JPH07184661A - 抗骨粗鬆症物質をスクリーニングするための物質および方法 - Google Patents

抗骨粗鬆症物質をスクリーニングするための物質および方法

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JPH07184661A
JPH07184661A JP6137287A JP13728794A JPH07184661A JP H07184661 A JPH07184661 A JP H07184661A JP 6137287 A JP6137287 A JP 6137287A JP 13728794 A JP13728794 A JP 13728794A JP H07184661 A JPH07184661 A JP H07184661A
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estrogen
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ナ・ノラ・ヤン
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、「ラロキシフェン応答要素」と命
名した新規な調節要素を含有するトランスフォーミング
増殖因子β遺伝子のプロモーター領域由来の核酸を単離
し、クローニングし、そして使用することに関する。ま
た本発明は、ラロキシフェン応答要素がリポーター遺伝
子の転写を変調させるように該リポーター遺伝子に機能
的に結合した該ラロキシフェン応答要素を含有する真核
細胞を包含する。 【効果】 本発明により、骨粗鬆症を治療するための治
療薬物および血清脂質を低減させる物質を同定するため
の方法が提供され、さらに、現在の抗骨粗鬆症治療処方
に付随する有害または望ましくない副作用を誘導するこ
となく、ラロキシフェン応答要素に機能的に結合した遺
伝子の転写を誘導する抗骨粗鬆症物質を同定するための
方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は骨粗鬆症を治療するため
の治療薬物を同定するための方法に関する。本発明は、
「ラロキシフェン(raloxifene)応答要素」と命名した新
規な調節要素である哺乳動物トランスフォーミング増殖
因子βのプロモーター領域を含有する核酸を単離し、ク
ローニングし、そして使用することに関する。また本発
明は、ラロキシフェン応答要素がリポーター遺伝子に機
能的に結合した組換え発現構築物を含有する遺伝子加工
した真核細胞を包含する。このような細胞において、ラ
ロキシフェン応答要素は、ある種の化合物による処理に
答えてリポーター遺伝子の転写を変調させることができ
る。さらに本発明は、ラロキシフェン応答要素によって
ある種の遺伝子の転写を誘導するが、エストロゲン置換
療法に付随する有害または望ましくない副作用(例え
ば、子宮および乳癌による危険の増大)を特異的に誘導
することのない抗骨粗鬆症物質を同定するための方法に
関する。本発明の核酸、細胞および方法は、抗骨粗鬆症
物質の推定供給源をスクリーニングし、そして現在の抗
骨粗鬆症物質に付随する望ましくない副作用を好都合に
欠く推定供給源を同定するための効果的な方法を提供す
る。また本発明は、エストロゲン受容体に結合したとき
にラロキシフェン応答要素からの転写を強力に誘導する
化合物を投与することからなる、骨形成を誘導するため
の方法、骨粗鬆症を治療するための方法、および骨折を
治療するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９９１年に米国製薬会社は、新規な治
療用物質の同定に向けた研究および開発に概算で７９億
ドルを費やした(Pharmaceutical Manufacturer's Assoc
iation)。この額の大きさは、一部には、許容できない
レベルの有害または望ましくない副作用を引き起こすこ
とのない１個の有効な治療用物質を同定するために、数
千ではないにしても数百の化合物質を試験しなければな
らないことに起因している。多数の化学物質を試験して
疾患の治療に有効であると考えられる化合物を迅速に同
定する経済的な方法に対する要求が増大している。現時
点では、そのような経済的な系はわずかしか存在してい
ない。
【０００３】多数の可能性ある治療用薬物をスクリーニ
ングするための迅速な方法を特に欠く疾患の１つは骨損
失である。骨損失は多種多様の患者において発生する
が、このような患者には、子宮切除術を受けた患者、コ
ルチコステロイド類の長期投与を受けたかまたは受けて
いる患者、クッシング症候群に罹患しているかまたは性
器発育異常を有する患者、ならびに閉経後の女性が含ま
れる。
【０００４】骨損失の機序はよくわかっていないが、実
際的にはこの疾患は骨組織の正味の損失に傾斜する新し
い健康な骨の形成と古い骨の再吸収のアンバランスに起
因している。この骨損失には骨のタンパク質マトリック
ス成分と無機質含量の両方の減少が含まれ、主として大
腿骨ならびに前腕および脊椎中の骨の骨折率の増加を導
く。次いで、これらの骨折が全般的な病的状態の増大、
身長および運動性の顕著な損失、そして多くの場合、合
併症に起因する死亡率の増大を導く。
【０００５】抑制されない骨損失は骨粗鬆症を導くこと
ができる。この骨粗鬆症は主要な衰弱性疾患であり、そ
の主な特徴は骨体積が減少することなく骨重量が損失し
て多孔性と脆さを生成することである(密度の減少と骨
空間の拡大による)。閉経後の女性の骨粗鬆症は最も普
通の種類の骨疾患の１つであり、米国だけでもおよそ２
０００〜２５００万人の女性が罹患している。閉経後の
骨粗鬆症の大きな特徴は、卵巣によるエストロゲン産生
の停止に起因する骨重量の大きくかつ速い損失である。
実際のところ、エストロゲンが骨粗鬆症の骨損失の進行
を制限しうることをデータが支持するのが明らかであ
り、エストロゲン置換は米国および他の多くの国におい
て閉経後骨粗鬆症のための認められた治療法である。
【０００６】エストロゲンは低レベルで投与したときに
骨に有益な効果を有するが、長期のエストロゲン置換療
法は種々の疾患に関与している(子宮および乳癌の危険
の増大を含む)。これらの重度の副作用は多くの女性が
この治療を辞退する原因となっている。プロゲストゲン
とエストロゲンの組合せを投与するなどの癌の危険を減
少させるように設計された別の治療処方は、一部の患者
が規則的な撤退出血を経験する原因となり、これはほと
んどの老齢女性にとって許容できるものではない。エス
トロゲン置換療法に付随するこれらの大きな望ましくな
い副作用に対する懸念、および存在する骨損失を逆転さ
せるエストロゲンの能力の制限は、望ましくない副作用
を引き起こさない骨損失の別の有効な治療法の開発に対
する強い動機を与える。
【０００７】骨粗鬆症治療の別のアプローチは抗エスト
ロゲンを使用することである。通常、抗エストロゲンは
身体中のエストロゲンの活性を抑制する(それに拮抗す
る)。抗エストロゲンはエストロゲン受容体に結合する
が、抗エストロゲンとエストロゲン受容体の間の相互作
用にはエストロゲンが結合するドメインとは異なる受容
体のドメインが関与していると考えられている。一方、
一部の抗エストロゲンは、アゴニストとアンタゴニスト
の性質の混合物である薬理学的性質を示す。別の言い方
をすると、これらの化合物はエストロゲンに似た一定の
効果を引き起こすが、その一方でこの受容体を発現する
細胞においてエストロゲン投与に通常付随する他の効果
に拮抗する。一部の抗エストロゲンのこの混合した作用
の故に、これらはエストロゲン置換療法に付随する同一
の逆作用を免れない。
【０００８】このような混合したアゴニスト／アンタゴ
ニスト作用を示すことが知られている抗エストロゲンの
１つは、乳癌の治療に使用される薬物であるタモキシフ
ェンである。タモキシフェンは乳腫瘍の増殖を低下させ
るその能力においてエストロゲンアンタゴニストとして
作用するが、健康な女性および乳癌を有する女性の両者
において血清コレステロールの量を減少させるその能力
においてアゴニストとしても作用する[Loveら, Annals
Int.Med., 115, 860-864 (1991)]。また、タモキシフェ
ンは乳癌患者の骨密度を増加させるように作用する[Lov
eら, N.Eng.J.Med., 326, 852-856 (1991)]。少なくと
も１つの研究が、タモキシフェンによって可能な骨密度
の増加が腰椎に限定されるようであることを示唆してお
り、タモキシフェンで治療された一部の乳癌患者の橈骨
において骨損失が報告されている。さらに、タモキシフ
ェン治療は閉経後の女性の体重増に寄与することも示唆
されている[Loveら, Ann.Int.Med.；同上]。
【０００９】ネガティブな副作用を引き起こすことなく
骨密度の増加を達成する改良された抗骨粗鬆症物質が明
らかに必要とされている。しかし、残念ながら現在のと
ころ多数の化合物を迅速かつ効率的にスクリーニングし
て所望の抗骨粗鬆症作用を示す化合物を同定するための
方法は存在しない。このスクリーニング過程は、改良さ
れた抗骨粗鬆症化合物を同定する際に最も時間と費用の
かかる工程を含むので、多数の化合物を試験して抗骨粗
鬆症作用を持つ可能性のある化合物を同定するための迅
速な方法を開発することが極めて望ましい。
【００１０】エストロゲンは、最初にエストロゲン受容
体に結合し、次いでこのエストロゲン／エストロゲン受
容体コンプレックスがＤＮＡに結合することによって、
その効果を発揮することがよく確かめられている。この
ホルモン／受容体コンプレックスはこのＤＮＡ結合によ
って遺伝子発現を変調させる[Kumar, Cell, 55, 145-15
6 (1988)]。また、抗エストロゲンもエストロゲン受容
体に結合する。これらの抗エストロゲン／受容体コンプ
レックスはＤＮＡに結合するが、通常、これらは遺伝子
発現を変調させることはない。エストラジオール／エス
トロゲン受容体コンプレックスとヒドロキシタミクソフ
ェン／エストロゲン受容体コンプレックスの両方が、エ
ストロゲン応答要素と呼ばれるＤＮＡ結合ドメインにイ
ンビトロで結合する[Kumar, Cell；同上]。
【００１１】このリガンド／受容体コンプレックスの立
体配座はいくつか議論のあるところである。しかし、最
近の研究によると、エストラジオールに結合したエスト
ロゲン受容体と４−ヒドロキシタモキシフェンまたはＩ
ＣＩ １６４,３８４に結合した同一のエストロゲン受容
体の間の立体配座の相違が示唆されている[Klingeら,J.
Ster.Biochem.Mol.Biol., 43, 249-262 (1992)]。
【００１２】改良された抗骨粗鬆症物質を開発するとい
う課題に合理的に取り組む努力において、研究者らは骨
維持にある役割を果すことが知られているタンパク質を
研究した。骨の改造および骨の代謝回転に影響を与える
ことが知られているタンパク質の１つはトランスフォー
ミング増殖因子β(ＴＧＦβ)である。通常は単一の化合
物として言及されるが、実際はＴＧＦβは一群の分子で
あり、現在では少なくとも３つのイソ形態(ＴＧＦβ-
１、ＴＧＦβ-２およびＴＧＦβ-３)を含むことが知ら
れている[Arrickら, Canc.Res., 50, 299-303 (1990)を
参照]。本発明者は卵巣摘出がラット骨においてＴＧＦ
β-３の有意の減少を誘導することを知っており(本発明
者が集めたデータは未公表である)、他の者はＴＧＦβ
(イソ形態は特定されていない)のレベルに関して同じよ
うな関係を知っている[Finkelmanら, Proc.Nat'l.Acad.
Sci.USA, 89, 12190-12193 (1992)を参照]。さらに本発
明者は、抗エストロゲンであるラロキシフェンを卵巣摘
出ラットに投与すると、ＴＧＦβ-３濃度を対照動物で
観察されるレベルと等しいかまたはそれより高いレベル
まで回復させることを知っている。ＴＧＦβ-３レベル
とエストロゲンまたは抗エストロゲンの循環レベルの間
のこの直接的な関係、ならびにＴＧＦβ(イソ形態は特
定されていない)が骨の改造および代謝回転に重要な役
割を果すという発見は、骨粗鬆症がインビボでのＴＧＦ
β-３の発現の減少に起因しているのかもしれないとい
うことを示唆する[Nodaら, Endocrin., 12, 2991-2994
(1989)を参照]。
【００１３】ＴＧＦβ-３レベルの減少が骨損失を招く
のかもしれないという仮説は、ＴＧＦβが多くの供給源
から単離されており、広く分岐した作用を示すという知
見によって弱められる。例えば、それは間葉細胞および
上皮細胞の増殖を抑制し、それはプロテオグリカン、フ
ィブロネクチンおよびプラスミノーゲン活性化因子の生
合成を誘導し、そして線維芽細胞、マクロファージおよ
び平滑筋細胞に対して走化性である[Flaumenhaftら, J.
Cell.Bio., 120(4), 995-1002 (1993)を参照]。
【００１４】さらに、タモキシフェン(tamoxifen)また
はトレミフェン(toremifene)などの抗エストロゲンは、
ヒト胎児線維芽細胞を誘導してエストロゲン受容体の非
存在下でＴＧＦβ(イソ形態に関係なく)を分泌させる[C
ollettaら, Br.J.Cancer, 62, 405-409 (1990)]。ＴＧ
Ｆβは、骨芽細胞骨形成を刺激し、破骨細胞形成および
破骨細胞活性を抑制することがわかっている[Mundy,
「ＴＧＦβの臨床適用」,Ciba Foundation Symposium No.
157, 137-151, Wiley, Chichester]。ＴＧＦβは１つの
ヒト子宮内膜癌セルライン(Ishikawa)の分裂を抑制した
が、別のこのようなセルライン(ＨＥＣ-５０)に関して
は有糸分裂誘発性であることが示された[Murphyら, J.S
ter.Biochem.Molec.Bio., 41, 309-314 (1992)]。
【００１５】３カ月のタモキシフェンによる抗エストロ
ゲン治療が、乳癌バイオプシーにおける細胞外ＴＧＦβ
-１の誘導と関係付けられている[Buttaら, Cancer Re
s., 52, 4261-4264 (1992)]。ＴＧＦβ-１ mＲＮＡ濃度
の減少が、１％ ctＦＢＳを含有する培地(２回活性炭除
去したＦＢＳ)で増殖させた１つのヒト子宮内膜癌セル
ライン(ＨＥＣ-５０)において、この細胞をエストラジ
オールまたはある種の抗エストロゲンのどちらかに暴露
したときに観察された[Gongら, Canc.Res., 52,1704-17
09 (1992)]。
【００１６】ＴＧＦβ-２ mＲＮＡはＴ-４７ＤおよびＭ
ＤＡ-ＭＢ-２３１セルラインによって発現される。エス
トラジオールによるこれらセルラインの処理はＴＧＦβ
-２mＲＮＡの発現を減少させたが、タモキシフェンは同
じ作用を示さなかった。ＴＧＦβ-３は、ＴＧＦβ-１に
比べて３〜５倍高い割合で、骨芽細胞に富む骨細胞培養
物において有糸分裂、コラーゲン合成およびアルカリホ
スファターゼ活性を誘導する[Arrickら, Canc.Res., 5
0, 299-303 (1990)]。
【００１７】ＴＧＦβの性質の全般的な概説は、Sporn
ら[J.Cell Bio., 105, 1039-1045 (1987)]、Massague[C
ell, 49, 437-438 (1987)]、およびMoses[Cell, 63, 24
5-247(1990)]が記載している。これらの参考文献は、イ
ンビトロおよびインビボの系においてＴＧＦβによって
発揮される性質を広く記載している。
【００１８】上記の複雑な発現パターンは、種々のＴＧ
Ｆβイソ形態の発現調節の独特かつ複雑な機序を示唆す
る。遺伝子ＴＧＦβ-１、ＴＧＦβ-２およびＴＧＦβ-
３のそれぞれのプロモーター領域はクローン化され、記
載されている[Kimら, J.Biol.Chem., 264, 402-408 (19
89)；Nomaら, Growth Factors, 4, 247-255 (1991)；La
fyatisら, J.Biol.Chem., 265, 19128-19136 (1990)]。
【００１９】ＴＧＦβ-２およびＴＧＦβ-３のプロモー
ターは特徴付けられており、cＡＭＰ応答要素、ＡＰ-１
部位、ＡＰ-２部位およびＳＰ-１部位を含むことが報告
されている。Nomaらは、ＴＧＦβ-２プロモーター活性
が研究したプロモーターの領域および誘導検定に選択し
たセルラインに依存することを示した。
【００２０】多数の化合物の生物学的活性を効率的にス
クリーニングするための少なくとも１つの方法が国際特
許出願 Ｎo. ＰＣＴ／ＵＳ９２／００４１９に記載され
ており、成長因子の発現を転写によって調節するための
方法が特許請求されている。この特許は、ヒト成長ホル
モン遺伝子、c-ＥrbＢ２遺伝子のプロモーター領域、Ｋ
-ras配列のプロモーター領域、ならびにサイトメガロウ
イルスの初期プロモーターおよびエンハンサーにより転
写を誘導することができる化合物を同定するための検定
を開示している。この出願は、主として種々の腫瘍遺伝
子の調節を決定するという課題に向けられている。
【００２１】現在まで、抗骨粗鬆症作用を示す可能性が
ある化合物を同定することは、疫学的研究、所望の効果
を達成する際の関連化学物質の利用、および他の時間の
かかる非効率的な方法に基づいて個々の化合物を実質的
にランダムに研究することを必要としている。現在のス
クリーニング法によって引き起こされる遅延および上記
のような非効率的な試験の経済的コストの両方が、さら
に研究するに値する可能性ある抗骨粗鬆症薬物を同定す
るための経済的かつ効率的な方法に対する必要性を高め
ている。
【００２２】図面の説明 図１および図２は、ＴＧＦβ-１遺伝子のプロモーター
領域を示す。図３、図４および図５は、ＴＧＦβ-２遺
伝子のプロモーター領域を示す。図６、図７、図８およ
び図９は、ＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター領域を示
す。図１０は、対照化合物、エストロゲン、ラロキシフ
ェン、およびタモキシフェンの存在下での、ＣＡＴ遺伝
子に機能的に結合させたＴＧＦβ-１プロモーター、Ｃ
ＡＴ遺伝子に機能的に結合させたＴＧＦβ-２プロモー
ター、またはＣＡＴ遺伝子に機能的に結合させたＴＧＦ
β-３プロモーターを含有する発現構築物でトランスフ
ェクションした細胞におけるリポーター遺伝子の相対的
な発現レベルを示す。通常、ＴＧＦβ-３構築物を含有
する細胞が最も高レベルのリポーター遺伝子を発現し、
次いでＴＧＦβ-２構築物、そしてＴＧＦβ-１構築物を
含有する細胞が続く。図１１および図１２は、エストロ
ゲン、ラロキシフェン、およびエストロゲンとラロキシ
フェンの組合せの存在下、エストロゲン応答要素または
ＴＧＦβ-３プロモーターの部分のどちらかの支配下で
のリポーター遺伝子の誘導を示す。この図は、２種類の
調節配列によって発揮される顕著に異なる調節パターン
を示す。
【００２３】図１３は、ＴＧＦβ-３プロモーター配列
の部分を含有する発現構築物でトランスフェクションさ
れ、エストロゲン受容体の存在下および非存在下に対照
化合物、エストロゲン、ラロキシフェン、およびエスト
ロゲンとラロキシフェンの組合せに暴露された細胞にお
けるリポーター遺伝子発現の相対的レベルを示す棒グラ
フである。エストロゲン受容体は、エストロゲンおよび
抗エストロゲンの両方によるリポーター遺伝子の発現の
誘導に必要である。図１４は、実施例１１に挙げた削除
構築物によって発現されるエストロゲン受容体(ＥＲ)タ
ンパク質の種々のドメインを示す。さらに、ＴＧＦβ-
３プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を含有する発現
構築物および種々の突然変異ＥＲでトランスフェクショ
ンされた細胞において達成しうる相対的な誘導倍率が示
されている。図１５は、種々濃度のエストラジオール、
ラロキシフェン、タモキシフェン、およびＩＣＩ １６
４,３８４の存在下、ＴＧＦβ-３プロモーターとＣＡＴ
遺伝子を含有する発現構築物でトランスフェクションさ
れた細胞において達成しうるリポーター遺伝子発現のレ
ベルを示す。通常、ラロキシフェンが全ての濃度におい
て最も強力な誘導物質であり、次いでＩＣＩ １６４,３
８４、タモキシフェンが続く。エストロゲンはこの系に
おいて最も弱い誘導物質である。
【００２４】図１６は、種々濃度のエストラジオールお
よびラロキシフェンの存在下、ＴＧＦβ-３プロモータ
ーの部分とルシフェラーゼ遺伝子を含有する発現構築物
でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞におけるリポ
ーター遺伝子の相対的な発現を示す。通常、ラロキシフ
ェンが低濃度の場合を除いて比較的強力な誘導物質であ
る。図１７は、種々濃度のエストラジオールおよびラロ
キシフェンの存在下、ＴＧＦβ-３プロモーターとルシ
フェラーゼ遺伝子を含有する発現構築物でトランスフェ
クションされたＭＣＦ-７細胞におけるリポーター遺伝
子の相対的な発現を示す。ラロキシフェンが全ての濃度
において比較的強力な誘導物質である。図１８は、実施
例１０で評価した化合物の化学構造を示す。図１９は、
ＴＧＦβ-３プロモーター／ＣＡＴ発現構築物でトラン
スフェクションされ、種々濃度の実施例１０に挙げた化
合物に暴露されたＭＧ６３細胞におけるリポーター遺伝
子発現の相対的な誘導レベルを示す。全体として化合物
１７７３６６が最も強力な誘導物質であり、一方、９８
００５は誘導を示さない。
【００２５】図２０は、４１塩基対のラロキシフェン応
答要素を同定するために用いたＴＧＦβ-３プロモータ
ーの部分を示し、リポーター遺伝子に機能的に結合させ
たＴＧＦβ-３プロモーター配列のこれら表示した部分
を含有するプラスミドで形質転換した細胞におけるラロ
キシフェンによるリポーター遺伝子発現の相対的な誘導
を示す。pＢ-３０１構築物によって達成しうる誘導倍率
が最も高いが、ラロキシフェン応答要素(塩基対 ＋３５
〜＋７５)の存在がこれら細胞におけるラロキシフェン
による転写の有意の誘導に必須であることが明らかであ
る。図２１は、ＴＧＦβ-３プロモーターの分析を示
す。主要な転写開始部位およびＣＣＣＴＣ−モチーフが
実施例１１で説明するように描かれている。図２２は、
エストロゲン受容体と種々濃度のエストラジオールおよ
びラロキシフェンの存在下、ＬＤＬＲプロモーターとル
シフェラーゼ遺伝子を含有する発現構築物でトランスフ
ェクションされたＨep２細胞におけるリポーター遺伝子
の相対的な発現を示す。通常、ラロキシフェンが比較的
強力な誘導物質である。
【００２６】図２３は、種々濃度のエストラジオールお
よびラロキシフェンの存在下であってエストロゲン受容
体の非存在下、ＬＤＬＲプロモーターとルシフェラーゼ
遺伝子を含有する発現構築物でトランスフェクションさ
れたＨep２細胞におけるリポーター遺伝子の相対的な発
現を示す。高濃度のラロキシフェンが発現を若干誘導す
るが、このことはこのような濃度における別の非-ＥＲ
依存性の誘導機序を示唆する。図２４は、本発明の教示
に従って、ある化合物群を、本明細書中で説明した調節
コントロール要素に機能的に結合させたリポーター遺伝
子の転写を誘導するそれらの能力について評価するため
に実施することができる工程の順序を例示する工程図で
ある。実施例１３に記載する誘導プロフィールを示す化
合物とインビボで抗骨粗鬆症薬物として作用するこれら
化合物の能力の間にある関係が存在すると予想される。
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】本発明によれば、ある
化合物群をスクリーニングしてこれら化合物がラロキシ
フェン応答要素を含有するプロモーターからのステロイ
ドホルモン応答性遺伝子発現を変調させることができる
か否かを決定するための新規かつ効率的な方法が提供さ
れる。また、実質的にＴＧＦβ遺伝子のプロモーター領
域から単離したラロキシフェン応答要素を含有するヌク
レオチド配列からなる核酸、および該核酸でトランスフ
ェクションされた真核細胞が提供される。さらに、リポ
ーター遺伝子に機能的に結合させたラロキシフェン応答
要素を含有する組換え発現構築物が提供される。また、
エストロゲン受容体に結合したときにＴＧＦβ遺伝子の
プロモーター領域のラロキシフェン応答要素からの転写
を強力に誘導する化合物を投与することからなる、骨形
成を誘導するための方法、骨粗鬆症を治療するための方
法、および骨折を治療するための方法が提供される。
【００２８】
【課題を解決するための手段】本発明は、ある化合物群
をスクリーニングしてこれら化合物が本発明により発見
され本明細書中に記載するようなラロキシフェン応答要
素を含有する哺乳動物プロモーターからのステロイドホ
ルモン応答性遺伝子発現を変調させることができるか否
かを決定するための新規かつ効率的な方法に関する。本
発明は、実質的にこのようなラロキシフェン応答要素を
含有する哺乳動物プロモーターのヌクレオチド配列から
なる核酸を包含する。好ましい態様においては、このラ
ロキシフェン応答要素を含有するプロモーターは、ヒト
ＴＧＦβ-３またはＴＧＦβ-２の遺伝子のプロモーター
領域から導かれる。
【００２９】また本発明は、リポーター遺伝子に機能的
に結合させたラロキシフェン応答要素を保持するプロモ
ーターを含有する組換え真核性発現構築物を包含する。
好ましい態様においては、このリポーター遺伝子は、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子である。特に好ましいのは
ルシフェラーゼ遺伝子である。さらに本発明は、細胞が
ラロキシフェンまたは他の抗エストロゲン性化合物に暴
露されたときにリポーター遺伝子を発現させることがで
きる上記の真核性発現構築物でトランスフェクションさ
れた細胞をも提供する。
【００３０】さらに、本発明は骨形成を誘導するための
方法であって、エストロゲン受容体に結合したときにＴ
ＧＦβ-３遺伝子のプロモーター領域のラロキシフェン
応答要素からの転写を強力に誘導する化合物の有効量を
投与することからなる方法を包含する。また、本発明は
骨粗鬆症を治療するための方法であって、エストロゲン
受容体に結合したときにＴＧＦβ-３遺伝子のプロモー
ター領域のラロキシフェン応答要素からの転写を強力に
誘導する化合物の有効量を投与することからなる方法を
包含する。さらに、本発明は骨折を治療するための方法
であって、エストロゲン受容体に結合したときにＴＧＦ
β-３遺伝子のプロモーター領域のラロキシフェン応答
要素からの転写を強力に誘導する化合物の有効量を投与
することからなる方法を包含する。
【００３１】第１の態様において、本発明は、ラロキシ
フェン応答要素[この要素は、哺乳動物(好ましくはヒ
ト)トランスフォーミング増殖因子β遺伝子のプロモー
ター領域から単離される]を含有するヌクレオチド配列
により実質的に構成される核酸を提供する。好ましい態
様においては、このトランスフォーミング増殖因子β遺
伝子はヒトＴＧＦβ-２遺伝子またはヒトＴＧＦβ-３遺
伝子である。本発明のこの態様のさらに好ましい態様に
おいては、この核酸は本明細書中でさらに詳しく説明す
るように、プラスミドpＢ-３０１(ＴＧＦβ-３プロモー
ター配列の−３０１〜＋１１０位を含有する)；pＢ-２
２１(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−２２１〜＋１１
０位を含有する)；pＢ-９１(ＴＧＦβ-３プロモーター
配列の−９１〜＋１１０位を含有する)；pＢ-６０(ＴＧ
Ｆβ-３プロモーター配列の−６０〜＋１１０位を含有
する)；pＢ-４７(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−４
７〜＋１１０位を含有する)；およびpＢ-３８(ＴＧＦβ
-３プロモーター配列の−３８〜＋１１０位を含有する)
中に示されるようにＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター
配列により実質的に構成される。
【００３２】第２の態様において、本発明は、リポータ
ー遺伝子に機能的に結合させたラロキシフェン応答要素
[この要素は、哺乳動物(好ましくはヒト)トランスフォ
ーミング増殖因子β遺伝子のプロモーター領域から単離
される]を含有するヌクレオチド配列により実質的に構
成される核酸を含有する組換え発現構築物を提供する。
好ましい態様においては、このトランスフォーミング増
殖因子β遺伝子はヒトＴＧＦβ-２遺伝子またはヒトＴ
ＧＦβ-３遺伝子である。好ましい態様においては、こ
のリポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子
である。特に好ましいのはルシフェラーゼ遺伝子であ
る。本発明のこの態様のさらに好ましい態様において
は、この核酸はＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター配列
により実質的に構成されるプロモーター配列を含有し、
本明細書中でさらに詳しく説明するようにリポーター遺
伝子に機能的に結合しており、プラスミドpＢ-３０１
(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−３０１〜＋１１０位
を含有する)；pＢ-２２１(ＴＧＦβ-３プロモーター配
列の−２２１〜＋１１０位を含有する)；pＢ-９１(ＴＧ
Ｆβ-３プロモーター配列の−９１〜＋１１０位を含有
する)；pＢ-６０(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−６
０〜＋１１０位を含有する)；pＢ-４７(ＴＧＦβ-３プ
ロモーター配列の−４７〜＋１１０位を含有する)；お
よびpＢ-３８(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−３８〜
＋１１０位を含有する)からなる。
【００３３】別の態様において、本発明の組換え発現構
築物は、このような構築物でトランスフェクションされ
た真核細胞においてこのような構築物によりコードされ
ているリポーター遺伝子を発現させることができる。好
ましい態様において、このような真核細胞はエストロゲ
ン受容体タンパク質またはその突然変異体をさらに発現
する。特に好ましい態様においては、本発明の組換え発
現構築物によるリポーター遺伝子の発現を、ラロキシフ
ェンまたは本明細書中で規定するような他の抗エストロ
ゲン性化合物を用いて該細胞を処理することによって誘
導することができる。
【００３４】本発明の第３の態様は、本発明の組換え発
現構築物が導入された真核細胞を提供する。好ましい態
様においては、この真核細胞は本発明の組換え発現構築
物でトランスフェクションされた細胞である。好ましい
態様において、本発明の真核細胞はエストロゲン受容体
タンパク質またはその突然変異体を発現する。特に好ま
しい態様においては、このような細胞中でのリポーター
遺伝子の発現を、ラロキシフェンまたは本明細書中で規
定するような他の抗エストロゲン性化合物を用いて該細
胞を処理することによって誘導することができる。
【００３５】また本発明は、多数の化合物をスクリーニ
ングして抗骨粗鬆症薬物としての可能性を有する化合物
を同定するための方法を提供する。本発明のこの態様の
１つの態様においては、多数の化合物をスクリーニング
して抗骨粗鬆症薬物としての可能性を有する化合物を同
定するための方法が提供される。本発明のこの態様によ
って提供される方法は、哺乳動物プロモーターのラロキ
シフェン応答要素からの転写を誘導することができ、特
異的な転写誘導物質であり、哺乳動物プロモーターのエ
ストロゲン応答要素からの転写を誘導することができ
ず、そして抗エストロゲン性または非エストロゲン性化
合物である、多数の化合物を同定することからなる。こ
の態様によって提供される方法はさらに次の工程を包含
する： (a)化合物が哺乳動物プロモーターのラロキシフェン応
答要素からの転写を誘導しうることについて検定し； (b)化合物がラロキシフェン応答要素を持たない哺乳動
物プロモーターからの転写を誘導しえないことについて
検定し； (c)化合物がエストロゲン応答プロモーターからの転写
を誘導しえないことについて検定し；そして (d)化合物がエストロゲン応答プロモーターからのエス
トロゲン誘導の転写をエストロゲンの存在下に阻害しう
ることについて検定する。
【００３６】好ましい態様においては、上記(a)の検定
は、ラロキシフェン応答要素を含有する哺乳動物プロモ
ーターに機能的に結合させたリポーター遺伝子の発現を
誘導する化合物の能力を測定する工程からなる。別の好
ましい態様においては、上記(b)の検定は、プロモータ
ーがラロキシフェン応答要素によって構成されていない
哺乳動物プロモーターに機能的に結合させたリポーター
遺伝子の発現を誘導する化合物の能力がないことを測定
する工程からなる。本発明のこの態様のさらに別の好ま
しい態様は、エストロゲン応答哺乳動物プロモーターに
機能的に結合させたリポーター遺伝子の発現を誘導する
化合物の能力がないことを測定する工程からなる上記
(c)の検定を提供する。最後の好ましい態様において
は、本発明は、エストロゲン応答哺乳動物プロモーター
に機能的に結合させたリポーター遺伝子の発現のエスト
ロゲン依存性誘導をエストロゲンの存在下に阻害する化
合物の能力を測定する工程からなる上記(d)の検定を提
供する。
【００３７】本発明のこの態様の特に好ましい態様にお
いては、ラロキシフェン応答哺乳動物プロモーターは哺
乳動物(特に、ヒト)のトランスフォーミング増殖因子β
遺伝子から単離される。最も好ましいのは、このトラン
スフォーミング増殖因子β遺伝子がヒトＴＧＦβ-２遺
伝子またはヒトＴＧＦβ-３遺伝子である態様である。
他の好ましい態様においては、このリポーター遺伝子
は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子である。本発明のこ
の態様のさらに好ましい態様においては、ラロキシフェ
ン応答プロモーター配列は実質的にＴＧＦβ-３遺伝子
のプロモーター配列からなり、本明細書中でさらに詳し
く説明するようにリポーター遺伝子に機能的に結合して
おり、プラスミドpＢ-３０１(ＴＧＦβ-３プロモーター
配列の−３０１〜＋１１０位を含有する)；pＢ-２２１
(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−２２１〜＋１１０位
を含有する)；pＢ-９１(ＴＧＦβ-３プロモーター配列
の−９１〜＋１１０位を含有する)；pＢ-６０(ＴＧＦβ
-３プロモーター配列の−６０〜＋１１０位を含有す
る);pＢ-４７(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−４７〜
＋１１０位を含有する)；およびpＢ-３８(ＴＧＦβ-３
プロモーター配列の−３８〜＋１１０位を含有する)か
らなる。
【００３８】本発明の特に好ましい態様は、以下の特定
の好ましい態様のさらに詳しい説明および特許請求の範
囲から明らかとなるであろう。本明細書は多数の短縮形
を含んでいる。本明細書で用いる「ＴＧＦβ」はトラン
スフォーミング増殖因子β(イソ形態に言及しない)を意
味する。ＴＧＦβ-１、ＴＧＦβ-２およびＴＧＦβ-３
は当分野で十分に確立された意味を有する。即ち、トラ
ンスフォーミング増殖因子β遺伝子の３種の既知のイソ
形態を表す。本明細書中で用いる「ＣＡＴ」なる短縮形
は、クロラムフェニコールアセチルＣoＡトランスフェ
ラーゼを意味する。「エストラジオール」は１つのエス
トロゲンであり、本明細書中においてＥ２と短縮形で表
すこともある。本明細書中で用いる「ＥＲ」なる短縮形
は、エストロゲン受容体タンパク質を意味する。
【００３９】本明細書中で用いる「ラロキシフェン応答
要素」なる用語は、ラロキシフェンおよびエストロゲン
受容体タンパク質に暴露された宿主細胞において、この
ラロキシフェン応答要素が機能的に結合された任意の構
造遺伝子の転写を誘導することができるＴＧＦβ遺伝子
の哺乳動物プロモーター領域を含有する核酸のヌクレオ
チド配列を意味する。ラロキシフェン応答要素には、本
明細書中でさらに詳しく説明するように、プラスミドp
Ｂ-３０１(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−３０１〜
＋１１０位を含有する)；pＢ-２２１(ＴＧＦβ-３プロ
モーター配列の−２２１〜＋１１０位を含有する)；pＢ
-９１(ＴＧＦβ-３プロモーター配列の−９１〜＋１１
０位を含有する)；pＢ-６０(ＴＧＦβ-３プロモーター
配列の−６０〜＋１１０位を含有する)；pＢ-４７(ＴＧ
Ｆβ-３プロモーター配列の−４７〜＋１１０位を含有
する)；およびpＢ-３８(ＴＧＦβ-３プロモーター配列
の−３８〜＋１１０位を含有する)のＴＧＦβプロモー
ター配列を含有するヌクレオチド配列、ならびにこれら
核酸と実質的に同じ生物学的活性を有する核酸が含まれ
るが、これらに限定はされない。この定義は、ＴＧＦβ
遺伝子のプロモーター領域中の天然のアレル変異体を包
含することが意図されている。本発明の単離されたラロ
キシフェン応答要素はあらゆる起源の哺乳動物種のＴＧ
Ｆβプロモーターから得ることができるが、ヒト起源も
のであるのが好ましい。
【００４０】本明細書中で用いる「抗エストロゲン」
は、完全および部分的なエストロゲンのアンタゴニスト
を含むことが意図されている。本明細書中に記載する実
施例において用いたエストラジオールの全ては１７β−
エストラジオールである。
【００４１】「有効量」なる用語は、哺乳動物に投与し
てエストロゲン受容体に結合したときに、ラロキシフェ
ン応答要素からの転写を誘導することができる化合物の
量を表す。投与される化合物の具体的な量はその症例を
取り巻く特定の要因によって決定され、これら要因には
投与される化合物、投与経路、治療される具体的な症
状、および同様の考慮事項が含まれる。
【００４２】「強力に」なる用語は、化合物を本明細書
中に記載するインビトロ検定において試験し、エストロ
ゲン受容体に結合させたときに、１０nＭ(１ｘ１０
-8Ｍ)に等しいかまたはそれ未満の最小有効濃度(ＭＥ
Ｃ)でラロキシフェン応答要素からの転写を誘導する化
合物を表す(実施例５、６、１０および１４を参照)。
【００４３】プロモーター配列の全ての部分が、この遺
伝子の主な転写開始部位からの距離(ヌクレオチド数)で
識別されており、図１〜図９に示すようにこの開始部位
を＋１としている。数の前の負の記号(−)はヌクレオチ
ドが開始部位の５'側にあることを示し、数の前の正の
記号(＋)はヌクレオチドが開始部位の３'側にあること
を示す。また、これらの配列は配列番号１〜３に示す番
号付与によっても識別され、図１〜図９の番号付与と明
確に関連している。
【００４４】本発明のラロキシフェン応答要素をコード
しているＤＮＡは、本明細書中の開示に鑑みて、化学合
成、インビトロ増幅[ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を
含むが、これに限定はされない]、またはこれら方法の
組合せによって、天然の供給源、例えば哺乳動物細胞の
培養物、このような細胞からのゲノムＤＮＡ、またはこ
のようなＤＮＡのライブラリーから得ることができる。
【００４５】ラロキシフェン応答要素をリポーター遺伝
子に機能的に結合させるのが好都合であり、当分野で周
知の適当なベクター、構築物、および手段(例えば、Ｄ
ＮＡ媒介の遺伝子転移手段であり、トランスフェクショ
ン、電気穿孔およびウイルス媒介感染を含むがこれらに
限定はされない)を使用することによって、適当な宿主
細胞を一時的または安定に形質転換するのに用いること
ができる。本明細書中で用いる「組換え発現構築物」な
る用語は、本発明のラロキシフェン応答要素が機能的に
結合したリポーター遺伝子の発現を指令することができ
るＤＮＡ構築物を意味することが意図されている。
【００４６】複数のＤＮＡ領域は、それらが互いに機能
的に関連しているときに機能的に結合されている。例え
ば、プロモーターはそれが暗号配列の転写を支配するな
らばその暗号配列に機能的に結合しており、リボソーム
結合部位はそれが翻訳を可能にするように設置されてい
るならば暗号配列に機能的に結合している。一般に、機
能的に結合とは隣接していることを意味する。
【００４７】リポーター遺伝子とは、通常の手段(例え
ば、酵素活性の測定、比色定量法、化学発光、試料中の
放射活性の存在、ＥＬＩＳＡ、抗体結合、放射免疫検
定、または当業者に既知の他の定量法)によって定量す
ることができる構造タンパク質をコードしている遺伝子
である。使用されるリポーター遺伝子は、選択した宿主
および選択した形質転換法に依存して変わるであろう。
有用なリポーター遺伝子には、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または他のあ
らゆる定量可能なタンパク質産物が含まれるが、これら
に限定はされない。本発明の好ましい態様においては、
このリポーター遺伝子はルシフェラーゼである。
【００４８】トランスフェクションされた細胞とは、組
換えＤＮＡ法を用いて調製されたラロキシフェン応答要
素−リポーター遺伝子組換え発現構築物でトランスフェ
クションされた細胞である。細胞の特性としてまたはエ
ストロゲン受容体をコードする発現構築物の同時トラン
スフェクションによりエストロゲン受容体を発現する、
組換えラロキシフェン応答要素−リポーター遺伝子発現
構築物でトランスフェクションされた細胞は、適当な環
境下(即ち、抗エストロゲンまたは他の誘導物質への暴
露)でリポーター遺伝子の遺伝子産物を発現するであろ
う。例えば、本発明において使用するのに適した好まし
いセルラインであるＭＣＦ-７は、エストロゲン受容体
を構成的に発現する。このようなセルラインに対して
は、組換えラロキシフェン応答要素−リポーター遺伝子
発現構築物の単独によるトランスフェクションによっ
て、本発明において使用するのに適した細胞が得られる
であろう。また、ＭＧ６３細胞は、ラロキシフェン応答
要素−リポーター遺伝子発現構築物およびエストロゲン
受容体発現構築物で同時トランスフェクションしたとき
にのみ、ラロキシフェンに依存してリポーター遺伝子を
発現する。
【００４９】多細胞生物から導いた細胞の培養物は、ラ
ロキシフェン応答要素−リポーター遺伝子発現構築物の
発現のための望ましい宿主である。原則的に、エストロ
ゲン受容体を天然に発現するかまたはエストロゲン受容
体(または、この受容体の一部)を発現するように遺伝的
に修飾されたあらゆる高等真核細胞培養物が使用可能で
ある。実施例中に示すように、哺乳動物細胞が好まし
い。細胞培養におけるこのような細胞の増殖は常法とな
っている[Tissue Cul ture, Academic Press, Kruse & P
atterson編 (1973)を参照]。有用な宿主セルラインの例
は、ＭＣＦ-７、ＭＧ６３、ＨeＬa、ＲＬ９５.２、Ｈep
Ｇ２およびＣＨＯ細胞である[これらの全てがAmerican
Type Culture Collection (Rockville, Maryland)から
入手可能である]。本発明の目的のためには、ＭＣＦ-７
セルラインがエストロゲン受容体を構成的に発現するの
で、このセルラインの使用が特に好ましい。
【００５０】エストロゲン受容体またはこの受容体の一
部を発現し、ラロキシフェン応答要素−リポーター遺伝
子発現構築物を含有する宿主細胞を用いて、後記実施例
に記載するようにラロキシフェン応答要素によって転写
を誘導する能力について化合物を評価することができ
る。本発明の好ましい態様においては、化合物の存在下
でのリポーター遺伝子の転写が化合物の非存在下での発
現に比較して２倍に増加したときに、化合物は調節要素
(ＴＧＦβプロモーターから導いた核酸またはその削除
構築物を含むが、これらに限定はされない)による転写
を誘導したとみなされる。好ましさは劣るが、化合物が
転写を対照の５０％以上のレベルで誘導したときに、化
合物は転写誘導物質と見なされる。しかし、通常はバッ
クグラウンドを越える検出可能な誘導は、化学物質によ
る誘導を示すに足るものである。
【００５１】スクリーニング法に関する本発明の態様
(実施例１３を参照)の実施には、プラスミドpＢ-３０１
によって示されるラロキシフェンに対する高レベルの応
答性の故に、このプラスミドの使用が好ましい。他の態
様は、−３８〜＋７５位を包含するＴＧＦβ-３プロモ
ーター領域を含有する構築物を利用する。本発明の全て
の機能的な態様において、ラロキシフェン応答要素が転
写を可能にするようにリポーター遺伝子に機能的に結合
されるが、これはこの要素が本明細書中に記載したラロ
キシフェン応答誘導を可能にするために必要であるため
である。
【００５２】本発明のスクリーニング法の各工程を実施
する順序は変化してよく、ある場合にはこれら工程の一
部を削除してもよい。以下に挙げる実施例は、本発明の
特定の態様およびその種々の使用を説明するものであ
る。これらは説明のためにのみ挙げたものであって、本
発明を限定するものと理解すべきではない。
【００５３】
【実施例】実施例１ リポータープラスミドの構築 Ａ．ｐｈＴＧ１２、ｐＴＧＦ−１およびｐＢ−４９９ 可能性ある抗骨粗鬆症薬物をスクリーニングするのに有
用なセルラインを開発する際の第１段階として、クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(Ｃ
ＡＴ)[Gormanら, Molec.Cell.Biol., 2, 1044-1051 (19
82)]をコードし、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２およびＴ
ＧＦβ−３遺伝子のプロモーター配列に機能的に結合し
た一連のリポータープラスミドをＡ.Ｒoberts [Nationa
l Institutes of health, Laboratory of chemoprevent
ion (NIH/NCI,Bethesda,MD)]から入手した。これらのプ
ラスミドは各々ｐｈＴＧ(ＴＧＦβ−１)、ｐＴＧＦ−１
(ＴＧＦβ−２)およびｐＢ−４９９(ＴＧＦβ−３)と命
名した。これらのプロモーターの各配列は[Kimら, J.Bi
ol.Chem., 264, 402-408 (1989)(ＴＧＦβ−１)；Noma
ら, Growth Factor, 4, 247-255 (1991)(ＴＧＦβ−
２)；およびLafyatisら, J.Biol.Chem., 265, 19128-19
136 (1990)(ＴＧＦβ−３)]に示されている。ＴＧＦβ
−１遺伝子のプロモーター配列はＧenＢank／ＥＭＢＬ
データバンクに登録番号Ｊ０４４３１で提出されてい
る。ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２およびＴＧＦβ−３の
プロモーター配列は各々図１〜図９に、ならびに配列番
号１、２および３として示されている。
【００５４】また、各々のＴＧＦβプロモーター配列に
機能的に結合したＣＡＴ含有リポータープラスミドは、
通常のクローニング技術を用いて、市販品から入手可能
なＣＡＴ構築物、例えば、ｐＣＡＴ−Ｂasic (Promega,
Madison, WI)中に各ＴＧＦβプロモーターをサブクロ
ーニングすることによって得ることができる[Sambrook,
Fritsch,Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory
Manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Sp
ring Harbor, New York (以後Sambrookら)を参照]。
【００５５】抗エストロゲンであるラロキシフェンに応
答するＴＧＦβ−３遺伝子プロモーターの領域を同定す
るために、ＴＧＦβ−３遺伝子プロモーターの部分配列
を含む構築物によって指令されるＣＡＴリポーター遺伝
子の発現を分析した。６種のＴＧＦβ−３プロモーター
削除／ＣＡＴリポーター構築物をＡ.Ｒobertsから入手
した。プラスミドの命名とこれらプラスミドの各々に含
まれるプロモーター領域の範囲を以下に挙げる。 ・ｐＢ−３０１：−３０１〜＋１１０ (図６〜図９お
よび配列番号３に示された１８９６〜２３０６に相当す
る)； ・ｐＢ−２２１：−２２１〜＋１１０ (図６〜図９お
よび配列番号３に示された１９７６〜２３０６に相当す
る)； ・ｐＢ−９１ ：−９１〜＋１１０ (図６〜図９お
よび配列番号３に示された２１０６〜２３０６に相当す
る)； ・ｐＢ−６０ ：−６０〜＋１１０ (図６〜図９お
よび配列番号３に示された２１３７〜２３０６に相当す
る)； ・ｐＢ−４７ ：−４７〜＋１１０ (図６〜図９お
よび配列番号３に示された２１５０〜２３０６に相当す
る)； ・ｐＢ−３８ ：−３８〜＋１１０ (図６〜図９お
よび配列番号３に示された２１５９〜２３０６に相当す
る)。
【００５６】さらに２種のＴＧＦβ−３プロモーター削
除構築物を以下に説明するように構築した。最初の構築
物はプロモーター配列の−３８〜＋７５位に相当し、図
６〜図９および配列番号３に示された２１５９〜２２７
１[Lafyatisら；同上を参照]に相当するヒトＴＧＦβ−
３プロモーター領域配列から成る。第２のプロモーター
削除構築物はプロモーター配列の−３８〜＋３５位に相
当し、図６〜図９および配列番号３に示された２１５９
〜２２３１に相当するヒトＴＧＦβ−３プロモーター領
域配列から成る。当分野で確立された常法により、転写
開始部位からの距離によって同定した全てのプロモータ
ー配列を同定する。
【００５７】これらのプラスミドを次のように創製し
た。各プラスミドにおいて必要なＴＧＦβ−３プロモー
ター配列の範囲に相当するオリゴヌクレオチドを、製造
元指定のβ−シアノエチルホスホアミダイト合成条件下
で、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置[Model394，Applied Biosy
stems Inc. (Foster City, CA)]を用いて合成した。通
常の方法[Sambrookら、同上]を用い、各プラスミド構築
物に対する相補性オリゴヌクレオチド対を合成し、精製
し、混合し、そしてアニールリングさせて、適当なＴＧ
Ｆβ−３プロモーター配列に相当する二本鎖ＤＮＡを形
成させた。配列の５'末端と３'末端の各々に適切な突出
末端としてＨindIIIおよびＸbaI制限酵素認識部位を合
成した。次いで、二本鎖プロモーター配列を、ＨindIII
／ＸbaI切断したＣＡＴリポータープラスミドｐＢ−３
０１中に連結し、標準条件下で細菌中にて増殖させた。
このようにして得たＴＧＦβ−３プロモーターの−３８
〜＋７５領域を含むリポータープラスミドをｐＴＧＦβ
＋７５ＣＡＴと呼び、ＴＧＦβ−３プロモーターの−３
８〜＋７５領域を含むプラスミドをｐＴＧＦβ＋３５Ｃ
ＡＴと呼ぶ。これらのプラスミドを下記の実施例５に記
載のようにＣＡＴ分析に用いた。
【００５８】Ｂ．ＴＧＦβ−３プロモーター削除構築物
を含むルシフェ ラーゼリポータープラスミド(プロモー
ター領域部分を含 まない対照を含む)：ｐＴＧＦβ−３
０１ＬＵＣ、ｐＴＧ Ｆβ−３８ＬＵＣ、ｐＴＧＦβ＋７
５ＬＵＣ、ｐＴＧＦβ＋３５ＬＵＣ、およびｐＬＵＣ ＴＧＦβ−３プロモーター配列の転写制御下で発現され
るルシフェラーゼ遺伝子(ＲＥＦ)を含み、そしてその削
除誘導体からなる４種のプラスミドを構築した。プラス
ミドｐＴＧＦβ−３０１ＬＵＣは、ｐＢ−３０１をＨin
dIIIで切断し、次いでこのＨindIII切断により生成した
突出末端を細菌性ＤＮＡポリメラーゼＩのＫlenow断片
(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)で処理して
平滑にすることによって作製した。次にＸbaI切断を行
って−３０１〜＋１１０位に相当するＴＧＦβ−３プロ
モーター部分を遊離させた。この断片をＳmaI／ＸbaI切
断したｐＳＰ７３(Promega)中にサブクローニングし、
シャトルベクターｐＳＰＴＧＦβ−３０１を得た。
【００５９】細菌中でのインビボ増幅の後、単離して、
精製したｐＳＰＴＧＦβ−３０１の調製物をＮdeIおよ
びＨindIIIで切断し、プロモーター配列を含む断片を、
０.８％アガロースゲル(BRL-LifeTechnologies, Inc.,
Gaithersburg, MD)で分離した後に、単離した。ルシフ
ェラーゼ含有構築物であるｐＬＤＬＲＬＵＣ１０[米国
特許出願Ｎo.０８／０１８,９８５(１９９３年３月３日
出願)および下記Ｃ項に記載]をＮdeI／ＨindIIIで切断
し、アガロースゲル電気泳動の後に、精製した。これら
の単離した断片を、混合し、連結し、そして細菌を形質
転換するのに用いた[Sambrookら；同上]。
【００６０】初めに、ＢamＨI／ＸbaI二重切断により各
々ｐＢ−３８、ｐＴＧＦβ＋７５ＣＡＴおよびｐＴＧＦ
β＋３５ＣＡＴからＴＧＦβ−３プロモーター配列を削
除することによって、プラスミドｐＴＧＦβ−３８ＬＵ
Ｃ、ｐＴＧＦβ＋７５ＬＵＣおよびｐＴＧＦβ＋３５Ｌ
ＵＣを作製した。ルシフェラーゼ含有プラスミドｐＧＬ
２−Ｂasic(または“ｐＧＬ２ＬＵＣ”)(Promega)をＮh
eI／ＢamＨIで切断し、上記の適当なＴＧＦβ−３プロ
モーター配列をルシフェラーゼ含有プラスミド中に連結
することによって各々の組換えプラスミドを作製した。
これらのプラスミドを下記の実施例６に記載のルシフェ
ラーゼ分析に用いた。
【００６１】ルシフェラーゼ遺伝子を含有するがＴＧＦ
β−３遺伝子部分を含有しない対照プラスミドは、ｐＴ
ＧＦβ＋７５ＬＵＣプラスミドＤＮＡを制限エンドヌク
レアーゼＸbaIおよびＨindIIIで切断することによって
構築した。突出末端を標準条件下、全４種のｄＮＴＰの
存在下にＫlenow酵素反応によって充填した(Sambrook
ら；同上)。こうして平滑化された末端を製造元提示条
件の下、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Boehringer Mannheim)で
連結させた。得られたプラスミドをｐＬＵＣと命名し
た。
【００６２】Ｃ．ＬＤＬＲプロモーター含有のリポータ
ープラスミド： ｐＬＤＬＲＬＵＣ１０ プラスミドｐＬＤＬＲＬＵＣ１０は米国特許出願Ｎo.０
８／０１８,９８５(１９９３年３月３日出願)(以下 '９
８５出願という)に記載されている。このプラスミドの
構築を以下に詳細に説明する。：ヒトＬＤＬ受容体プロ
モーターの１５４６塩基対配列をポリメラーゼ連鎖反応
を用いて増幅した。以下の合成オリゴヌクレオチド(各
々２０ｐモル)：
【化５】5'-GCGCCATATGAGTCTTAACTGCCAAAAATTCTTATCATC
AAT-3' （配列番号４） および 5'-AAGCAAGCTTTCGCAGCCTCTGCCAGGCAGTGTCCCGACCCGGA-3'
（配列番号５） および腺癌セルラインＰ３ＵＣＬＡから精製されたヒト
ゲノムＤＮＡ(１μｇ)、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
およびｄＴＴＰ(各２００μＭ)、Ｔaq ＤＮＡポリメラ
ーゼ(２．５Ｕ)、１０ｍＭ トリス塩酸(ｐＨ９.３)、５
０ｍＭ ＫＣl、１５ｍＭ ＭgＣl2、０.１％ゼラチンを
最終容量１００μｌで含む反応混合物を、１サイクルが
１５秒間９６°Ｃ、３０秒間５５°Ｃ、１分間７２°Ｃ
からなる３０サイクルにかけた。その試料を１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、１５４６塩基対(ｂｐ)のバン
ドを単離し、ＨindIIIおよびＮdeIで制限酵素切断し
た。この断片をプラスミドｐＳＰ７２(Promega)(予めＨ
indIIIおよびＮdeIで分解しておく)に連結した。得られ
たベクターｐＮＬＤＬＲＰをＮdeIおよびＨindIIIで切
断して、この試料を１％アガロースゲル電気泳動にか
け、１５４６塩基対のＬＤＬ受容体配列をそれから再単
離した。
【００６３】プラスミドベクターｐＳｖ２は、ＨindIII
およびＢglIIでプラスミドｐＳｖ２−グロビンを切断
し、ベクター中にＮruI−ＸhoIリンカーを連結すること
によって構築した。プラスミドｐＳｖ２−グロビンは米
国特許Ｎo.４,７７５,６２４に開示されている(本明細
書の一部を構成する)。このリンカーは次の配列を含ん
でいる：
【化６】5'-AGCTTCGCGACTCGAGA-3' （配列番号６） および 5'-GATCTCTCCAGTCGCGA-3' （配列番号７） 得られたベクターはＢamＨI部位、ＮruI部位、ＸhoI部
位およびＢglII部位を含むのでｐＳｖ２−ＨＮＸＢと命
名した。次いで、プラスミドｐＡｌｃ４(ＮＲＲＬ Ｂ−
１８７８３)[ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子(ＲＥＦ)を
含む]をプラスミドｐＳｖ２−ＨＮＸＢのＨindIII−Ｂg
lII部位に連結した。
【００６４】上記の１５４６塩基対の断片を単離し、そ
してホタル・ルシフェラーゼリポーター遺伝子を含有す
る予めＮdeIで完全にＨindIIIで部分的に制限酵素切断
しておいたベクターｐＳｖ２中にクローニングした。得
られたベクターｐＬＤＬＲＬＵＣ１０はホタル・ルシフ
ェラーゼ遺伝子の発現を指令するヒトＬＤＬ受容体プロ
モーターと、アンピシリン耐性マーカーおよび複製起点
を含む。
【００６５】実施例２ ヒト・エストロゲン受容体発現
プラスミド エストロゲン受容体を含む哺乳動物発現構築物ｐＣＭＶ
ＥＲおよびｐＲＳＶ−ＥＲをＢ.Ｓ.Ｋatzenellenbogen
[Department of Physiology and Biophysics, Universi
ty of Illinois (Urbana-Champaign, IL)]から入手した
[ReeseおよびKatzenellenbogen, J. Biol. Chem., 266,
10880-10887 (1990)を参照]。これらのプラスミドを、
例えば以下の実施例７に記載のように発現分析において
使用した。
【００６７】実施例３ エストロゲン応答要素／ルシフ
ェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドの構築 アフリカツメガエル(Xenopus laevis)・ビテロゲニンＡ
ｚ遺伝子プロモーター由来のエストロゲン応答要素(Ｅ
ＲＥ)に相当し、−３４１〜−３１０位に相当する相補
性オリゴヌクレオチド[Metzgerら, Nature, 344, 31-36
(1988)]を設計し、合成し、そしてアニーリングさせ
て、実質的に実施例１に記載のようにエストロゲン応答
要素である二本鎖領域を形成させた。ＸhoI制限酵素認
識部位を含む配列を、以下のヌクレオチド配列（各々配
列番号８および９で示す）を持つ要素、ＥＲＥ配列を囲
むように合成した：
【化７】5'-TCG-AGA-AAA-GTC-AGG-TCA-CAG-TGA-CCT-GAT
-CAA-AC-3' 3'-CT-TTT-CAG-TCC-AGT-GTC-ACT-GGA-CTA-GTT-TGA-GCT-
5' 二本鎖ＥＲＥをＸhoI切断ｐＧＬ１２−Ｂasic(Promega)
中にサブクローニングし、これによりルシフェラーゼ遺
伝子をＥＲＥの転写の影響下に置いた。このプラスミド
をｐＧＬ２ＥＲＥＬＵＣと命名し、下記(実施例６)のよ
うに後の実験で使用した。
【００６８】実施例４ ＤＮＡトランスフェクション Ａ．細胞培養 哺乳動物細胞を、Ｄulbeccoの改良Ｅagle培地とＦ１２
培地[３：１の比率で混合；GIBCO (Grand Island, NY)
から入手]から成り、フェノールレッドを含まず、１０
％子牛血清(ＦＢＳ; Hyclone, Logan, UT)を含む培地
(３：１培地と呼ぶ)で培養した。細胞を４日間隔で継代
した。トランスフェクションの1日前に、細胞を０.０５
％トリプシン／５.３ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナ
トリウム(GIBCO)の溶液(１ｍｌ)と共に室温で５分間イ
ンキュベートすることによってトリプシン処理し、次い
で培養皿１０ｃｍにつき１００万細胞の密度で、１０％
活性炭処理ＦＢＳ(csＦＢＳ; Hyclone)を含む３：１培
地にまいた。
【００６９】Ｂ．ＴＧＦβ構築物とヒトＥＲ構築物の一
時的な同時トラ ンスフェクション 同時トランスフェクション実験は、ＰroＦection Ｍamm
alianトランスフェクション系(Progma)を用い、ＭＧ６
３(ヒト骨肉腫)細胞において実施した。ＴＧＦβプロモ
ーター含有リポータープラスミドＤＮＡ(１０μｇ)と、
ヒト・エストロゲン受容体(ｈＥＲ)含有発現プラスミド
(ｐＲＳＶ−ＥＲまたはｐＣＭＶ−ＥＲ；Ｂ.Ｓ.Ｋatzen
ellenbogen[Department of Physiology and Biophysic
s, University of Illinois]から入手[ReeseとKatzenel
lenbogen, J. Biol. Chem., 266,10880-10887 (1990)を
参照])またはｐＲＳＶ(対照)プラスミド(５μｇ)を混合
し、共沈澱させ、１０ｃｍ培養皿につき２〜４百万細胞
中にトランスフェクションさせた。細胞をＤＮＡ沈澱物
と共に３７゜Ｃで１５時間インキュベートした後、細胞
をＤulbeccoリン酸緩衝生理食塩水(Ｄ−ＰＢＳ; GIBCO)
で２度洗浄することによりＤＮＡ沈殿物を除去した。次
いで、細胞に新鮮な１０％ｃｓＦＢＳ含有３：１培地を
供給した。リポーター遺伝子発現を変調させる能力につ
いて評価するための化合物を適当なときに加え、以下に
記載のように分析した。
【００７０】Ｃ．ＴＧＦβ構築物とヒトＥＲ構築物の安
定な同時トラン スフェクション トランスフェクションされたプラスミド配列が受容細胞
ゲノム中に安定に組み込まれる結果になるトランスフェ
クション実験のためにＭＣＦ−７細胞を使用した。これ
らの実験において、ＴＧＦβプロモーター含有プラスミ
ドＤＮＡを選択マーカーをコードするＤＮＡと混合し
た。例えば、ＴＧＦβプロモーター含有プラスミドＤＮ
Ａ(ｐＴＧＦβ−３０１ＬＵＣ、ｐＧＬ２ＬＵＣまたは
ｐＧＬ２ＥＲＥＬＵＣ)(６０μｇ)を、ｐＳＶ２ＨＹＧ
誘導体であるハイグロマイシン耐性遺伝子含有プラスミ
ドｐＳＶ２ＨＹＧｔＢ(６０μｇ)[米国特許出願第０７
／９５３,６３３号(１９９２年９月２９日出願)に記載;
この出願の内容は本明細書の一部を構成する]と混合
し、上記のＰroＦection系(Promeg)を用いて２００万個
のＭＣＦ−７細胞にトランスフェクションさせた。３７
゜Ｃで一晩インキュベートした後、上記のように沈澱物
を細胞から洗浄し、次いで細胞に新鮮な１０％ｃｓＦＢ
Ｓ含有３：１培地を供給し、さらに３７゜Ｃで４８時間培
養した(通常はこの時点で細胞が全面に達する)。上記の
ように細胞をトリプシン処理し、各々の培養皿の中身を
２つの１０ｃｍ培養皿中の１０％ＦＢＳ含有３：１培地
中に再びまいた。２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ
[Calbiochem-Novabiochem, LaJolla, CA]を追加した培
地中で細胞を培養することによってハイグロマイシン耐
性株を選択した。この選択培地を、選択実験の期間中、
細胞を乱すことなく、２日毎に新鮮なハイグロマイシン
Ｂ添加培地と置き換えた。クローンのコロニーは、選択
培地で約１４日間増殖させた後に目に見えるようになっ
た。このようなクローンを単離し、滅菌したピペット・
チップを用いて２４ウェル細胞培養皿(Flow Laboratori
es, McLean, VA)の個々のウェルに移した。このクロー
ンを選択培地で増殖させ、維持した。
【００７１】ルシフェラーゼ遺伝子含有プラスミド配列
との同時トランスフェクションに成功したハイグロマイ
シン耐性クローンを同定するために、ポリメラーゼ連鎖
反応(ＰＣＲ)を用いてトランスフェクションＤＮＡ中の
ルシフェラーゼｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列を検出した。
オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーをルシフェラーゼ
ｃＤＮＡ配列の３５５−３７３位(センス・プライマー)
および９２９−９１１位(アンチセンス・プライマー)に
相当するよう合成した。ＰＣＲはＰerkin−Ｅlmer Ｇen
eＡmp ＰＣＲ Ｓystem ９６００を用い、実質的に製造
元が提示した条件下で３５サイクル行った；１サイクル
は９４゜Ｃで４５秒、５５゜Ｃで４５秒、７２゜Ｃで２分
である。
【００７２】ルシフェラーゼを含むハイグロマイシン耐
性クローンを上記のようにエストロゲンまたはラロキシ
フェンと共にインキュベートし、リポーター遺伝子の発
現に及ぼす効果を、細胞抽出物中に存在する酵素活性量
を測定することによって分析した。ルシフェラーゼ分析
のために、細胞を、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.８)／
１％トリトンＸ−１００(Boehringer Mannheim)／２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡおよび１ｍＭジチオスレイトール(ＤＴＴ;
Ｂoehringer Ｍannheim)を含む真核細胞溶解試薬中で溶
解し、Ａnalytical Ｌuminescence Ｌaboratory[San Di
ego, CA]が開発した最適化非増強ルシフェラーゼ測定法
を用いて分析した。光出力を微量滴定プレート・ルミノ
メーター(ML3000, Dynatech Laboratories, Chantilly,
VA)を用いて測定し、記録した。次いでＴＧＦβ−リポ
ーター遺伝子構築物で安定にトランスフェクションされ
た細胞のクローンを、下記(実施例１３)のように新規な
抗骨粗鬆症スクリーニング分析に用いた。
【００７３】実施例５ エストロゲンと抗エストロゲン
によるＴＧＦβプロモーター媒介の転写活性化の分析 ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２およびＴＧＦβ−３遺伝子
の発現をエストロゲンとタモキシフェンを用いて特異的
に誘導できることが先行技術において知られている[上
記を参照]。この誘導性の範囲とパターンを、次のような
一連のインビトロ発現分析において、上記のＴＧＦβプ
ロモーター含有プラスミドを用いて特徴付けた。
【００７４】ＭＧ６３細胞培養物を、ＰroＦection系(P
romega)を用いてｐＲＳＶＥＲプラスミドとｐｈＴＧ１
２、ｐＴＧＦ−１またはｐＢ２−４９９のいずれかと一
時的に同時トランスフェクションさせた。各トランスフ
ェクション細胞培養物について、ＤＮＡ含有リン酸カル
シウム沈澱物を各培養皿に滴下し、培地中に完全に混合
した。培地のｐＨは注意深くｐＨ７.２〜ｐＨ７.４の間
に維持した。次いでトランスフェクションされた細胞培
養物を３７゜Ｃの５％ＣＯ2大気中で一晩インキュベート
した。全ての培養物について、一晩インキュベートの後
に培養皿から培地を吸引し、次いで各々の皿を２度Ｄ−
ＰＢＳですすぐことによって沈殿物を除去した。各同時
トランスフェクション・セルラインについて、緩衝液を
新鮮な１０％ｃｓＦＢＳ含有培地(１０ｍｌ)および次の
組成物のうちのいずれかと置き換えた。 ａ．１０μｌ エタノール(ホルモン担体)＝対照； ｂ．１０μｌ エタノール中１０-4Ｍの濃度の１７β−
エストラジオール(Sigma)(“エストラジオール")； ｃ．１０μｌ エタノール中１０-4Ｍの濃度のラロキシ
フェン(Eli Lilly Laboratories)； ｄ．１０μｌ エタノール中１０-4Ｍの濃度のタモキシ
フェン(Sigma)；２４時間これらホルモン調製物(または
担体対照)と共にインキュベートした後、細胞をＤ−Ｐ
ＢＳで２度洗浄した。次いで、細胞をゴム製のポリスマ
ン(policeman)とＤ−ＰＢＳ(１ｍｌ)を用いて培養皿か
らかき集めた。細胞を卓上遠心機(MicroMax Model, IE
C, Newark, NY)で８,０００ｒｐｍ、２分間遠心して集
めた。上清を除去し、細胞ペレットを０.２５Ｍトリス
塩酸溶液(ｐＨ７.８)(１５０μｌ)中に再懸濁した。ド
ライアイス／エタノール浴中での凍結と３７゜Ｃの水浴
中で解凍(各サイクルにつき３分)を３サイクル行って細
胞を溶解した。溶解した細胞調製物を、１５,０００ｒ
ｐｍで５分間、４゜Ｃで遠心して細胞残渣を除去した。
可溶性細胞溶解物を含む上清を、クロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)活性を測定する
ため新しい一組の試験管に移した。
【００７５】上記細胞溶解物についてＣＡＴ分析を行う
前に、まず市販の分析(BioRad Laboratories, Richmon
d, CA)を用いて各溶解物のタンパク質含有量を測定し
た。次いで、１００μｇの合計タンパク質を含む各細胞
溶解物の総量を、ＣＡＴ分析緩衝液[０.４Ｍトリス塩酸
(ｐＨ７.８)／０.５ｍＭアセチルＣｏＡ(Boehringer Ma
nnheim)／０.１μＣｉ Ｄ−スレオ−(ジクロロアセチル
−１,２−[14Ｃ]−クロラムフェニコール)]と１５時間
混合した。このインキュベートの後、反応混合物を酢酸
エチル(９００μｌ)で激しく抽出することによって反応
を停止させた。有機相と水相を１４,０００ｒｐｍで１
分間の短時間遠心によって分離し、有機相(約８００μ
ｌ)を新しい一組の試験管に移した。酢酸エチルを蒸発
させてＣＡＴ触媒反応産物を濃縮した。
【００７６】アセチル化および非アセチル化クロラムフ
ェニコール種を、アセンディング緩衝液として９５：５
(ｖ／ｖ)クロロホルム／メタノール混合物を用いて、薄
層クロマトグラフィーで分解した。このようにして分解
された各々の種からの放射活性をＢetascope６０３ブロ
ット分析機(Betagen, Intelligenetics Inc., Mountain
View, CA)を用いて測定した。総計数値に対するアセチ
ル化計数値の割合(％)を算出して、各々の分析されたト
ランスフェクタントの相対的ＣＡＴ活性を得た(本明細
書中に示した全てのＣＡＴ活性はこれに基づいて算出し
た)。各々の分析を２度実施した。
【００７７】ＭＧ６３トランスフェクタント・セルライ
ンに関する上記実験の結果を図１０に示す。代表的な実
験結果を以下の表にまとめる：
【表１】 表 １ エストラジオール ラロキシフェン タモキシフェ ン プロモーター 対照 活性 誘導倍率* 活性 誘導倍率 活性 誘導倍率 ＴＧＦβ−１ ６.４ ４.７ ０.７ ５.６ ０.９ ６.９ １.１ ＴＧＦβ−２ ０.８ １.２９ １.６ ２.３ ２.９ ２.０ ２.６ ＴＧＦβ−３ ０.７ ２.１ ２.８ ５.２ ７.３ １.９ ２.６ *：誘導倍率は、対照との比較をもとに算出した。
【００７８】これらの実験は以下のことを示す。ＣＡＴ
リポーター遺伝子の転写は、エストロゲンと抗エストロ
ゲンであるラロキシフェンとタモキシフェンによって誘
導され、特にＴＧＦβ−３プロモーターに対してラロキ
シフェンはエストロゲンよりも強い効力を発揮する。対
照的に、この実験で使用したＴＧＦβ−１プロモーター
領域(−１０３２〜＋７２７位)はエストラジオールまた
はラロキシフェンのいずれに対しても反応を示なかっ
た。
【００７９】実施例６ エストロゲンとラロキシフェン
によるＴＧＦβ−３プロモーターとビテロゲニンプロモ
ーターのＥＲＥの特異的な誘導 先の実施例で得られた結果は以下のことを示す。ＴＧＦ
β−３遺伝子プロモーターはエストロゲンおよび“抗エ
ストロゲン”化合物(ラロキシフェンやタモキシフェン
など)の両方に転写的に応答し、この転写はラロキシフ
ェン処理によって、エストロゲンに応答して得られる転
写誘導の度合よりも比較的大きな度合で誘導される。本
実施例は、アフリカツメガエルのタンパク質ビテロゲニ
ンをコードする遺伝子はインビボで正に逆に応答するこ
と、即ち、ビテロゲニン遺伝子の転写はエストロゲンに
よって強く誘導され、ラロキシフェンによっては弱くし
か誘導されないことを示す。さらにラロキシフェンは、
エストロゲンと同時に与えられたとき、ビテロゲニン産
物のエストロゲンによる誘導に強く拮抗する。これらの
結果は、上記実施例６で分析されたリポータープラスミ
ド中のリポーター遺伝子の転写を指令するＴＧＦβプロ
モーター配列が、独特のエストロゲンおよび抗エストロ
ゲン応答パターンによって特徴づけられる新規なラロキ
シフェン応答要素を含有することを示唆した。
【００８０】このエストロゲンおよび抗エストロゲン応
答パターンを、先の実施例に記載したリポーター遺伝子
分析系を用いてさらに調べた。ＭＧ６３細胞の培養物
を、実施例４に記載のようにｐＢ−３０１およびｐＲＳ
ＶＥＲと共に一時的に同時トランスフェクションした。
このような一時的な同時トランスフェクション培養物に
ついて、濃度を１０-9から１０-5Ｍまで１０倍増加で変
化させたエストラジオールおよびラロキシフェンで処理
して、リポーター遺伝子発現の転写活性化を試験した。
また、エストロゲンとラロキシフェンの組合せを、エス
トロゲン単独のときと同じ一連の濃度を用いて、エスト
ロゲンに応答するリポーター遺伝子誘導に対する１０-8
Ｍのラロキシフェンの効果を測定することによって試験
した。これらの分析は実質的に実施例５と同様に行っ
た。
【００８１】同様の分析を、ｐＧＬ２ＥＲＥＬＵＣおよ
びｐＲＳＶＥＲで一時的に同時トランスフェクションし
たＭＧ６３細胞の培養物を用いて行った。しかし、これ
らの分析においては、エストロゲンと組み合わせて加え
るラロキシフェンの量を変化させて、混合物中のラロキ
シフェン濃度をエストロゲン濃度の２０倍にした(即
ち、１０-9Ｍ エストロゲン／２×１０-8Ｍ ラロキシフ
ェン；１０-8Ｍ エストロゲン／２×１０-7Ｍ ラロキシ
フェン等)。
【００８２】トランスフェクションされた細胞をホルモ
ンの量や組み合わせを変化させて処理し、次いでＤ−Ｐ
ＢＳで２度すすいだ。次に、細胞を真核細胞溶解試薬(実
施例６に記載)(２５０μｌ)を用いて、４℃で２０分間
インキュベートして溶解させ、ゴム製ポリスマンでかき
集めて微量遠心管に移した。細胞溶解物を１４，０００
ｒｐｍで１分間遠心して細胞残渣を除去した。次いで、
細胞抽出物(上清)をタンパク質含有量およびルシフェラ
ーゼ活性について分析した。
【００８３】ルシフェラーゼ分析を次のように行った。
各細胞抽出物(５０μｌ)を微量滴定プレートの個々のウ
ェル中の試薬Ａ緩衝液[４.０ｍＭ ＡＴＰ／１５ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ4／３０ｍＭ トリシン緩衝液(ｐＨ７.８)／１０
ｍＭ ＤＴＴを含む](１００μｌ)に加えた。１ｍＭ Ｄ
(−)−ルシフェリン[０.１Ｍ ＫＰＯ4(ｐＨ７.８)中；B
oehringer Mannheim](１００μｌ)を各ウェルに加え、
発光量をＭＬ３０００微量滴定プレート・ルミノメータ
ーを用いて測定した(積分フラッシュ・モード、高増
加、積分ウィンドウ＝１０秒、温度２２℃の条件下
で)。ルシフェラーゼ活性を各細胞溶解サンプル中のタ
ンパク質含有量に比例した全光出力として算出した。
【００８４】これらの試験結果を以下の表にまとめる。
【表２】 表 ２ ｐＢ−３０１ 対照 １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ -6 Ｍ １０ -5 Ｍ ラロキシフェン ０.７ ２.４ ９.６ ９.６３ ９.０５ ５.２５ エストラジオール ０.７ １.１ ３.２ ５.５ ５.２ ８.０ Ｅ２＋Ｒａｌ −−− １７.３ １６.０ ７.３ ９.３ １０.５ ｐＧＬ２ＥＲＥＬＵＣ： 対照 １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ -6 Ｍ １０ -5 Ｍ ラロキシフェン １.７ １.９ １.５ ２.０ １.９ １.９ エストラジオール １.７ ５.８ ５.５ ５.９ ６.２ ６.５ Ｅ２＋Ｒａｌ −−− １.８ １.９ ２.１ ２.３ ２.４ これら実験の代表的な結果を図１１および図１２に示
す。
【００８５】これらの結果は、抗エストロゲンに応答す
るＴＧＦβ遺伝子プロモーター中の別個のプロモーター
領域の存在を明らかに示している。ラロキシフェンはビ
テロゲニン遺伝子のような遺伝子のＥＲＥ含有プロモー
ターによって開始される転写の強力なアンタゴニストと
して作用する一方、ＴＧＦβ−３プロモーターからの転
写誘導において超アゴニストとして作用することが本発
明により示された。興味深いことに、低濃度では、ラロ
キシフェンとエストロゲンは本発明のリポータープラス
ミド中のＴＧＦβ−３プロモーターからの転写を相乗効
果的に誘導し、ラロキシフェン誘導の遺伝子転写に新規
な機序が介在することが示唆された。
【００８６】実施例７ エストロゲンおよび抗エストロ
ゲンによるＴＧＦβ−３のエストロゲン受容体依存性の
遺伝子活性化 ＴＧＦβ産生に影響を与えるエストロゲンおよび抗エス
トロゲン両方の能力がエストロゲン受容体(ＥＲ)の発現
に依存することは先行技術において知られていたが、こ
の影響が発揮される段階は知られていなかった(即ち、
転写、翻訳、または翻訳後)。従って一連の実験を行
い、本発明のＴＧＦβプロモーター含有構築物を用いて
リポーター遺伝子発現誘導の推定上のＥＲ発現依存性を
調べた。ＥＲ発現の欠如はエストラジオールやラロキシ
フェンの存在とは無関係に、実質的にＴＧＦβ−３発現
を停止させる。突然変異ＥＲタンパク質の使用によっ
て、ＥＲ分子の異なるドメインがエストロゲンおよびラ
ロキシフェン誘導の原因であることを決定した。
【００８７】Ａ．ＴＧＦβ−３のＥＲ依存誘導 ＭＧ６３培養物を実施例４で行ったように同時トランス
フェクション用に調製した。このような培養物の１つを
ｐＢ２−４９９およびｐＲＳＶＥＲと同時トランスフェ
クションさせ、別の培養物をｐＢ２−４９９およびｐＲ
ＳＶベクタープラスミド(対照)と同時トランスフェクシ
ョンさせた。次いでＴＧＦβ−３遺伝子のラロキシフェ
ン応答要素によって転写を誘導する次の化合物の能力
を、実質的に実施例５に記載のように分析した； (a)エタノール (b)１７β−エストラジオール(１０-7Ｍ) (c)ラロキシフェン(２×１０-6Ｍ) (d)１７β−エストラジオール(１０-7Ｍ)およびラロキ
シフェン(２×１０-6Ｍ)
【００８８】このような実験の１つの結果を次の表にま
とめ、これにより得られた薄層クロマトグラムの代表的
な例を図１３に示す。
【表３】 表 ３ ホルモン エストラ ラロキシ エストラジオール 担体 ジオール フェン ＋ラロキシフェン 対照 ０.９ １.０ １.１ １.２ プラスミド ＥＲ発現 １.３ ４.６ ４５.７ ３３.７ プラスミド これらの結果は明らかに、エストロゲン、抗エストロゲ
ンおよびそれらの組み合わせに応答したリポーター遺伝
子発現のＴＧＦβ−３遺伝子プロモーター媒介誘導にＥ
Ｒ発現が必要とされることを示す。
【００８９】Ｂ．ＴＧＦβ−３プロモーターからの誘導
に必要とされる ＥＲタンパク質ドメインの分析 “Ｅ"と命名したＥＲタンパク質領域がエストロゲン結
合に必要とされる一方、領域“Ｃ"がＤＮＡ結合に必要
とされることが先行技術に開示されている[Kumarら, EM
BO J., 9, 2231-2236 (1986)を参照]。また、“Ｃ"領域
はＥＲＥ含有遺伝子のＥＲ活性化に必須である一方、
“Ｅ"領域はエストロゲン依存誘導性に必要とされるこ
ともよく確かめられている。
【００９０】ＴＧＦβ−３プロモーターからの転写誘導
に関与するＥＲ領域を決定するために、ＭＧ６３細胞培
養物を実施例４で行ったように同時トランスフェクショ
ン用に調製した。細胞を、ｐＴＧＦβ−３０１ＬＵＣお
よびＥＲの種々の欠失突然変異を含む次の発現プラスミ
ドのうち１つの混合物を用いてトランスフェクションさ
せた。 ａ．ｐＣＭＶ−ＥＲ ｂ．ｐＣＭＶ−ＥＲΔＡ／Ｂ ｃ．ｐＣＭＶ−ＥＲΔＢ／Ｃ／Ｄ ｄ．ｐＣＭＶ−ＥＲΔＥ／Ｆ ｅ．ｐＣＭＶ−ＥＲ1-530 ｆ．ｐＣＭＶ−ＥＲL540Ｑ これらプラスミド中の各々の欠失範囲のさらに詳しい説
明については、ReeseとKatzenellenbogen [J.Biol.Che
m., 266, 10880-10887 (1990)]および図１４を参照。
【００９１】これらの突然変異ＥＲのラロキシフェン誘
導ＴＧＦβ−３活性化を媒介する能力を、担体(１０μ
ｌエタノール)または１０-7Ｍラロキシフェンで同時ト
ランスフェクション細胞を処理することによって試験し
た。基本活性を超えるラロキシフェン誘導ルシフェラー
ゼ活性の増加を、図１４で示したように、異なる突然変
異ＥＲ形態の存在下でのラロキシフェンによる誘導倍率
として算出した。
【００９２】このような実験の１つの結果を次の表にま
とめる。
【表４】 表 ４ ＥＲ突然変異体形態 担体 ラロキシフェン 誘導倍率 ｐＣＭＶ−ＥＲwt ３.７ ３２.８ ８.９ ｐＣＭＶ−ＥＲΔＡ／Ｂ １４.２ ３９.４ ２.８ ｐＣＭＶ−ＥＲΔＢ／Ｃ／Ｄ ２１.２ ７３.４ ３.４ ｐＣＭＶ−ＥＲΔＥ／Ｆ １７.４ ２０.９ １.２ ｐＣＭＶ−ＥＲ1-530 １３.４ ２６.５ ２.０ ｐＣＭＶ−ＥＲ L540 Ｑ １２.２ ３９.８ ３.３
【００９３】これらの結果は以下のことを示す。ホルモ
ン結合ドメイン(即ち、エストロゲン受容体分子の“Ｅ"
領域)は、本発明のリポータープラスミド中のリポータ
ー遺伝子のラロキシフェン刺激のＴＧＦβ−３プロモー
ター媒介トランスフェクションを媒介するのに必要かつ
十分である。ＥＲ分子の“Ｃ"領域はこの過程に必要と
されないようである。この発見はさらに、ＥＲが関与す
る遺伝子転写活性化の新規な機序がＴＧＦβプロモータ
ーからの転写に関与しているのであろうという示唆を支
持する。
【００９４】実施例８ ＴＧＦβ-３プロモーターに対
するエストロゲンおよび抗エストロゲンの活性 エストロゲンおよび抗エストロゲン化合物によるＴＧＦ
βプロモーター媒介遺伝子発現の転写活性化は、濃度依
存性であることがわかった。ＭＧ６３細胞の培養物を、
実施例５の記載のようにpＢ-３０１およびpＲＳＶＥＲ
で一時的に同時トランスフェクションした。このように
一時的にトランスフェクションされた細胞培養物を１２
の培養物からなる４つの群に分け、４群のそれぞれを用
いてＴＧＦβ-３プロモーターからの転写を誘導する１
つのエストロゲンまたは抗エストロゲン化合物の能力を
別々に試験した。１２培養物からなる各群に対して、特
定のエストロゲンまたは抗エストロゲン化合物を、担体
だけで処理した１組の複製培養物ならびに１０-9Ｍから
１０-5Ｍまで１０倍増加で変化する６つの濃度の複製培
養物において試験した(１つの実験処理あたり合計１２
の培養物に対して)。上記のように、ホルモンをエタノ
ールに溶解し、これを培養培地に適用した。試験した４
種のエストロゲンおよび抗エストロゲンは、以下の通り
である。 ａ．１７β-エストラジオール(Sigma Chemical Corp.,
St. Louis, MO)； ｂ．ラロキシフェン(Eli Lilly, Indianapolis, IN)； ｃ．タモキシフェン(Sigma)； ｄ．ＩＣＩ １６４,３８４(1988年7月20日発行の欧州特
許 No. EP138504に記載)。 ホルモン処理(または、対照)の２４時間後に、実施例５
の記載のように細胞を洗浄し、収穫し、溶解し、そして
ＣＡＴ活性について検定した。このような実験の結果を
以下の表にまとめ、図１５に示す。
【表５】 表 ５ 担体 １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ -6 Ｍ １０ -5 Ｍ エストラジオール ０.８５ ０.９６ １.１ １.６ ４.３ ３.４ ラロキシフェン ０.８５ ６.９ １９.２ １８.１ １９.６ １４.８ タモキシフェン ０.８５ ０.９１ １.２ ０.９８ ２.９ １３.５ＩＣＩ 164,384 ０.８５ ０.８９ ０.８８ １０.９ １５ .２ ６.５
【００９５】全てのエストロゲンおよび抗エストロゲン
がＴＧＦβ-３プロモーター活性に影響を与えるが、各
化合物はそれ独特の用量−応答曲線を示す。ラロキシフ
ェンは極めて強力な活性化物質であり、２０倍以上のリ
ポーター遺伝子転写の誘導を示し、ナノモル濃度のＥＤ
50を有している。対照的に、エストラジオールは４倍の
リポーター遺伝子発現の誘導、およびラロキシフェンに
比べて２オーダー高いＥＤ50を示すにすぎなかった。タ
モキシフェンは高レベル(即ち、マイクロモルより高い)
ときにだけＴＧＦβ-３プロモーターを活性化する。Ｉ
ＣＩ １６４,３８４は１０-7ＭのＥＤ50を示したが、こ
の化合物は高濃度(１０-5Ｍ)のときに活性が低下するよ
うである。これらの結果は、ラロキシフェン応答要素
(ＲＲＥ)と呼ばれるＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター
領域中に新規な要素が見い出されたことを示す。この要
素はエストロゲンと抗エストロゲンの両方の存在下で転
写を誘導し、これら化合物のそれぞれは特有の転写活性
化の用量−応答プロフィールを示す。
【００９６】実施例９ ＣＨＯおよびＭＣＦ-７細胞に
おけるＴＧＦβ-３プロモーターのラロキシフェン媒介
の転写活性化 エストロゲン媒介の誘導とは別個のＴＧＦβ-３プロモ
ーターからの転写を誘導するラロキシフェンの能力を、
種々のセルラインにおいて証明した。 Ａ．ＣＨＯ細胞におけるＴＧＦβ-３活性化 ＣＨＯ細胞の培養物を実施例４の記載のようにpＢ-３０
１およびpＲＳＶＥＲで一時的に同時トランスフェクシ
ョンし、これら培養物を用いてラロキシフェン応答要素
によって転写を誘導するラロキシフェンとエストラジオ
ールの両方の能力を測定した。１２の一時的にトランス
フェクションした培養物を、１０-9Ｍから１０-5Ｍまで
１０倍増加で変化する６つの濃度でエストラジオールま
たはラロキシフェンを用いて複製で処理した(担体だけ
の対照も含む；合計１２の培養物に対して)。上記のよ
うにホルモンをエタノールに溶解し、これを培養培地に
適用した。ホルモン調製物(または、担体)と共に２４時
間インキュベートした後、実施例５の記載のように細胞
を洗浄し、収穫し、溶解し、そしてＣＡＴ活性について
検定した。これらの結果を以下の表にまとめ、図１６に
示す。
【表６】 表 ６ ０Ｍ １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ -6 Ｍ １０ -5 Ｍ エストラジオール １０.６ １１.９ ２２.６ ２９.４ ３２.９ ３３.３ラロキシフェン １０.６ ２１.３ ２１.２ １９.７ ２０.８ １０.１ これらの結果は、先に観察したエストロゲンおよびラロ
キシフェンに対するＴＧＦβ-３プロモーターの応答性
が、ＣＨＯ細胞において検定したときに保持されている
ことを示した。
【００９７】Ｂ．ＭＣＦ-７細胞におけ るＴＧＦβ-３活
性化 ＭＣＦ-７細胞の培養物を、実施例４の記載のようにpＴ
ＧＦβ-３０１ＬＵＣで一時的にトランスフェクション
した。これらの培養物を用いて本細胞種において転写を
誘導するラロキシフェンおよびエストラジオールの能力
を試験した。培養物を０Ｍ、１０-9Ｍ、１０-8Ｍ、１０
-7Ｍ、１０-6Ｍおよび１０-5Ｍの６つの濃度のいずれか
のエストラジオールまたはラロキシフェンのいずれかで
処理した。上記のようにホルモンをエタノールに溶解
し、これを培養培地に適用した。ホルモン調製物(また
は、担体対照)で２４時間処理した後、実施例６の方法
に従って細胞を洗浄し、収穫し、溶解し、そしてＬＵＣ
活性について検定した。この実験の結果を以下の表にま
とめ、一連のこのような実験の結果を図１７にまとめ
る。
【表７】 表 ７ ０Ｍ １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ - 6 Ｍ １０ -5 Ｍ エストラジオール ７.８ １９.２ ９.１ １０７.３ １０１.３ １２２ラロキシフェン ７.８ １５８ ３０９ ３１４ ４５１ ２０６ (ルシフェラーゼ活性は１０００単位で表示している)
【００９８】同様の検定を、ヒト子宮内膜癌細胞(ＲＬ
５９.２)、ヒト頸管癌細胞(ＨeＬa)およびサル腎細胞
(ＣＯＳ-１)[American Type Culture Collection, Rock
ville,MD]において行なった。ＴＧＦβ-３プロモーター
によって開始される転写は、試験した全ての細胞種にお
いてエストロゲンおよびラロキシフェンによって誘導さ
れることがわかった(誘導の大きさは変化する)。これら
の結果は、ＴＧＦβ-３プロモーターからのリポーター
遺伝子転写のエストロゲンおよびラロキシフェン媒介誘
導が特定の細胞種に制限されないことを示すものであ
る。しかし、異なる細胞における異なるレベルの誘導
は、調節に関与しているこれら細胞中の他の因子が多い
ことを示すものであるのかもしれない。リポーター遺伝
子としてルシフェラーゼおよびＣＡＴの両方を用いてＴ
ＧＦβ-３プロモーターのラロキシフェンおよびエスト
ロゲン応答性が見い出されたことは、この調節がこのプ
ロモーターからの遺伝子発現の一般的特徴であることを
示すものである。
【００９９】実施例１０ ラロキシフェンおよび関連化
合物によるＴＧＦβ-３プロモーターからのリポーター
遺伝子発現の誘導の比較 抗エストロゲン化合物は、用量に依存してＴＧＦβ遺伝
子発現を誘導しうることが従来技術において知られてい
た[Knabbeら, Am.J.Clin.Onc., 14 (Suppl.2),S15-S20
(1991)]。さらに、上記の実施例８に示したように、ラ
ロキシフェンおよびタモキシフェンは用量に依存してＴ
ＧＦβ-３遺伝子発現を誘導しうることが見い出されて
いた。本実施例に記載する実験は、ＴＧＦβ-３プロモ
ーターのラロキシフェン応答要素によって転写を誘導す
る化合物の能力を、これら化合物の卵巣摘出ラットにお
いて示されるような既知のウテロトロピック(uterotrop
ic)能力と関係付けるために行なった。ラロキシフェン
に構造的に関連している７種の化合物について、ＴＧＦ
β-３プロモーターのラロキシフェン応答要素によって
転写を誘導するそれらの能力を試験した。これらの化合
物は、ウテロトロピック(ＬＹ１１２６７６、ＬＹ８１
０９９およびＬＹ１３３１４)から抗ウテロトロピック
(ＬＹ１１３５２６、ＬＹ１３９４８２およびＬＹ１７
７３６６)までの範囲のインビボ活性のスペクトルに基
づいて区別することができ、また、インビボで不活性で
あることが知られている化合物(ＬＹ９８００５)を含ん
でいた。これら化合物のＩＵＰＡＣ名およびこれら化合
物が特許請求されている米国特許[( )内]を以下に挙げ
る。 ・１１３５２６：２−(p−ヒドロキシフェニル)ベンゾ
[Ｂ]チエン−３−イルp−[２−(１−ピロリジニル)エト
キシ]フェニル ケトン (４,１３３,８１４)； ・１３９４８２：[４−[２−(ヘキサヒドロ−１Ｈ−ア
ゼピン−１−イル)エトキシ]フェニル][６−ヒドロキシ
−２−(４−ヒドロキシフェニル)ベンゾ[Ｂ]チエン−３
−イル]メタノン (４,３８０,６３５)； ・１７７３６６：[６−(２,２−ジメチル−１−オキソ
プロポキシ)−２−[４−(２,２−ジメチル−１−オキソ
プロポキシ)フェニル]ベンゾ[Ｂ]チエン−３−イル][４
−[２−１−ピペリジニル)エトキシ]フェニル］メタノ
ン・塩酸塩 (１９９２年７月２８日出願の０７／９０
２,９３３；本明細書の一部を構成する); ・９８００５：ｐ−ヒドロキシフェニル ３−(−ヒドロ
キシフェニル)ベンゾ[Ｂ]チエン−２−イル ケトン； ・１１２６７６：(ｐ−ヒドロキシフェニル) ５−ヒド
ロキシ−３−フェニルベンゾ[Ｂ]チエン−２−イル ケ
トン (４,０７５,２２７)； ・８１０９９：ｐ−ヒドロキシフェニル ３−フェニル
ベンゾ[Ｂ]チエン−２−イル ケトン (４,０７５,２２
７)； ・１３３３１４：[３,４−ジヒドロ−２−(４−メトキ
シフェニル)−１−ナフタンレニル][４−[２−(１−ピ
ロリジニル)エトキシ]フェニル］メタノン・メタンスル
ホン酸塩。 これらの化合物を図１８に挙げる。
【０１００】ラロキシフェン、ＬＹ８１０９９、ＬＹ９
８００５、ＬＹ１１２６７６、ＬＹ１１３５２６、ＬＹ
１３３１４、ＬＹ１３９４８２、およびＬＹ１７７３６
６(Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana)を
検定して、異なる濃度でＴＧＦβ-３遺伝子のプロモー
ターからの転写を誘導するこれら化合物の能力を比較し
た。pＢ-３０１およびpＲＳＶＥＲで一時的に同時トラ
ンスフェクションしたＭＧ６３細胞の培養物を、実施例
６の記載のように、０Ｍ、１０-9Ｍ、１０-8Ｍ、１０-7
Ｍ、１０-6Ｍ、１０-5Ｍの濃度の上記化合物で処理し
た。これら実験の結果を以下の表にまとめ、図１９に示
す。
【表８】 表 ８ ０Ｍ １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ -6 Ｍ １０ -5 Ｍ ラロキシフェン ０.６１ ２.１ ６.４ ７.５ ７.０ ４.０ ＬＹ８１０９９ ０.６１ ０.６ ０.５ ０.７ ０.９ ２.３ ＬＹ９８００５ ０.６１ ０.４ ０.５ ０.５ ０.４ ０.５ ＬＹ１１２６７６ ０.６１ ０.６ ０.６ ０.５ １.７ ３.８ ＬＹ１１３５２６ ０.６１ ０.７ ０.７ ０.６ ２.０ ２.１ ＬＹ１３３３１４ ０.６１ ０.７ ０.７ ３.１ ６.６ １.０ ＬＹ１３９４８２ ０.６１ ０.８ ２.５ ２.７ ２.５ ２.０ ＬＹ１７７３６６ ０.６１ １.１ ７.９ １０.２ ７.９ ６ .１
【０１０１】インビボでウテロトロピックの性質を示し
た化合物(即ち、エストロゲン性化合物)は、約１０-7Ｍ
のＥＤ50値を示し、ＴＧＦβ-３プロモーターからのリ
ポーター遺伝子発現の比較的低倍率の誘導を有していた
(実施例８においてエストロゲンによって示されたプロ
フィールに非常に近似している)。対照的に、インビボ
でラロキシフェンに類似したプロフィールを有する化合
物は、１０-9ＭのＥＤ50を示し、エストロゲン性化合物
に比べて比較的高倍率の誘導を示した。ラロキシフェン
のインビボのデータは米国特許出願Ｎo．07/920,933(19
92年7月28日出願)に記載されており、そのデータは本明
細書の一部を構成する。まとめると、インビボでエスト
ロゲンに類似した性質を発揮する化合物は、インビボで
抗エストロゲン様の性質を発揮した化合物に比べて有意
に低いＴＧＦβ-３プロモーターによる転写の誘導を示
した。これら実験の結果は、本明細書中に記載したリポ
ーター遺伝子含有発現プラスミドを、可能性ある抗骨粗
鬆症薬物を同定するためのスクリーニング法として利用
することを示す。この理由は、誘導プロフィールおよび
ＥＤ50がラロキシフェン様であるこれら化合物が、本検
定において比較的低い誘導プロフィールと比較的高いＥ
Ｄ50を有するエストロゲン様化合物に比べて比較的低い
ウテロトロピック作用を示すためである。
【０１０２】実施例１１ ＋３５から＋７５までの領域
中へのＴＧＦβ-３プロモーター中のラロキシフェン応
答要素の位置決定 ヒトＴＧＦβ-３遺伝子プロモーター中のラロキシフェ
ン応答要素(ＲＲＥ)の少なくとも一部は、＋３５〜＋７
５位に見い出される特定の４１ヌクレオチド配列にほぼ
局在化されていた。この配列は、上記のＴＧＦβ−リポ
ーター遺伝子発現構築物におけるリポーター遺伝子発現
のラロキシフェン誘導の転写活性化を媒介するのに必要
であることがわかった。
【０１０３】Ａ．インビトロで調製したＴＧＦβ-３プ
ロモーターの削除突然変異体の機能分析によるラロキシ
フェン応答要素の 同定 種々のＴＧＦβ-３プロモーター削除リポーター構築物
(pＢ-４９９、pＢ-３０１、pＢ-２２１、pＢ-９１、pＢ
-６０、pＢ-４７、pＴＧＦβ-３８ＬＵＣ、pＴＧＦβ＋
７５ＬＵＣ、pＴＧＦβ＋３５ＬＵＣおよびpＬＵＣを含
む)の１つとpＣＭＶＥＲで一時的に同時トランスフェク
ションしたＭＧ６３細胞の培養物を、実施例１の記載の
ように創製した。次いで、これらの培養物をエタノール
(対照として)または１０-6Ｍラロキシフェンのいずれか
で処理した。担体単独による処理によって得られる誘導
と比較したときのラロキシフェン処理後のリポーター遺
伝子発現の誘導度を、それぞれのＴＧＦβ-３プロモー
ター削除構築物について計算し、以下の表にまとめ、図
２０に示した。
【表９】 表 ９ ＴＧＦβ−３ ラロキシフェンベクター プラスミド プロモーター領域 による誘導倍率 ｐＢ−４９９ −４９９ − ＋１１０ ６.８ ｐＢ−３０１ −３０１ − ＋１１０ １３.１ ｐＢ−２２１ −２２１ − ＋１１０ ８.７ ｐＢ−９１ −９１ − ＋１１０ １０.１ ｐＢ−６０ −６０ − ＋１１０ １２.５ ｐＢ−４７ −４７ − ＋１１０ １１.５ ＴＧＦβ−３８ＬＵＣ −３８ − ＋１１０ ７.１ ＴＧＦβ＋７５ＬＵＣ −３８ − ＋７５ ５.８ ＴＧＦβ＋３５ＬＵＣ −３８ − ＋３５ １.２ ｐＬＵＣ ベクター単独 ０.５ これらの結果は、ラロキシフェン応答要素の少なくとも
一部を、ＴＧＦβ-３プロモーター配列中の＋３５〜＋
７５位に局在化する。
【０１０４】Ｂ．ラロキシフェン応答要素のヌクレオチ
ド配列 −３８から＋１１０位までのＴＧＦβ-３プロモーター
のヌクレオチド配列を図２１に示した。このラロキシフ
ェン応答配列は、この図に概略した形態で示される配列
であることがわかった。白抜きの矢印は主転写開始部位
(＋１)を示す。２つの黒の矢印は２つの副転写開始部位
を示す。「ＴＡＴＡ」配列は箱で囲んで示す。推定のＣ
ＣＣＴＣ−モチーフは、推定のラロキシフェン応答要素
の配列の下に一連の水平矢印で示す。Lobanenekovら[On
cogene, 5, 1743-1753 (1990)]を参照。ＴＧＦβ-３の
分析によって２つの結論を導くことができる。その第１
は、ＥＲＥに相同な回文的な配列はＴＧＦβ-３プロモ
ーターのこの領域中には見い出されないことである。こ
の発見は、ＥＲのＤＮＡ結合活性が必要とされないこと
を証明した実施例７に示した結果と一致する。第２は、
ＴＧＦβ-３のＥＲ媒介のラロキシフェン活性化はラロ
キシフェン応答配列に結合しうる他の因子を必要とする
可能性が最も高いことである。このようなタンパク質の
良い候補は、c-myc遺伝子調節に関与しているLobanenko
vらによって同定されたＣＴＣＦ因子である。これらの
発見は、プロモーター中にラロキシフェン応答要素を有
する可能性あるラロキシフェン誘導性遺伝子としての他
の遺伝子の同定を導きうる。さらにこのような遺伝子を
用いて、実施例１３に記載したスクリーニング法におい
て使用するためのラロキシフェン応答要素の活性を有す
る遺伝子要素を同定することもできるであろう。
【０１０５】本発明のラロキシフェン応答要素を用いて
GenBank配列ライブラリーを検索し、この要素と以下の
遺伝子中の要素の間に有意の相同性が見い出された(Gen
Bank/EMBLデータバンク取得番号と遺伝子の種類で示
す)： ・Ｘ５６５９５：ニワトリVI型コラーゲン -２； ・Ｘ５５３７３：ヒトＥＴＳ-２プロモーター領域； ・Ｍ３０１３７：ヒトＥＴＳ-２(５'境界)； ・Ｄ１０２３１：マウスグルコース輸送体(エンハンサ
ー２)； ・Ｍ１２７３１：マウスＮ-myc癌原遺伝子； ・Ｍ１３９４５：マウスpim-１癌原遺伝子； ・Ｘ６３２８１：R.norvegicus Ｎ-myc遺伝子； ・Ｘ１６９９５：マウスＮ１０遺伝子； ・Ｍ９４１５２：ラットアデノシン受容体； ・Ｍ２０１３１：ラットシトクロムＰ４５０ＩＩＥ１； ・Ｍ３４１１１：ラットＰＴＨrＰ； ・Ｊ０５０９７：ラットサブスタンスＰ受容体； ・Ｍ６４２３６：ラットサブスタンスＰ受容体。 この発見は、種々の組織および細胞種においてインビボ
で多面性の生理学的効果を媒介しうる別個の重要な調節
単位としてのこの要素の存在を支持する。
【０１０６】実施例１２ エストロゲンおよびラロキシ
フェンによって誘導されるＬＤＬ受容体プロモーターの
活性化 ＬＤＬ受容体の発現は、血清ＬＤＬ−コレステロール取
込みの調節に必須の役割を果している。エストロゲンが
インビボにおいてＬＤＬ受容体のメッセンジャーＲＮＡ
を誘導することが知られている[Maら, Proc.Natl.Acad.
Sci.USA, 83, 792-796 (1986)]。本実施例において示す
ように、このエストロゲンによるＬＤＬ受容体プロモー
ター配列の活性化はＥＲによって媒介されている。ま
た、ラロキシフェンもＬＤＬ受容体プロモーターを誘導
するが、この誘導はＥＲ−非依存性である。
【０１０７】Ａ．ＥＲ存在下のエストロゲンおよび抗エ
ストロゲン誘導 のＬＤＬＲ-Ｌucの産生 実施例４の記載のように、ＡＴＣＣ株ＨepＧ２細胞をp
ＬＤＬＲＬＵＣ１０およびpＲＳＶＥＲで同時トランス
フェクションした。これらの細胞を、実施例６に記載の
条件下でエストラジオールおよびラロキシフェンに暴露
した。これらの結果を以下の表にまとめ、一連の実験を
図２２に示す。
【表１０】 表 １０ ０Ｍ １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ -6 Ｍ １０ -5 Ｍ エストラジオール ２０.９ １６.６ １５.４ ４０.７ ７４.０ ６９.０ラロキシフェン ２０.９ ２０.９ １９.９ ２６.９ １４.６ １４.６
【０１０８】Ｂ．ＥＲ非存在下のエストロゲンおよび抗
エストロゲン誘導のＬＤＬＲ-Ｌucの産生 実施例４の記載のように、ＡＴＣＣ株ＨepＧ２細胞をp
ＬＤＬＲＬＵＣ１０およびpＲＳＶで同時トランスフェ
クションした。これらの細胞を、実施例６に記載の条件
下でエストラジオールおよびラロキシフェンに暴露し
た。これらの結果を以下の表にまとめ、代表的な一連の
このような実験を図２３に示す。
【表１１】 表 １１ ０Ｍ １０ -9 Ｍ １０ -8 Ｍ １０ -7 Ｍ １０ -6 Ｍ １０ -5 Ｍ エストラジオール 1597 1645 1792 1574 1578 2445 ラロキシフェン 1597 1652 1234 1025 1291 5561 これらの結果は、ラロキシフェンとエストロゲンの両方
がＬＤＬ受容体発現を誘導する能力を有していることを
示す。この結果は、動物モデルおよびヒトの両方のイン
ビボにおけるエストロゲンおよびラロキシフェンによる
血清脂質低下作用の説明を与える。
【０１０９】実施例１３ 可能性ある抗骨粗鬆症薬物の
スクリーニング法 上記の実施例に基づいて、リポーター遺伝子としてルシ
フェラーゼを用いる検定を設計し、可能性ある抗骨粗鬆
症薬物をスクリーニングした。実施例４に記載の方法を
用いて、ＭＣＦ-７細胞の培養物を、(1) pＴＧＦβ-３
０１ＬＵＣ；(2) pＧＬ２ＬＵＣ；または(3) pＧＬ２Ｅ
ＲＥＬＵＣ；で安定にトランスフェクションした。次い
で、これら細胞を、図２４に示した本発明の方法におい
て用いた。 工程１：本スクリーニング検定において使用する第１の
操作は、ＴＧＦβプロモーターからの転写を誘導する化
合物の能力を測定することである。この検定は、pＴＧ
Ｆβ-３０１ＬＵＣで安定にトランスフェクションされ
たＭＣＦ-７細胞を用い、実質的に実施例９の記載のよ
うに行なった。細胞培養と検定条件を９６ウエル微量滴
定プレートの形式に適合させた。約５０％全面の結果に
なる密度で９６ウエルプレートに細胞を蒔いた。試験化
合物は、種々の供給源から選択することができる。これ
ら供給源には、薬学的探索の記録、化成品製造元の製品
リスト、および発酵抽出物などの天然の供給源が含まれ
る。試験化合物を含有する増殖培地(例えば、実施例４
に記載)で細胞を約２４時間インキュベートする。次い
で、細胞をプレートのその場で溶解し、この溶解液を定
量タンパク質検定とルシフェラーゼ活性検定の両方に付
す。ルシフェラーゼ活性の２倍を越える増加を誘導した
化合物を、さらに試験するに適格であるとみなす。
【０１１０】工程２：工程１に記載したように同定され
た化合物を用い、pＧＬ２ＬＵＣで安定にトランスフェ
クションされた細胞培養物において検定を行ない、これ
ら化合物が一般的な転写誘導物質であるか否かを決定す
る。このような一般的な転写誘導物質は、ラロキシフェ
ン応答要素に依存性の遺伝子発現の変調物質である可能
性ある抗骨粗鬆症薬物に必要とされる転写誘導の特異性
を欠いているので、このような一般的な誘導物質はさら
に試験することから除外する。 工程３：次いで、ラロキシフェン応答要素に依存性の遺
伝子発現の変調物質である可能性ある抗骨粗鬆症薬物の
ための必要とされる転写誘導の特異性を有する化合物
(即ち、pＧＬ２ＬＵＣでトランスフェクションされた細
胞において転写を誘導することなくpＴＧＦβ-３０１Ｌ
ＵＣ細胞において転写を誘導しうる化合物)を検定し
て、このような化合物がエストロゲン応答要素からの転
写を誘導するか否かを測定する。pＧＬ２ＥＲＥＬＵＣ
で安定にトランスフェクションした細胞を、実施例６の
記載のようにエストラジオールの存在下および非存在下
の両方で検定する。エストロゲンの非存在下でpＧＬ２
ＥＲＥＬＵＣを活性化した化合物を、さらに試験するの
に不適格とする。この理由は、エストロゲンの非存在下
でエストロゲン応答要素からの転写を誘導するこれら化
合物の能力が、インビボでの可能性あるエストロゲン性
活性の証拠となるためである。
【０１１１】工程４：次いで、上記の工程１〜３の基準
を満たした化合物をさらに試験して、これら化合物が抗
エストロゲン性または非エストロゲン性／非抗エストロ
ゲン性のいずれであるかを決定する。この目的のため
に、pＧＬ２ＥＲＥＬＵＣで安定にトランスフェクショ
ンした細胞においてエストラジオールの存在下に化合物
を検定する。この検定におけるエストロゲン誘導のルシ
フェラーゼ活性の阻害は、このような化合物が抗エスト
ロゲン活性を有していることを示す。抗エストロゲン性
および非エストロゲン性の両化合物は、これら化合物の
用量−応答プロフィールおよびＥＤ50値について特徴付
ける。これら化合物の用量−応答プロフィールを作成
し、その結果をラロキシフェンのような既知の抗エスト
ロゲンと比較するために、さらに実験を行なうことがで
きる。このスクリーニングプロトコールの後、通常の検
定、特に適当な動物モデル系を含むインビボ検定を用い
て、本明細書中に記載のように同定した化合物の抗エス
トロゲン性の性質をさらに特徴付けることができる。次
いで、望ましい抗骨粗鬆症薬物の性質を有するこのよう
な抗エストロゲン性化合物の開発を、本検定において同
定した化合物から好都合かつ迅速に達成することができ
る。
【０１１２】実施例１４ インビトロおよびインビボ活
性の間の関係 以下の実験は、インビトロ検定と閉経後骨粗鬆症のイン
ビボモデルの間の関係を示すために行なった。このイン
ビトロ検定は、ＴＧＦβ-３プロモーターのラロキシフ
ェン応答要素により転写を誘導する試験化合物の能力を
測定する。このインビボモデルは、卵巣摘出ラットの骨
(大腿)無機質密度の変化を測定する。以下の化合物をこ
れらの実験に用いた。 ・ラロキシフェン：６−ヒドロキシ−２−(４−ヒドロ
キシフェニル)−３−[４−(２−ピペリジノエトキシ)ベ
ンゾイル]ベンゾ[ｂ]チオフェン； ・０８８０７４：６−ヒドロキシ−２−(４−ヒドロキ
シフェニル)−３−(４−ヒドロキシベンゾイル)ベンゾ
[ｂ]チオフェン； ・１５６６７８：６−ヒドロキシ−２−(４−ヒドロキ
シフェニル)−３−[４−(２−(３−メチルピロリジン)
エトキシル)ベンゾイル]ベンゾ[ｂ]チオフェン； ・１７１１４７：２−(４−ヒドロキシフェニル)−３−
[４−(２−ピペリジノエトキシ）ベンゾイル］ベンゾ
[ｂ]チオフェン； ・３０９５０３：６−ヒドロキシ−２−(４−ヒドロキ
シフェニル)−３−[４−(２−ヒドロキシエトキシ)ベン
ゾイル]ベンゾ[ｂ]チオフェン。 これらの化合物は、米国特許 No.4,133,814(1979年1月9
日発行；本明細書の一部を構成する)に一般的に記載さ
れているように調製する。
【０１１３】ラロキシフェン、０８８０７４、１５６６
７８、１７１１４７、および３０９５０３(Eli Lilly a
nd Company)を検定して、ルシフェラーゼ活性によって
測定したときに、１０nＭ未満の濃度[即ち、最小有効濃
度(ＭＥＣ)＜１０nＭ]でＴＧＦβ-３遺伝子のプロモー
ターからの転写の２倍誘導を与えるこれら化合物の能力
を測定した。トランスフェクションの１日前に、ＨeＬa
細胞を０.０５％トリプシン／５.３mＭエチレンジアミ
ン四酢酸四ナトリウム(ＥＤＴＡ)の溶液でトリプシン処
理して単細胞浮遊液を得た。分離した全面細胞を計数
し、１,０００,０００細胞／mlの濃度まで希釈した。３
００万個の細胞と３：１培地(２５ml)をt-１５０フラス
コに加え、一晩インキュベートした。その翌日に培地を
細胞から除去し、新鮮な培地(２５ml)で置換した。ProF
ection Mammalian Transfection System (Promega)を用
いて、細胞をpＴＧＦβ-３０１ＬＵＣ(１０μg)、pＣＭ
ＶＥＲ(１μg)、およびpＲＳＶβgal(１μg)で一時的に
同時トランスフェクションした。pＴＧＦβ-３０１ＬＵ
Ｃ(９４０μg)、pＣＭＶＥＲ(９４μg)、pＲＳＶβgal
(９４μg)、ＣaＣl2(５.７０４ml)、およびヌクレアー
ゼを含まない水(４７ml)を渦巻撹拌しながら２ｘＨＥＰ
ＥＳ(４７ml)と混合することによって、トランスフェク
ション溶液を調製した。得られた溶液を室温で３０分間
インキュベートした。このトランスフェクション溶液
(３ml)をそれぞれのフラスコに加えた。細胞をトランス
フェクション溶液と共に一晩インキュベートした後、培
地を除去し、それぞれのフラスコをＣa／Ｍgを含まない
リン酸緩衝食塩溶液(１０ml；GIBCO)で洗浄した。この
洗浄した細胞をトリプシン処理(３mlのトリプシン／Ｅ
ＤＴＡ)して細胞を分離させた。この分離細胞を新鮮な
培地(３ml)で処理した。遠心して培地とトリプシンを除
去することによって細胞ペレットを調製した。細胞を約
２０mlの培地に浮遊させ、計数した。この細胞を５０
０,０００細胞／mlの濃度まで希釈した。次いで、５０,
０００の細胞を９６ウエルプレートの各ウエルに加え、
細胞を一晩インキュベートした。
【０１１４】試験化合物をジメチルスルホキシドに溶解
し、最初は１：１０００に希釈した。この希釈は、深い
ウエルの微量滴定プレート中の培地(１０００μl)に薬
物溶液(２μl)を加え(１：５００希釈)、次いで、この
希釈薬物溶液(１００μl)を既にプレート中にある培地
(１００μl)に加える(１：２希釈)ことによって行なっ
た。化合物のスクリーニングのためには、化合物を上記
のように１：１０００に希釈し、次いでさらに１：１０
０に希釈した。また、最小有効濃度は８希釈の用量−応
答曲線を用いて決定した。化合物と細胞を９６ウエルプ
レート中で一晩インキュベートした。培地を細胞から除
去し、各ウエルをＣa／Ｍgを含まないリン酸緩衝食塩水
(２００μl)で洗浄した。この食塩溶液を除去し、細胞
を溶解緩衝液[１００mＭ ＫＰＯ4、０.２％ トリトンＸ
-１００、１mＭ ＤＴＴ、pＨ７.８](６０μl)で溶解し
た。得られた溶液を用いてルシフェラーゼまたはβ-gal
活性を検定した。ルシフェラーゼ検定は、ルシフェリン
溶液がルシフェリン(１００mg)、１Ｍグリシル−グリシ
ン(９ml)、４０mＭ ＥＧＴＡ(３６ml)、１Ｍ ＤＴＴ(７
２０ml)、１ＭＭgＳＯ4(５.４ml)、および水(３１０ml)
を含有することを除き、実質的に実施例６の記載のよう
に行なった。これら実験の結果を以下の表にまとめる。
【表１２】 表 １２ 化合物 ＴＧＦβ検定 a 骨密度 b ラロキシフェン ＋ ＋ ０８８０７４ − − １５６６７８ ＋ ＋ １７１１４７ ＋ ＋３０９５０３ − − a：「＋」は、試験化合物がＥＤ50＜１０nＭで規格化ル
シフェラーゼ活性において２倍の誘導を与えたことを示
す。 b：骨の無機質密度が卵巣摘出動物よりも統計学的に高
いことを示す。
【０１１５】また、卵巣摘出ラットの骨無機質密度を保
存する上記化合物の能力についても試験した。７５日齢
の老齢雌性Sprague Dawleyラット(体重範囲２２５〜２
７５g)をCharles River Laboratories (Portage, MI)か
ら入手した。これらを３つの群で飼育し、食物(カルシ
ウム含量：約１％)と水を任意に摂取させた。室温は４
０％の最少相対湿度で２２.２℃±１.７℃に維持した。
部屋の光周期は１２時間明るくし１２時間暗くした。到
着の１週間後に、ラットを麻酔下[４４mg／kgケタミン
および５mg／kgキシラジン(Butler, Indianapolis, IN)
を筋肉内投与]に両側卵巣摘出に付した。担体または試
験化合物による処置は、手術日の麻酔から醒めた後に開
始した。経口投与を、１％カルボキシメチルセルロース
(ＣＭＣ)(０.５ml)中のガベージによって行なった。体
重を手術時およびその後の毎週測定し、投与量を体重の
変化に合わせた。担体または処置の卵巣摘出(ovex)ラッ
トおよび非卵巣摘出(無傷)ラットを、陰性および陽性対
照となるそれぞれの実験群と平行して評価した。ラット
を３５日間毎日処置し(処置群あたり６匹のラット)、３
６日目に断頭して犠牲にした。３５日の期間は、本明細
書中の記載のように測定する骨密度を最大に減少させる
に十分であった。右大腿骨を切り取り、単一光子吸収法
により膝蓋骨溝から１mmの遠位骨幹端のところでスキャ
ンした。デンシトメーター測定の結果は、骨無機質含量
と骨幅の関数としての骨密度の計算値を表す。一般に、
ラットの卵巣摘出は、無傷の担体処置対照と比較したと
きに、約２５％の大腿骨密度の減少を引き起こした。こ
れら実験の結果を表１２にまとめる。
【０１１６】これら実験の結果は、ラロキシフェン、１
５６６７８および１７１１４７などのＴＧＦβ-３遺伝
子のプロモーター領域のラロキシフェン応答要素からの
転写を強力に誘導する化合物が卵巣摘出ラットの骨密度
の保存をも示すことを示すものである。また、０８８０
７４および３０９５０３などのラロキシフェン応答要素
の転写を誘導しない化合物は、卵巣摘出ラットの骨の無
機質密度の損失に対して統計学的に有意の保護も示さな
い。
【０１１７】上記の開示が本発明のある種の特定の態様
を強調するものであること、そして、これらと等価な全
ての修飾または改変は本願の特許請求の範囲に記載した
本発明の思想または範囲の内にあることは理解されるべ
きである。
【０１１８】
【配列表】
【０１１９】配列番号：１ 配列の長さ：２２０５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：misc_ＲＮＡ 存在位置：１..２ 他の情報：／注＝「番号１はＴＧＦβ−１プロモーター
の−１３６２に対応」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc_ＲＮＡ 存在位置：１３６３..１３６５ 他の情報：／注＝「ＴＧＦβ−１の＋１コドンに対応」 配列： GGATCCTTAG CAGGGGAGTA ACATGGATTT GGAAAGATCA CTTTGGCTGC TGTGTGGGGA 60 TAGATAAGAC GGTGGGAGCC TAGAAAGGAG GCTGGGTTGG AAACTCTGGG ACAGAAACCC 120 AGAGAGGAAA AGACTGGGCC TGGGGTCTCC AGTGAGTATC AGGGAGTGGG GAATCAGCAG 180 GAGTCTGGTC CCCACCCATC CCTCCTTTCC CCTCTCTCTC CTTTCCTGCA GGCTGGCCCC 240 GGCTCCATTT CCAGGTGTGG TCCCAGGACA GCTTTGGCCG CTGCCAGCTT GCAGGCTATG 300 GATTTTGCCA TGTGCCCAGT AGCCCGGGCA CCCACCAGCT GGCCTGCCCC ACGTGGCGGC 360 CCCTGGGCAG TTGGCGAGAA CAGTTGGCAC GGGCTTTCGT GGGTGGTGGG CCGCAGCTGC 420 TGCATGGGGA CACCATCTAC AGTGGGGCCG ACCGCTATCG CCTGCACACA GCTGCTGGTG 480 GCACCGTGCA CCTGGAGATC GGCCTGCTGC TCCGCAACTT CGACCGCTAC GGCGTGGAGT 540 GCTGAGGGAC TCTGCCTCCA ACGTCACCAC CATCCACACC CCGGACACCC AGTGATGGGG 600 GAGGATGGCA CAGTGGTCAA GAGCACAGAC TCTAGAGACT GTCAGAGCTG ACCCCAGCTA 660 AGGCATGGCA CCGCTTCTGT CCTTTCTAGG ACCTCGGGGT CCCTCTGGGC CCAGTTTCCC 720 TATCTGTAAA TTGGGGACAG TAAATGTATG GGGTCGCAGG GTGTTGAGTG ACAGGAGGCT 780 GCTTAGCCAC ATGGGAGGTG CTCAGTAAAG GAGAGCAATT CTTACAGGTG TCTGCCTCCT 840 GACCCTTCCA TCCCTCAGGT GTCCTGTTGC CCCCTCCTCC CACTGACACC CTCCGGAGGC 900 CCCCATGTTG ACAGACCCTC CTTCTCCTAC CTTGTTTCCC AGCCTGACTC TCCTTCCGTT 960 CTGGGTCCCC CTCCTCTGGT CGGCTCCCCT GTGTCTCATC CCCCGGATTA AGCCTTCTCC 1020 GCCTGGTCCT CTTTCTCTGG TGACCCACAC CGCCCGCAAA GCCACAGCGC ATCTGGATCA 1080 CCCGCTTTGG TGGCGCTTGG CCGCCAGGAG GCAGCACCCT GTTTGCGGGG CGGAGCCGGG 1140 GAGCCCGCCC CCTTTCCCCC AGGGCTGAAG GGACCCCCCT CGGAGCCCGC CCACGCGAGA 1200 TGAGGACGGT GGCCCAGCCC CCCCATGCCC TCCCCCTGGG GGCCGCCCCC GCTCCCGCCC 1260 CGTGCGCTTC CTGGGTGGGG CCGGGGGCGG CTTCAAAACC CCCTGCCGAC CCAGCCGGTC 1320 CCCGCCGCCG CCGCCCTTCG CGCCCTGGGC CATCTCCCTC CCACCTCCCT CCGCGGAGCA 1380 GCCAGACAGC GAGGGCCCCG GCCGGGGGCA GGGGGGACGC CCCGTCCGGG GCACCCCCCC 1440 GGCTCTGAGC CGCCCGCGGG GCCGGCCTCG GCCCGGAGCG GAGGAAGGAG TCGCCGAGGA 1500 GCAGCCTGAG GCCCCAGAGT CTGAGACGAG CCGCCGCCGC CCCCGCCACT GCGGGGAGGA 1560 GGGGGAGGAG GAGCGGGAGG AGGGACGAGC TGGTCGGGAG AAGAGGAAAA AAACTTTTGA 1620 GACTTTTCCG TTGCCGCTGG GAGCCGGAGG CGCGGGGACC TCTTGGCGCG ACGCTGCCCC 1680 GCGAGGAGGC AGGACTTGGG GACCCCAGAC CGCCTCCCTT TGCCGCCGGG GACGCTTGCT 1740 CCCTCCCTGC CCCCTACACG GCGTCCCTCA GGCGCCCCCA TTCCGGACCA GCCCTCGGGA 1800 GTCGCCGACC CGGCCTCCCG CAAAGACTTT TCCCCAGACC TCGGGCGCAC CCCCTGCACG 1860 CCGCCTTCAT CCCCGGCCTG TCTCCTGAGC CCCCGCGCAT CCTAGACCCT TTCTCCTCCA 1920 GGAGACGGAT CTCTCTCCGA CCTGCCACAG ATCCCCTATT CAAGACCACC CACCTTCTGG 1980 TACCAGATCG CGCCCATCTA GGTTATTTCC GTGGGATACT GAGACACCCC CGGTCCAAGC 2040 CTCCCCTCCA CCACTGCGCC CTTCTCCCTG AGGAGCCTCA GCTTTCCCTC GAGGCCCTCC 2100 TACCTTTTGC CGGGAGACCC CCAGCCCCTG CAGGGGCGGG GCCTCCCCAC CACACCAGCC 2160 CTGTTCGCGC TCTCGGCAGT GCCGGGGGGC GCCGCCTCCC CCATG 2205
【０１２０】配列番号：２ 配列の長さ：５５７８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＴＡＴＡ_signal 存在位置：２２４８..２２５２ 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：２２７８..３９８０ 配列の特徴 特徴を表す記号：intron 存在位置：３９８１..５５７８ 配列の特徴 特徴を表す記号：misc_ＲＮＡ 存在位置：３６３５..３９８０ 他の情報：／注＝「ＣＤＳ、コドン開始＝１」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc_ＲＮＡ 存在位置：１..２ 他の情報：／注＝「番号１はＴＧＦβ−２の−２２７７
に対応」 配列： AAGCTTTTAC CAATACCTCC CGTCTTACCC CTCCTGGGCT TTGGGGAAAT TAAAGTAGCC 60 TCTTATGAGT AAGTCAGGGG TCTCAGGTCT AAGGAGTTGT TAAGTGAGCA ATAGGTACTC 120 AGTAAACTAA GTATTATGAA CAAAAGTGTG TATGTCTATG TCAGGAAGAG GGGTGGCCAT 180 CAGAATTTAT GGCTTGCGCT GTTTCCTAGA AGTGATGTAA TGAACTTTTG CTACTCTATC 240 CACACTCTAA TCTGAATCTA CTTAAGGTGC ATCAGTGTCT GTACCAAGAA GGTTGTCTAT 300 AAACATGAAA GATGGATGCT CACTGGCTTG TGGAAGCTGA ACCTGTATCC TCAGAAAATA 360 CAGTGATAGC TAATTCAGGT AACCAGCCAT ATTCCACAGC AGCATCTTCT CTCAGTAGCT 420 CTGGTTTGGA GCTCCTGCTC TGTGTCTATA ATGGCCACAG GTGTAAGAAT ATTCACTTTT 480 TGTCCAATCT GTAGAGCTAG CCTACTGCAG TTCTCAAACT GAACTCAGAG GGAGGACCTA 540 ACTGGATGAA ACTACTAGTC TGACAGTAGC GCCTCTTGAT TATCTTTTTC TTGGGCTACT 600 GGGATGGTAG CTTTGCTTCA ACTCAAAACT GGTATCAAGG AAAGGAACCT GCTGGTGCTG 660 ATTTATACAT AATTTTTAGA ATTATTCAGA AGTGGGTTGG AACAATTATT TTATTCCAGA 720 GTTTTTCAAT GTGTGATAAT GGAAAAAATT CTGTATTCAA GGGAGTTTGG AAAATGCTGG 780 GTTAAAAGAG TGAAAAGGTT TTCTCTTCTA CAGGAGTTTC AGAGCCTTTA ACATGATAAT 840 GTTCCAGAAT GAGGAATCTA AGAGGACAGG AGAGTACCCA GTATCTCCCA AACTTGTTTG 900 ACTCCAGAAT TCCTGTTTGT CAGAACATAT TCTGGGACCA TTGTTTCTCA GAAGTACATA 960 GTAGGTAAGA ACATAGTGGA TCCTGACTGC AAAAATCCAG CTCTACCACT TACTGTGGTC 1020 TCGAACAAAG TACTTAACTT CTTTGTACCT CAGTCTCCTC ATCTGCCAGA TATGGATAAT 1080 AAGACCCACT TTATAGGTTC ATAGTGAAGA TTAAATGACC ATACACAACA CACATCAAAT 1140 TACTAAGTGT AGTATATGTT AGCTATTATT ATTTTATTTA TTCAGTGCTC TACTAATAAC 1200 CTAGGCCCCA TACACAACTG AAGTATAATT CCAAAAGTGA TAGAAAGTTC TTTGTGACTT 1260 TTCTGAACTC AGGAACATCT GAAGTAGAGA ACAGTATAGA GATCTTGGGT TTGGGAGTAC 1320 ATTCAACAGA GTTTTCCAGT TTAAATCATC TGTCTGGTCA GTATGGCTGC AGAGTCATGC 1380 CGAAATGAAA ATGTTGACTT TGAGTAACTA AAGGTAAAAT AAAAGAAAAA GGGAAGGTGG 1440 AACAGTGGTA AGAGTTATTC TGTATTCATC TAATTTAAGA CTTAGTTGAA ATTGAAAATG 1500 TCAAGTTATG AGTAGTGTAG AACAAGTAGA CATCAAACAC TTAAAATTCC AGCTTCCTGG 1560 ATTATGCTAT GGAAAGAATG AAGTTGGTGG ATAATGTTTA GCCTAGCAAG AAGGTCAAGA 1620 AGAAGAAAGC CATACAAGAA GTGGCTTAGG CAGCAAATTA TAAAGGTGAC CATTCATTCA 1680 AATCAGTAAA ACAAACAAGT ATACCTTATT CTTTAGGTAA AATTGATGGA TCTCTGTTTT 1740 CCAGCAGTTC ACAAACAGAG GGGTACATTG TAAACAACAA ACTAACAAAA TAAATTCTGG 1800 GATGGCAACC TGCTAAGGTA TCCCAGAAAA TAAGAGGTAG GACATGAATT TAAAAGATTG 1860 GAAGGTATGT CTTCAGTACT GGCCTGGCCC TGAGTAGACT AGTGCCCTCC ATAGGGGTGC 1920 GTGTGCACAC ATAATACAGG AGGGAAGCCT TCCCTTCTAG AGCAAGTGAT TCAGCTTGGG 1980 AGGCTGTGAC TGAGCTACAC TAAGTAAAAA CGGGAGACTT GATTGTCCTT CAACAGACCT 2040 GTCCAAAATG ACTGGAAAGT AAATACCGTA AATCACTGTT GTCAGGGCGC ACATTCCACC 2100 TCCTTCCTCC CTTACCCACA GCGGTCCACA TTTCCACACT CCCTACACGG TTCGGGGAGA 2160 GCTCGTGGTC TAAGTAACGA GAGGACTTCT GACTGTAATC CTAGCACGTC ACTTTGTTGA 2220 AGGCAGACAC GTGGTTCAGA GAGAACTTAT AAATCTCCCC TCCCCGCGAA GATCGTGATG 2280 TTATTCGCTG GCAGCAGAAG GTCTTGCCGA GCGAGCTCCA GAACGTCCTG ACAAGAGAAA 2340 GACAGATTGA GATAGAGATA GAAAGAGAAA GAGAGAAAGA GACAGCAGAG CGAGAGCGCA 2400 AGTGAAAGAG GCAGGGGAGG AGGGGGATGG AGCATATTAC GTGACCGGCC TAGGGAGTCA 2460 TCCAGGAACA AACTGAGGGG CTGCCCGGCT GCAGACAGGA GGAGACAGAG AGGATCTATT 2520 TTAGGGTGGC AAGTGCCTCC TACCCTAAGC GAGCAATTCC ACGTTGGGGA GAAGCCAGCA 2580 GAGGTTGGGA AAGGGTGGGA GTCCAAGGGA CGCCCCTGCG CAACTCCCTC AGGAATAAAA 2640 CTCCCCAGCC AGGGTGTCGC AAGGGCTGCC GTTGTGATCC GCAGGGGGTG AACGCAACCG 2700 CGACGGCTGA TCGTATGTGG CTGGGTTGGC GTTTGGAGCA AGAGAAGGAG GAGCAGGAGA 2760 AGGAGGGAGC TGGAGGCTGG AAGCGTTTGC AAGCGGCGGC GGCAGCAACG TGGAGTAACC 2820 AAGCGGGTCA GCGCGCGCGC GCCAGGGTGT AGGCCACGGC GCGCAGCTCC CAGAGCAGGA 2880 TCCGCCCGCC CTCGGCAGCC TCTGCGGCCC CTGCGGCACC CGACCGAGTA CCGAGCGCCC 2940 TGCGAACGGC ACCCTCCTCC CCGCGGTGGC TGGGCTCGCC CCAGCGCGCA CACGCACACA 3000 CACACACACA CACACACACG CACGCACACA CGTGTCGTTC TCTGCTCCGG AGCTGCTGCT 3060 GCTCCTGCTC TCAGCGCCGC AGTGGAAGGC AGGACCGAAC CGCTCCTTCT TTAAATATAT 3120 AAATTTCAGC CCAGGTCAGC CTCGGCGGCC CCCCTCACCG CGCTCCCGCC CCTCCCGTCA 3180 GTTCGCCAGC TGCCAGCCCC GGGACCTTTT CATCTCTTCC CTTTTGGCCG GAGGAGCCGA 3240 GTTCAGATCC GCCACTCCGC ACCCGAGACT GACACACTGA ACTCCACTTC CTCCTCTTAA 3300 ATTTATTTCT ACTTAATAGC CACTCGTCTC TTTTTTTCCC CATCTCATTG CTCCAAGAAT 3360 TTTTTTCTTC TTACTCGCCA AAGTCAGGGT TCCCTCTGCC CGTCCCCTAT TAATATTTCC 3420 ACTTTTGGAA CTACTGGCCT TTTCTTTTTA AAGGAATTCA AGCAGGATAC GTTTTTCTGT 3480 TGGGCATTGA CTAGATTGTT TGCAAAAGTT TCGCATCAAA AACAACAACA ACAAAAAACC 3540 AAACAACTCT CCTTGATCTA TACTTTGAGA ATTGTTGATT TCTTTTTTTT ATTCTGACTT 3600 TTAAAAACAA CTTTTTTTTC CACTTTTTTA AAAAATGCAC TACTGTGTGC TGAGCGCTTT 3660 TCTGATCCTG CATCTGGTCA CGGTCGCGCT CAGCCTGTCT ACCTGCAGCA CACTCGATAT 3720 GGACCAGCTC ATGCGCAAGA GGATCGAGGC GATCCGCGGG CAGATCCTGA GCAAGCTGAA 3780 GCTCACCAGT CCCCCAGAAG ACTATCCTGA GCCCGAGGAA GTCCCCCCGG AGGTGATTTC 3840 CATCTACAAC AGCACCAGGG ACTTGCTCCA GGAGAAGGCG AGCCGGAGGG CGGCCGCCTG 3900 CGAGCGCGAG AGGAGCGACG AAGAGTACTA CGCCAAGGAG GTTTACAAAA TAGACATGCC 3960 GCCCTTCTTC CCCTCCGAAA GTAAGTACTT ATTTTGACTT CCATCCCCTG AGGTTTAGCT 4020 CTGCCCGGAG CTCTCAAAAC CGCAGCAGCT CCCGGGATCG CCCTTCCCTC TGCCGGTTCC 4080 CGTTCGCTCT TTTCCCGTTC TCCTGTCCTT CACCCCACCA CCTCCTTTTC AGTTGTAGTC 4140 TTGAGGCCAT CAGGCTTTAA AATGTTTACT TTCTACTTTA TTTTCTCCAT CTTTCCCTTG 4200 CCCCCTAACA ATGCGGTTCT TTAAAAGGCG TTATTCTCTT TTTCTCTTCC CTGAAGTTCT 4260 TTAGTCGGCC ACCAGCTAAG GAGTCAGCCC CACTCTGTCA AACTAGAGGT GCTCCCAGGG 4320 GCAGAGTTAA ACTGAGGAAT CTTCGTAGGT TTGTTTTCTT TGCTCCGATT GGCGTGGAGC 4380 GGCCGAACTG GTGCACGAGG GTTAAAAAAA GTGCTCTCAA AACTAGCCTC TGCCGGAAGC 4440 GCCCCCTTTC CGTGCTGACC TATCAGCTGG TTCCCCAAGC CTTCTCTATT GTCTCTAACT 4500 ACCCTAAAAA TGTCAGCATC GCCGAGACAA AACCCGGTTT GGAGACCCCT CGAGAAACCT 4560 ACCTGGCCCT CAGTCCTTGA TGTATACTTT GCTATACCTA GGTGTTTCAT TACCCACCGG 4620 CAAAATCCTA TAACCACGTT CCCTTTTCAC TTAACCTGGA GCGCAGAAAG GACAACTCCG 4680 TTTCTGACTA TGTTTTAAAA GGTTTTGTTC ACGTTATTTT TCAGCATACA CTCAAACCTG 4740 CCTTCTTCAC ATCTCCAGTG TAGCAGATCA TTTTTCTTAC GGGTCTGTTA TCCTGCTCCT 4800 GCCTTTTCGT AGGCTTCCTG CAGTTACTTC AATGCATTCT TAAAACTCAG AGTAGACGAC 4860 AGCCGTATTT TTTTTTTTTT TTTTTACTGG CTTCTCTGAG AACAGTGTCC TCAAAACCAG 4920 CTGGCATACA GTAGCAATAG GAGTGAAATG ATTTATTGCA GAGGAAGGGA ACAGACAGTG 4980 TAGAATGATT TCAGAGTTCT TAAAAAAAGA AAAAAAAGAA AGAAAGAAAG AAAAGGGGCA 5040 GCAGCATCCA CTTGATACCT GAGAGGGTTA AATACCAGGA AGAAGAAAAA GAAAAGTGGG 5100 GGCGGGGTGG GGGGAACTCT TCAACATTTG TGTATTCCAA ATCCAAGTCA TAAACTTTTC 5160 ATTGGTTGCT CATTTCTCTC CTCCCCTTTC CATGCCCTAT ATACTTGCTG GCTGCCTTTG 5220 CAAAGTCTCT GTGTCTTGCC TAAATAGATA ATATAGCCTT CTTGGTAATT TTCTCTTAAA 5280 GGTTCTAGTT GCAGGGTGGT GCTTTTCTTT TTTAATATTT ATTTTTAGTT TGACAAGTCC 5340 TAGCTATGTG ACCTGCCATG TCTTGTACTT GATGGTCTCA GAAGTCAGCC CATGTATCTA 5400 ACCCCAGTCT TCCTAGTGAC CCTTATTTTG CTGCAGTTTC TCCTGTTCTT GTTCAATAGC 5460 AGAACAGATG CAGAGAATTC TGGCAAGCAG GATGATTTTA TTATTGTAAT TATGGCACTA 5520 TCCGCAACAG CTGATAAATA CACTCCACCC CTGGTTATCC CCTTTGGAAG TAAAGCTT 5578
【０１２１】配列番号：３ 配列の長さ：３３０３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：mＲＮＡ 存在位置：２１７０..３３０３ 配列の特徴 特徴を表す記号：mＲＮＡ 存在位置：２２１４..３３０３ 配列の特徴 特徴を表す記号：mＲＮＡ 存在位置：２２１９..３３０３ 配列の特徴 特徴を表す記号：misc_ＲＮＡ 存在位置：３３０１..３３０３ 他の情報：／注＝「ＣＤＳ開始、コドン開始＝１、翻訳
Ｍ」 配列の特徴 特徴を表す記号：ＴＡＴＡ_signal 存在位置：２１７０..２１７６ 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１８９６..２３０６ 他の情報：／注＝「pＢ-３０１ −３０１から＋１１
０まで」 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１９７６．．２３０６ 他の情報：／注＝「pＢ-２２１ −２２１から＋１１
０まで」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２１０６..２３０６ 他の情報：／注＝「pＢ-９１ −９１から＋１１０ま
で」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２１３７..２３０６ 他の情報：／注＝「pＢ-６０ −６０から＋１１０ま
で」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２１５０..２３０６ 他の情報：／注＝「pＢ-４７ −４７から＋１１０ま
で」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２１５９..２３０６ 他の情報：／注＝「pＢ-３８ −３８から＋１１０ま
で」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２１５９..２２７１ 他の情報：／注＝「ＴＧＦβ-３の−３８から＋７５位ま
で」 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２１５９..２２３１ 他の情報：／注＝「ＴＧＦβ-３の−３８から＋３５位ま
で」 配列： CAGTAGTAGC TTCCAGAACT TGCTTAGCAC CTGAATCACG TGTGAGGTTT GTAAAGAAAC 60 AGAGATGCCA GGGCCTCAGC TCTGGAGACT GATTGGTAGA GGTGGAGTCC AAAAAAGTAT 120 AACTTTAATA ATTTTCCTTC CTATCTTCAA CTGTCTGCTC AAAGGCCTTC CCTTATCACC 180 CTATTTGAAA CTGCAACATC CCCCAACCTA GGCACACCCC ATCCTCCTTC CCTGCTTGAT 240 TTTCTGCCAC ACCACATTTG TTTGTTTGCT TGTCTGTTTG AGACACGGTC TTGCTCTGTC 300 GTCCAGGCTG GAGTGCAGTG GTGCAATCTT GGCCCCCTGT AAACTCGCCT CCCTGGCTCA 360 AGTGATTATC CTGCTCAGCC TCCCAAGTAG ATGCGTGCGC CAACATGCCG GGCTAATTTT 420 TCCATTTTTT TGTAGAGACT GGGTTTCGCC GTGTTGCTGG GGCTGGTCTC GAATTCCTGA 480 GCTCAAGTAA TCCTCCTGCA TGGGCCTCCC CAAATGCTGG GATTACAGGC GTGAGCCACT 540 GCACCTGGCT CAGCACTTTT TACCGTACTA CATCATTTAC ATATTTATTT AGTTTATCGC 600 CTCCTCCACT GCCCCACCCC TGCCTCTAAA TAAAATTTCC CTGAGGGCAG GAGTTTTGTT 660 TCGTTCACTG ATATTCTTCA CAGAGCCTAG AATAGTGCCT GGTATATAGA AACATTAAAC 720 TTTTTCTGAA ATTTCAGAGG CAGTATAGCA TAGTAATTAA GTCCAGAATC TGGCAACGTC 780 CTGGGTGCAA ATCCCAACAG CTGACACCTA ATAACTATGT GACCTTGGGC AAGTTACTTT 840 TAAAGTTTCT ACCCCTAGGT TTCCCATTGG TTTTGCAAAT GAAAGTAATG CCTACCCAAG 900 CTAGATAGCC TGTGTAAATA TCGCCTCCAT CACTCACAAG CAGTGTGGTC TGTAAAAAAA 960 AAAACAAAAA ACTCTATGCC TCAGTTTCCT CATCCGTAAA AGTGACCCAC CGCTGTGCTG 1020 GGATACAGAG AACAGCCCCT TCAGTTAGTG GCCTGGAAGC CAGCCTCTCA GAAAGGGTCC 1080 AGGAAGGCTG GAGTGAGATG GGGTGGAGCG GCACTCACTC TCAGGAAAGT TCAGTTCAGA 1140 GGCAAGCCCT GTGTTGCGGG GTGCGGGGAG CCACGTGCCC TACCCTCCCT TGGCTGCTCG 1200 TGGGAAAAGG CCTAGAGGTT CGGGCCGAGA AGAGGAGCGA AAGCACAGAG CCGACTTCCC 1260 CTCACCCATC TGGGAAATGG CTCGGGCCAA CTGCTGACTT CGCGCTCGCT GGCCGACGTC 1320 CTGCGGAGAC CTCGGCGGGG AGGGAGGCTG AACATCTGGA TGACATTTCT GCGAGAGAGC 1380 GGCTCCGGAG CGGCGGTCGG GGAGGGAGAG CTGCTCGTGC GCACGTCGGG CCGGGAGGGA 1440 GGCGATTCCT CGGGGCCTGG GTCTTGTTTT TCTCGCTCTC TACCGCAGCC CCTTCTCCCG 1500 CCCCTCAGCC CCCACCCCGC AGCCCCCAGC CCCCGAGCCT CCCCGGCTCC CGACCAGCCG 1560 AGCTCCTTCA CTGGCGGCCT CCGCTCGCCA GAGGGCACCC TCGATCTTCC GGAAAACGCC 1620 ACCATTTTTC ACTGCCCCTG GAGCGTCTCC AGGCTTCTGC CCGCCTCCCG ACTCCGATCT 1680 TGTCAATGAA GAATCGGGCC AGGATCGCCG CGGAGCGGAC GCCGACCCTC CGACCCGGCT 1740 CGCAGGCTGG GAGTCCCCTC TGCGAGGCTG GCATGGCCGC CCCTACCGGG TCCCGCGCCC 1800 TCTGCGGACC CTCCCCGGGT TGGGCCTGGC CGCGGGCGGC CCCGGGACCG GGGGACCAGG 1860 AGGGAGAGTA GACCGGGCCG GACGGCGCGG ACTGACAGCT GGCGAGAGGG CGCCGGGGCT 1920 GGGGGAAAGG GAGGGAGGGG GCTCATCGGA GTAACTTTCC AGAAAAACAC CAACGTGTGG 1980 CAGGAGTGAT TCCAAGAGGG GAAAAAAAGT TCAGCTACCA CGTCGAACGA GAGGACTCGC 2040 AAAGTATTTT TCAAAAGGGC TCGGCTTTTC CTGTGCCTGT TTAAAACATT AACATCGTGC 2100 AGCAAAAGAG GCTGCGTGCG CTGGTCCCTC CCTCCCCCAC CCCAGGCCAG AGACGTCATG 2160 GGAGGGAGGT ATAAAATTTC AGCAGAGAGA AATAGAGAAA GCAGTGTGTG TGCATGTGTG 2220 TGTGTGTGAG AGAGAGAGGG AGAGGAGCGA GAGGGAGAGG GAGAGGGAGA GAGAGAAAGG 2280 GAGGGAAGCA GAGAGTCAAG TCCAAGGGAA TGACCGAGAG AGGCAGAGAC AGGGGAAGAG 2340 GCGTGCGAGA GAAGGAATAA CAGCAGCTTT CCGGAGCAGG CGTGCCGTGA ACTGGCTTCT 2400 ATTTTATTTT ATTTTTTTCT CCTTTTTATT TTTTAAAGAG AAGCAGGGGA CAGAAGCAAT 2460 GGCCGAGGCA GAAGACAAGC CGAGGTGCTG GTGACCCTGG GCGTCTGAGT GGATGATTGG 2520 GGCTGCTGCG CTCAGAGGCC TGCCTCCCTG CCTTCCAATG CATATAACCC CACACCCCAG 2580 CCAATGAAGA CGAGAGGCAG CTGAAAAAGT CATTTAGAAA GCCCCCGAGG AAGTGTAAAC 2640 AAAAGAGAAA GCATGAATGG AGTGCCTGAG AGACAAGTGT GTCCTGTACT GCCCCACCTT 2700 TAGCTGGGCC AGCAACTGCC CGGCCCGCTT CTCCCCACCT ACTCACTGGT GATCTTTTTT 2760 TTTTTACTTT TTTTTCCCTT TTCTTTTCCA TTCTCTTTTC TTATTTTCTT TCAAGGCAAG 2820 GCAAGGATTT TGATTTTGGG ACCCAGCCAT GGTCCTTCTG CTTCTTCTTT AAAATACCCA 2880 CTTTCTCCCC ATCGCCAAGC GGCGTTTGGC AATATCAGAT ATCCACTCTA TTTATTTTTA 2940 CCTAAGGAAA AACTCCAGCT CCCTTCCCAC TCCCAGCTGC CTTGCCACCC CTCCCAGCCC 3000 TCTGCTTGCC CTCCACCTGG CCTGCTGGGA GTCAGAGCCC AGCAAAACCT GTTTAGACAC 3060 ATGGACAAGA ATCCCAGCGC TACAAGGCAC ACAGTCCGCT TCTTCGTCCT CAGGGTTGCC 3120 AGCGCTTCCT GGAAGTCCTG AAGCTCTCGC AGTGCAGTGA GTTCATGCAC CTTCTTGCCA 3180 AGCCTCAGTC TTTGGGATCT GGGGAGGCCG CCTGGTTTTC CTCCCTCCTT CTGCACGTCT 3240 GCTGGGGTCT CTTCCTCTCC AGGCCTTGCC GTCCCCCTGG CCTCTCTTCC CAGCTCACAC 3300 ATG 3303
【０１２２】配列番号：４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： GCGCCATATG AGTCTTAACT GCCAAAAATT CTTATCATCA AT 42
【０１２３】配列番号：５ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： AAGCAAGCTT TCGCAGCCTC TGCCAGGCAG TGTCCCGACC CGGA 44
【０１２４】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： AGCTTCGCGA CTCGAGA 17
【０１２５】配列番号：７ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： GATCTCTCCA GTCGCGA 17
【０１２６】配列番号：８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： TCGAGAAAAG TCAGGTCACA GTGACCTGAT CAAAC 35
【０１２７】配列番号：９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： TCGAGTTTGA TCAGGTCACT GTGACCTGAC TTTTC ３
５
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＴＧＦβ−１遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その１)。
【図２】 ＴＧＦβ-１遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その２)。
【図３】 ＴＧＦβ-２遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その１)。
【図４】 ＴＧＦβ-２遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その２)。
【図５】 ＴＧＦβ-２遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その３)。
【図６】 ＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その１)。
【図７】 ＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その２)。
【図８】 ＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その３)。
【図９】 ＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター領域を示
す配列図である(その４)。
【図１０】 対照化合物、エストロゲン、ラロキシフェ
ン、およびタモキシフェンの存在下での、ＣＡＴ遺伝子
に機能的に結合させたＴＧＦβ-１プロモーター、ＣＡ
Ｔ遺伝子に機能的に結合させたＴＧＦβ-２プロモータ
ー、またはＣＡＴ遺伝子に機能的に結合させたＴＧＦβ
-３プロモーターを含有する発現構築物でトランスフェ
クションした細胞におけるリポーター遺伝子の相対的な
発現レベルを示すグラフである。
【図１１】 エストロゲン、ラロキシフェン、およびエ
ストロゲンとラロキシフェンの組合せの存在下、エスト
ロゲン応答要素の支配下でのリポーター遺伝子の誘導を
示すグラフである。
【図１２】 エストロゲン、ラロキシフェン、およびエ
ストロゲンとラロキシフェンの組合せの存在下、ＴＧＦ
β−３プロモーターの部分の支配下でのリポーター遺伝
子の誘導を示すグラフである。
【図１３】 ＴＧＦβ-３プロモーター配列の部分を含
有する発現構築物でトランスフェクションされ、エスト
ロゲン受容体の存在下および非存在下に対照化合物、エ
ストロゲン、ラロキシフェン、およびエストロゲンとラ
ロキシフェンの組合せに暴露された細胞におけるリポー
ター遺伝子発現の相対的レベルを示すグラフである。
【図１４】 実施例１１に挙げた削除構築物によって発
現されるエストロゲン受容体(ＥＲ)タンパク質の種々の
ドメインを示し、さらにＴＧＦβ-３プロモーターとル
シフェラーゼ遺伝子を含有する発現構築物および種々の
突然変異ＥＲでトランスフェクションされた細胞におい
て達成しうる相対的な誘導倍率を示す模式図である。
【図１５】 種々濃度のエストラジオール、ラロキシフ
ェン、タモキシフェン、およびＩＣＩ １６４,３８４の
存在下、ＴＧＦβ-３プロモーターとＣＡＴ遺伝子を含
有する発現構築物でトランスフェクションされた細胞に
おいて達成しうるリポーター遺伝子発現のレベルを示す
グラフである。
【図１６】 種々濃度のエストラジオールおよびラロキ
シフェンの存在下、ＴＧＦβ-３プロモーターの部分と
ルシフェラーゼ遺伝子を含有する発現構築物でトランス
フェクションされたＣＨＯ細胞におけるリポーター遺伝
子の相対的な発現を示すグラフである。
【図１７】 種々濃度のエストラジオールおよびラロキ
シフェンの存在下、ＴＧＦβ-３プロモーターとルシフ
ェラーゼ遺伝子を含有する発現構築物でトランスフェク
ションされたＭＣＦ-７細胞におけるリポーター遺伝子
の相対的な発現を示すグラフである。
【図１８】 実施例１０で評価した化合物の化学構造を
示す模式図である。
【図１９】 ＴＧＦβ-３プロモーター／ＣＡＴ発現構
築物でトランスフェクションされ、種々濃度の実施例１
０に挙げた化合物に暴露されたＭＧ６３細胞におけるリ
ポーター遺伝子発現の相対的な誘導レベルを示すグラフ
である。
【図２０】 ４１塩基対のラロキシフェン応答要素を同
定するために用いたＴＧＦβ-３プロモーターの部分を
示し、リポーター遺伝子に機能的に結合させたＴＧＦβ
-３プロモーター配列のこれら表示した部分を含有する
プラスミドで形質転換した細胞におけるラロキシフェン
によるリポーター遺伝子発現の相対的な誘導を示す模式
図である。
【図２１】 ＴＧＦβ-３プロモーターの分析を示す配
列図である。
【図２２】 エストロゲン受容体と種々濃度のエストラ
ジオールおよびラロキシフェンの存在下、ＬＤＬＲプロ
モーターとルシフェラーゼ遺伝子を含有する発現構築物
でトランスフェクションされたＨep２細胞におけるリポ
ーター遺伝子の相対的な発現を示すグラフである。
【図２３】 種々濃度のエストラジオールおよびラロキ
シフェンの存在下であってエストロゲン受容体の非存在
下、ＬＤＬＲプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を含
有する発現構築物でトランスフェクションされたＨep２
細胞におけるリポーター遺伝子の相対的な発現を示すグ
ラフである。
【図２４】 本発明の教示に従って、ある化合物群を、
本明細書中で説明した調節コントロール要素に機能的に
結合させたリポーター遺伝子の転写を誘導するそれらの
能力について評価するために実施することができる工程
の順序を例示する工程図である。
【手続補正書】
【提出日】平成６年１０月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＴＧＦβ−２またはＴＧＦβ−３である
    ＴＧＦβ遺伝子のプロモーター領域から単離されるラロ
    キシフェン応答要素を含有する核酸。
  2. 【請求項２】 多数の化合物をスクリーニングして抗骨
    粗鬆症薬物としての可能性を有する化合物を同定するた
    めの方法であって、哺乳動物プロモーターのラロキシフ
    ェン応答要素からの転写を誘導することができ、非特異
    的な転写誘導物質ではなく、哺乳動物プロモーターのエ
    ストロゲン応答要素からの転写を誘導することができ
    ず、そして抗エストロゲン性または非エストロゲン性化
    合物である多数の化合物を同定することからなり、さら
    に次の工程からなる方法： (a)化合物が哺乳動物プロモーターのラロキシフェン応
    答要素からの転写を誘導しうることについて検定し； (b)化合物がラロキシフェン応答要素を持たない哺乳動
    物プロモーターからの転写を誘導しえないことについて
    検定し； (c)化合物がエストロゲン応答プロモーターからの転写
    を誘導しえないことについて検定し；そして (d)化合物がエストロゲン応答プロモーターからのエス
    トロゲン誘導の転写をエストロゲンの存在下に阻害しう
    ることについて検定する。
  3. 【請求項３】 哺乳動物の骨形成を誘導するための方法
    であって、エストロゲン受容体に結合したときにＴＧＦ
    β-３遺伝子のプロモーター領域のラロキシフェン応答
    要素からの転写を強力に誘導する化合物を投与すること
    からなる方法[ただし、この化合物は以下の式で示され
    る化合物またはその薬学的に許容しうる塩以外の化合物
    である： 【化１】 (式中、ｎは０、１、または２であり；ＲおよびＲ1は独
    立して水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ1
    〜Ｃ6アシルオキシ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシＣ2〜Ｃ6アシ
    ルオキシ、Ｒ3置換されたアリールオキシ、Ｒ3置換され
    たアロイルオキシ、Ｒ4置換されたカルボニルオキシ、
    クロロ、またはブロモであり；Ｒ2はピロリジノ、ピペ
    リジノ、またはヘキサメチレンイミノからなる群から選
    ばれる複素環であり；Ｒ3はＣ1〜Ｃ3アルキル、Ｃ1〜Ｃ
    3アルコキシ、水素、またはハロゲンであり；そしてＲ4
    はＣ1〜Ｃ6アルコキシまたはアリールオキシである)]。
  4. 【請求項４】 骨粗鬆症を治療するための方法であっ
    て、エストロゲン受容体に結合したときにＴＧＦβ-３
    遺伝子のプロモーター領域のラロキシフェン応答要素か
    らの転写を強力に誘導する化合物を投与することからな
    る方法[ただし、この化合物は以下の式で示される化合
    物またはその薬学的に許容しうる塩以外の化合物であ
    る： 【化２】 (式中、ｎは０、１、または２であり；ＲおよびＲ1は独
    立して水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ1
    〜Ｃ6アシルオキシ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシＣ2〜Ｃ6アシ
    ルオキシ、Ｒ3置換されたアリールオキシ、Ｒ3置換され
    たアロイルオキシ、Ｒ4置換されたカルボニルオキシ、
    クロロ、またはブロモであり；Ｒ2はピロリジノ、ピペ
    リジノ、またはヘキサメチレンイミノからなる群から選
    ばれる複素環であり；Ｒ3はＣ1〜Ｃ3アルキル、Ｃ1〜Ｃ
    3アルコキシ、水素、またはハロゲンであり；そしてＲ4
    はＣ1〜Ｃ6アルコキシまたはアリールオキシである)]。
  5. 【請求項５】 骨折を治療するための方法であって、エ
    ストロゲン受容体に結合したときにＴＧＦβ-３遺伝子
    のプロモーター領域のラロキシフェン応答要素からの転
    写を強力に誘導する化合物を投与することからなる方法
    [ただし、この化合物は以下の式で示される化合物また
    はその薬学的に許容しうる塩以外の化合物である： 【化３】 (式中、ｎは０、１、または２であり；ＲおよびＲ1は独
    立して水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ1
    〜Ｃ6アシルオキシ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシＣ2〜Ｃ6アシ
    ルオキシ、Ｒ3置換されたアリールオキシ、Ｒ3置換され
    たアロイルオキシ、Ｒ4置換されたカルボニルオキシ、
    クロロ、またはブロモであり；Ｒ2はピロリジノ、ピペ
    リジノ、またはヘキサメチレンイミノからなる群から選
    ばれる複素環であり；Ｒ3はＣ1〜Ｃ3アルキル、Ｃ1〜Ｃ
    3アルコキシ、水素、またはハロゲンであり；そしてＲ4
    はＣ1〜Ｃ6アルコキシまたはアリールオキシである)]。
  6. 【請求項６】 哺乳動物の骨形成を誘導するための方法
    であって、以下の性質を示す化合物： (a)ＴＧＦβ-３遺伝子のプロモーター領域のラロキシフ
    ェン応答要素からの転写を強力に誘導し； (b)ラロキシフェン応答要素を持たない哺乳動物プロモ
    ーターからの転写を誘導せず； (c)エストロゲン応答プロモーターからの転写を誘導せ
    ず；そして (d)エストロゲン応答プロモーターからのエストロゲン
    誘導の転写をエストロゲンの存在下に阻害する；を投与
    することからなる方法[ただし、この化合物は以下の式
    で示される化合物またはその薬学的に許容しうる塩以外
    の化合物である： 【化４】 (式中、ｎは０、１、または２であり；ＲおよびＲ1は独
    立して水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ1
    〜Ｃ6アシルオキシ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシＣ2〜Ｃ6アシ
    ルオキシ、Ｒ3置換されたアリールオキシ、Ｒ3置換され
    たアロイルオキシ、Ｒ4置換されたカルボニルオキシ、
    クロロ、またはブロモであり；Ｒ2はピロリジノ、ピペ
    リジノ、またはヘキサメチレンイミノからなる群から選
    ばれる複素環であり；Ｒ3はＣ1〜Ｃ3アルキル、Ｃ1〜Ｃ
    3アルコキシ、水素、またはハロゲンであり；そしてＲ4
    はＣ1〜Ｃ6アルコキシまたはアリールオキシである)]。
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