JPH07188051A - 骨代謝調節物質及び代謝性骨疾患治療薬 - Google Patents
骨代謝調節物質及び代謝性骨疾患治療薬Info
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- JPH07188051A JPH07188051A JP5315547A JP31554793A JPH07188051A JP H07188051 A JPH07188051 A JP H07188051A JP 5315547 A JP5315547 A JP 5315547A JP 31554793 A JP31554793 A JP 31554793A JP H07188051 A JPH07188051 A JP H07188051A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を併せ持
ち、さらに製造や精製が容易である骨代謝調節物質を提
供する 【構成】 硬骨魚類のスタニオカルシンのＮ末端付近に
共通なアミノ酸配列を有するペプチドを代謝性骨疾患治
療薬の有効成分とする。
ち、さらに製造や精製が容易である骨代謝調節物質を提
供する 【構成】 硬骨魚類のスタニオカルシンのＮ末端付近に
共通なアミノ酸配列を有するペプチドを代謝性骨疾患治
療薬の有効成分とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は骨代謝調節物質及びそれ
を含む代謝性骨疾患治療薬に関する。
を含む代謝性骨疾患治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】骨粗ショウ症は、様々な要因によって全
身的な骨の脆弱化による骨格の機能不全をきたす疾患で
ある。この疾病は老人、特に女性の半数以上が罹患する
と言われており、高齢化が進む現代に於いては重大な社
会問題と言える。
身的な骨の脆弱化による骨格の機能不全をきたす疾患で
ある。この疾病は老人、特に女性の半数以上が罹患する
と言われており、高齢化が進む現代に於いては重大な社
会問題と言える。
【０００３】骨粗ショウ症は、生理的な骨の老化と代謝
性骨疾患の二面性を持っており、骨の質的変化を伴わな
い非生理的骨量の減少を招く。従って、治療薬の要件
は、骨量減少の抑制、骨量増加、骨代謝回転の刺
激の何れかの作用を持つことである。
性骨疾患の二面性を持っており、骨の質的変化を伴わな
い非生理的骨量の減少を招く。従って、治療薬の要件
は、骨量減少の抑制、骨量増加、骨代謝回転の刺
激の何れかの作用を持つことである。
【０００４】上記の作用を有するものとしてカルシト
ニン、イプリフラボン、ビスフォスフォネ−トが、の
作用を持つものとしてエストロジェン、ビタミンｋが、
の作用を持つものとして１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3、パ
ラチロイドホルモン（ＰＴＨ）等が知られている。
ニン、イプリフラボン、ビスフォスフォネ−トが、の
作用を持つものとしてエストロジェン、ビタミンｋが、
の作用を持つものとして１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3、パ
ラチロイドホルモン（ＰＴＨ）等が知られている。
【０００５】このうち、カルシトニンは、安全性と、血
清カルシウム濃度を低下させるのみならず破骨細胞に直
接作用して骨吸収を抑制するという優れた作用を持つと
いう点で骨粗ショウ症治療薬として、現在最も有力な物
質であるが、１）骨吸収を抑制するという対症療法的な
作用しかないこと、２）骨形成促進作用という本来的な
治療効果の無いこと、３）比活性の高いものは他動物種
由来の蛋白であり、人体に於いては異物として認識さ
れ、抗体により中和されてしまうこと等の重大な欠点を
有しており、骨粗ショウ症治療薬として決して満足の行
くものとは言えない。
清カルシウム濃度を低下させるのみならず破骨細胞に直
接作用して骨吸収を抑制するという優れた作用を持つと
いう点で骨粗ショウ症治療薬として、現在最も有力な物
質であるが、１）骨吸収を抑制するという対症療法的な
作用しかないこと、２）骨形成促進作用という本来的な
治療効果の無いこと、３）比活性の高いものは他動物種
由来の蛋白であり、人体に於いては異物として認識さ
れ、抗体により中和されてしまうこと等の重大な欠点を
有しており、骨粗ショウ症治療薬として決して満足の行
くものとは言えない。
【０００６】一方、スタニオカルシンは、硬骨魚類に於
いて血中カルシウム濃度を低下させる物質として知られ
ており、分子量約２５０００の糖蛋白が２分子結合した
ホモダイマ−構造をとることが知られている。
いて血中カルシウム濃度を低下させる物質として知られ
ており、分子量約２５０００の糖蛋白が２分子結合した
ホモダイマ−構造をとることが知られている。
【０００７】又、オ−ストラリア・ウナギのスタニオカ
ルシンｃＤＮＡは、１９８７年にバッカス（Ｂｕｔｋｕ
ｓ）らがクローニングに成功しており、シロザケのスタ
ニオカルシンのアミノ酸配列は１９９０年に小出らが明
らかにしている。さらに、ギンザケでは、１９９２年に
ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）がｃＤＮＡクローニングに
成功している。
ルシンｃＤＮＡは、１９８７年にバッカス（Ｂｕｔｋｕ
ｓ）らがクローニングに成功しており、シロザケのスタ
ニオカルシンのアミノ酸配列は１９９０年に小出らが明
らかにしている。さらに、ギンザケでは、１９９２年に
ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）がｃＤＮＡクローニングに
成功している。
【０００８】しかし、多くの研究者が種々の検討を行っ
た結果、これらのスタニオカルシンは、骨吸収抑制作用
及び骨形成促進作用が小さい上に、天然物由来の巨大な
蛋白質であるために製造或いは精製が大変困難であり、
医薬品として開発されるには至らなかった。
た結果、これらのスタニオカルシンは、骨吸収抑制作用
及び骨形成促進作用が小さい上に、天然物由来の巨大な
蛋白質であるために製造或いは精製が大変困難であり、
医薬品として開発されるには至らなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、骨吸収抑制作用と骨形成促進作
用を併せ持ち、さらに製造や精製が容易である骨代謝調
節物質を提供することを課題とする。
らなされたものであり、骨吸収抑制作用と骨形成促進作
用を併せ持ち、さらに製造や精製が容易である骨代謝調
節物質を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、硬骨魚類由来
のスタニオカルシンの部分ペプチドが、優れた骨吸収抑
制作用と骨形成促進作用を併せ持つことを見いだし、発
明を完成させた。
に、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、硬骨魚類由来
のスタニオカルシンの部分ペプチドが、優れた骨吸収抑
制作用と骨形成促進作用を併せ持つことを見いだし、発
明を完成させた。
【００１１】即ち本発明は、硬骨魚類のスタニオカルシ
ンに共通なアミノ酸配列を有するペプチドからなる骨代
謝調節物質である。また、本発明はこの骨代謝調節物質
を有効成分として含有する代謝性骨疾患治療薬を提供す
る。
ンに共通なアミノ酸配列を有するペプチドからなる骨代
謝調節物質である。また、本発明はこの骨代謝調節物質
を有効成分として含有する代謝性骨疾患治療薬を提供す
る。
【００１２】以下、発明について詳しく説明する。本発
明者らは、硬骨魚類のカルシウム代謝において、骨粗シ
ョウ症治療薬として期待されているカルシトニンが果た
している役割は明確ではなく、スタニオカルシンが主役
であることに着目した。さらに、スタニオカルシンが骨
吸収や骨形成に作用する部分は、同一分子内に有するの
ではないかと推測し、スタニオカルシンの部分ペプチド
に、優れた骨吸収抑制作用または骨形成促進作用を有す
るものがあるのではないかと考えた。この部分ペプチド
は、各種硬骨魚類のスタニオカルシンに共通して保存さ
れていると考えられる。また、分子量の小さい部分ペプ
チドであれば、合成が容易であり、製造上の問題も解決
できると考えた。
明者らは、硬骨魚類のカルシウム代謝において、骨粗シ
ョウ症治療薬として期待されているカルシトニンが果た
している役割は明確ではなく、スタニオカルシンが主役
であることに着目した。さらに、スタニオカルシンが骨
吸収や骨形成に作用する部分は、同一分子内に有するの
ではないかと推測し、スタニオカルシンの部分ペプチド
に、優れた骨吸収抑制作用または骨形成促進作用を有す
るものがあるのではないかと考えた。この部分ペプチド
は、各種硬骨魚類のスタニオカルシンに共通して保存さ
れていると考えられる。また、分子量の小さい部分ペプ
チドであれば、合成が容易であり、製造上の問題も解決
できると考えた。
【００１３】すなわち、本発明の骨代謝調節物質は、硬
骨魚類のスタニオカルシンに共通なアミノ酸配列を有す
るペプチドからなる。また、以下に示すように、本発明
の骨代謝調節物質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列
の少なくとも一部の配列を有するペプチドであることが
好ましい。
骨魚類のスタニオカルシンに共通なアミノ酸配列を有す
るペプチドからなる。また、以下に示すように、本発明
の骨代謝調節物質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列
の少なくとも一部の配列を有するペプチドであることが
好ましい。
【００１４】各種硬骨魚類のスタニオカルシンのアミノ
酸配列を比較した結果、共通な配列なアミノ酸配列が存
在し、特にＮ末端のペプチド部分が、魚の種属を越えて
相同性が高いことを見いだし、スタニオカルシンの基本
的性格に骨代謝調節作用があるならば、この部分が最も
その作用の強い部分ではないかと推論した。この共通な
配列の一例として、Ｎ末端より２０個のアミノ酸配列を
配列番号１に示す。
酸配列を比較した結果、共通な配列なアミノ酸配列が存
在し、特にＮ末端のペプチド部分が、魚の種属を越えて
相同性が高いことを見いだし、スタニオカルシンの基本
的性格に骨代謝調節作用があるならば、この部分が最も
その作用の強い部分ではないかと推論した。この共通な
配列の一例として、Ｎ末端より２０個のアミノ酸配列を
配列番号１に示す。
【００１５】上記推論に従って、ペプチドシンセサイザ
ーを用いて、上記配列と同一のアミノ酸配列を有するペ
プチドを合成し、その骨代謝に与える影響を調べたとこ
ろ、後記実施例に示す如く、優れた骨吸収抑制作用と骨
形成促進作用を併せ持つことを見いだした。また、この
ペプチドがアミノ酸２０個の極めて小さい分子であるこ
とから、その抗原性も極めて少ないことが期待できた。
ーを用いて、上記配列と同一のアミノ酸配列を有するペ
プチドを合成し、その骨代謝に与える影響を調べたとこ
ろ、後記実施例に示す如く、優れた骨吸収抑制作用と骨
形成促進作用を併せ持つことを見いだした。また、この
ペプチドがアミノ酸２０個の極めて小さい分子であるこ
とから、その抗原性も極めて少ないことが期待できた。
【００１６】尚、上記２０アミノ酸からなる配列中に
は、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を担う部分が含ま
れていると推察され、これらの作用に関与しないアミノ
酸も含まれていると考えられる。本発明においては、上
記ペプチドからこのようなアミノ酸を除いた残余部分、
例えばＮ末端及び／又はＣ末端の１あるいは２以上のア
ミノ酸を除いたペプチドも同様な作用を有すると推定さ
れる。本明細書においては、このようなペプチドも含め
て「本発明のペプチド」ということがある。同様に、本
発明のペプチドの少なくとも一端に他のアミノ酸あるい
はペプチドを付加したものも、骨吸収抑制作用と骨形成
促進作用を有するものであれば、本発明の範囲に含まれ
る。
は、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を担う部分が含ま
れていると推察され、これらの作用に関与しないアミノ
酸も含まれていると考えられる。本発明においては、上
記ペプチドからこのようなアミノ酸を除いた残余部分、
例えばＮ末端及び／又はＣ末端の１あるいは２以上のア
ミノ酸を除いたペプチドも同様な作用を有すると推定さ
れる。本明細書においては、このようなペプチドも含め
て「本発明のペプチド」ということがある。同様に、本
発明のペプチドの少なくとも一端に他のアミノ酸あるい
はペプチドを付加したものも、骨吸収抑制作用と骨形成
促進作用を有するものであれば、本発明の範囲に含まれ
る。
【００１７】本発明のペプチドは、市販のペプチドシン
セサイザーを用いれば、常法通り容易に合成できるが、
その製造方法については、上記アミノ酸配列を有するも
のであれば特に限定はされない。
セサイザーを用いれば、常法通り容易に合成できるが、
その製造方法については、上記アミノ酸配列を有するも
のであれば特に限定はされない。
【００１８】また、本発明のペプチドは、後記実施例に
示す如く、安全性も極めて高いので、代謝性骨疾患の治
療剤として、とりわけ骨粗ショウ症の治療薬として、大
変有用である。
示す如く、安全性も極めて高いので、代謝性骨疾患の治
療剤として、とりわけ骨粗ショウ症の治療薬として、大
変有用である。
【００１９】本発明のペプチドを骨代謝治療薬として用
いる場合、本発明のペプチドの水溶性が極めて高いこと
から、注射剤として用いるのが最も好ましい。注射剤に
するにあたっては、塩化ナトリウム等の等張剤や、燐酸
塩やクエン酸塩等の緩衝剤、グルコース等の糖類等、一
般的に注射剤形に用いられる任意成分とともに用いるこ
とができる。
いる場合、本発明のペプチドの水溶性が極めて高いこと
から、注射剤として用いるのが最も好ましい。注射剤に
するにあたっては、塩化ナトリウム等の等張剤や、燐酸
塩やクエン酸塩等の緩衝剤、グルコース等の糖類等、一
般的に注射剤形に用いられる任意成分とともに用いるこ
とができる。
【００２０】注射剤として投与する場合、本発明のペプ
チドは、生理食塩水等の水性担体に溶解させて滅菌処理
したものを用いても良いし、滅菌後、凍結乾燥などして
おいた注射用粉末を予め用意しておき、用時に溶解して
用いても良い。
チドは、生理食塩水等の水性担体に溶解させて滅菌処理
したものを用いても良いし、滅菌後、凍結乾燥などして
おいた注射用粉末を予め用意しておき、用時に溶解して
用いても良い。
【００２１】注射剤の投与経路は特に限定されないが、
ペプチダーゼの影響を受けにくい筋肉内投与が最も望ま
しい。本発明のペプチドを代謝性骨疾患の治療剤として
用いる場合、成人１人１日あたりの投与量は、症状、年
令、体重、体調により異なるが、０．００１μｇ〜１０
ｍｇが適当である。
ペプチダーゼの影響を受けにくい筋肉内投与が最も望ま
しい。本発明のペプチドを代謝性骨疾患の治療剤として
用いる場合、成人１人１日あたりの投与量は、症状、年
令、体重、体調により異なるが、０．００１μｇ〜１０
ｍｇが適当である。
【００２２】
【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。 ＜部分ペプチドの合成＞ペプチドシンセサイザー（島津
ＰＭＳＳＭ−８）に、配列番号１に示すアミノ酸配列を
入力し、本発明のペプチドの自動合成を行った。得られ
たペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸シークェンサー
（島津ＰＳ−１）を用いて決定した結果、入力通りのア
ミノ酸配列であった。以下、このペプチドを単に「部分
ペプチド」ともいう。
ＰＭＳＳＭ−８）に、配列番号１に示すアミノ酸配列を
入力し、本発明のペプチドの自動合成を行った。得られ
たペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸シークェンサー
（島津ＰＳ−１）を用いて決定した結果、入力通りのア
ミノ酸配列であった。以下、このペプチドを単に「部分
ペプチド」ともいう。
【００２３】＜本発明のペプチドの評価＞ （１）ＳＤラット頭蓋冠器官培養による骨吸収抑制作用
の検討 妊娠１７日目の雌性ＳＤラットの母体に、45ＣａＣｌ2
を１００μＣｉ皮下投与し、胎仔の骨をプレラベルし
た。一方、２４ウェルプレートにポアサイズ０．４５μ
ｍのフィルターをのせたグリッドを入れ、２ｍｇ／ｍｌ
のアルブミン入りＢＧＪｂ培地（ＳＩＧＭＡ製）を６０
０μｌづつ添加した。
の検討 妊娠１７日目の雌性ＳＤラットの母体に、45ＣａＣｌ2
を１００μＣｉ皮下投与し、胎仔の骨をプレラベルし
た。一方、２４ウェルプレートにポアサイズ０．４５μ
ｍのフィルターをのせたグリッドを入れ、２ｍｇ／ｍｌ
のアルブミン入りＢＧＪｂ培地（ＳＩＧＭＡ製）を６０
０μｌづつ添加した。
【００２４】プレラベル２日後に胎仔から無菌的に頭蓋
冠を摘出し、正中で２分割した。別々の個体から摘出し
た頭蓋冠を１枚づつ上記フィルターにのせ、３７℃ Ｃ
Ｏ2インキュベーター（ホルマ製）で、空気と培地の界
面で２４時間前培養した。前培養後に、ｂＰＴＨ（ｂｏ
ｖｉｎｅ ＰＴＨ １−３４；ペニンシュララボラトリ
ー製）１×１０ー9モル添加及び非添加の２条件のもと
に、上記で得られた部分ペプチドを添加し、４日間培養
した後、頭蓋冠を取り出し、１規定の塩酸で１晩脱灰し
た。
冠を摘出し、正中で２分割した。別々の個体から摘出し
た頭蓋冠を１枚づつ上記フィルターにのせ、３７℃ Ｃ
Ｏ2インキュベーター（ホルマ製）で、空気と培地の界
面で２４時間前培養した。前培養後に、ｂＰＴＨ（ｂｏ
ｖｉｎｅ ＰＴＨ １−３４；ペニンシュララボラトリ
ー製）１×１０ー9モル添加及び非添加の２条件のもと
に、上記で得られた部分ペプチドを添加し、４日間培養
した後、頭蓋冠を取り出し、１規定の塩酸で１晩脱灰し
た。
【００２５】培地と脱灰液にそれぞれシンチレーター
（アクアゾル；デュポン製）を１０ｍｌづつ加え、液体
シンチレーションシステム（アロカＬＳＣ−７００）で
45Ｃａを測定した。45Ｃａが骨吸収によって培地中へ溶
出した割合、即ち、培地中の45Ｃａの放射活性を培地中
の45Ｃａの放射活性と脱灰液中の45Ｃａの放射活性の和
で除した値を骨吸収活性値とした。この値を表１に示
す。
（アクアゾル；デュポン製）を１０ｍｌづつ加え、液体
シンチレーションシステム（アロカＬＳＣ−７００）で
45Ｃａを測定した。45Ｃａが骨吸収によって培地中へ溶
出した割合、即ち、培地中の45Ｃａの放射活性を培地中
の45Ｃａの放射活性と脱灰液中の45Ｃａの放射活性の和
で除した値を骨吸収活性値とした。この値を表１に示
す。
【００２６】
【表１】
【００２７】この結果から、本発明のペプチドがｂＰＴ
Ｈによって励起される骨吸収を抑制しているのは明白で
ある。又、ｂＰＴＨ非共存下では共存下よりも骨吸収へ
の影響が少ないことから、本発明のペプチドがｂＰＴＨ
と拮抗していることが判る。又、ｂＰＴＨ非共存下で
も、少ないながらも骨吸収を抑制することから内在性因
子による骨吸収も抑制していることが判る。
Ｈによって励起される骨吸収を抑制しているのは明白で
ある。又、ｂＰＴＨ非共存下では共存下よりも骨吸収へ
の影響が少ないことから、本発明のペプチドがｂＰＴＨ
と拮抗していることが判る。又、ｂＰＴＨ非共存下で
も、少ないながらも骨吸収を抑制することから内在性因
子による骨吸収も抑制していることが判る。
【００２８】（２）マウス頭蓋冠器官培養に於ける骨吸
収抑制作用の検討 ３日齢の新生仔ＩＣＲマウスに、45ＣａＣｌ2を２μＣ
ｉ皮下投与しプレラベルした後、４日後頭蓋冠を取り出
し、前記と同様の手技で器官培養を行い、上記部分ペプ
チドの骨吸収に対する影響を調べた。但し、ｂＰＴＨ共
存下での検討は行わなかった。結果を表２に示す。
収抑制作用の検討 ３日齢の新生仔ＩＣＲマウスに、45ＣａＣｌ2を２μＣ
ｉ皮下投与しプレラベルした後、４日後頭蓋冠を取り出
し、前記と同様の手技で器官培養を行い、上記部分ペプ
チドの骨吸収に対する影響を調べた。但し、ｂＰＴＨ共
存下での検討は行わなかった。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】 この結果から、本発明のペプチドが骨吸収を抑制してい
るのが明らかである。
るのが明らかである。
【００３０】（３）骨芽細胞様細胞株のｃＡＭＰ産生応
答の検討 理化学研究所ジーンバンクより入手したラット・オステ
オザルコーマ由来の骨芽細胞様細胞株ＲＯＳ１７／２．
８−５を用いて、部分ペプチドのＰＴＨ依存性のｃＡＭ
Ｐ産生に対する影響を調べた。ＲＯＳ１７／２．８−５
細胞は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清；ハイクロンラボ
ラトリー製）を含むハムのＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ製）
で継代１０代以内のものを用いた。
答の検討 理化学研究所ジーンバンクより入手したラット・オステ
オザルコーマ由来の骨芽細胞様細胞株ＲＯＳ１７／２．
８−５を用いて、部分ペプチドのＰＴＨ依存性のｃＡＭ
Ｐ産生に対する影響を調べた。ＲＯＳ１７／２．８−５
細胞は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清；ハイクロンラボ
ラトリー製）を含むハムのＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ製）
で継代１０代以内のものを用いた。
【００３１】ＲＯＳ１７／２．８−５細胞を、５％ＦＢ
Ｓ含有ハムのＦ１２培地で、４８ウェルプレートに５×
１０4個／ウェル播種し、３７℃ ＣＯ2インキュベータ
ー（ホルマ製）で３日間培養した。又、この時一部に部
分ペプチドを添加して培養した。細胞が一様に一層にな
ったところでＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）ですす
ぎ、予め３７℃に加温したｂＰＴＨもしくは部分ペプチ
ドを含む０．５％ＦＢＳ含有ＰＢＳを各ウェルに３００
μｌ添加した。
Ｓ含有ハムのＦ１２培地で、４８ウェルプレートに５×
１０4個／ウェル播種し、３７℃ ＣＯ2インキュベータ
ー（ホルマ製）で３日間培養した。又、この時一部に部
分ペプチドを添加して培養した。細胞が一様に一層にな
ったところでＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）ですす
ぎ、予め３７℃に加温したｂＰＴＨもしくは部分ペプチ
ドを含む０．５％ＦＢＳ含有ＰＢＳを各ウェルに３００
μｌ添加した。
【００３２】５分後上清を除去して反応を止め、氷冷し
た６５％エタノールを各ウェルに加え、超音波処理によ
り細胞を破壊し、処理液を２０００Ｇで１５分間遠心し
た。上清を遠心乾燥機で乾燥させ、これをＰＢＳに溶解
させ、バイオトラークｃＡＭＰＥＩＡシステム（アマシ
ャム製）を用いて、ｃＡＭＰ量を定量した。表３にｂＰ
ＴＨ及び部分ペプチド単独でのｃＡＭＰ産生に対する影
響を、表４にｂＰＴＨ共存下での部分ペプチドのｃＡＭ
Ｐ産生に対する影響を示した。
た６５％エタノールを各ウェルに加え、超音波処理によ
り細胞を破壊し、処理液を２０００Ｇで１５分間遠心し
た。上清を遠心乾燥機で乾燥させ、これをＰＢＳに溶解
させ、バイオトラークｃＡＭＰＥＩＡシステム（アマシ
ャム製）を用いて、ｃＡＭＰ量を定量した。表３にｂＰ
ＴＨ及び部分ペプチド単独でのｃＡＭＰ産生に対する影
響を、表４にｂＰＴＨ共存下での部分ペプチドのｃＡＭ
Ｐ産生に対する影響を示した。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】これらの結果より、本発明のペプチドはｃ
ＡＭＰ産生に何等影響しないが、ｂＰＴＨに励起される
ｃＡＭＰの産生をｂＰＴＨに拮抗して抑制していること
が判る。これより、本発明のペプチドはＰＴＨの作用を
骨芽細胞のレベルでも抑制していることが判る。従っ
て、破骨細胞に直接作用して骨吸収を抑制すると言われ
ているカルシトニンと作用機序が全く異なり優れてい
る。
ＡＭＰ産生に何等影響しないが、ｂＰＴＨに励起される
ｃＡＭＰの産生をｂＰＴＨに拮抗して抑制していること
が判る。これより、本発明のペプチドはＰＴＨの作用を
骨芽細胞のレベルでも抑制していることが判る。従っ
て、破骨細胞に直接作用して骨吸収を抑制すると言われ
ているカルシトニンと作用機序が全く異なり優れてい
る。
【００３６】（４）骨髄細胞培養系に於ける破骨細胞形
成への影響の検討 ８週齢のｄｄｙマウスのケイ骨を摘出し、付着する筋肉
を剥離した。７０％エタノールで骨表面を消毒し、遠心
部、膝関節部を切断した。α−ＭＥＭ（α−ミニマムエ
ッセンシャルメディウム）（ＧＩＢＣＯ製）を注射用シ
リンジに取り、２４Ｇの注射針を遠心部に挿入すること
により、骨髄細胞を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ懸濁液
として採取し、７．５×１０5個／０．５ｍｌ／ウェル
で２４ウェルプレートに播種した。
成への影響の検討 ８週齢のｄｄｙマウスのケイ骨を摘出し、付着する筋肉
を剥離した。７０％エタノールで骨表面を消毒し、遠心
部、膝関節部を切断した。α−ＭＥＭ（α−ミニマムエ
ッセンシャルメディウム）（ＧＩＢＣＯ製）を注射用シ
リンジに取り、２４Ｇの注射針を遠心部に挿入すること
により、骨髄細胞を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ懸濁液
として採取し、７．５×１０5個／０．５ｍｌ／ウェル
で２４ウェルプレートに播種した。
【００３７】ここに、ｂＰＴＨ、１α，２５（ＯＨ）2
Ｄ3、或いは部分ペプチドを添加して３７℃ ＣＯ2イン
キュベーター（ホルマ製）にて培養した。３日後、培地
の半量を新鮮培地と交換し、更に、５日間培養した。培
養終了後ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）
を細胞化学的に染色した。即ち、培養後プレートをＰＢ
Ｓで洗浄し、１０％ホルマリン含有ＰＢＳで１０分間固
定した。さらにエタノール／アセトン（５０：５０Ｖ／
Ｖ）で１分間再固定し、プレートを乾燥させ、これに基
質液を添加して１５分間放置した。この基質液は、ナフ
トールＡＳ−ＭＸ（シグマ製）５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド０．５ｍｌに溶解させ、５０ミリモル酒
石酸ナトリウム−０．１モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５，０）を５０ｍｌ加え、更にファーストレッドバイ
オレットＬＢ塩（シグマ製）３０ｍｌを溶かしてろ過し
て調製したものである。
Ｄ3、或いは部分ペプチドを添加して３７℃ ＣＯ2イン
キュベーター（ホルマ製）にて培養した。３日後、培地
の半量を新鮮培地と交換し、更に、５日間培養した。培
養終了後ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）
を細胞化学的に染色した。即ち、培養後プレートをＰＢ
Ｓで洗浄し、１０％ホルマリン含有ＰＢＳで１０分間固
定した。さらにエタノール／アセトン（５０：５０Ｖ／
Ｖ）で１分間再固定し、プレートを乾燥させ、これに基
質液を添加して１５分間放置した。この基質液は、ナフ
トールＡＳ−ＭＸ（シグマ製）５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド０．５ｍｌに溶解させ、５０ミリモル酒
石酸ナトリウム−０．１モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５，０）を５０ｍｌ加え、更にファーストレッドバイ
オレットＬＢ塩（シグマ製）３０ｍｌを溶かしてろ過し
て調製したものである。
【００３８】プレートを水洗、乾燥後、ＴＲＡＰ陽性の
多核細胞を破骨細胞として数えた。部分ペプチドの破骨
細胞形成への影響を表５、６に示す。尚、表５はｂＰＴ
Ｈ１×１０-8モル存在下での結果、表６は１α，２５
（ＯＨ）2Ｄ3（ＶＤ3）１×１０-9モル存在下での結果
である。
多核細胞を破骨細胞として数えた。部分ペプチドの破骨
細胞形成への影響を表５、６に示す。尚、表５はｂＰＴ
Ｈ１×１０-8モル存在下での結果、表６は１α，２５
（ＯＨ）2Ｄ3（ＶＤ3）１×１０-9モル存在下での結果
である。
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】これらの結果より、本発明のペプチドは、
ｂＰＴＨ或いは１α，２５（ＯＨ） 2Ｄ3によって誘導さ
れる破骨細胞の形成に対して、優れた抑制作用を有して
いるのが明らかである。
ｂＰＴＨ或いは１α，２５（ＯＨ） 2Ｄ3によって誘導さ
れる破骨細胞の形成に対して、優れた抑制作用を有して
いるのが明らかである。
【００４２】（５）骨形成活性への影響の検討 新生仔マウスの頭蓋冠を用いて、コラーゲン合成率を指
標に本発明のペプチドの骨形成への作用を検討した。即
ち、２日齢のＩＣＲマウス新生仔の頭蓋冠を無菌的に取
り出し、正中で２分割し、血液及び結合組織を除去し
た。
標に本発明のペプチドの骨形成への作用を検討した。即
ち、２日齢のＩＣＲマウス新生仔の頭蓋冠を無菌的に取
り出し、正中で２分割し、血液及び結合組織を除去し
た。
【００４３】これらを、４ｍｇ／ｍｌアルブミン添加Ｂ
ＧＪｂ培地を６ｍｌ加えた１０ｃｍシャーレで４時間、
３７℃ ＣＯ2インキュベーター（ホルマ製）で前培養し
た。前培養後、同新鮮培地を２ｍｌ入れた３０ｍｌ三角
フラスコに頭蓋冠を３枚づつ移し、同時に５％ＦＣＳ、
ウシインスリン（ＧＩＢＣＯ製）、ｂＰＴＨ、或いは部
分ペプチドをそれぞれ添加し、前培養の条件に加えて、
３７℃ ＣＯ2インキュベーター（ホルマ製）にて１分間
６０振幅で９６時間振盪培養した。培地は毎日新鮮培地
と交換した。
ＧＪｂ培地を６ｍｌ加えた１０ｃｍシャーレで４時間、
３７℃ ＣＯ2インキュベーター（ホルマ製）で前培養し
た。前培養後、同新鮮培地を２ｍｌ入れた３０ｍｌ三角
フラスコに頭蓋冠を３枚づつ移し、同時に５％ＦＣＳ、
ウシインスリン（ＧＩＢＣＯ製）、ｂＰＴＨ、或いは部
分ペプチドをそれぞれ添加し、前培養の条件に加えて、
３７℃ ＣＯ2インキュベーター（ホルマ製）にて１分間
６０振幅で９６時間振盪培養した。培地は毎日新鮮培地
と交換した。
【００４４】培養終了２時間前に、５μＣｉ／ｍｌにな
る様にしたＬ−［２，３−3Ｈ］プロリン（アマシャム
製）を添加してパルスラベルした。培養終了後、頭蓋冠
を取り出し、氷冷したＰＢＳですすいだ後、５％ＴＣ
Ａ、アセトン、エーテルで抽出し、ドラフト内で乾燥さ
せ、頭蓋冠重量を測定した。乾燥した頭蓋冠を０．５モ
ル酢酸でホモジナイズし、このホモジネートに０．５Ｎ
水酸化ナトリウム、１モルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）
を加えサンプル液とした。これを、表７に示すコラゲナ
ーゼ混合液を用いてコラゲナーゼによる消化を行った。
る様にしたＬ−［２，３−3Ｈ］プロリン（アマシャム
製）を添加してパルスラベルした。培養終了後、頭蓋冠
を取り出し、氷冷したＰＢＳですすいだ後、５％ＴＣ
Ａ、アセトン、エーテルで抽出し、ドラフト内で乾燥さ
せ、頭蓋冠重量を測定した。乾燥した頭蓋冠を０．５モ
ル酢酸でホモジナイズし、このホモジネートに０．５Ｎ
水酸化ナトリウム、１モルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）
を加えサンプル液とした。これを、表７に示すコラゲナ
ーゼ混合液を用いてコラゲナーゼによる消化を行った。
【００４５】
【表７】
【００４６】表７に示す混合液と上記サンプル液を混合
し、３７℃３時間で消化した。途中１時間毎に撹はんを
加えた。酵素消化後、それぞれを氷冷下、２０μｌの
０．５％ＢＳＡを加えて反応を止め、１０％ＴＣＡ／
０．５％タンニン酸を加え、充分に撹はん後氷冷した。
５分放置後、５０００ｒｐｍ１５分間遠心し上清を回収
した。
し、３７℃３時間で消化した。途中１時間毎に撹はんを
加えた。酵素消化後、それぞれを氷冷下、２０μｌの
０．５％ＢＳＡを加えて反応を止め、１０％ＴＣＡ／
０．５％タンニン酸を加え、充分に撹はん後氷冷した。
５分放置後、５０００ｒｐｍ１５分間遠心し上清を回収
した。
【００４７】沈澱に５％ＴＣＡ／０．２５％タンニン酸
を加え、充分に撹はん後再遠心した。この上清を最初の
上清に加え、１０ｍｌのシンチレーターと混和し放射活
性を測定した。コラゲナーゼ存在下での試料のカウント
からコラゲナーゼ非存在下での試料のカウントを差し引
いたものをコラゲナーゼ消化性蛋白（ＣＤＰ）に取り込
まれたトリチュウムラベルプロリンによる放射活性とし
た。又、沈澱には０．５ｍｌの０．５％ドデシル硫酸ナ
トリウム５ミリモルジチオスレイトール溶液を加え、５
分間煮沸して溶解した。これに５ｍｌのシンチレーター
を加えて放射活性を測定し、これをコラゲナーゼ非消化
性蛋白（ＮＤＰ）中に取り込まれたトリチュウムラベル
プロリンによる放射活性とした。骨形成に於けるコラー
ゲン合成活性は、コラーゲン合成率として式１に示す式
より算出した。
を加え、充分に撹はん後再遠心した。この上清を最初の
上清に加え、１０ｍｌのシンチレーターと混和し放射活
性を測定した。コラゲナーゼ存在下での試料のカウント
からコラゲナーゼ非存在下での試料のカウントを差し引
いたものをコラゲナーゼ消化性蛋白（ＣＤＰ）に取り込
まれたトリチュウムラベルプロリンによる放射活性とし
た。又、沈澱には０．５ｍｌの０．５％ドデシル硫酸ナ
トリウム５ミリモルジチオスレイトール溶液を加え、５
分間煮沸して溶解した。これに５ｍｌのシンチレーター
を加えて放射活性を測定し、これをコラゲナーゼ非消化
性蛋白（ＮＤＰ）中に取り込まれたトリチュウムラベル
プロリンによる放射活性とした。骨形成に於けるコラー
ゲン合成活性は、コラーゲン合成率として式１に示す式
より算出した。
【００４８】
【式１】コラーゲン合成率（％）＝（ＣＤＰ中の放射活
性×１００）／（ＣＤＰ中の放射活性＋ＮＤＰ中の放射
活性×５．４）
性×１００）／（ＣＤＰ中の放射活性＋ＮＤＰ中の放射
活性×５．４）
【００４９】結果を表８に示す。
【００５０】
【表８】
【００５１】この結果から、ｂＰＴＨは骨形成を抑制
し、インスリンと本発明のペプチドは骨形成を促進して
いるのが判る。又、本発明のペプチドはインスリンより
も優れた骨形成促進作用を有していることが明白であ
る。
し、インスリンと本発明のペプチドは骨形成を促進して
いるのが判る。又、本発明のペプチドはインスリンより
も優れた骨形成促進作用を有していることが明白であ
る。
【００５２】（６）急性毒性試験 ５週齢の雄性ＩＣＲマウス（２５〜３０ｇ）を用いて急
性毒性を調べた。部分ペプチドを生理食塩水に溶解さ
せ、マウスに経口投与しその１４日後に生死を判定し急
性毒性を求めた。最高投与量は５０００ｍｇ／Ｋｇとし
た。
性毒性を調べた。部分ペプチドを生理食塩水に溶解さ
せ、マウスに経口投与しその１４日後に生死を判定し急
性毒性を求めた。最高投与量は５０００ｍｇ／Ｋｇとし
た。
【００５３】その結果、最高投与量に於いても死亡例は
なく、従って、急性毒性値は５０００ｍｇ／Ｋｇ以上で
あった。これより本発明のペプチドの安全性の高いこと
が明白である。
なく、従って、急性毒性値は５０００ｍｇ／Ｋｇ以上で
あった。これより本発明のペプチドの安全性の高いこと
が明白である。
【００５４】
【発明の効果】本発明のペプチドは、破骨細胞を介して
のみならず、骨芽細胞を介しても骨吸収を抑制し、且
つ、骨形成も促進する上、安全性も高い。したがって、
これを含む本発明の治療薬は、骨粗ショウ症を始めとす
る代謝性骨疾患の治療薬として有益である。
のみならず、骨芽細胞を介しても骨吸収を抑制し、且
つ、骨形成も促進する上、安全性も高い。したがって、
これを含む本発明の治療薬は、骨粗ショウ症を始めとす
る代謝性骨疾患の治療薬として有益である。
【００５５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Ser Pro Asn Ser Pro Ser Asp Val Ala Arg Cys Leu Asn Gly Ala 1 5 10 15 Leu Asp Val Gly 20
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/585 8318−4Ｈ (72)発明者 小杉 哲也 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560ポーラ化 成工業株式会社戸塚研究所内 (72)発明者 永田 欽也 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560ポーラ化 成工業株式会社戸塚研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 硬骨魚類のスタニオカルシンに共通なア
ミノ酸配列を有するペプチドからなる骨代謝調節物質。 - 【請求項２】 配列番号１に記載のアミノ酸配列の少な
くとも一部の配列を有するペプチドである請求項１記載
の骨代謝調節物質。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の骨代謝調節物質
を有効成分として含有する代謝性骨疾患治療薬。 - 【請求項４】 代謝性骨疾患が骨粗ショウ症である請求
項３記載の代謝性骨疾患治療薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5315547A JPH07188051A (ja) | 1993-11-16 | 1993-12-15 | 骨代謝調節物質及び代謝性骨疾患治療薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28686293 | 1993-11-16 | ||
| JP5-286862 | 1993-11-16 | ||
| JP5315547A JPH07188051A (ja) | 1993-11-16 | 1993-12-15 | 骨代謝調節物質及び代謝性骨疾患治療薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07188051A true JPH07188051A (ja) | 1995-07-25 |
Family
ID=26556490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5315547A Pending JPH07188051A (ja) | 1993-11-16 | 1993-12-15 | 骨代謝調節物質及び代謝性骨疾患治療薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07188051A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000038707A1 (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-06 | Garvan Institute Of Medical Research | Method for the treatment of bone loss |
| WO2002004013A1 (fr) * | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Bml, Inc. | Remedes pour maladies osseuses |
| WO2013008681A1 (ja) | 2011-07-09 | 2013-01-17 | 国立大学法人東北大学 | 線維症予防又は治療用医薬組成物 |
-
1993
- 1993-12-15 JP JP5315547A patent/JPH07188051A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000038707A1 (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-06 | Garvan Institute Of Medical Research | Method for the treatment of bone loss |
| WO2002004013A1 (fr) * | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Bml, Inc. | Remedes pour maladies osseuses |
| JP4955186B2 (ja) * | 2000-07-11 | 2012-06-20 | 株式会社ビー・エム・エル | 骨粗しょう症治療剤 |
| WO2013008681A1 (ja) | 2011-07-09 | 2013-01-17 | 国立大学法人東北大学 | 線維症予防又は治療用医薬組成物 |
| US9060988B2 (en) | 2011-07-09 | 2015-06-23 | Tohoku University | Method for treating pulmonary fibrosis using a pharmaceutical composition containing stanniocalcin 1 (STC1) |
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