CN106841258A - 一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供纤维致密型的血凝块；(2)将待测物质与步骤(1)的血凝块混合，调节血凝块的结构；(3)如果步骤(2)中的血凝块的结构由纤维致密型变为纤维稀疏型，那么步骤(2)中的待测物质为促进骨愈合的药物。本申请发明人首次揭示了血凝块的质地在正常骨愈合模型和骨延迟愈合模型中的显著差异，通过亚硝基谷胱甘肽干预血凝块的纤维结构，使其变为纤维疏松型血凝块后能明显地加快骨缺损愈合进程，影响局部细胞的移入、粘附、增殖、分化和生长因子的粘附、释放等一系列生理性活动，从而改善局部微环境，促进骨早期愈合。

Description

一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法
技术领域
本发明属于医学领域，尤其属于骨科领域。
背景技术
(1)骨延迟愈合和不愈合是临床骨科极具挑战性的科学问题
长久以来，由于严重创伤、疾病、感染等因素而导致骨块丢失过多的一系列并发症严重影响着患者的生活质量，尤其是骨延迟愈合(Delayed bone healing)和骨不连(Bonynon-union)。目前，如何使骨组织又好又快地愈合，提高患者生活质量，已经成为临床骨科、口腔种植体医师的研究热点。在正常骨缺损愈合(Normal bone healing)过程中，主要包括三个阶段：血肿(Hematoma)炎症机化期(Reactive phase)，骨痂形成期(Reparativephase)，和骨板形成塑形期(Remodeling phase)(图1)。
骨组织的正常愈合涉及许多因素，包括足量的间充质干细胞(Mesenchymal StemCells，MSCs)、生长因子、充足的血供、受损部位的机械力学稳定性等。在临床实践过程中，许多促进骨快速愈合的治疗方案已经被尝试，如骨替代物植入术、干细胞移植术等。然而，这些方法在运用的同时，也不可避免地带来一系列的问题，如新骨形成的诱导率不高、术中术后感染、材料本身的快速降解和机械强度不足、材料表面缺乏生物相容性。为了减少上述副作用，Platelet-rich plasma(PRP)技术曾一度被尝试性运用于临床上帮助骨早期愈合。PRP技术是将患者自体血液(10mL)加入到10％柠檬酸钠溶液中，在室温下放入离心机中离心(160G，20分钟)，血液将分为血清层和血细胞层，移取两者分界线下6mm以上的溶液至新的无抗凝剂试管中，再次离心(400G，15分钟)，得到上层的血清层和下层的PRP层。临床使用前，需用凝血酶(Thrombin，T)和氯化钙溶液将其激活后局部使用。理论上讲，在骨折部位局部运用患者自体的PRP，在凝血酶和氯化钙刺激后，快速形成一个富集生长因子的纤维血凝块，一方面填充骨缺损部位达到快速止血的作用，另一方面它能释放内部的大量生长因子，从而促进骨折的早期愈合。尽管如此，一些学者通过构建大鼠和羊等骨缺损模型后植入PRP，并未发现PRP有任何明显促进骨愈合的作用。
近年来，新兴的Platelet-rich fibrin(PRF)技术得到临床骨科医师广泛的认可。PRF技术是在PRP技术基础的一种改良。在制作过程中，患者的血液被快速和直接地加入试管中，随后立即离心机(3000rpm，10分钟，20℃)，血液将会分为三层：最上层Platelet poorplasma(PPP)，中间层PRF层，最下层红细胞层。由于在整个制作过程中未涉及到任何抗凝剂和凝血酶等生物制剂的参与，相比PRP而言，PRF自然而缓慢地形成的纤维结构被表明能更好地吸附激活血小板释放的生长因子，从而缓慢释放它们，提高成骨率。通过对比与成骨活动密切相关的生长因子Transforming growth factor-β(TGF-β)和Platelet-derivedgrowth factor(PDGF)发现，尽管PRP中含量明显高于PRF，但两者植入骨缺损部位后，PRF的成骨效果却较PRP更为显著。所以，有研究者认为PRF中的纤维结构可能为等边连接(Equilateral junction)，为生长因子的缓慢释放或细胞的迁移、粘附和增殖创造更有利的环境，而PRP中的纤维结构可能为等腰连接(Bilateral junction)，导致过快地释放生长因子或阻止细胞的迁移，因而并未达到显著成骨作用。
血纤维结构的不同，提供给细胞活动的环境不同，对生长因子的粘附能力也有着不同，最终竟能导致截然不同的成骨效应。在导致骨延迟愈合或不愈合的众多因素中，骨缺损面积大小(Gap size)一直被公认为是最为重要的因素之一。由于创伤过大，骨块丢失面积达到或超过临界点(Critical size defect，CSD)时，必将引发骨不连的出现。因此，值得我们考虑的是，那么创伤较小的正常骨愈合和创伤较大的骨延迟愈合，两种不同骨缺损中所形成的血凝块的结构性质似乎也存在一些差异呢？简言之，骨折血凝块可能也有“好”或“坏”之分。
迄今为止，血凝块变“好”或“坏”的最根本原因仍不清楚。血凝块的性质似乎与发生部位有一定的联系。显而易见地是，头皮血肿和皮下血肿通常不会分化成为骨组织，而骨折血凝块则可以机化、矿化为新鲜的骨组织。一般情况下，骨折部位形成的血凝块能演变为正常骨组织而没有任何并发症，但某些时候由于缺损过大、感染、血供不足等情况，骨折延迟愈合或骨不连仍会发生。所以，对于正常骨愈合和骨延迟愈合中血凝块结构的基础性研究，仍然是一个巨大的疑问。早在1990年，Mizuno就将一个4天的血凝块从大鼠股骨骨折部位，移植入肌肉内，最终发现肌肉内新骨形成。而把一个2天的血凝块采用相同的手术方式进行对照，则并未观察到新骨形成。这个实验表明了血凝块内部结构的成熟程度能显著影响骨愈合的能力。
一个“好”血凝块应该具备以下的特征：①.除了有效止血以外，它能作为一个临时的纤维基质材料，进而促进MSC、成骨细胞的迁移、粘附、增殖和分化，因为细胞的迁移和粘附活动很大程度上依赖于基质的参与。②.一个“好”血凝块还应具有一定的多孔性，才能更好地促进氧气和其他营养物质的交换，同时也有利于代谢产物的排出。③.一个“好”血凝块，由于高渗透性和低密度纤维束，使它更容易被降解，从而为新生肉芽组织的长入提供更多的空间。④.一个“好”血凝块还应拥有一个较大的表面积，用以吸附游离的生长因子，并缓慢释放它们，从而更有效地提高成骨细胞分化率。
(2)血凝块的形成过程和结构特征
经典的凝血反应包括内源性和外源性两条通路。内源性凝血起始于前激肽释放酶、高分子量肽原(High Molecular Weight Kininogen，HMWK)和凝血因子XII等物质接触到异物表面。凝血因子XII一旦被激活，首先激活HMWK，HMWK正反馈进一步激活更多的XII因子，从而放大凝血效应。XIIa继续激活下游的XI因子，而XIa进一步在钙离子的协助下激活IX因子，激活的IXa和VIIIa因子，在钙离子和磷脂(Phospholipid，PL)存在的条件下，激活X因子转变为Xa，最后进入共同通路。
对于骨折血凝块(实质上是纤维血凝块)而言，是通过外源性凝血通路来达到止血效果的(图2)。外源性凝血通路始于组织因子(Tissue Factor,TF)的释放，它能进一步激活凝血因子VII，从而形成TF-VIIa复合物。该复合物继续激活下游的凝血因子X生成Xa，Xa激活凝血因子V并与其形成FXa-Va复合物，进而在钙离子和磷脂协助下，使促凝血酶原(Prothrombin)转变为具有生物活性的凝血酶。内源性和外源性的共同通路是从凝血因子X转化为激活的Xa开始。凝血酶的生成具有两个主要作用是：一方面可以转化纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)成为纤维素纤维(Fibrin fiber)，另一方面它还可以激活凝血因子XIII。激活后的XIIIa在纤维素纤维形成网状纤维血凝块的过程中，起着至关重要的作用。
在心脏内科和血液内科的前期基础研究中，血栓凝块主要包括以下结构特征：纤维的直径、密度、分支点的数量、分支点之间的距离、孔径率(Porosity)和孔径大小(Poresize)等。一般来说，纤维直径的粗细与纤维的密度是成反比关系，但和孔径的大小成正比关系。纤维直径的粗细和孔径大小对MSC的生理功能的调节起着非常重要的作用。尽管单根粗纤维(Coarse fiber)和单根细纤维(Thin fiber)相比，有较高的机械强度，然而由粗纤维构成为主的纤维凝块却通常表现出较低的硬度，可能的原因是由于粗纤维形成的数量较少。从血栓凝块降解角度来看，纤维的密度是较为主要的决定性因素，而非直径大小。决定纤维直径和密度两个极为重要的因素就是纤维蛋白原和凝血酶的浓度。低浓度的纤维蛋白原和(或)凝血酶能形成一个较浑浊、粗的、疏松的血栓凝块；相反，高浓度的纤维蛋白原和(或)凝血酶则形成一个不浑浊、细的、致密的血栓凝块。这两种不同类型的血栓凝块，表现出不同的纤维降解速率，前者往往降解较快，从而增大了过早溶解、出血等可能；后者往往降解较慢，却增加了血栓长期存在的风险。除了这两个因素对血栓凝块结构调节起着重要作用外，局部的PH值、离子强度、钙离子浓度等诸多变量也能影响其结构变化。
(3)纤维素纤维形成的机制
纤维蛋白原是一个分子量约为340kDa的糖蛋白，长约45μm，由2组3条多肽链(AαBβγ)2组成，多肽链之间以二硫键相互连接而成。纤维蛋白原按区域来划分，包括一个中央区(E domain)，二个外围区(D domain)由Bβ链和γ链的羧基端组成，Aα链的羧基端(αCregion)折回参与E区结构，以及连接E区与D区之间的带状结构(Coiled-coil区)。
在转变成纤维素纤维的聚合反应中(图3)，凝血酶首先会裂解2条Aα链氨基端Arg16-Gly17释出一对纤维蛋白肽A(Fibrinopeptide A,FpA)从而暴露出Gly-Pro-Arg-Pro(GPRP)区域(也称为knob A)，从从而形成纤维蛋白单体Ⅰ(αBβγ)2(FMI)，与knob A相对应的结构是位于γ链羧基端的hole‘a’或pocket‘a’结构。20-25个FMI间通过A：a间氢键结合(A：a interaction)，先形成低聚体(Oligomer)，最后聚合成以22.5nm为周期横纹的不稳定的双链原纤维(protofibrils)。此外，凝血酶继续裂解原纤维上的2条Bβ链氨基端Arg14-Gly15释出一对纤维蛋白肽B(FPB)，暴露出Gly-His-Arg-Pro(GHRP)区域(也称为knob B),形成纤维蛋白单体Ⅱ(αβγ)2，与之相对应的则是位于β链羧基端的hole‘b’或pocket‘b’结构。它们之间形成的B：b结合(B：b interaction)主要作用至今未知，但可以明确的是，B：b结合能促进侧向聚集作用(Lateral aggregation)。最终，上述的(αβγ)2在凝血因子XIIIa的作用下，形成一个成熟的网状纤维凝块，从而达到止血目的。
B：b结合加强侧向聚集作用的可能原因是：首先，由于knob B本身较长且灵活，以致于它和pocket‘b’之间的绑定并不会显著影响到原纤维结构的重新排列。其次，B：b结合后可能会诱导β链羧基端向外更加突出，从而使得与相邻分子的β链羧基端接触更为紧密。再次，FpB的释放使原本依附于FpB的αC domain变成游离状态(untethered state)，而相邻分子间游离状的αC domain通过多种聚合方式形成αC多聚体(αC polymer)，从而使纤维变粗。最后，B：b结合可能从动力学上更加稳定了原纤维的结构，继而加强了侧向聚集作用。不管以何种机制，可以肯定的是B：b结合键是真实存在并且在纤维聚合反应中起着重大作用。因此，如果仅仅释放FpA而不释放FpB，形成的纤维凝块主要由致密的细纤维构成。
侧向聚集作用决定纤维的粗细程度，多种结构位点参与了侧向聚集作用的发生机制。已知的研究结果表明，knob B和pocket‘b’、γ链羧基端(γ350-360和γ370-380)和相邻β链羧基端、Aα链羧基端的αC region、Coiled-coil区、和Bβ364Asn andγ52Asn上的N-葡糖胺多糖等都和侧向聚集作用有密切关系。Lord在体外研究指出，运用截断的Aα251纤维蛋白原(缺乏αC region部分)，形成的纤维直径较正常对照组下降25％。在αC region内部结构中，含有一条相对灵活的区域—αC连接体(αC connector)和一个独立折叠的致密区域—αC区域(αCdomain)，αC连接体位于Aα221-391基因序列，而αC区域则位于Aα392-610序列(图4)。更重要的是，αC区域还可以细分为两个亚区域(subdomain)：即N端亚区域(Aα392-503)和C端亚区域(Aα504-610)。相邻原纤维分子间发生侧向聚集作用时，N端亚区域间通常以自交联(Self-association)中的β发夹交换方式(β-hairpin swapping)相互聚合，而C端亚区域上存在一些受体位点，如Lys-418、-448、-508等，这些位点能与αC连接体上的供体，如Gln-221、-237、-328等，借助于激活的凝血因子XIII形成∈-amino(γ-Glutamyl)Lysine共轭键发生交联(Crosslinking)。这种原纤维间的共轭交联方式使整个纤维聚合过程不可逆转，并形成稳定的αC多聚体，最终增强纤维凝块的机械强度和抵抗溶解的能力。除此之外，由凝血因子XIII介导的∈-amino(γ-Glutamyl)Lysine共轭键还出现在相邻γ链上的γ406Lys和γ398/399Gln之间，这种聚合方式叫γ-γ交联。αC-αC交联(即αC多聚体形成)和γ-γ交联两者都和纤维凝块的硬度有紧密联系。因此，从一定程度上来说，αC多聚体的形成量能决定纤维凝块中纤维直径的粗细。也就是说，凡有利于发生侧向聚集作用的因素，如αC多聚体形成越多，则形成一个粗纤维为主和少分支点的纤维凝块；而不利于发生侧向聚集作用的因素，则形成一个细纤维为主和多分支点的纤维凝块。最近一项体外实验表明，αC多聚体的形成能促进内皮细胞上整合素的聚集，从而增加它们的粘附、扩散力，并激活整合素介导的Focal adhesion kinase(FAK)和Extracellular signal regulated kinase(ERK1/2)两条通路，最终促进内皮细胞迁移和增殖，促进愈合。
亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)作为一种S-亚硝化谷胱甘肽衍生物，通过抑制血小板的激活发挥抗凝作用从而可预防血栓形成。除了对血小板的抑制作用，GSNO也被报道能够通过增加αC多聚体生成，从而形成以粗纤维为主的易于溶解的纤维凝块。在大鼠牙周炎的模型中，局部齿龈内给药注射GSNO可以明显减少过度炎症反应所导致的骨破坏。临床中，GSNO也被广泛地用于预防心肌梗塞和心脏瓣膜术后的再度狭窄。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种调节血凝块纤维的结构在制备用于促进骨愈合的药物中的用途，所述药物用于调节血凝块纤维的结构，所述调节血凝块纤维的结构包括调节血凝块的纤维直径、纤维密度、孔径率和孔径大小来促进骨愈合。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提供纤维致密型的血凝块；
(2)将待测物质与步骤(1)的血凝块混合，调节血凝块的结构；
(3)如果步骤(2)中的血凝块的结构由纤维致密型变为纤维稀疏型，那么步骤(2)中的待测物质为促进骨愈合的药物。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，所述纤维致密型的血凝块纤维密度高、纤维直径细；所述纤维稀疏型的血凝块纤维密度低、纤维直径粗。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，所述纤维致密型的血凝块纤维密度为26.92～34.68根/40μm2，纤维直径为180-220nm；所述纤维稀疏型的血凝块纤维密度为6.55～10.75根/40μm2，纤维直径大于或等于400nm。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中调节血凝块纤维的结构包括调节血凝块的纤维直径、纤维密度。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，所述药物为亚硝基谷胱甘肽。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，所述亚硝基谷胱甘肽的浓度从0mM到10mM时，随着亚硝基谷胱甘肽浓度的增加，血凝块的纤维直径逐渐增大；所述亚硝基谷胱甘肽的浓度超过10mM时，随着亚硝基谷胱甘肽浓度的增加，血凝块的纤维直径逐渐变小。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，所述亚硝基谷胱甘肽的浓度从0mM到0.1mM时，随着亚硝基谷胱甘肽浓度的增加，血凝块的纤维密度基本不变；所述亚硝基谷胱甘肽的浓度从1mM增加到10mM时，随着亚硝基谷胱甘肽浓度的增加，血凝块的纤维密度逐渐下降。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，所述亚硝基谷胱甘肽的浓度从0mM到1mM时，随着亚硝基谷胱甘肽浓度的增加，矿化骨组织新生量和总量逐渐增加；所述亚硝基谷胱甘肽的浓度从1mM增加到10mM时，随着亚硝基谷胱甘肽浓度的增加，矿化骨组织新生量和总量逐渐减少；所述亚硝基谷胱甘肽的浓度为10mM时，添加亚硝基谷胱甘肽组与空白对照组的矿化骨组织新生量和总量差别不显著。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，在早期血凝块阶段，在正常骨缺损愈合模型中，在血凝块的边缘部分可见孔状结构，而在骨延迟愈合模型中可见致密的纤维结构。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，当在正常骨缺损愈合模型中，在血凝块的边缘部分可见肉芽组织时，而在骨延迟愈合模型中血凝块边缘无明显变化。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，当在正常骨缺损愈合模型中，大部分血凝块已经消退时，而在骨延迟愈合模型中血凝块的主体部分仍然存在。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，当在正常骨缺损愈合模型的早期血凝阶段和新生肉芽组织形成阶段时，正常骨缺损愈合模型中的血凝块纤维直径均明显大于骨延迟愈合模型中的血凝块纤维直径。
作为本发明所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法的优选实施方式，当在正常骨缺损愈合模型的早期血凝阶段和新生肉芽组织形成阶段时，正常骨缺损愈合模型中的血凝块纤维密度均明显小于骨延迟愈合模型中的血凝块纤维密度。
另外，本发明公开一种骨缺损中纤维致密型血凝块作为调节位点在筛选用于促进骨愈合的药物中的用途。
本发明所述调节血凝块纤维的结构在制备用于促进骨愈合的药物中的用途对于骨科、口腔种植、颌面修复等领域具有重要意义。血凝块无疑是最理想的‘植入材料’，我们运用常见的骨缺损大鼠模型，对骨缺损中血凝块分类这一概念进行了有益的提出，并通过调节血凝块内部结构性质，从而促进骨缺损部位的骨再生，并且我们已经发现在正常骨缺损模型中的血凝块边缘存在一些“小孔”，而骨延迟愈合模型中血凝块却没有发现类似结构。总之，血凝块内部纤维结构的变化必将影响局部细胞的移入、粘附、增殖、分化和生长因子的粘附、释放等一系列生理性活动，导致微环境的改变，从而影响骨的愈合进程。
附图说明
图1为骨折愈合的生理过程，引用自http://www.mc3cb.com；
图2为骨折血凝块形成的外源性凝血通路图；
图3为凝血酶作用下的纤维素纤维形成示意图；
图4为αC region结构及αC多聚体形成示意图；
图5为实施例1中正常骨缺损愈合模型和骨延迟愈合模型的骨缺损图，即1mm和3mm骨缺损模型图；
图6中的A-E为实施例1中通过Micro-CT初步评估矿化骨组织新生量(BV)和总量(TV)的对比图，Cartilage代表软骨组织，Natural代表正常骨缺损愈合模型，Delayed代表骨延迟愈合模型，*代表新生矿化骨组织，A为第7天1mm骨缺损，B为第7天3mm骨缺损，C为第28天1mm骨缺损，D为第28天3mm骨缺损，E为第7和28天的BV/TV统计图，F-I为组织学Safranin O染色图，其中，F、G为第28天1mm的染色图，H、I为第28天3mm的染色图；
图7为实施例3中正常骨缺损愈合模型和骨延迟愈合模型的纤维表面形貌和粗糙度等的差异电镜图(A-R)，A、G、M为第1、4、7天1mm骨缺损中血凝块的形态图，D、J、P为第1、4、7天3mm骨缺损中血凝块的形态图；
图8为本发明实施例4中血凝块纤维结构的直径和密度扫描电镜图，Natural和Natural healing均代表正常骨缺损愈合模型，Delayed和Delayed healing均代表骨延迟愈合模型，S、T为第1、4天1mm骨缺损中血凝块边缘的形态图，U、V为第1、4天3mm骨缺损中血凝块边缘的形态图；
图9为本发明实施例5中调查不同浓度的GSNO调节血凝块结构后对成骨的影响的SEM图，A为0、0.1、1、10mM GSNO作用下，第1天血凝块的扫描电镜图，B为手术过程中，加GSNO到3mm骨缺损部位，并和血液进行均匀地混合，C为不同浓度的GSNO作用下，纤维直径的统计图，D为不同浓度的GSNO作用下，纤维密度的统计图；
图10为本发明实施例5中调查不同浓度的GSNO调节血凝块结构后对骨缺损中新生骨量的影响的X-ray和Micro-CT图，A为第7、28天时，不同浓度的GSNO影响下骨缺损的X光片图，B为第7、28天时，不同浓度的GSNO影响下骨缺损的Micro-CT图和纤维直径、密度统计图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1正常骨缺损愈合(Normal bone healing，NBH)和骨延迟愈合(Delayedbone healing,DBH)模型建立
实验方法：雄性Inbred fisher 344大鼠(6-8周)均分为正常骨缺损愈合组(直径1mm，深度2mm)和骨延迟愈合组(直径3mm，深度2mm)。Inbred fisher344大鼠是目前较为流行的一种鼠类，这种鼠类比较活跃相比其他种类，同时，该种属的骨骼比较宽大，适合骨科手术。最重要的是，Inbred fisher 344大鼠属于近亲繁殖，所以一只老鼠的细胞、组织等可以移植入另一只老鼠体内，因为它们的血液具有同源性。麻醉状态下，我们使用两种不同规格的圆柱状钻头(Australian Jewelers Supplies Pty Ltd.,Australia)在大鼠的双侧股骨内侧髁上，分别钻入直径1mm+深度2mm和直径3mm+深度2mm的骨缺损(图5)。术后第7和28天，二氧化碳吸入法处死大鼠，取双侧股骨标本，行Micro-CT和Safranin O染色等方法来鉴定模型是否成功建立。
据文献报道，1mm的大鼠骨缺损钻孔模型在14天内，骨缺损愈合率高达92％，充分表明了1mm的骨缺损通过直接愈合的方式(膜内成骨)。同时，Marsell和Oryan也指出骨缺损范围在800μm to 1mm，可直接通过膜内成骨。然而，在大鼠股骨内侧髁钻孔模型中，直径3mm×深度2mm的骨缺损直到第90天时，愈合率仅为76.5±3.0％(仍未完全愈合)，表明了该骨缺损通过间接愈合方式(软骨内成骨)。根据骨愈合的标准，大鼠的骨正常愈合周期约为4-6周(28-42天)，任何骨缺损超过42天或更长时间的愈合，均可视为骨延迟愈合。
实验结果：如图6中的A-E所示，通过Micro-CT初步评估矿化骨组织新生量(BV)和总量(TV)比值，可以发现在正常骨缺损愈合模型(1mm)中成骨速率远比骨延迟愈合模型(3mm)的高，且具有显著性统计学意义。第7天，1mm骨缺损中BV/TV比值为6.13％±0.86％(图6A)，而3mm骨缺损中BV/TV比值为1.80％±0.61％(图6B)。第28天，1mm骨缺损中比值上升至66.01％±13.57％(图6C)，3mm骨缺损中比值上升达到35.65％±0.85％(图6D)。
如图6中的F、H所示，通过组织学Safranin O染色，软骨组织(Cartilage)被染成典型的红色。从1mm骨缺损来看，清晰地展示了在第28天中出现大量的新生矿化骨组织(*)(6G)。而从3mm骨缺损来看，由于血肿降解缓慢，停留在缺损部位时间过长，最后出现以纤维软骨组织(Cartilage)主的典型骨延迟愈合表现(6I)。因此，可以鉴定模型的成功建立。
实施例2关于术后时间点的选择
正常骨愈合的大致时间顺序是：术后第1天，代表早期的血凝块阶段；术后第4天，新生肉芽组织形成；术后第7天，血凝块大部分消失，软组织和早期的矿化组织出现；术后第28天，新骨形成和塑形阶段。
实施例3调查血凝块在正常骨缺损愈合模型和骨延迟愈合模型中的结构性差异
实验方法：
A.原始血凝块形态观察：术后第1、4、7天，NBH组和DBH组大鼠股骨分离后，使用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffer solution，PBS)(PH＝7.4)冲洗至少3次，用3％戊二醛溶液过夜固定。标本被置于环境扫描电镜SEM TM3000(Hitachi High-TechnologiesCorporation,Japan)中观察血凝块的自然形态。分别取血凝块的边缘和中心两个区域，进行比较。放大率为50和1000倍，电压范围为15KV。
B.血凝块中纤维结构的观察：术后第1和4天，NBH组和DBH组的血凝块随着周围骨和软组织一起被移至二甲砷酸盐缓冲液(0.1M)溶液中，后经4％饿酸后固定，不同梯度酒精脱水，固定和喷金。标本在扫描电镜SEM Quanta 200(FEI,USA)下，放大率为5000倍，观察纤维的直径和密度等结构。通过组织学染色(HE染色)观察血凝块在NBH组和DBH组的形态学差异；通过原子力学显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)，观察纤维表面形貌和粗糙度等差异。
实验结果：如图7中的A、D所示，通过环境扫描电镜观察到，第1天时，在1mm骨缺损中血凝块的边缘部分(图7C)发现有一些小孔状结构(白色圆形框)，而在3mm骨缺损中相同位置(图7F)却发现的是致密的纤维结构。而两者血凝块的中央部分(图7B、E)，从视觉上来看，没有发现明显的区别。第4天时，在1mm骨缺损的血凝块(图7G)边缘出现一些肉芽组织(图7I)，而3mm骨缺损的凝块(图7J)边缘仍无明显变化(图7L)。而两者血凝块的中央部分(图7H、K)，未发现有明显的结构变化。第7天时，在1mm骨缺损中大部分的血凝块已经消退(图7M、N、O)，但在3mm骨缺损中血凝块的主体部分仍然存在(图7P、R、Q)，相比第4天而言，在血凝块的表面上的血细胞似乎明显减少。
实施例4量化纤维的结构特征
实验方法：由实施例3进一步通过高分辨率的扫描电镜观察第1和4天标本边缘部分，借助于Image J软件从而量化纤维的结构特征。
实验结果：由图8中的S-V看出，一方面，第1天时(图8S、U)，在1mm骨缺损中的血凝块纤维直径范围约是397.58±125.34nm，而3mm骨缺损中的纤维直径为245.76±41.26nm，具有明显的统计学意义(P<0.001)；第4天时(图8T、V)，两者的值分别为295.72±49.86nm(1mm骨缺损)和226.16±57.0(3mm骨缺损)，有明显的统计学差异(P<0.001)。
另一方面，由图8中的S-V看出，第1天时(图8S、U)，在1mm骨缺损中纤维密度约为8.65±2.1根/40μm2，相比而言，在3mm的骨缺损中纤维密度则为30.8±3.88根/40μm2(P<0.001)。第4天时(图8T、V)，1mm骨缺损中纤维密度为8.4±1.98根/40μm2，而3mm骨缺损中纤维密度为25.8±3.92根/40μm2(P<0.001)。
实施例5调查不同浓度的GSNO调节血凝块结构后对成骨的影响
实验方法：
A.麻醉状态下，构建上述的骨延迟愈合骨缺损模型，随后，不同浓度的GSNO(0,0.1,1或10mM)立即与骨缺损中血液进行适当地混合。过夜后，处死大鼠，使用上述高分辨率的SEM进行血凝块结构的观察。
B.进行相同的手术方式后，加入不同浓度的GSNO，术后第7和28天，处死大鼠，进行X光片和Micro-CT检测，评估骨缺损中新生骨量的情况。
实验结果：如图9中的A-D所示，SEM观察后统计显示，血凝块中纤维平均直径从245.8±41.7nm(空白对照组)上升至316.9±104nm(0.1mM GSNO组)，随着GSNO浓度增加，直径增加到最大值596.6±249.4nm(1mM GSNO组)(P<0.05)。随后，继续增加GSNO，直径将下降到189.7±47.8nm(10mMGSNO)。另一方面，当对比空白对照组和0.1mM GSNO组时，发现血凝块中纤维密度却没有明显改变(P>0.05)。而对比1mM GSNO组时，纤维密度则发生明显下降(空白对照组为18.0±2.7根/40μm2，1mM GSNO为5.2±2.3根/40μm2)，继续增加GSNO至10mM时，纤维的生成几乎全部消失。
如图10中的A所示，第7和28天时，通过X-ray可以发现0.1和1mM GSNO组中骨缺损部位有骨愈合迹象，而10mM GSNO组骨缺损部位，仍有较明显的缺损存在。图10中的B所示，通过Micro-CT再次评估BV和TV比值发现，第7天时，在0.1和1mM GSNO组中骨量增加有显著的统计学意义，其值分别为(15.41％±1.24％和18.35％±1.34％)(P<0.01)。第28天时，在0.1mM GSNO组中BV和TV比值达到55.17％±11.05％，相比空白对照组中36.65％±1.04％，具有统计学差异(P<0.05)。随着GSNO浓度达到1mM时，其比值继续增大至63.72％±14.13％。然而，对比10mM GSNO组和空白对照组，并未发现有明显的统计学差异。
结论，我们首次揭示了血凝块的质地在正常骨愈合模型和骨延迟愈合模型中的显著差异，通过亚硝基谷胱甘肽干预血凝块的纤维结构，使其变为纤维疏松型血凝块后能明显地加快骨缺损愈合进程，从而得出一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其包括以下步骤：(1)提供纤维致密型的血凝块；(2)将待测物质与步骤(1)的血凝块混合，调节血凝块的结构；(3)如果步骤(2)中的血凝块的结构由纤维致密型变为纤维稀疏型，那么步骤(2)中的待测物质为促进骨愈合的药物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提供纤维致密型的血凝块；
(2)将待测物质与步骤(1)的血凝块混合，调节血凝块的结构；
(3)如果步骤(2)中的血凝块的结构由纤维致密型变为纤维稀疏型，那么步骤(2)中的待测物质为促进骨愈合的药物。
2.如权利要求1所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述纤维致密型的血凝块纤维密度高、纤维直径细；所述纤维稀疏型的血凝块纤维密度低、纤维直径粗。
3.如权利要求1所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述纤维致密型的血凝块纤维密度为26.92～34.68根/40μm2，纤维直径为180-220nm；所述纤维稀疏型的血凝块纤维密度为6.55～10.75根/40μm2，纤维直径大于或等于400nm。
4.如权利要求1所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中调节血凝块纤维的结构包括调节血凝块的纤维直径、纤维密度。
5.如权利要求1所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述药物为亚硝基谷胱甘肽。
6.骨缺损中纤维致密型血凝块作为调节位点在筛选用于促进骨愈合的药物中的用途。
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