JPH07188288A - ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミド - Google Patents
ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミドInfo
- Publication number
- JPH07188288A JPH07188288A JP5327943A JP32794393A JPH07188288A JP H07188288 A JPH07188288 A JP H07188288A JP 5327943 A JP5327943 A JP 5327943A JP 32794393 A JP32794393 A JP 32794393A JP H07188288 A JPH07188288 A JP H07188288A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- present
- gene
- amino acid
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 配列番号１のアミノ酸配列を有する分子量１
６ｋＤのタンパク質、該タンパク質のアミノ酸配列をコ
ードする領域を含む遺伝子および該遺伝子を含有するプ
ラスミド。 【効果】 ニンジン根部において特異的に存在する本タ
ンパク質を高発現させることにより高タンパク質化ニン
ジンを育種することが可能となる。
６ｋＤのタンパク質、該タンパク質のアミノ酸配列をコ
ードする領域を含む遺伝子および該遺伝子を含有するプ
ラスミド。 【効果】 ニンジン根部において特異的に存在する本タ
ンパク質を高発現させることにより高タンパク質化ニン
ジンを育種することが可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ニンジン根部に特異的
に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子
およびその遺伝子を含有するプラスミドに関するもので
ある。
に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子
およびその遺伝子を含有するプラスミドに関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】植物体の地下部の組織について、芋等の
貯蔵組織における貯蔵タンパク質では、サツマイモ、ジ
ャガイモ等で存在が明かとなっているが、一方根部を食
用としている作物である根菜類、例えばニンジンでは、
この地下組織における貯蔵タンパク質の存在は明かとさ
れていない。
貯蔵組織における貯蔵タンパク質では、サツマイモ、ジ
ャガイモ等で存在が明かとなっているが、一方根部を食
用としている作物である根菜類、例えばニンジンでは、
この地下組織における貯蔵タンパク質の存在は明かとさ
れていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ニンジン根部は、植物
体の生長に従い、肥大する組織であり、その根部組織は
根菜として食用されている。しかしながら、ニンジン根
部にはごくわずかなタンパク質しか含まれていない。こ
のため、ニンジンにおいて日常生活に必要なエネルギー
と栄養素、特に健康維持に欠かせないタンパク質の含量
を高めることが望まれている。そこでニンジン根部にお
いて特異的に存在するタンパク質を高発現させることに
よって、高タンパク質化ニンジンを育種することをめざ
した。このために、あらかじめニンジン根部において特
異的に発現しうるタンパク質およびその遺伝子を明らか
にする必要があった。
体の生長に従い、肥大する組織であり、その根部組織は
根菜として食用されている。しかしながら、ニンジン根
部にはごくわずかなタンパク質しか含まれていない。こ
のため、ニンジンにおいて日常生活に必要なエネルギー
と栄養素、特に健康維持に欠かせないタンパク質の含量
を高めることが望まれている。そこでニンジン根部にお
いて特異的に存在するタンパク質を高発現させることに
よって、高タンパク質化ニンジンを育種することをめざ
した。このために、あらかじめニンジン根部において特
異的に発現しうるタンパク質およびその遺伝子を明らか
にする必要があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような状況下で、本
発明者らは鋭意検討を行った結果、ニンジン根部におい
て特異的に発現しうる可溶性タンパク質を見い出し、該
タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功
した。そして該ｃＤＮＡの塩基配列を解析することによ
って、該タンパク質のアミノ酸配列を決定し、本発明を
完成した。すなわち、本発明は、配列番号１で示される
アミノ酸配列を有する分子量１６ｋＤのタンパク質（以
下、本発明タンパク質と記す。）、該タンパク質のアミ
ノ酸配列をコードする領域を含む遺伝子（以下、本発明
遺伝子と記す。）および該遺伝子を含有するプラスミド
（以下、本発明プラスミドと記す。）を提供するもので
ある。
発明者らは鋭意検討を行った結果、ニンジン根部におい
て特異的に発現しうる可溶性タンパク質を見い出し、該
タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功
した。そして該ｃＤＮＡの塩基配列を解析することによ
って、該タンパク質のアミノ酸配列を決定し、本発明を
完成した。すなわち、本発明は、配列番号１で示される
アミノ酸配列を有する分子量１６ｋＤのタンパク質（以
下、本発明タンパク質と記す。）、該タンパク質のアミ
ノ酸配列をコードする領域を含む遺伝子（以下、本発明
遺伝子と記す。）および該遺伝子を含有するプラスミド
（以下、本発明プラスミドと記す。）を提供するもので
ある。
【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。本
発明で用いられる“遺伝子”とは、たとえばゲノムＤＮ
Ａ、これに対応するｍＲＮＡおよびこれに対応するｃＤ
ＮＡを含めた、遺伝情報を有する対応するすべての核酸
を意味する。そして、本発明遺伝子には、配列番号２で
示される塩基配列以外の塩基配列である、配列番号１で
示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸配
列をコードする領域を含む遺伝子も含まれる。本発明タ
ンパク質は、たとえば「黒田五寸」、「アーリーチャン
テネー」、「インペレーター」、「ナンテススカレーレ
ット」等のニンジン（Daucus carotaL.) の多くの品種
に広く存在しており、しかもその根部に特異的に存在し
ている。分子量は１６ｋＤ（アミノ酸配列に基づいた計
算値は16125.03）である。そして本発明タンパク質の配
列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、たと
えば配列番号２で示される塩基配列を有している。この
ような本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺
伝子を利用することにより、たとえば高タンパク質化ニ
ンジンの育種を可能にし、また本遺伝子を他の根菜類作
物、たとえば、ダイコン、カブ、サトウダイコン、ゴボ
ウ等に導入し、発現させることによりタンパク質を増長
した品種改良を行なうこともできる。さらに、本発明タ
ンパク質をコードする塩基配列およびアミノ酸配列と相
同性の高い遺伝子およびアミノ酸配列を、ＥＭＢＬ、Ｎ
ＢＲＦ等のデータベースで検索することにより、たとえ
ば、（１）病害抵抗性に関与するタンパク質の遺伝子お
よびアミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タン
パク質のアミノ酸配列をコードする領域を含む遺伝子を
用いた通常の遺伝子工学的手法により、病害に抵抗性を
付与する品種改良や病害抵抗性機構の解明、（２）各種
植物ホルモンの変化に対応して発現、誘導されるタンパ
ク質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合に
は、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域
を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、
ストレス応答やホルモン応答を利用した種々の品種改
良、（３）花粉アレルギータンパク質の遺伝子およびア
ミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タンパク質
のアミノ酸配列をコードする領域を含む遺伝子を用いた
通常の遺伝子工学的手法により、花粉の改良、発現量の
抑制等がなされた非アレルギー性の品種改良、（４）ヒ
ートショックタンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列と
相同性が高い場合には、本発明タンパク質のアミノ酸配
列をコードする領域を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子
工学的手法により、有用タンパク質のホールディングを
補助して保存性を向上させたり、有用タンパク質の輸送
を改良させる品種改良に有効に利用できる。
発明で用いられる“遺伝子”とは、たとえばゲノムＤＮ
Ａ、これに対応するｍＲＮＡおよびこれに対応するｃＤ
ＮＡを含めた、遺伝情報を有する対応するすべての核酸
を意味する。そして、本発明遺伝子には、配列番号２で
示される塩基配列以外の塩基配列である、配列番号１で
示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸配
列をコードする領域を含む遺伝子も含まれる。本発明タ
ンパク質は、たとえば「黒田五寸」、「アーリーチャン
テネー」、「インペレーター」、「ナンテススカレーレ
ット」等のニンジン（Daucus carotaL.) の多くの品種
に広く存在しており、しかもその根部に特異的に存在し
ている。分子量は１６ｋＤ（アミノ酸配列に基づいた計
算値は16125.03）である。そして本発明タンパク質の配
列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、たと
えば配列番号２で示される塩基配列を有している。この
ような本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺
伝子を利用することにより、たとえば高タンパク質化ニ
ンジンの育種を可能にし、また本遺伝子を他の根菜類作
物、たとえば、ダイコン、カブ、サトウダイコン、ゴボ
ウ等に導入し、発現させることによりタンパク質を増長
した品種改良を行なうこともできる。さらに、本発明タ
ンパク質をコードする塩基配列およびアミノ酸配列と相
同性の高い遺伝子およびアミノ酸配列を、ＥＭＢＬ、Ｎ
ＢＲＦ等のデータベースで検索することにより、たとえ
ば、（１）病害抵抗性に関与するタンパク質の遺伝子お
よびアミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タン
パク質のアミノ酸配列をコードする領域を含む遺伝子を
用いた通常の遺伝子工学的手法により、病害に抵抗性を
付与する品種改良や病害抵抗性機構の解明、（２）各種
植物ホルモンの変化に対応して発現、誘導されるタンパ
ク質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合に
は、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域
を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、
ストレス応答やホルモン応答を利用した種々の品種改
良、（３）花粉アレルギータンパク質の遺伝子およびア
ミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タンパク質
のアミノ酸配列をコードする領域を含む遺伝子を用いた
通常の遺伝子工学的手法により、花粉の改良、発現量の
抑制等がなされた非アレルギー性の品種改良、（４）ヒ
ートショックタンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列と
相同性が高い場合には、本発明タンパク質のアミノ酸配
列をコードする領域を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子
工学的手法により、有用タンパク質のホールディングを
補助して保存性を向上させたり、有用タンパク質の輸送
を改良させる品種改良に有効に利用できる。
【０００６】本発明タンパク質は、市販されているニン
ジンの多くの品種、例えば「黒田五寸」、「アーリーチ
ャンテネー」、「インペレーター」、「ナンテススカー
レット」等の根部組織に存在し、これらの根部組織より
抽出される可溶性タンパク質の一つである。本発明タン
パク質を分離・精製または検出するには、たとえば以下
の方法をあげることができる。まず、根部組織を市販の
ミキサーや、ワーリングブレンダー等で、リン酸カリウ
ム溶液、ホウ酸ナトリウム溶液等の通常用いられる可溶
性タンパク質抽出バッファーとともに十分に粉砕し、組
織残渣をガーゼによる濾過や10,000rpm 、１０分程度の
遠心分離操作等で除き、本発明タンパク質の粗抽出液を
得る。なお、上記の可溶性タンパク質抽出バッファーに
は、必要に応じてアスコルビン酸や２−メルカプトエタ
ノール等の還元剤を添加してもよい。根部組織から本発
明タンパク質を抽出する際に用いられる可溶性タンパク
質抽出バッファーの量は、たとえば根部組織５ｇに対し
て約１０mlから約１００ml程度、好ましくは約１０mlか
ら約２５mlをあげることができる。得られた本発明タン
パク質の粗抽液は、Centriprep−１０（Amicon製）等を
用いる限外濾過により適宜濃縮することもできる。この
ようにして得られた本発明タンパク質の粗抽出液から本
発明タンパク質を分子量差で分離・精製するには、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Laemmli, U.
K. Nature, 227, 680(1970)) やゲル濾過による液体ク
ロマトグラフィー等による通常の方法を用いることがで
きる。これらの方法を用いると本発明タンパク質は分子
量的に１６ｋＤのサイズに分離される。さらに本発明タ
ンパク質は、ゲル濾過による液体クロマトグラフィー法
で分離・精製した画分や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法でゲル中で分離後切り出した画分等を抗
原として調製したポリクローナル抗体あるいはモノクロ
ーナル抗体を用いる免疫学的方法によって簡単に検出す
ることができる。
ジンの多くの品種、例えば「黒田五寸」、「アーリーチ
ャンテネー」、「インペレーター」、「ナンテススカー
レット」等の根部組織に存在し、これらの根部組織より
抽出される可溶性タンパク質の一つである。本発明タン
パク質を分離・精製または検出するには、たとえば以下
の方法をあげることができる。まず、根部組織を市販の
ミキサーや、ワーリングブレンダー等で、リン酸カリウ
ム溶液、ホウ酸ナトリウム溶液等の通常用いられる可溶
性タンパク質抽出バッファーとともに十分に粉砕し、組
織残渣をガーゼによる濾過や10,000rpm 、１０分程度の
遠心分離操作等で除き、本発明タンパク質の粗抽出液を
得る。なお、上記の可溶性タンパク質抽出バッファーに
は、必要に応じてアスコルビン酸や２−メルカプトエタ
ノール等の還元剤を添加してもよい。根部組織から本発
明タンパク質を抽出する際に用いられる可溶性タンパク
質抽出バッファーの量は、たとえば根部組織５ｇに対し
て約１０mlから約１００ml程度、好ましくは約１０mlか
ら約２５mlをあげることができる。得られた本発明タン
パク質の粗抽液は、Centriprep−１０（Amicon製）等を
用いる限外濾過により適宜濃縮することもできる。この
ようにして得られた本発明タンパク質の粗抽出液から本
発明タンパク質を分子量差で分離・精製するには、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Laemmli, U.
K. Nature, 227, 680(1970)) やゲル濾過による液体ク
ロマトグラフィー等による通常の方法を用いることがで
きる。これらの方法を用いると本発明タンパク質は分子
量的に１６ｋＤのサイズに分離される。さらに本発明タ
ンパク質は、ゲル濾過による液体クロマトグラフィー法
で分離・精製した画分や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法でゲル中で分離後切り出した画分等を抗
原として調製したポリクローナル抗体あるいはモノクロ
ーナル抗体を用いる免疫学的方法によって簡単に検出す
ることができる。
【０００７】本発明遺伝子は、例えばJ.Sambrook、E.F.
Frisch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング
第２版（Molecular Cloning 2nd edition)、コールドス
プリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory)発行、１９８９年等に記載の通常の遺伝
子工学的方法に準じて得られる。具体的にはまず、各種
の植物の植物組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシ
アネート等の強力なタンパク変性剤を含む溶液中で粉砕
し、そして遠心分離操作やフェノール、クロロホルム等
でタンパク質等を除去後、エタノール沈澱等でＲＮＡを
回収する塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェ
ノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の
通常の方法によって全ＲＮＡを抽出する。なお、これら
の方法に基づいたキットとしては、例えばISOGEN（ニッ
ポンジーン製）、Extraction-A-PLANT T M RNA ISOLATI
ON KIT (CLONTECH製))が市販されている。得られた全Ｒ
ＮＡからｍＲＮＡのみを精製するには、ｍＲＮＡのポリ
Ａ鎖とセルロースに結合したオリゴｄＴ鎖とのハイブリ
ダイゼーションを利用したアフィニティークロマトグラ
フィーが有効である。オリゴ（ｄＴ）セルロースは、フ
ァルマシア社やコラボレイティブ社等から市販されてい
る。カラムから抽出されたポリＡ鎖をもつｍＲＮＡはエ
タノール沈澱により回収される。このポリＡ鎖をもつｍ
ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成法としては、たとえば、
ｍＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをポリＡ鎖
にアニールさせ、逆転写酵素により、ファーストストラ
ンドｃＤＮＡを合成し、大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いてＲ
ＮＡ鎖にニックとギャップを入れた後、ＲＮＡの断片を
次のプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを
用いたダブルストランドのｃＤＮＡを合成する、更に
両末端はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化され
る。そして得られたｃＤＮＡはフェノール、クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱等で精製、回収する通常の方法
（Gubler, U, B.J.Hoffman, Gene,25,263(1983) やOkay
ama,H.,P.Berg やMol.Cell.Biol,2,161(1982) 等に記載
されている）をあげることができる。なお、これらの方
法に基づいたキットとしては、例えば、ｃＤＮＡ合成シ
ステム、プラス（アマシャム社製）が市販されている。
このようにして得られたｃＤＮＡは、両平滑末端にＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて適当なリンカーやアダプター
を結合させ、余分な遊離リンカーやアダプターをゲル濾
過法等で分離し、λファージ由来のベクター等の適当な
ベクターアームに連結させる。さらに in vitro パッケ
ージング操作により形成されたファージ粒子を大腸菌に
感染させて培地上でプラークを作らせる。これによりｃ
ＤＮＡライブラリーが作製できる。ｃＤＮＡライブラリ
ーから本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領
域を含むｃＤＮＡクローンを選択するには、λgtIIなど
のベクター系においては本発明タンパク質に対する抗体
によるイムノスクリーニングや、λgt10などのベクター
系においては本発明タンパク質のアミノ酸配列から予想
される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、
これをＲＩや蛍光試薬で標識して得られるプローブを用
いたプラークハイブリダイゼーション等が有効である。
またｃＤＮＡを有するファージのＤＮＡを精製し、ＤＮ
Ａプローグを用いたサザンプロットハイブリダイゼーシ
ョン等でも選択することができる。なお、上記のプロー
ブは、精製した本発明タンパク質をエドマン分解法に基
づいたアミノ酸シークエンサー（例えば、ＡＢＩ製 ア
ミノ酸シークエンサー ４７３Ａ）で解析することによ
りＮ末端側の数＋アミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸
配列情報から考えられる塩基コドンに置きかえる通常の
方法によって作製することができる。このようにして得
られた本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領
域を含むｃＤＮＡクローンは、ＤＮＡ調製や解析が容易
なプラスミドベクター（例えば、市販されるｐＵＣ18）
等にサブクローニングし、プラスミドＤＮＡを調製し、
Maxam Gilbert 法 (Maxam, A.M&W.Gilbert Proc.Natl.A
cad.Sci.,74,560,1977) やSanger法（Sanger,F.&A.R.Co
ulson, J.Mol Biol 94. 441,1975、Sanger, F,& Nickle
n and A.R. Coulson.Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463,197
7) により本発明タンパク質のｃＤＮＡ塩基配列を決定
することができる。
Frisch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング
第２版（Molecular Cloning 2nd edition)、コールドス
プリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory)発行、１９８９年等に記載の通常の遺伝
子工学的方法に準じて得られる。具体的にはまず、各種
の植物の植物組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシ
アネート等の強力なタンパク変性剤を含む溶液中で粉砕
し、そして遠心分離操作やフェノール、クロロホルム等
でタンパク質等を除去後、エタノール沈澱等でＲＮＡを
回収する塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェ
ノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の
通常の方法によって全ＲＮＡを抽出する。なお、これら
の方法に基づいたキットとしては、例えばISOGEN（ニッ
ポンジーン製）、Extraction-A-PLANT T M RNA ISOLATI
ON KIT (CLONTECH製))が市販されている。得られた全Ｒ
ＮＡからｍＲＮＡのみを精製するには、ｍＲＮＡのポリ
Ａ鎖とセルロースに結合したオリゴｄＴ鎖とのハイブリ
ダイゼーションを利用したアフィニティークロマトグラ
フィーが有効である。オリゴ（ｄＴ）セルロースは、フ
ァルマシア社やコラボレイティブ社等から市販されてい
る。カラムから抽出されたポリＡ鎖をもつｍＲＮＡはエ
タノール沈澱により回収される。このポリＡ鎖をもつｍ
ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成法としては、たとえば、
ｍＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをポリＡ鎖
にアニールさせ、逆転写酵素により、ファーストストラ
ンドｃＤＮＡを合成し、大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いてＲ
ＮＡ鎖にニックとギャップを入れた後、ＲＮＡの断片を
次のプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを
用いたダブルストランドのｃＤＮＡを合成する、更に
両末端はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化され
る。そして得られたｃＤＮＡはフェノール、クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱等で精製、回収する通常の方法
（Gubler, U, B.J.Hoffman, Gene,25,263(1983) やOkay
ama,H.,P.Berg やMol.Cell.Biol,2,161(1982) 等に記載
されている）をあげることができる。なお、これらの方
法に基づいたキットとしては、例えば、ｃＤＮＡ合成シ
ステム、プラス（アマシャム社製）が市販されている。
このようにして得られたｃＤＮＡは、両平滑末端にＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて適当なリンカーやアダプター
を結合させ、余分な遊離リンカーやアダプターをゲル濾
過法等で分離し、λファージ由来のベクター等の適当な
ベクターアームに連結させる。さらに in vitro パッケ
ージング操作により形成されたファージ粒子を大腸菌に
感染させて培地上でプラークを作らせる。これによりｃ
ＤＮＡライブラリーが作製できる。ｃＤＮＡライブラリ
ーから本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領
域を含むｃＤＮＡクローンを選択するには、λgtIIなど
のベクター系においては本発明タンパク質に対する抗体
によるイムノスクリーニングや、λgt10などのベクター
系においては本発明タンパク質のアミノ酸配列から予想
される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、
これをＲＩや蛍光試薬で標識して得られるプローブを用
いたプラークハイブリダイゼーション等が有効である。
またｃＤＮＡを有するファージのＤＮＡを精製し、ＤＮ
Ａプローグを用いたサザンプロットハイブリダイゼーシ
ョン等でも選択することができる。なお、上記のプロー
ブは、精製した本発明タンパク質をエドマン分解法に基
づいたアミノ酸シークエンサー（例えば、ＡＢＩ製 ア
ミノ酸シークエンサー ４７３Ａ）で解析することによ
りＮ末端側の数＋アミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸
配列情報から考えられる塩基コドンに置きかえる通常の
方法によって作製することができる。このようにして得
られた本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領
域を含むｃＤＮＡクローンは、ＤＮＡ調製や解析が容易
なプラスミドベクター（例えば、市販されるｐＵＣ18）
等にサブクローニングし、プラスミドＤＮＡを調製し、
Maxam Gilbert 法 (Maxam, A.M&W.Gilbert Proc.Natl.A
cad.Sci.,74,560,1977) やSanger法（Sanger,F.&A.R.Co
ulson, J.Mol Biol 94. 441,1975、Sanger, F,& Nickle
n and A.R. Coulson.Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463,197
7) により本発明タンパク質のｃＤＮＡ塩基配列を決定
することができる。
【０００８】本発明タンパク質ｃＤＮＡからゲノムＤＮ
Ａの塩基配列を決定するには、たとえば葉部、茎部、根
部等の植物組織を液体窒素で瞬時に凍結した後、乳鉢と
乳棒あるいはワーリングブレンダー等を用いて十分に磨
砕して得られた磨砕物から、たとえば渡辺格監修、杉浦
昌弘編集：「クローニングとシークエンス（植物バイオ
テクノロジー実験マニュアル）」、農村文化社、東京
（１９８９年）等に記載の通常の方法に準じて、ゲノム
ＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡは適当な制限
酵素で切断した後、ショ糖密度勾配遠心法や塩化ナトリ
ウム密度勾配遠心法等の公知の方法でＤＮＡ断片を分画
する。この分画されたＤＮＡ断片に対して、本発明タン
パク質のｃＤＮＡをプローブとした通常のサザンハイブ
リダイゼーション法（ゲノミックサザン法）を行ない、
目的とする情報をコードする遺伝子領域を決定する。さ
らにこの遺伝子領域を、市販のプラスミド、ファージ、
コスミド等の適当なベクターにライゲーションすること
によりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。このライ
ブラリーに対して、本発明タンパク質ｃＤＮＡをプロー
ブとして、ハイブリダイゼーションによる通常のスクリ
ーニングを行い、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコ
ードする領域を含むゲノムＤＮＡクローンを取得する。
得られたゲノムＤＮＡクローンは遺伝子配列の解析に適
当なベクター、例えばプラスミド等にサブクローニング
した後、通常の方法に準じて塩基配列を解析することに
より、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領
域を含むゲノムＤＮＡ塩基配列を決定することができ
る。さらにBina-Stem, Met al, Pro. Natl.Acad.Sci.US
A,76,731(1979)や Sollner-Webb & Reeder, R.H.,Cell,
18, 485(1979)等に記載されるプライマーエクステンシ
ョン法またはBerk, A.J.& Sharp,P.A.,Cell,12, 721(19
77) や Berk, A.J.& Sharp, P.A.,Proc.Natl.Acad.Sci
USA, 75,1274(1978)等に記載されるＳ１マッピング法等
により、本発明タンパク質のゲノムＤＮＡの転写開始点
を決定することができる。このようにして決定された転
写開始点の上流には、転写開始に必要なＴＡＴＡ配列が
存在する。通常この転写開始点の上流約１ｋｂから約１
０ｋｂに遺伝子発現の制御を荷負うプロモーター配列が
存在する。本発明遺伝子のプロモーター部位は、本発明
遺伝子のプロモーターが根部において特異的に働くこと
を利用して決定することができる。たとえば、あらかじ
め種々の長さのプロモーター領域を有する遺伝子断片を
ＧＵＳ等のレポーター遺伝子に接続し、これを導入した
トランスジェニック植物を作製し、作製された植物の各
組織におけるレポーター遺伝子の発現有無を調べること
により、本発明遺伝子のプロモーター部位を最終的に決
定することができる。一方、ターミネーター配列は、終
止ユドンの下流の３′末端非翻訳領域に存在するpoly
（Ａ）付加シグナル（AATAAAとコンセンサス配列とす
る）のさらに下流に通常存在するpoly Ａ配列下流に相
当するゲノムＤＮＡ領域に存在し、効率的な転写終結の
機能を有している。
Ａの塩基配列を決定するには、たとえば葉部、茎部、根
部等の植物組織を液体窒素で瞬時に凍結した後、乳鉢と
乳棒あるいはワーリングブレンダー等を用いて十分に磨
砕して得られた磨砕物から、たとえば渡辺格監修、杉浦
昌弘編集：「クローニングとシークエンス（植物バイオ
テクノロジー実験マニュアル）」、農村文化社、東京
（１９８９年）等に記載の通常の方法に準じて、ゲノム
ＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡは適当な制限
酵素で切断した後、ショ糖密度勾配遠心法や塩化ナトリ
ウム密度勾配遠心法等の公知の方法でＤＮＡ断片を分画
する。この分画されたＤＮＡ断片に対して、本発明タン
パク質のｃＤＮＡをプローブとした通常のサザンハイブ
リダイゼーション法（ゲノミックサザン法）を行ない、
目的とする情報をコードする遺伝子領域を決定する。さ
らにこの遺伝子領域を、市販のプラスミド、ファージ、
コスミド等の適当なベクターにライゲーションすること
によりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。このライ
ブラリーに対して、本発明タンパク質ｃＤＮＡをプロー
ブとして、ハイブリダイゼーションによる通常のスクリ
ーニングを行い、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコ
ードする領域を含むゲノムＤＮＡクローンを取得する。
得られたゲノムＤＮＡクローンは遺伝子配列の解析に適
当なベクター、例えばプラスミド等にサブクローニング
した後、通常の方法に準じて塩基配列を解析することに
より、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領
域を含むゲノムＤＮＡ塩基配列を決定することができ
る。さらにBina-Stem, Met al, Pro. Natl.Acad.Sci.US
A,76,731(1979)や Sollner-Webb & Reeder, R.H.,Cell,
18, 485(1979)等に記載されるプライマーエクステンシ
ョン法またはBerk, A.J.& Sharp,P.A.,Cell,12, 721(19
77) や Berk, A.J.& Sharp, P.A.,Proc.Natl.Acad.Sci
USA, 75,1274(1978)等に記載されるＳ１マッピング法等
により、本発明タンパク質のゲノムＤＮＡの転写開始点
を決定することができる。このようにして決定された転
写開始点の上流には、転写開始に必要なＴＡＴＡ配列が
存在する。通常この転写開始点の上流約１ｋｂから約１
０ｋｂに遺伝子発現の制御を荷負うプロモーター配列が
存在する。本発明遺伝子のプロモーター部位は、本発明
遺伝子のプロモーターが根部において特異的に働くこと
を利用して決定することができる。たとえば、あらかじ
め種々の長さのプロモーター領域を有する遺伝子断片を
ＧＵＳ等のレポーター遺伝子に接続し、これを導入した
トランスジェニック植物を作製し、作製された植物の各
組織におけるレポーター遺伝子の発現有無を調べること
により、本発明遺伝子のプロモーター部位を最終的に決
定することができる。一方、ターミネーター配列は、終
止ユドンの下流の３′末端非翻訳領域に存在するpoly
（Ａ）付加シグナル（AATAAAとコンセンサス配列とす
る）のさらに下流に通常存在するpoly Ａ配列下流に相
当するゲノムＤＮＡ領域に存在し、効率的な転写終結の
機能を有している。
【０００９】
【実施例】以上、実施例により詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。
明はこれに限定されるものではない。
【００１０】実施例１ （本発明タンパク質の分離およ
び検出） 市販されるニンジン（品種名：黒田五寸）の根部組織５
ｇに１2.５mlの可溶性タンパク質抽出用バッファー〔0.
１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ8.０）、１ｍＭＥＤＴＡ、
0.１％ アスコルビン酸、0.25％ ２−メルカプトエタ
ノール〕を加えた混合物をワーリングブレンダー（日本
精機製）を用いて、2000ｒｐｍ、氷中、５分間磨砕し
た。得られた磨砕物をガーゼ４枚を用いてろ過し、得ら
れたろ液を遠心分離（10,000ｒｐｍ、１０分、４℃）す
ることにより上清を得た。そして該上清はフィルターろ
過装置〔Centriprep−１０（Amicon製) とウルトラフリ
ーＣＬユニット（Millipore 製) 〕により約１〜２mgタ
ンパク質／mlの濃度まで濃縮された。得られた濃縮物を
試料として、アクリルアミド10-20%の濃度勾配であるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル「ＳＤＳ−ＰＡＧプレー
ト10/20 」（第一化学社製）、０．０６２５Ｍトリス−
塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロー
ル、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブ
ロモフェノールブルー）、泳動バッファー１リットル
（０．０２Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン、０．１％
ＳＤＳ、ｐＨ８．４）、６０ｍＡ定電流，６０ｍｉｎの
条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行なうことにより、各種のタンパク質を分子量的に分離
した。そして分離されたタンパク質は、市販の銀染色用
キットである、2D- 銀染色試薬・II「第一」( 第一化学
社製) を用いて銀染色し、タンパク質の分離パターンを
観察した。その結果を図１に示す。本発明タンパク質は
１６ｋＤａの分子量位置に検出され、その存在割合は目
視により観察した結果、根部組織から抽出された全タン
パク質の約１０％であった。
び検出） 市販されるニンジン（品種名：黒田五寸）の根部組織５
ｇに１2.５mlの可溶性タンパク質抽出用バッファー〔0.
１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ8.０）、１ｍＭＥＤＴＡ、
0.１％ アスコルビン酸、0.25％ ２−メルカプトエタ
ノール〕を加えた混合物をワーリングブレンダー（日本
精機製）を用いて、2000ｒｐｍ、氷中、５分間磨砕し
た。得られた磨砕物をガーゼ４枚を用いてろ過し、得ら
れたろ液を遠心分離（10,000ｒｐｍ、１０分、４℃）す
ることにより上清を得た。そして該上清はフィルターろ
過装置〔Centriprep−１０（Amicon製) とウルトラフリ
ーＣＬユニット（Millipore 製) 〕により約１〜２mgタ
ンパク質／mlの濃度まで濃縮された。得られた濃縮物を
試料として、アクリルアミド10-20%の濃度勾配であるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル「ＳＤＳ−ＰＡＧプレー
ト10/20 」（第一化学社製）、０．０６２５Ｍトリス−
塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロー
ル、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブ
ロモフェノールブルー）、泳動バッファー１リットル
（０．０２Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン、０．１％
ＳＤＳ、ｐＨ８．４）、６０ｍＡ定電流，６０ｍｉｎの
条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行なうことにより、各種のタンパク質を分子量的に分離
した。そして分離されたタンパク質は、市販の銀染色用
キットである、2D- 銀染色試薬・II「第一」( 第一化学
社製) を用いて銀染色し、タンパク質の分離パターンを
観察した。その結果を図１に示す。本発明タンパク質は
１６ｋＤａの分子量位置に検出され、その存在割合は目
視により観察した結果、根部組織から抽出された全タン
パク質の約１０％であった。
【００１１】実施例２ （本発明タンパク質のＮ末端ア
ミノ酸配列の決定） 実施例１で得られたニンジン根部可溶性タンパク質の濃
縮物を、実施例１に記載されたものと同様な電気泳動法
により分離した後、分離されたタンパク質は、Matsudai
ra.P、The Journal of Biological Chemistry (1987)記
載の方法に準じて染色された。すなわち、ゲル中のタン
パク質は、ブロッティングバッファー〔１０ｍＭ ＣＡ
ＰＳ（３−Cyclohexylaminopropane sulfonic acid) −
１０％メタノール （ｐＨ１1.０）〕中で、１００Ｖ、
１時間の条件下で市販のポリビニリデンジフルオリド
（polyvinylidene difluoride)膜にブロッティングさ
れ、0.１％クーマジーブリリアントブル−（ＣＢＢ）Ｒ
２５０／５０％メタノールで染色し、５０％メタノール
−１０％酢酸中で脱色し、タンパク質の分離を行った。
ＣＢＢ試薬で染色されたＰＶＤＦ膜上の本発明タンパク
質のバンドをカッターで切り出し、本発明タンパク質を
回収した。回収された本発明タンパク質のうち、３００
p mole をアミノ酸シークエンサー４７３Ａ（ＡＢＩ
製）を用いてエドマン分解法に準じて、アミノ酸配列を
解析した。この結果を図２に示す。本発明タンパク質の
Ｎ末端に存在する３５個のアミノ酸の配列を決定した。
ミノ酸配列の決定） 実施例１で得られたニンジン根部可溶性タンパク質の濃
縮物を、実施例１に記載されたものと同様な電気泳動法
により分離した後、分離されたタンパク質は、Matsudai
ra.P、The Journal of Biological Chemistry (1987)記
載の方法に準じて染色された。すなわち、ゲル中のタン
パク質は、ブロッティングバッファー〔１０ｍＭ ＣＡ
ＰＳ（３−Cyclohexylaminopropane sulfonic acid) −
１０％メタノール （ｐＨ１1.０）〕中で、１００Ｖ、
１時間の条件下で市販のポリビニリデンジフルオリド
（polyvinylidene difluoride)膜にブロッティングさ
れ、0.１％クーマジーブリリアントブル−（ＣＢＢ）Ｒ
２５０／５０％メタノールで染色し、５０％メタノール
−１０％酢酸中で脱色し、タンパク質の分離を行った。
ＣＢＢ試薬で染色されたＰＶＤＦ膜上の本発明タンパク
質のバンドをカッターで切り出し、本発明タンパク質を
回収した。回収された本発明タンパク質のうち、３００
p mole をアミノ酸シークエンサー４７３Ａ（ＡＢＩ
製）を用いてエドマン分解法に準じて、アミノ酸配列を
解析した。この結果を図２に示す。本発明タンパク質の
Ｎ末端に存在する３５個のアミノ酸の配列を決定した。
【００１２】実施例３ （ニンジン根部ｃＤＮＡライブ
ラリーの作製） 市販されるニンジン（品種名、黒田五寸）の根部組織
（播種後９週目）１０ｇ新鮮重を液体窒素１０ml中で凍
結させた後、木づちで組織をあらかじめ砕き、ワーリン
グブレンダー（日本精機製）を用い、液体窒素を数mlず
つ追加しながら1,500 rpm 、２５分間粉砕し、細かい粉
末にした。液体窒素を気化させた後、市販のＲＮＡ抽出
キット〔Extract-A-PLANT T M RNA ISOLATION KIT(CLO
NTECH 製）〕を用いてＲＮＡ抽出を行い、この抽出液か
らエタノール沈澱により全ＲＮＡを回収し、520 μｇの
全ＲＮＡを得た。得られた全ＲＮＡを市販のOligo dTカ
ラム（５′→３′製）で分画し、4.８μｇのポリＡ Ｒ
ＮＡを得た。該ポリＡ末端ＲＮＡ １μｇから市販のｃ
ＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ合成システムプラス、アマ
シャム製）を用いてｃＤＮＡ合成を行ない、６３ｎｇの
ｃＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡを市販のＴ４ ligase （宝
酒造製）を用いて EcoRI-NotI-BamHI アダプター（宝酒
造製）にライゲーションした後、EcoRI digested λ Z
APII (Stratagene製) と、さらに市販の in vitro パッ
ケージングキット（GIGA PACK II Gold(Stratagene 製)
を用いて Escherichia coli Ｋ−12株由来の XL1-BLUE
株を宿主とする、ラムダファージからなるｃＤＮＡラ
イブラリーを作製した。
ラリーの作製） 市販されるニンジン（品種名、黒田五寸）の根部組織
（播種後９週目）１０ｇ新鮮重を液体窒素１０ml中で凍
結させた後、木づちで組織をあらかじめ砕き、ワーリン
グブレンダー（日本精機製）を用い、液体窒素を数mlず
つ追加しながら1,500 rpm 、２５分間粉砕し、細かい粉
末にした。液体窒素を気化させた後、市販のＲＮＡ抽出
キット〔Extract-A-PLANT T M RNA ISOLATION KIT(CLO
NTECH 製）〕を用いてＲＮＡ抽出を行い、この抽出液か
らエタノール沈澱により全ＲＮＡを回収し、520 μｇの
全ＲＮＡを得た。得られた全ＲＮＡを市販のOligo dTカ
ラム（５′→３′製）で分画し、4.８μｇのポリＡ Ｒ
ＮＡを得た。該ポリＡ末端ＲＮＡ １μｇから市販のｃ
ＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ合成システムプラス、アマ
シャム製）を用いてｃＤＮＡ合成を行ない、６３ｎｇの
ｃＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡを市販のＴ４ ligase （宝
酒造製）を用いて EcoRI-NotI-BamHI アダプター（宝酒
造製）にライゲーションした後、EcoRI digested λ Z
APII (Stratagene製) と、さらに市販の in vitro パッ
ケージングキット（GIGA PACK II Gold(Stratagene 製)
を用いて Escherichia coli Ｋ−12株由来の XL1-BLUE
株を宿主とする、ラムダファージからなるｃＤＮＡラ
イブラリーを作製した。
【００１３】実施例４ （本発明タンパク質のｃＤＮＡ
クローンのスクリーニング） 実施例２で決定された本発明タンパク質のＮ末端アミノ
酸配列をもとにして、予想されるＤＮＡ塩基配列 （１）プローブ１： ５′−GGT GCC CAG AGC CAT GTI CTC GAG ATC ACT TCT TCA GTC TCC GCA GAG AA A ATA TTC AGC GGC ATT GTC CTT GAT GTT GAT ACA GTT ATT CCC AAG GCT GCC CC C −３′ （２）プローブ２（混合プローブ）： ５′−GGG GCG CAG AGG CAC GTG CTC GAG ATC −３′ A を有する２種の合成プローブＤＮＡを合成した。これら
の合成プローブＤＮＡを市販の放射性標識キット（MAGA
LABEL 、宝酒造製) を用いて放射性標識した合成プロー
ブＤＮＡを調製した。宿主であるEscherichia coli Ｘ
ＬＩ−BLUEにファージｃＤＮＡライブラリー5.０×１０
4 pfu を加え、37℃、15分間インキュベートした後、φ
150mm のＮＺＹプレート（１％ＮＺアミン、0.５％ Yea
st Extract、0.５％ ＮａＣｌ、1.５％寒天）にプレー
ティングし、37℃、７時間インキュベートした。プレー
トを４℃、２ｈｒｓ冷却した後、市販のナイロンフィル
ター、Hybord−Ｎ（アマシャム製）にプラークを移し
た。フィルターを風乾後、アルカリ変性液（0.５Ｍ Ｎ
ａＯＨ，1.５Ｍ ＮａＣｌ）２分、中和液（0.５Ｍ Tri
s-ＨＣｌ,pH8.0、1.５ＭＮａＣｌ）２分、３×ＳＳＣ
（0.４５Ｍ ＮａＣｌ、0.105 Ｍ クエン酸ナトリウ
ム）２分の順でフィルターを変性させ、風乾した後、Ｕ
Ｖ光を照射してフィルターのＤＮＡを固定した。ポリエ
チレン袋にフィルター１０枚を入れ、プレハイブリダイ
ゼーションバッファー〔６×ＳＳＣ（0.９Ｍ ＮａＣ
ｌ、0.２１Ｍクエン酸ナトリウム）、５×Denhardt's溶
液（0.１％ フィコール４００、0.１％ポリビニルピロ
リドン、0.１％ＢＳＡ）、0.１％ＳＤＳ，１００μｇ／
ml変性サケ精子ＤＮＡ〕２５mlを加えて、４５℃、２時
間インキュベートした後、プレハイブリダイゼーション
バッファーを捨て、新たに６mlのプレハイブリダイゼー
ションバッファーを加えた。更に前記方法で得られたＲ
Ｉ標識した上記の合成プローグＤＮＡを１０7 ｃｐｍ加
え、４５℃、一晩インキュベートした。フィルターを取
り出して、５０mlの６×ＳＳＣ中で室温、５分間インキ
ュベート、１００mlの６×ＳＳＣ中で室温、５分間イン
キュベート、１００mlの６×ＳＳＣ−１０％ＳＤＳ中で
４５℃、５分間インキュベートの洗浄後、フィルター上
のＲＩ活性により本発明タンパク質のｃＤＮＡを含むプ
ラークが得られた。得られたシグナルプラークは、パス
ツールピペットを用いて５００μｌ ＳＭ（５０ｍＭ
Tris−ＨＣｌ, ｐＨ7.5 、0.１Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ
ＭｇＳＯ4 、0.０１％ゼラチン）と２０μｌクロロホル
ムを含む溶液中に単離した。更にシングルクローンを得
るため、宿主であるEscherichia coli ＸＬＩ−BLUEと
ファージ液１０3 −１０ 2 pfu を混合し、３７℃、１５
分インキュベート後、φ９０mmのＮＺＹプレートにプレ
ーティングし、３７℃、一晩インキュベートしたプレー
トを前記の方法でナイロンメンブレンにトランスファー
し、上記同様の合成プローグＤＮＡを用いたプラークハ
イブリダイゼーション法によって２つの本発明タンパク
質のｃＤＮＡクローンを単離した。
クローンのスクリーニング） 実施例２で決定された本発明タンパク質のＮ末端アミノ
酸配列をもとにして、予想されるＤＮＡ塩基配列 （１）プローブ１： ５′−GGT GCC CAG AGC CAT GTI CTC GAG ATC ACT TCT TCA GTC TCC GCA GAG AA A ATA TTC AGC GGC ATT GTC CTT GAT GTT GAT ACA GTT ATT CCC AAG GCT GCC CC C −３′ （２）プローブ２（混合プローブ）： ５′−GGG GCG CAG AGG CAC GTG CTC GAG ATC −３′ A を有する２種の合成プローブＤＮＡを合成した。これら
の合成プローブＤＮＡを市販の放射性標識キット（MAGA
LABEL 、宝酒造製) を用いて放射性標識した合成プロー
ブＤＮＡを調製した。宿主であるEscherichia coli Ｘ
ＬＩ−BLUEにファージｃＤＮＡライブラリー5.０×１０
4 pfu を加え、37℃、15分間インキュベートした後、φ
150mm のＮＺＹプレート（１％ＮＺアミン、0.５％ Yea
st Extract、0.５％ ＮａＣｌ、1.５％寒天）にプレー
ティングし、37℃、７時間インキュベートした。プレー
トを４℃、２ｈｒｓ冷却した後、市販のナイロンフィル
ター、Hybord−Ｎ（アマシャム製）にプラークを移し
た。フィルターを風乾後、アルカリ変性液（0.５Ｍ Ｎ
ａＯＨ，1.５Ｍ ＮａＣｌ）２分、中和液（0.５Ｍ Tri
s-ＨＣｌ,pH8.0、1.５ＭＮａＣｌ）２分、３×ＳＳＣ
（0.４５Ｍ ＮａＣｌ、0.105 Ｍ クエン酸ナトリウ
ム）２分の順でフィルターを変性させ、風乾した後、Ｕ
Ｖ光を照射してフィルターのＤＮＡを固定した。ポリエ
チレン袋にフィルター１０枚を入れ、プレハイブリダイ
ゼーションバッファー〔６×ＳＳＣ（0.９Ｍ ＮａＣ
ｌ、0.２１Ｍクエン酸ナトリウム）、５×Denhardt's溶
液（0.１％ フィコール４００、0.１％ポリビニルピロ
リドン、0.１％ＢＳＡ）、0.１％ＳＤＳ，１００μｇ／
ml変性サケ精子ＤＮＡ〕２５mlを加えて、４５℃、２時
間インキュベートした後、プレハイブリダイゼーション
バッファーを捨て、新たに６mlのプレハイブリダイゼー
ションバッファーを加えた。更に前記方法で得られたＲ
Ｉ標識した上記の合成プローグＤＮＡを１０7 ｃｐｍ加
え、４５℃、一晩インキュベートした。フィルターを取
り出して、５０mlの６×ＳＳＣ中で室温、５分間インキ
ュベート、１００mlの６×ＳＳＣ中で室温、５分間イン
キュベート、１００mlの６×ＳＳＣ−１０％ＳＤＳ中で
４５℃、５分間インキュベートの洗浄後、フィルター上
のＲＩ活性により本発明タンパク質のｃＤＮＡを含むプ
ラークが得られた。得られたシグナルプラークは、パス
ツールピペットを用いて５００μｌ ＳＭ（５０ｍＭ
Tris−ＨＣｌ, ｐＨ7.5 、0.１Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ
ＭｇＳＯ4 、0.０１％ゼラチン）と２０μｌクロロホル
ムを含む溶液中に単離した。更にシングルクローンを得
るため、宿主であるEscherichia coli ＸＬＩ−BLUEと
ファージ液１０3 −１０ 2 pfu を混合し、３７℃、１５
分インキュベート後、φ９０mmのＮＺＹプレートにプレ
ーティングし、３７℃、一晩インキュベートしたプレー
トを前記の方法でナイロンメンブレンにトランスファー
し、上記同様の合成プローグＤＮＡを用いたプラークハ
イブリダイゼーション法によって２つの本発明タンパク
質のｃＤＮＡクローンを単離した。
【００１４】実施例５ （本発明タンパク質ｃＤＮＡク
ローンのインサートの解析および本発明タンパク質をコ
ードする塩基配列とアミノ酸配列の決定） 実施例４で得られた２つのｃＤＮＡクローンは、J. Sam
brook 、E.F.Fritsch、T.Maniatis著：「Molecular Clo
ning Second Edition」、Cold Spring HarborLaborator
y Press(1989年）に記載されている通常の方法により、
プラスミドベクターpBluescript ＳＫ（−）にサブクロ
ーニングし、プラスミドｃＤＮＡクローンｐＣ１６−１
及びｐＣ１６−２を得た。そして該ｃＤＮＡクローンの
インサートの塩基配列を、Taq Dye Primer Cycle Seque
ncing Kit 及びTaq Dye DeoxyTerminator Cycle Sequen
cing Kit (Applied Biosystems 製) を用いてAppliedBi
osystems製の３７３Ａ ＤＮＡ Sequencerにより決定し
た。ｐＣ１６−１とｐＣ１６−２はいずれも同一塩基配
列のインサートを有していた。このため、これらのプラ
スミドは同一であり、ｐＣ１６と命名した（図３参
照）。なお、ｐＣ１６は、Escherichia coli XL1-BLUE/
pC16(FERM BP-4469)として工業技術院生命工学工業技術
研究所にブダペスト条約下で寄託されている（平成５年
11月17日受託）。インサートのサイズは７３９塩基であ
り（配列番号３参照）、うち１４番目から４７８番目ま
での４６５塩基がニンジン根部に特異的に発現する分子
量１６ｋＤのタンパク質をコードする領域であった。４
７９番目から７１７番目の塩基は３’非翻訳領域であ
り、７１８番目から７３９番目の２２個のアデニンはポ
リＡ末端であることが判明した。さらにニンジン根部に
特異的に発現する分子量１６ｋＤのタンパク質をコード
する領域の塩基配列から該タンパク質の全アミノ酸配列
を決定した（配列番号２参照）。本発明タンパク質は１
５４個のアミノ酸（配列番号１参照）からなり、分子量
は16125.02と計算された。
ローンのインサートの解析および本発明タンパク質をコ
ードする塩基配列とアミノ酸配列の決定） 実施例４で得られた２つのｃＤＮＡクローンは、J. Sam
brook 、E.F.Fritsch、T.Maniatis著：「Molecular Clo
ning Second Edition」、Cold Spring HarborLaborator
y Press(1989年）に記載されている通常の方法により、
プラスミドベクターpBluescript ＳＫ（−）にサブクロ
ーニングし、プラスミドｃＤＮＡクローンｐＣ１６−１
及びｐＣ１６−２を得た。そして該ｃＤＮＡクローンの
インサートの塩基配列を、Taq Dye Primer Cycle Seque
ncing Kit 及びTaq Dye DeoxyTerminator Cycle Sequen
cing Kit (Applied Biosystems 製) を用いてAppliedBi
osystems製の３７３Ａ ＤＮＡ Sequencerにより決定し
た。ｐＣ１６−１とｐＣ１６−２はいずれも同一塩基配
列のインサートを有していた。このため、これらのプラ
スミドは同一であり、ｐＣ１６と命名した（図３参
照）。なお、ｐＣ１６は、Escherichia coli XL1-BLUE/
pC16(FERM BP-4469)として工業技術院生命工学工業技術
研究所にブダペスト条約下で寄託されている（平成５年
11月17日受託）。インサートのサイズは７３９塩基であ
り（配列番号３参照）、うち１４番目から４７８番目ま
での４６５塩基がニンジン根部に特異的に発現する分子
量１６ｋＤのタンパク質をコードする領域であった。４
７９番目から７１７番目の塩基は３’非翻訳領域であ
り、７１８番目から７３９番目の２２個のアデニンはポ
リＡ末端であることが判明した。さらにニンジン根部に
特異的に発現する分子量１６ｋＤのタンパク質をコード
する領域の塩基配列から該タンパク質の全アミノ酸配列
を決定した（配列番号２参照）。本発明タンパク質は１
５４個のアミノ酸（配列番号１参照）からなり、分子量
は16125.02と計算された。
【００１５】実施例６ （本発明タンパク質の組織特異
性発現） 市販されるニンジン（品種名：黒田五寸）の種子を温室
内でポットに播種し、栽培した。播種後、４週目、７週
目、９週目および２１週目毎に植物体を採取し、植物体
を根部（地下部）組織と葉部（地上部）組織に分けてそ
れぞれの組織の全タンパク質を実施例１に記載した同様
な方法で抽出、濃縮後、１レーン当り１μｇのタンパク
質を試料として、実施例１に記載されたものと同様な条
件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うこ
とにより、各種のタンパク質を分子量的に分離し、本発
明タンパク質の発現を比較した。この結果を図４に示
す。４週目の全植物体と７、９、２１週目の根部と葉部
の全タンパク質を比較すると本発明タンパク質の発現が
顕著に異なることがわかる。即ち、本発明タンパク質
は、幼植物体及び各葉部組織では発現しておらず、根部
組織でのみ発現しており、さらに根部組織が生長するの
に伴って全タンパク質に対する割合が増加する貯蔵性の
タンパク質であることが明らかである。
性発現） 市販されるニンジン（品種名：黒田五寸）の種子を温室
内でポットに播種し、栽培した。播種後、４週目、７週
目、９週目および２１週目毎に植物体を採取し、植物体
を根部（地下部）組織と葉部（地上部）組織に分けてそ
れぞれの組織の全タンパク質を実施例１に記載した同様
な方法で抽出、濃縮後、１レーン当り１μｇのタンパク
質を試料として、実施例１に記載されたものと同様な条
件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うこ
とにより、各種のタンパク質を分子量的に分離し、本発
明タンパク質の発現を比較した。この結果を図４に示
す。４週目の全植物体と７、９、２１週目の根部と葉部
の全タンパク質を比較すると本発明タンパク質の発現が
顕著に異なることがわかる。即ち、本発明タンパク質
は、幼植物体及び各葉部組織では発現しておらず、根部
組織でのみ発現しており、さらに根部組織が生長するの
に伴って全タンパク質に対する割合が増加する貯蔵性の
タンパク質であることが明らかである。
【００１６】実施例７ （本発明タンパク質の品種間比
較） 市販されるニンジンの各種品種（品種名：黒田五寸、ア
ーリーチャンテネー、インペレーター、ナンテススカー
レット）の根部組織から実施例１に記載した同様な方法
により全タンパク質を抽出、濃縮後、１レーン当り１μ
ｇのタンパク質を試料として、実施例１に記載されたも
のと同様な条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行なうことにより、各種のタンパク質を分子量的
に分離し、本発明タンパク質の発現を比較した。その結
果を図５に示す。品種の種類に係わらず、本発明タンパ
ク質は全タンパク質の約１０％を占める最も主要なタン
パク質であることがわかった。
較） 市販されるニンジンの各種品種（品種名：黒田五寸、ア
ーリーチャンテネー、インペレーター、ナンテススカー
レット）の根部組織から実施例１に記載した同様な方法
により全タンパク質を抽出、濃縮後、１レーン当り１μ
ｇのタンパク質を試料として、実施例１に記載されたも
のと同様な条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行なうことにより、各種のタンパク質を分子量的
に分離し、本発明タンパク質の発現を比較した。その結
果を図５に示す。品種の種類に係わらず、本発明タンパ
ク質は全タンパク質の約１０％を占める最も主要なタン
パク質であることがわかった。
【００１７】実施例８ （本発明タンパク質の相同性） 実施例５で決定された本発明タンパク質をコードする塩
基配列及びアミノ酸配列と相同性の高い遺伝子及びアミ
ノ酸配列を、データベースＥＭＢＬ及びＮＢＲＦで検索
した結果、本発明遺伝子及びアミノ酸配列は数種の植物
病害抵抗性に関与するタンパク質の遺伝子及びアミノ酸
配列と最も高い相同性を示した（図６参照）。最も相同
性の高かったタンパク質は、ニンジンと同じセリ科のパ
セリのPathogenesis-related Protein (PR-Protein) １
−３、１−１、１−２であった（図参照）。また、マウ
スのヒートショックタンパク質であるＨＳＰ６０の３Ｔ
３−７、３Ｔ３−９、３Ｔ３−Ｍ１クローンのｍＲＮＡ
とも比較的高い相同性が認められた。
基配列及びアミノ酸配列と相同性の高い遺伝子及びアミ
ノ酸配列を、データベースＥＭＢＬ及びＮＢＲＦで検索
した結果、本発明遺伝子及びアミノ酸配列は数種の植物
病害抵抗性に関与するタンパク質の遺伝子及びアミノ酸
配列と最も高い相同性を示した（図６参照）。最も相同
性の高かったタンパク質は、ニンジンと同じセリ科のパ
セリのPathogenesis-related Protein (PR-Protein) １
−３、１−１、１−２であった（図参照）。また、マウ
スのヒートショックタンパク質であるＨＳＰ６０の３Ｔ
３−７、３Ｔ３−９、３Ｔ３−Ｍ１クローンのｍＲＮＡ
とも比較的高い相同性が認められた。
【００１８】
【発明の効果】ニンジン根部において特異的に存在する
本発明タンパク質を高発現させることにより高タンパク
質化ニンジンを育種することが可能となる。
本発明タンパク質を高発現させることにより高タンパク
質化ニンジンを育種することが可能となる。
【００１９】配列番号：１ 配列の長さ：１５４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.) 品種名：黒田五寸 組織の種類：根部（地下部） 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．１５４ 特徴を決定した方法：Ｅ Met Gly Ala Gln Ser His Ser Leu Glu Ile Thr Ser Ser Val Ser Ala 1 5 10 15 Glu Lys Ile Phe Ser Gly Ile Val Leu Asp Val Asp Thr Val Ile Pro 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Gly Ala Tyr Lys Ser Val Asp Val Lys Gly Asp Gly 30 40 45 Gly Ala Gly Thr Val Arg Ile Ile Thr Leu Pro Glu Gly Ser Pro Ile 50 55 60 Thr Ser Met Thr Val Arg Thr Asp Ala Val Asn Lys Glu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Tyr Asp Ser Thr Val Ile Asp Gly Asp Ile Leu Leu Glu Phe Ile Glu 85 90 95 Ser Ile Glu Thr His Met Val Val Val Pro Thr Ala Asp Gly Gly Ser 100 105 110 Ile Thr Lys Thr Thr Ala Ile Phe His Thr Lys Gly Asp Ala Val Val 115 120 125 Pro Glu Glu Asn Ile Lys Phe Ala Asp Ala Gln Asn Thr Ala Leu Phe 130 135 140 Lys Ala Ile Glu Ala Tyr Leu Ile Ala Asn 145 150 154
【００２０】配列番号：２ 配列の長さ：４６５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.) 品種名：黒田五寸 組織の種類：根部（地下部） 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．４６５ 特徴を決定した方法 ATG GGT GCC CAG AGC CAT TCA CTC GAG ATC ACT TCT TCA GTC TCC GCA 48 GAG AAA ATA TTC AGC GGC ATT GTC CTT GAT GTT GAT ACA GTT ATT CCC 96 AAG GCT GCC CCC GGA GCT TAC AAG AGT GTC GAT GTT AAA GGA GAC GGT 144 GGA GCT GGA ACC GTC AGA ATT ATC ACC CTT CCC GAA GGT AGC CCA ATC 192 ACC TCA ATG ACG GTT AGG ACT GAT GCA GTG AAC AAG GAG GCC TTG ACA 240 TAC GAT TCC ACA GTC ATT GAT GGA GAC ATC CTT CTA GAA TTC ATC GAA 288 TCC ATT GAA ACC CAT ATG GTA GTT GTG CCA ACT GCT GAC GGA GGT AGC 336 ATT ACC AAG ACC ACT GCC ATA TTC CAC ACC AAA GGC GAT GCC GTG GTT 384 CCT GAG GAG AAC ATC AAG TTT GCA GAT GCT CAG AAC ACT GCT CTT TTC 432 AAG GCT ATT GAG GCC TAC CTC ATT GCT AAT TAA 465
【００２１】配列番号：３ 配列の長さ：７３９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.) 品種名：黒田五寸 組織の種類：根部（地下部） 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１４．．４７８ 特徴を決定した方法：Ｅ CATTCTAAAT ATC 13 ATG GGT GCC CAG AGC CAT TCA CTC GAG ATC ACT TCT TCA GTC TCC GCA 61 GAG AAA ATA TTC AGC GGC ATT GTC CTT GAT GTT GAT ACA GTT ATT CCC 109 AAG GCT GCC CCC GGA GCT TAC AAG AGT GTC GAT GTT AAA GGA GAC GGT 157 GGA GCT GGA ACC GTC AGA ATT ATC ACC CTT CCC GAA GGT AGC CCA ATC 205 ACC TCA ATG ACG GTT AGG ACT GAT GCA GTG AAC AAG GAG GCC TTG ACA 253 TAC GAT TCC ACA GTC ATT GAT GGA GAC ATC CTT CTA GAA TTC ATC GAA 301 TCC ATT GAA ACC CAT ATG GTA GTT GTG CCA ACT GCT GAC GGA GGT AGC 349 ATT ACC AAG ACC ACT GCC ATA TTC CAC ACC AAA GGC GAT GCC GTG GTT 397 CCT GAG GAG AAC ATC AAG TTT GCA GAT GCT CAG AAC ACT GCT CTT TTC 445 AAG GCT ATT GAG GCC TAC CTC ATT GCT AAT TAA 478 GCTGAGCTCT CAACTTCCGT AATTTTATGA GTGAGTGGAG GAATTGCAAC 528 GTTTTCTTTT GTGTTTTGTT TTCGAGCAAC TTCATAATTT ACAGAGTGAG 578 TGACAGTCAG TGACAGAATT GCAACTTTCT CTTTGTACTT TGTTGTGACT 628 TGTGATGAAT AACTTCATCT GGCTGGTAAT GTATGCGATC TTTTTAAATA 678 ATATGCACTA TTATTAAACC AATAATCATA TTCATTCTCA AAAAAAAAAA 728 AAAAAAAAAA A 739
【図１】ニンジン根部に存在する全タンパク質を試料と
して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（銀染色）
を行なった結果を示す図である。レーンＭは分子量マー
カー、レーン１は試料である。矢印は本発明タンパク質
のバンドを示す。
して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（銀染色）
を行なった結果を示す図である。レーンＭは分子量マー
カー、レーン１は試料である。矢印は本発明タンパク質
のバンドを示す。
【図２】本発明タンパク質のＮ末端アミノ酸配列（一文
字表示）を示す図である。なおこの配列は配列番号１で
示されるアミノ酸配列の２番目から３６番目に相当して
いる。
字表示）を示す図である。なおこの配列は配列番号１で
示されるアミノ酸配列の２番目から３６番目に相当して
いる。
【図３】本発明タンパク質の遺伝子を含有するプラスミ
ドであるｐＣ１６を示す図である。
ドであるｐＣ１６を示す図である。
【図４】本発明タンパク質の組織特異性を検討するため
にＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（銀染色）を行
った結果を示す図である。レーンＭは分子量マーカー、
レーン１は播種後、４週間目の全植物体に存在する全タ
ンパク質試料、レーン２は播種後、７週間目の葉部に存
在する全タンパク質試料、レーン３は播種後、７週間目
の根部に存在する全タンパク質試料、レーン４は播種
後、９週間目の葉部に存在する全タンパク質試料、レー
ン５は播種後、９週間目の根部に存在する全タンパク質
試料、レーン６は播種後、２１週間目の根部に存在する
全タンパク質試料である。矢印は本発明タンパク質のバ
ンドを示す。
にＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（銀染色）を行
った結果を示す図である。レーンＭは分子量マーカー、
レーン１は播種後、４週間目の全植物体に存在する全タ
ンパク質試料、レーン２は播種後、７週間目の葉部に存
在する全タンパク質試料、レーン３は播種後、７週間目
の根部に存在する全タンパク質試料、レーン４は播種
後、９週間目の葉部に存在する全タンパク質試料、レー
ン５は播種後、９週間目の根部に存在する全タンパク質
試料、レーン６は播種後、２１週間目の根部に存在する
全タンパク質試料である。矢印は本発明タンパク質のバ
ンドを示す。
【図５】本発明タンパク質の品種間比較を調べるために
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（銀染色）を行な
った結果を示す図である。レーンＭは分子量マーカー、
レーン１は「黒田五寸」の根部に存在する全タンパク質
試料、レーン２は「アーリーチャンテネー」の根部に存
在する全タンパク質試料、レーン３は「インペレータ
ー」の根部に存在する全タンパク質試料、レーン４は
「ナンテススカーレット」の根部に存在する全タンパク
質試料である。矢印は本発明タンパク質のバンドを示
す。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（銀染色）を行な
った結果を示す図である。レーンＭは分子量マーカー、
レーン１は「黒田五寸」の根部に存在する全タンパク質
試料、レーン２は「アーリーチャンテネー」の根部に存
在する全タンパク質試料、レーン３は「インペレータ
ー」の根部に存在する全タンパク質試料、レーン４は
「ナンテススカーレット」の根部に存在する全タンパク
質試料である。矢印は本発明タンパク質のバンドを示
す。
【図６】本発明タンパク質の相同性を検討するためにデ
ータベースＥＭＢＬおよびＮＢＲＦで検索した結果を示
す図である。
ータベースＥＭＢＬおよびＮＢＲＦで検索した結果を示
す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列
を有する分子量１６ｋＤのタンパク質。 - 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質のアミノ
酸配列をコードする領域を含む遺伝子。 - 【請求項３】 配列番号２で示される塩基配列を有
する分子量１６ｋＤのタンパク質遺伝子。 - 【請求項４】 請求項２記載の遺伝子を含有するプ
ラスミド。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32794393A JP3435775B2 (ja) | 1993-12-24 | 1993-12-24 | ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミド |
| CA002138823A CA2138823A1 (en) | 1993-12-24 | 1994-12-22 | Carrot 16 kd protein, gene coding for said protein and plasmid containing said gene |
| US08/363,010 US5512484A (en) | 1993-12-24 | 1994-12-23 | Carrot 16 KD protein, gene coding for said protein and plasmid containing said gene |
| EP94120679A EP0659884A3 (en) | 1993-12-24 | 1994-12-27 | Carrot 16kd protein, gene encoding this protein, and plazmid containing this gene. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32794393A JP3435775B2 (ja) | 1993-12-24 | 1993-12-24 | ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07188288A true JPH07188288A (ja) | 1995-07-25 |
| JP3435775B2 JP3435775B2 (ja) | 2003-08-11 |
Family
ID=18204748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32794393A Expired - Fee Related JP3435775B2 (ja) | 1993-12-24 | 1993-12-24 | ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5512484A (ja) |
| EP (1) | EP0659884A3 (ja) |
| JP (1) | JP3435775B2 (ja) |
| CA (1) | CA2138823A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002085068A (ja) * | 2000-09-08 | 2002-03-26 | Sumitomo Chem Co Ltd | 免疫寛容の誘導方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3435775B2 (ja) * | 1993-12-24 | 2003-08-11 | 住友化学工業株式会社 | ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミド |
| JP3791059B2 (ja) * | 1996-08-12 | 2006-06-28 | 住友化学株式会社 | 植物プロモーターおよびその利用 |
| US7635764B2 (en) * | 1997-11-24 | 2009-12-22 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid molecules associated with the methionine synthesis and degradation pathways |
| CN1263862C (zh) | 1998-10-02 | 2006-07-12 | 住友化学工业株式会社 | 植物启动子和植物终止子 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451516A (en) * | 1991-08-16 | 1995-09-19 | Us Agriculture | Bifunctional protein from carrots (Daucus carota) with aspartokinase and homoserine dehydrogenase activities |
| JP3435775B2 (ja) * | 1993-12-24 | 2003-08-11 | 住友化学工業株式会社 | ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミド |
-
1993
- 1993-12-24 JP JP32794393A patent/JP3435775B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-12-22 CA CA002138823A patent/CA2138823A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-23 US US08/363,010 patent/US5512484A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-27 EP EP94120679A patent/EP0659884A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002085068A (ja) * | 2000-09-08 | 2002-03-26 | Sumitomo Chem Co Ltd | 免疫寛容の誘導方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5512484A (en) | 1996-04-30 |
| CA2138823A1 (en) | 1995-06-25 |
| JP3435775B2 (ja) | 2003-08-11 |
| EP0659884A2 (en) | 1995-06-28 |
| EP0659884A3 (en) | 1997-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2003276774B2 (en) | Organ preferential genes identified by T-DNA insertional mutagenesis of rice | |
| Mau et al. | Molecular cloning of cDNAs encoding the protein backbones of arabinogalactan‐proteins from the filtrate of suspension‐cultured cells of Pyrus communis and Nicotiana alata | |
| Suh et al. | Purification and characterization of the 22-kilodalton potato tuber proteins | |
| CA2412052A1 (en) | Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology | |
| WO1995031547A1 (en) | Brazzein sweetener | |
| JPH0662870A (ja) | 大豆ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び５’非翻訳領域 | |
| EP0684995B1 (en) | Brazzein sweetener | |
| US6274789B1 (en) | Rice gene resistant to blast disease | |
| EP0941332B1 (en) | Carrot antifreeze polypeptides | |
| KR20000022313A (ko) | 에이에이티티 프로모터 요소 및 전사 인자 | |
| AU711118B2 (en) | Fruit ripening | |
| JP3435775B2 (ja) | ニンジン根部に特異的に発現しうる分子量１６ｋＤのタンパク質、その遺伝子およびその遺伝子を含有するプラスミド | |
| Futamura et al. | Isolation and characterization of cDNAs that encode homologs of a pathogenesis-related protein allergen from Cryptomeria japonica | |
| US5571904A (en) | Male flower specific gene sequences | |
| CN101210247A (zh) | 胚乳特异表达启动子、胚乳细胞特异基因及其应用 | |
| US20020013958A1 (en) | Polynucleotides and polypeptides derived from corn seedling | |
| US6177614B1 (en) | Control of floral induction in plants and uses therefor | |
| US6440674B1 (en) | Plant promoter derived from luminal binding protein gene and methods for its use | |
| CA2211018C (en) | Seed coat specific dna regulatory region and peroxidase | |
| JPH08103267A (ja) | ベタインアルデヒド脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子 | |
| JP2004522442A (ja) | 繊維含量が改変され、種皮が改変された植物種子の産生方法 | |
| AU2002231513A1 (en) | Method for the production of plant seed with modified fibre content and modified seed coat | |
| CN1332980C (zh) | 水稻抗逆相关基因－锚定序列重复蛋白基因及其应用 | |
| Lanham et al. | Expression of dehydrin-like genes in response to chilling in leaves of blackcurrant, Ribes nigrum L. | |
| CN114644703A (zh) | 小麦秆锈病抗性蛋白及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |