、シン（Sinn,L.）およびベーレンス（Behrens,
O.K.）によつて決定された〔ジヤーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエテイ（J.Am.Chem.Soc）、79280
1−2805、（1957）〕。その後の研究により、他の哺乳
動物から分離されたグルカゴンも、豚のグルカゴンと同
一であることがわかつた。
W.W.）、シン（Sinn,L.）およびベーレンス（Behrens,
O.K.）によつて決定された〔ジヤーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエテイ（J.Am.Chem.Soc）、79280
1−2805、（1957）〕。その後の研究により、他の哺乳
動物から分離されたグルカゴンも、豚のグルカゴンと同
一であることがわかつた。
グルカゴン（分子量:3485ダルトン）は、膵島のＡ細胞
に於いて、分子量約18,000〜19,000ダルトンと推定され
る前駆体分子から合成される。このプレプロホルモンは
一連のタンパク分解によつてグルカゴンに変換される。
に於いて、分子量約18,000〜19,000ダルトンと推定され
る前駆体分子から合成される。このプレプロホルモンは
一連のタンパク分解によつてグルカゴンに変換される。
市販のグルカゴンは、インシユリン抽出の際の副産物と
して、牛または豚の膵臓から分離されたものである。膵
臓インシユリンの抽出の際、膵臓起源のグルカゴンに豊
んだ塩ケーキを回収することができる。この塩ケーキ
（グルカゴン塩ケーキという）が、本発明方法の出発物
質となる。
して、牛または豚の膵臓から分離されたものである。膵
臓インシユリンの抽出の際、膵臓起源のグルカゴンに豊
んだ塩ケーキを回収することができる。この塩ケーキ
（グルカゴン塩ケーキという）が、本発明方法の出発物
質となる。
発明の要約 即ち、本発明は、膵腺起源のグルカゴンを含有している
グルカゴン塩ケーキからグルカゴンを純化する方法であ
つて、 （１）水混和性の溶媒を含有している水性媒質中に該グ
ルカゴン塩ケーキを溶解し、 （２）このグルカゴン塩ケーキ溶液を、グルカゴンが疎
水性吸着担体に吸着される条件下、約４以下のpHまたは
約7.5以上のpHで、該疎水性吸着担体に接触させ、 （３）水混和性有機溶媒を含んでいる水性溶液で該疎水
性吸着担体からグルカゴンを溶離して第１番目のグルカ
ゴン含有溶液を得、 （４）該疎水性吸着担体から溶離したpH約7.5〜約10.5
のグルカゴン含有溶液を、グルカゴンがアニオン交換担
体に吸着される条件下で該アニオン交換担体と接触さ
せ、 （５）該アニオン交換担体からグルカゴンを溶離して第
２番目のグルカゴン含有溶液を得、そして （６）高められた純度のグルカゴンを回収する、 ことからなる方法を提供するものである。
グルカゴン塩ケーキからグルカゴンを純化する方法であ
つて、 （１）水混和性の溶媒を含有している水性媒質中に該グ
ルカゴン塩ケーキを溶解し、 （２）このグルカゴン塩ケーキ溶液を、グルカゴンが疎
水性吸着担体に吸着される条件下、約４以下のpHまたは
約7.5以上のpHで、該疎水性吸着担体に接触させ、 （３）水混和性有機溶媒を含んでいる水性溶液で該疎水
性吸着担体からグルカゴンを溶離して第１番目のグルカ
ゴン含有溶液を得、 （４）該疎水性吸着担体から溶離したpH約7.5〜約10.5
のグルカゴン含有溶液を、グルカゴンがアニオン交換担
体に吸着される条件下で該アニオン交換担体と接触さ
せ、 （５）該アニオン交換担体からグルカゴンを溶離して第
２番目のグルカゴン含有溶液を得、そして （６）高められた純度のグルカゴンを回収する、 ことからなる方法を提供するものである。
詳細な説明 本発明方法により、グルカゴン塩ケーキから高純度の膵
臓起源のグルカゴンを得ることができる。本発明方法
は、独立し、連続した３つの工程からなり、それらは
（１）疎水性吸着クロマトグラフイー、（２）アニオン
交換クロマトグラフイー、および（３）グルカゴン結晶
化の順に行なわれる。
臓起源のグルカゴンを得ることができる。本発明方法
は、独立し、連続した３つの工程からなり、それらは
（１）疎水性吸着クロマトグラフイー、（２）アニオン
交換クロマトグラフイー、および（３）グルカゴン結晶
化の順に行なわれる。
勿論、疎水性吸着工程は２段階、即ち疎水性吸着担体へ
のグルカゴンの適用段階、および担体からのグルカゴン
の溶離段階を含んでいる。絶対に必要であるということ
ではないが、この疎水性吸着工程の各段階は、異なつた
条件で行なうので好ましい。
のグルカゴンの適用段階、および担体からのグルカゴン
の溶離段階を含んでいる。絶対に必要であるということ
ではないが、この疎水性吸着工程の各段階は、異なつた
条件で行なうので好ましい。
本発明方法で使用される、出発物質としてのグルカゴン
含有物質は、膵臓抽出で得られるグルカゴン塩ケーキで
あるか、類似の処理で得られるグルカゴン含有物質であ
る。本発明に於いては、「グルカゴン塩ケーキ」という
用語は、上記のいずれをも含む広い意味で使用されてい
る。
含有物質は、膵臓抽出で得られるグルカゴン塩ケーキで
あるか、類似の処理で得られるグルカゴン含有物質であ
る。本発明に於いては、「グルカゴン塩ケーキ」という
用語は、上記のいずれをも含む広い意味で使用されてい
る。
疎水性吸着担体は、通常ポリスチレンコポリマー樹脂で
あり、より具体的に言うと、ポリスチレン−ジビニルベ
ンゼン・コポリマー樹脂である。この疎水性吸着担体の
例として、HP20、HP20−SS、XAD樹脂の全て、例えばXAD
−２、XAD4、XAD−７、およびXAD−８が挙げられる。特
に重要な、そして好ましいのはHP20およびHP20−SSであ
り、後者が特に好ましい。
あり、より具体的に言うと、ポリスチレン−ジビニルベ
ンゼン・コポリマー樹脂である。この疎水性吸着担体の
例として、HP20、HP20−SS、XAD樹脂の全て、例えばXAD
−２、XAD4、XAD−７、およびXAD−８が挙げられる。特
に重要な、そして好ましいのはHP20およびHP20−SSであ
り、後者が特に好ましい。
グルカゴン塩ケーキを水性媒質に溶解し、得られた溶液
のpHが約4.0以下、または約7.5以上になる様に調節して
疎水性吸着担体に適用する。
のpHが約4.0以下、または約7.5以上になる様に調節して
疎水性吸着担体に適用する。
必ずしも絶対に必要ではないが、この様なpHに維持する
緩衝能力のある塩を添加して、選択したpHを保持しても
よい。この様な緩衝剤の例として、グリシン、トリス、
酢酸ナトリウムなどをあげることができる。緩衝剤を使
用する場合、その非常に好ましいものはグリシンであ
る。
緩衝能力のある塩を添加して、選択したpHを保持しても
よい。この様な緩衝剤の例として、グリシン、トリス、
酢酸ナトリウムなどをあげることができる。緩衝剤を使
用する場合、その非常に好ましいものはグリシンであ
る。
既述した様に、グルカゴン塩ケーキ溶液のpHは約7.5以
上、または約4.0以下に維持する。酸性pHが好ましく、
この範囲内に於いては、約2.0〜約3.6のpHが最も好まし
い。
上、または約4.0以下に維持する。酸性pHが好ましく、
この範囲内に於いては、約2.0〜約3.6のpHが最も好まし
い。
グルカゴン塩ケーキを溶解する目的にのみ使用され、従
つて必ずしも必要ではないが、水混和性の有機溶媒をグ
ルカゴン塩ケーキ−水性混合物に添加してもよい。この
水混和性有機溶媒として使用し得るものの例は、例えば
ニトリル類（アセトニトリルなど）、アルコール類（メ
タノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソ
プロピルアルコールなど）、ケトン類（アセトンな
ど）、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサンな
ど）、アミド類（例えばN,N−ジメチルホルムアミド）
などである。グルカゴン塩ケーキを溶解するのに十分な
量ではあるが、グルカゴンの担体への有効な吸着を減少
させた程多くない量の水混和性有機溶媒を、水性媒質に
添加する。非常に好ましい有機溶媒はアセトニトリルと
エタノールであり、その内最も好ましいのはアセトニト
リルである。アセトニトリルを使用する場合は、吸着さ
れたグルカゴンを連続的に脱着させることなく、グルカ
ゴン塩ケーキを溶解させるに十分な様に、通常約20容量
％を越えない量のアセトニトリルを水性媒質に添加す
る。エタノールを使用する場合、通常その量は、グルカ
ゴンの連続的な脱着をひき起すことなく、約35容量％ま
で増加させることができる。
つて必ずしも必要ではないが、水混和性の有機溶媒をグ
ルカゴン塩ケーキ−水性混合物に添加してもよい。この
水混和性有機溶媒として使用し得るものの例は、例えば
ニトリル類（アセトニトリルなど）、アルコール類（メ
タノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソ
プロピルアルコールなど）、ケトン類（アセトンな
ど）、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサンな
ど）、アミド類（例えばN,N−ジメチルホルムアミド）
などである。グルカゴン塩ケーキを溶解するのに十分な
量ではあるが、グルカゴンの担体への有効な吸着を減少
させた程多くない量の水混和性有機溶媒を、水性媒質に
添加する。非常に好ましい有機溶媒はアセトニトリルと
エタノールであり、その内最も好ましいのはアセトニト
リルである。アセトニトリルを使用する場合は、吸着さ
れたグルカゴンを連続的に脱着させることなく、グルカ
ゴン塩ケーキを溶解させるに十分な様に、通常約20容量
％を越えない量のアセトニトリルを水性媒質に添加す
る。エタノールを使用する場合、通常その量は、グルカ
ゴンの連続的な脱着をひき起すことなく、約35容量％ま
で増加させることができる。
グルカゴン塩ケーキに含まれるグルカゴンが疎水性担体
に吸着されたら、グルカゴンを担体上に残しながら非グ
ルカゴン物質を溶離させる条件下で担体を洗浄してもよ
い。この洗浄用媒質は、水混和性の有機溶媒の量を増加
させるという点で、適用に用いた媒質と異なるのが普通
である。この増加する量は、非グルカゴン物質を溶離す
るには十分であるが、グルカゴンを溶離することはでき
ない量である。例えば、水混和性有機溶媒としてアセト
ンを使用する場合、先ず10％のアセトニトリルを含んで
いる洗浄用媒質を使用し、次いで20％のアセトニトリル
を含んでいるものを使用する。この順序で行なうと、２
番目の洗浄で、例えば副生成物としての膵臓性ポリペプ
チドが溶離される。
に吸着されたら、グルカゴンを担体上に残しながら非グ
ルカゴン物質を溶離させる条件下で担体を洗浄してもよ
い。この洗浄用媒質は、水混和性の有機溶媒の量を増加
させるという点で、適用に用いた媒質と異なるのが普通
である。この増加する量は、非グルカゴン物質を溶離す
るには十分であるが、グルカゴンを溶離することはでき
ない量である。例えば、水混和性有機溶媒としてアセト
ンを使用する場合、先ず10％のアセトニトリルを含んで
いる洗浄用媒質を使用し、次いで20％のアセトニトリル
を含んでいるものを使用する。この順序で行なうと、２
番目の洗浄で、例えば副生成物としての膵臓性ポリペプ
チドが溶離される。
洗浄を行なつた場合、これが終了したら、段階的、直線
的、あるいは段階的および直腺的グラジエント（勾配）
クロマトグラフイーによりグルカゴンを溶離する。グル
カゴンを溶離する際、段階的であれ連続的であれ、溶離
が完了するまで、水性のpHを調節した媒質中に水混和性
有機溶媒の量が増加していく様に、この溶離液の組成を
変える。例えば、アセトニトリルが選択した有機溶媒の
場合、グルカゴンの溶離は、その溶離液の容量組成が約
35％アセトニトリルに達した時に完了する。水混和性の
有機溶媒が、例えばエタノールの場合、有機溶媒の量は
もつと必要になり、通常約55％になるであろう。
的、あるいは段階的および直腺的グラジエント（勾配）
クロマトグラフイーによりグルカゴンを溶離する。グル
カゴンを溶離する際、段階的であれ連続的であれ、溶離
が完了するまで、水性のpHを調節した媒質中に水混和性
有機溶媒の量が増加していく様に、この溶離液の組成を
変える。例えば、アセトニトリルが選択した有機溶媒の
場合、グルカゴンの溶離は、その溶離液の容量組成が約
35％アセトニトリルに達した時に完了する。水混和性の
有機溶媒が、例えばエタノールの場合、有機溶媒の量は
もつと必要になり、通常約55％になるであろう。
本発明の疎水性吸着工程から得たグルカゴン含有溶出液
を、直接または非直接的に第２工程、即ちアニオン交換
クロマトグラフイー工程で処理する。
を、直接または非直接的に第２工程、即ちアニオン交換
クロマトグラフイー工程で処理する。
本発明の第２工程で使用されるアニオン交換クロマトグ
ラフイーの担体は、広範囲の材料から選ばれる。通常、
この担体はDEAE（ジエチルアミノエチル）、QAE（ジエ
チル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル）など
の官能基を含んでいるものである。この様な官能性アニ
オン交換基を含んでいる代表的な担体としては、セフア
デツクス（交差結合したデキストランビーズ）、セファ
ロース（アガロースビーズ）、セフアセル（セルロース
ビーズ）、セルロフアイン（セルロースビーズ）、ワツ
トマン（セルロース）IRA（スチレン−ジビニルベンゼ
ン）、モノビーズ（スチレン−ジビニルベンゼン）、フ
ラクトゲル（ビニルエーテル結合ポリマー）、トリサク
リル（アクリル性トリスポリマー）などが挙げられる。
好ましいアニオン交換担体はDEAE−セフアデツクス、通
常DEAE−セファデックスA25である。
ラフイーの担体は、広範囲の材料から選ばれる。通常、
この担体はDEAE（ジエチルアミノエチル）、QAE（ジエ
チル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル）など
の官能基を含んでいるものである。この様な官能性アニ
オン交換基を含んでいる代表的な担体としては、セフア
デツクス（交差結合したデキストランビーズ）、セファ
ロース（アガロースビーズ）、セフアセル（セルロース
ビーズ）、セルロフアイン（セルロースビーズ）、ワツ
トマン（セルロース）IRA（スチレン−ジビニルベンゼ
ン）、モノビーズ（スチレン−ジビニルベンゼン）、フ
ラクトゲル（ビニルエーテル結合ポリマー）、トリサク
リル（アクリル性トリスポリマー）などが挙げられる。
好ましいアニオン交換担体はDEAE−セフアデツクス、通
常DEAE−セファデックスA25である。
疎水性吸着工程から直接、または非直接的に得られたグ
ルカゴン含有物質を、そのpHを約7.5〜約10.5の範囲に
調節した後、アニオン交換クロマトグラフイー担体に適
用する。このグルカゴン含有混合物の好ましいpHは約8.
0〜約9.0であり、最も好ましくは約8.0〜約8.4である。
通常、この混合物のpHは、緩衝剤を使用して所望のレベ
ルに維持する。広範囲の種類の一般に認められている緩
衝剤を使用することができる。好ましい緩衝剤はトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）である。
ルカゴン含有物質を、そのpHを約7.5〜約10.5の範囲に
調節した後、アニオン交換クロマトグラフイー担体に適
用する。このグルカゴン含有混合物の好ましいpHは約8.
0〜約9.0であり、最も好ましくは約8.0〜約8.4である。
通常、この混合物のpHは、緩衝剤を使用して所望のレベ
ルに維持する。広範囲の種類の一般に認められている緩
衝剤を使用することができる。好ましい緩衝剤はトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）である。
工程２に適用されるグルカゴン含有溶液は、溶解を可能
ならしめる量の水混和性有機溶媒、通常は疎水性吸着工
程からグルカゴンを溶離するのに使用した溶離液中に存
在しているものと同じ溶媒、を含んでいる。従つて、ア
ニオン交換カラムに適用するグルカゴン溶液は、約15％
〜約50％の水混和性有機溶媒、通常はグルカゴン塩ケー
キを溶解するのに使用される溶媒として先に挙げたもの
のいずれか、を含んでいる。好ましい水混和性有機溶媒
はアセトニトリルおよびエタノールであり、最も好まし
いのはアセトニトリルである。
ならしめる量の水混和性有機溶媒、通常は疎水性吸着工
程からグルカゴンを溶離するのに使用した溶離液中に存
在しているものと同じ溶媒、を含んでいる。従つて、ア
ニオン交換カラムに適用するグルカゴン溶液は、約15％
〜約50％の水混和性有機溶媒、通常はグルカゴン塩ケー
キを溶解するのに使用される溶媒として先に挙げたもの
のいずれか、を含んでいる。好ましい水混和性有機溶媒
はアセトニトリルおよびエタノールであり、最も好まし
いのはアセトニトリルである。
アニオン交換カラムに適用した後、有機−水性塩含有溶
離液を用いてグルカゴンを溶離する。代表的な塩はトリ
スであり、イソクラテイツク（同一組成）溶離を行なつ
てもグラジエント溶離を行なつてもよい。塩濃度は、pH
を含む多くの因子によつて変わる。例えば、塩濃度はア
ニオン交換担体からグルカゴンを溶離させるに十分な高
い濃度でなければならず、また、強く結合している不純
物がグルカゴンと共に溶離してこない程十分低濃度でな
ければならない。一般に、塩濃度は約0.02M〜約1Mの範
囲に維持する。グルカゴン含有画分のプールはタンパク
を検出する常法によつて行なう。
離液を用いてグルカゴンを溶離する。代表的な塩はトリ
スであり、イソクラテイツク（同一組成）溶離を行なつ
てもグラジエント溶離を行なつてもよい。塩濃度は、pH
を含む多くの因子によつて変わる。例えば、塩濃度はア
ニオン交換担体からグルカゴンを溶離させるに十分な高
い濃度でなければならず、また、強く結合している不純
物がグルカゴンと共に溶離してこない程十分低濃度でな
ければならない。一般に、塩濃度は約0.02M〜約1Mの範
囲に維持する。グルカゴン含有画分のプールはタンパク
を検出する常法によつて行なう。
本発明方法の第３工程は、高められた純度のグルカゴン
を回収することである。一般に回収は結晶化により行な
い、通常、第２工程から得た溶出液のプールから直接結
晶化させる。グルカゴンの結晶は、単に溶出液を通常約
０℃〜約５℃に冷却することによつて得ることができ
る。しかし、冷却に加えて、pHの選択および溶媒組成に
より結晶化を促進させることができる。即ち、グルカゴ
ン混合物のpHを約7.0〜約8.0、好ましくは約7.2に変
え、水混和性有機溶媒の含量を通常約15容量％以下に減
らすことが好ましい。水混和性有機溶媒の濃度は，例え
ば蒸発、希釈、サイズ・エクスクルージヨン・カラムを
使つた溶媒交換、カチオン交換樹脂からのバツチ式吸着
および脱着、などによつて下げることができる。結晶は
遠心、デカンテーシヨンまたは過などの常法により集
めることができる。通常、得られた結晶を水、希NaCl、
またはエタノールで洗浄し、凍結乾燥する。
を回収することである。一般に回収は結晶化により行な
い、通常、第２工程から得た溶出液のプールから直接結
晶化させる。グルカゴンの結晶は、単に溶出液を通常約
０℃〜約５℃に冷却することによつて得ることができ
る。しかし、冷却に加えて、pHの選択および溶媒組成に
より結晶化を促進させることができる。即ち、グルカゴ
ン混合物のpHを約7.0〜約8.0、好ましくは約7.2に変
え、水混和性有機溶媒の含量を通常約15容量％以下に減
らすことが好ましい。水混和性有機溶媒の濃度は，例え
ば蒸発、希釈、サイズ・エクスクルージヨン・カラムを
使つた溶媒交換、カチオン交換樹脂からのバツチ式吸着
および脱着、などによつて下げることができる。結晶は
遠心、デカンテーシヨンまたは過などの常法により集
めることができる。通常、得られた結晶を水、希NaCl、
またはエタノールで洗浄し、凍結乾燥する。
この様にして得られたグルカゴンは高純度（即ち50％以
上）であり、そのまゝ使用できる。
上）であり、そのまゝ使用できる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 A.工程１ 疎水性吸着による純化 HP−20SS樹脂を、15×100cmのガラスカラムに、床高さ9
0cmまで充填する。全樹脂容量は16lであつた。このカラ
ムをアセトニトリル:0.02Mグリシン（1:9）で平衡化
し、HClでpHを2.8に調節した。グルカゴン塩ケーキ（グ
ルカゴン21.08gを含む3.2kg）を、室温で２時間、アセ
トニトリル:0.02Mグリシン（1:9）（pH2.8）32lに攪拌
しながら溶解した。バルストン（Balston）フイルター
を通し、400ml/分の流速でカラムに入れた。全負荷量は
34lであつた。溶出液からサンプリングし、グルカゴン
が含まれていないことを確認した後捨てた。アセトニト
リル：グリシン（1:9）（pH2.8）18l、次いでアセトニ
トリル：グリシン（2:8）（pH2.8）3lを用い、約400ml/
分の流速でカラムを洗浄した。この最初の洗液は捨て
た。２番目の洗液は膵臓ポリペプチドを含んでいたので
貯蔵した。いずれの洗液にもグルカゴンは含まれていな
かつた。次いでアセトニトリル：グリシン（20:80）か
らなる混合用緩衝液32lとアセトニトリル：グリシン（3
5:65）からなる制限的緩衝液32l（いずれもpH2.8）のグ
ラジエント混合緩衝液を用いた溶離した。バルクフラン
クシヨン24lを集め、次いで３分間フラクシヨン（300ml
/流速（分））を30個集めた（各940ml）。１つおきのフ
ラクシヨンをHPLCで分析し、フランクシヨン10−26を主
要フランクシヨンとしてプールし、フランクシヨン１−
９を副フランクシヨンとしてプールした。アセトニトリ
ル:0.2N水酸化ナトリウム（50:50）70l、次いでアセト
ニトリル：H2O（30:70）4.0lを使つてカラムを再生し
た。グルカゴンのカラム収量は、主プールで14.8g（70.
2％）、副プールで4.1％であつた（分析用HPLCで測
定）。
0cmまで充填する。全樹脂容量は16lであつた。このカラ
ムをアセトニトリル:0.02Mグリシン（1:9）で平衡化
し、HClでpHを2.8に調節した。グルカゴン塩ケーキ（グ
ルカゴン21.08gを含む3.2kg）を、室温で２時間、アセ
トニトリル:0.02Mグリシン（1:9）（pH2.8）32lに攪拌
しながら溶解した。バルストン（Balston）フイルター
を通し、400ml/分の流速でカラムに入れた。全負荷量は
34lであつた。溶出液からサンプリングし、グルカゴン
が含まれていないことを確認した後捨てた。アセトニト
リル：グリシン（1:9）（pH2.8）18l、次いでアセトニ
トリル：グリシン（2:8）（pH2.8）3lを用い、約400ml/
分の流速でカラムを洗浄した。この最初の洗液は捨て
た。２番目の洗液は膵臓ポリペプチドを含んでいたので
貯蔵した。いずれの洗液にもグルカゴンは含まれていな
かつた。次いでアセトニトリル：グリシン（20:80）か
らなる混合用緩衝液32lとアセトニトリル：グリシン（3
5:65）からなる制限的緩衝液32l（いずれもpH2.8）のグ
ラジエント混合緩衝液を用いた溶離した。バルクフラン
クシヨン24lを集め、次いで３分間フラクシヨン（300ml
/流速（分））を30個集めた（各940ml）。１つおきのフ
ラクシヨンをHPLCで分析し、フランクシヨン10−26を主
要フランクシヨンとしてプールし、フランクシヨン１−
９を副フランクシヨンとしてプールした。アセトニトリ
ル:0.2N水酸化ナトリウム（50:50）70l、次いでアセト
ニトリル：H2O（30:70）4.0lを使つてカラムを再生し
た。グルカゴンのカラム収量は、主プールで14.8g（70.
2％）、副プールで4.1％であつた（分析用HPLCで測
定）。
分析用HPLC系では、アセトニトリル:0.1M燐酸塩（30:7
0）（pH2.1）を使い、ソルバツクスC8 150Å（4.1×250
mm）を使用した。検出は214nmで行ない、流速は0.7ml/
分であつた。
0）（pH2.1）を使い、ソルバツクスC8 150Å（4.1×250
mm）を使用した。検出は214nmで行ない、流速は0.7ml/
分であつた。
B.工程２ アニオン交換による純化 0.08Mトリス−アセトニトリル（70:30）中で平衡化した
DEAE−セフアデツクスＡ−25を17.1×40cmのガラスカラ
ムに28cmまで（6.5l）充填し、HClでpH8.0に調節した。
直径50mmの、ねじ山をつけたテフロン製の栓と、溶媒に
耐えるＯ−リングでカラムに栓をし、同じ緩衝液を用
い、N2圧を使つて0.7l/時間の割合で一夜平衡化した。
DEAE−セフアデツクスＡ−25を17.1×40cmのガラスカラ
ムに28cmまで（6.5l）充填し、HClでpH8.0に調節した。
直径50mmの、ねじ山をつけたテフロン製の栓と、溶媒に
耐えるＯ−リングでカラムに栓をし、同じ緩衝液を用
い、N2圧を使つて0.7l/時間の割合で一夜平衡化した。
HP−20SSからの主要プール（14.8l）に10％NaOH（100m
l）を加えてpHを82.5に調節し、流速46ml/分でDEAEカラ
ムに適用した。負荷後カラムをとめ、0.08Mトリス−ア
セトニトリル（70:30）（pH8.0）緩衝液のバツフアーヘ
ツド（１）を入れ、次いでカラムにシールをし、42−
50ml/分の流速で溶離を行なつた。フラクシヨン（各々2
2分間＝1.0〜1.1）を集め、溶出液を波長280nmの紫外
腺検出器ISCOモデルUA−７でモニターした（チヤートス
ピード:1.5cm/時間、感度:2.0）。UVプロフイルからフ
ラクシヨンを選び、分光光度計を使つて276nmでの光学
密度をより正確に測定し、主要フラクシヨン13−24をプ
ールした（12.6l）。このプールから全量13.23gのグル
カゴンを得た（カラムに適用したグルカゴン14.9gの88.
8％）。
l）を加えてpHを82.5に調節し、流速46ml/分でDEAEカラ
ムに適用した。負荷後カラムをとめ、0.08Mトリス−ア
セトニトリル（70:30）（pH8.0）緩衝液のバツフアーヘ
ツド（１）を入れ、次いでカラムにシールをし、42−
50ml/分の流速で溶離を行なつた。フラクシヨン（各々2
2分間＝1.0〜1.1）を集め、溶出液を波長280nmの紫外
腺検出器ISCOモデルUA−７でモニターした（チヤートス
ピード:1.5cm/時間、感度:2.0）。UVプロフイルからフ
ラクシヨンを選び、分光光度計を使つて276nmでの光学
密度をより正確に測定し、主要フラクシヨン13−24をプ
ールした（12.6l）。このプールから全量13.23gのグル
カゴンを得た（カラムに適用したグルカゴン14.9gの88.
8％）。
C.工程３ グルカゴンの結晶化 DEAEの主要プールに1N NaOH430mlを加えてpH10.0に調節
し、ロータリーエバポレーターを使つて10.96lで濃縮し
た。この濃縮したプールを、HEPA−冷蔵室中CUNOフイ
ルター（90SP）を通して過し、1N燐酸2.32lを使つてp
H7.20に調整した。この溶液を３日間４℃に保持する
と、その間に結晶化した。上清をデカントし、結晶スラ
リーを、3000rpmで30分間５℃で遠心した。遠心により
襟結晶を氷冷した精製水で２回洗浄し、精製水に懸濁
し、冷凍し、36時間凍結乾燥した。グルカゴン9.40gを
含んでいる凍結乾燥粉末9.89gを得た。DEAE主要プール
からのグルカゴンの回収率は73.1％であつた。グルカゴ
ン塩ケーキから通算回収率は44.6％であつた。
し、ロータリーエバポレーターを使つて10.96lで濃縮し
た。この濃縮したプールを、HEPA−冷蔵室中CUNOフイ
ルター（90SP）を通して過し、1N燐酸2.32lを使つてp
H7.20に調整した。この溶液を３日間４℃に保持する
と、その間に結晶化した。上清をデカントし、結晶スラ
リーを、3000rpmで30分間５℃で遠心した。遠心により
襟結晶を氷冷した精製水で２回洗浄し、精製水に懸濁
し、冷凍し、36時間凍結乾燥した。グルカゴン9.40gを
含んでいる凍結乾燥粉末9.89gを得た。DEAE主要プール
からのグルカゴンの回収率は73.1％であつた。グルカゴ
ン塩ケーキから通算回収率は44.6％であつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭51−100071（ＪＰ，Ａ) 米国特許4033941（ＵＳ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】膵腺起源のグルカゴンを含んでいるグルカ
ゴン塩ケーキからグルカゴンを純化する方法であつて、 （１）水混和性の溶媒を含有している水性媒質中に該グ
ルカゴン塩ケーキを溶解し、 （２）このグルカゴン塩ケーキ溶液を、グルカゴンか疎
水性吸着担体に吸着される条件下、約４以下のpHまたは
約7.5以上のpHで、該疎水性吸着担体に接触させ、 （３）水混和性有機溶媒を含んでいる水性溶液で該疎水
性吸着担体からグルカゴンを溶離して第１番目のグルカ
ゴン含有溶液を得、 （４）該疎水性吸着担体から溶離したpH約7.5〜約10.5
のグルカゴン含有溶液を、グルカゴンがアニオン交換担
体に吸着される条件下で該アニオン交換担体と接触さ
せ、 （５）該アニオン交換担体からグルカゴンを溶離して第
２番目のグルカゴン含有溶液を得、そして （６）第２番目のグルカゴン含有溶液から、結晶化によ
りグルカゴンを回収する、ことからなる方法。 - 【請求項２】グルカゴン塩ケーキを溶解するための水性
媒質中にグリシンを使用すること、グルカゴン塩ケーキ
溶液のpHが約2.0から約3.6であること、グルカゴン塩ケ
ーキ含有水性媒質中の水混和性有機溶媒が約35容量％を
超えない量のアセトニトリルであること、アニオン交換
担体と接触させるグルカゴン含有溶液のpHが約8.0から
約8.4であること、第２番目のグルカゴン含有溶液から
結晶化によりグルカゴンを回収すること、および第２番
目のグルカゴン含有溶液のpHを約7.0から約8.0の範囲に
することによって該溶液からグルカゴンを結晶化させ
る、ことからなる特許請求の範囲第１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75063685A | 1985-07-01 | 1985-07-01 | |
| US750636 | 1985-07-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS625998A JPS625998A (ja) | 1987-01-12 |
| JPH0720998B2 true JPH0720998B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=25018652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61152589A Expired - Lifetime JPH0720998B2 (ja) | 1985-07-01 | 1986-06-27 | 膵腺からのグルカゴンの回収法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0207727A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0720998B2 (ja) |
| AU (1) | AU587835B2 (ja) |
| CA (1) | CA1284000C (ja) |
| DK (1) | DK301786A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE509028T1 (de) * | 1999-03-15 | 2011-05-15 | Novo Nordisk As | Ionen-austausch-chromatographische trennung von glp-1 und verwandten peptiden |
| US6451987B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of proteins and peptides |
| US6444788B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-09-03 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof |
| EP1664108B1 (en) | 2003-08-21 | 2009-10-14 | Novo Nordisk A/S | Separation of polypeptides comprising a racemized amino acid |
| CN111269308B (zh) * | 2018-12-04 | 2022-09-09 | 联邦生物科技(珠海横琴)有限公司 | 一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4033941A (en) | 1975-12-17 | 1977-07-05 | Eli Lilly And Company | Process for purifying glucagon |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51100071A (en) * | 1975-02-07 | 1976-09-03 | Lilly Co Eli | Gurukagonno kaishuhoho |
-
1986
- 1986-06-23 CA CA000512164A patent/CA1284000C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-25 EP EP86304908A patent/EP0207727A3/en not_active Withdrawn
- 1986-06-26 DK DK301786A patent/DK301786A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-06-27 AU AU59342/86A patent/AU587835B2/en not_active Ceased
- 1986-06-27 JP JP61152589A patent/JPH0720998B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4033941A (en) | 1975-12-17 | 1977-07-05 | Eli Lilly And Company | Process for purifying glucagon |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS625998A (ja) | 1987-01-12 |
| EP0207727A2 (en) | 1987-01-07 |
| DK301786A (da) | 1987-01-02 |
| AU5934286A (en) | 1987-01-08 |
| CA1284000C (en) | 1991-05-07 |
| EP0207727A3 (en) | 1988-09-07 |
| AU587835B2 (en) | 1989-08-31 |
| DK301786D0 (da) | 1986-06-26 |
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