JPH07174898A

JPH07174898A - 試料容器および軟ｘ線顕微法

Info

Publication number: JPH07174898A
Application number: JP31841893A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Nagai; 宏明永井
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 1995-07-14

Abstract

(57)【要約】【目的】可視顕微鏡では観察し難い試料を観察する場
合であっても、可視光を用いて合焦位置を推定し得るよ
うにした軟Ｘ線顕微鏡用の試料容器を提供する。【構成】一対の窓枠材１、２の顕微鏡窓部１ａ、１ｂ
を覆うように第１の薄膜７および第２の薄膜８を設けて
窓材を構成し、該窓材をスペーサ３を介して所定距離離
間させるように対向配置して前記薄膜７、８およびスペ
ーサ３により形成される閉空間を試料室５とし、第１の
薄膜７、第２の薄膜８に夫々、可視光で検出可能な識別
構造９、１０を設ける。この試料容器を軟Ｘ線顕微鏡に
装着し、識別構造９、１０に可視光で焦点を合わせたと
きの合焦情報を夫々求め、得られた２つの合焦情報に基
づいて試料容器内に収容した試料６に焦点を合わせる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、軟Ｘ線顕微鏡による試
料観察に用いる試料容器および、その試料容器を用いる
軟Ｘ線顕微法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】軟Ｘ線領域には、多数の元素の吸収端が
存在することから、適当な波長を選択することにより、
試料を前処理することなく、高解像度でかつ高コントラ
ストの試料観察が可能になる。例えば、炭素のＫα吸収
端（４４Å）および酸素のＫα吸収端（２３．７１Å）
の間の、いわゆる「水の窓」領域においては、水の吸収
とタンパク質の吸収とが大きく異なるため、可視領域で
はほとんどコントラストが付かない生物試料を前処理す
ることなく生きた状態のまま観察することができる。

【０００３】さらに、近年においては、超精密加工技術
の進歩に伴い、軟Ｘ線を用いる軟Ｘ線顕微鏡の開発が盛
んに行われるようになってきている。そのような軟Ｘ線
顕微鏡において光学系を構成するコンデンサレンズや対
物レンズとしては、例えば、反射面に特定の波長の軟Ｘ
線に対し高い反射率を有する多層膜を積層して構成する
シュヴァルツシルド光学系や、全反射を利用するウォル
タ光学系や、回折を利用するゾーンプレート等が用いら
れている。

【０００４】このような軟Ｘ線顕微鏡では、空気による
軟Ｘ線の吸収をできるだけ抑えるため、光学系を真空中
に設置した状態で使用することから、生物試料を用いた
場合真空空間で死滅してしまうので、生理食塩水等の適
当な液体を満たした容器に生物試料を収容して保護する
必要があり、この容器は試料容器と呼ばれる。この試料
容器は、使用するに当たり、観察光である軟Ｘ線によっ
てアライメントや観察対象物に対する焦点合わせ（フォ
ーカシング）を行う場合にも軟Ｘ線の吸収を抑えるため
上記光学系を真空中に設置する必要があることから、操
作性の劣化を招く。なお、生物試料によっては軟Ｘ線に
よるダメージを被りやすいものもあるので、軟Ｘ線の被
曝量を極力抑えることが望ましく、真空下において可視
光による焦点合わせが行えることが望ましい。

【０００５】このため、大気中、真空中の何れにおいて
もアライメントや焦点合わせを行い得るようにするた
め、可視光観察系を軟Ｘ線顕微鏡に組み込む試みが特開
昭６４−３６００号公報等によりなされており、本願出
願人によっても、先に、特開平３−２８２３００号公報
により、可視光観察系を組み込んだ軟Ｘ線顕微鏡が提案
済みである。一方、明視野可視顕微鏡においては、本願
出願人は先に、特開平４−３２６７５４号公報により、
コントラストに乏しい試料に対し位相差顕微鏡を組み込
み、試料の位相差情報から明暗の情報を得て、試料に必
要以上の軟Ｘ線量が被爆されるのを防止する技術を提案
済みである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、観察対
象物によっては試料が透明でかつ位相差がほとんど付か
ない上に極めて薄いものである場合があり、そのような
試料は可視顕微鏡では如何なる手法をもってしても観察
することができない。よって、このような試料は、軟Ｘ
線顕微鏡によって観察しながら焦点合わせを行う必要が
あり、このことが観察対象物の軟Ｘ線量被曝量を必要以
上に増大させることになる。

【０００７】本発明は、上述した問題に鑑みてなされた
ものであり、可視顕微鏡では観察し難い試料を観察する
場合であっても、可視光を用いて合焦位置を推定し得る
ようにした軟Ｘ線顕微鏡用の試料容器を提供することを
目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の試料容器は、一
対の窓枠材に第１、第２の薄膜を設けて窓材を構成し、
該窓材をスペーサを介して所定距離離間させるように対
向配置して前記薄膜およびスペーサにより形成される閉
空間を試料室とした試料容器において、前記第１、第２
の薄膜に夫々、可視光で検出可能な識別構造を設けたこ
とを特徴とし、また、本発明の軟Ｘ線顕微法は、上記試
料容器を軟Ｘ線顕微鏡に装着し、前記各識別構造に可視
光で焦点を合わせたときの合焦情報を夫々求め、得られ
た２つの合焦情報に基づいて前記試料容器内に収容した
試料に焦点を合わせることを特徴とするものである。

【０００９】

【作用】本発明の試料容器は、例えば図１（ａ）の基本
概念図に示すように、一対の窓枠材１、２に第１の薄膜
７および第２の薄膜８を設けて窓材を構成し、該窓材を
スペーサ３を介して所定距離離間させるように対向配置
して前記薄膜７、８およびスペーサ３により形成される
閉空間を試料室５とし、第１の薄膜７、第２の薄膜８に
夫々、可視光で検出可能な識別構造９、１０を設けてい
る。１ａ，１ｂはこの試料容器を軟Ｘ線顕微鏡にセット
したとき光が通る領域である。

【００１０】一般に、軟Ｘ線による生物試料観察におい
ては試料室５の窓枠材間隔は「水の窓」領域を用いても
数μｍにしかならないので、例えば薄膜７、８の何れか
一方に可視顕微鏡で検出できる識別構造を設けてその識
別構造を付けた薄膜上に焦点を合わせ、そのときの合焦
情報（可視光光源を基準とする識別構造の位置情報）に
所定のオフセット（例えば数μｍ程度）を付与すること
により、ある程度精度良く試料６に焦点を合わせること
ができる。ところが、試料６の状態によっては図１
（ｂ）のように薄膜７，８が外方に膨らんだり図１
（ｃ）のように薄膜７、８が内方に膨らんだりすること
があり、上記のようにオフセットを付与する方法では試
料６の焦点合わせに狂いが生じる惧れがある。よって、
この問題を解消するため、本発明では上記のように識別
構造を薄膜７、８の双方に設けている。なお、これら識
別構造は、薄膜の外側に設けても内側に設けてもよく、
薄膜形成時に薄膜に取り込むようにしてもよい。

【００１１】これにより、識別構造９、１０に可視光に
よって焦点を合わせたときに検出した合焦位置から合焦
情報を得て、その合焦情報から試料６の合焦位置を推定
することができるから、試料に焦点合わせするために軟
Ｘ線を用いることはなく、試料が必要以上の軟Ｘ線を被
曝されることはない。

【００１２】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面に基づき詳細に
説明する。図２（ａ）〜（ｃ）は本発明の第１実施例の
試料容器の構成を示す断面図である。この試料容器は、
対向する窓枠材２１、２２をスペーサ２３を介して窓枠
材厚み方向に離間させ、窓枠材２１、２２の顕微鏡窓部
２１ａ、２１ｂを覆うように薄膜２７、２８を設けて窓
材を構成し、薄膜２７、２８とスペーサ２３とにより形
成した閉空間２５を試料室とし、その中に試料２６を収
容している。薄膜２７、２８には夫々、可視顕微鏡で観
察し得る識別構造２９、３０が形成されている。上記構
成の試料室５の間隔（厚み）は、軟Ｘ線における生物試
料の観察においては数μｍである。

【００１３】次に、上記試料容器の窓枠材２１、２２の
作製方法を図３（ａ）〜（ｅ）に基づき説明する。ま
ず、図３（ａ）のようにシリコンウエハ（シリコン基
板）３１の両面（図示上下面）に０．１μｍの窒化シリ
コンの薄膜３２を蒸着した後、上方の薄膜３２の上にシ
リコン膜３３を数μｍ蒸着し、さらにその上に窒化シリ
コン３４を１μｍ程度蒸着する。次に、同図（ｂ）のよ
うに、フォトリソエッチングにより窒化シリコン薄膜３
２に窓３５を形成する。

【００１４】次に、同図（ｃ）のように湿式エッチング
によって窒化シリコン薄膜３２の下面に至るまでシリコ
ン基板３１の一部を除去した後、スパッタリングにより
０．０５μｍのアルミニウム薄膜３６を窓３５側に形成
してから、同図（ｄ）ようにフォトリソエッチングによ
りアルミニウム薄膜３６によって格子状のパターン３７
を形成し（パターン３７は、必ずしも規則的に格子状に
設ける必要はなく、複数個あればよい）、アルミニウム
薄膜３６の残りの部分を除去する。その際、シリコン膜
３３は、スパッタリング時に窒化シリコン薄膜３２が破
損することを防止している。その後、同図（ｅ）のよう
にエッチングにより窒化シリコン薄膜３４およびシリコ
ン膜３３を除去する。

【００１５】このような構成の窓枠材２１、２２および
薄膜２７、２８を用いた本実施例の試料容器は、両側の
顕微鏡窓の薄膜２７、２８に設けたアルミニウムの格子
パターン３７より成る識別構造２９、３０を狙って可視
光で薄膜２７、２８の夫々に焦点合わせすることがで
き、得られた２つの合焦位置情報に基づいて、２つの合
焦位置間に位置する試料の合焦位置を推定することがで
きる。よって、試料の焦点合わせに軟Ｘ線を用いないの
で、試料が必要以上の軟Ｘ線を被曝されることはなくな
る。

【００１６】図４（ａ）〜（ｅ）は本発明の第２実施例
の試料容器の窓枠材２１、２２の作製方法を示す図であ
る。この試料容器は、可視光で識別し得る構造を金のク
ラスタを顕微鏡窓表面に付着させて構成している。ま
ず、図４（ａ）のようにシリコンウエハ（シリコン基
板）４１の両面（図示上下面）に０．１μｍの窒化シリ
コンの薄膜４２を蒸着した後、上方の薄膜４２の上にシ
リコン膜４３を数μｍ蒸着し、さらにその上に窒化シリ
コン４４を１μｍ程度蒸着する。次に、同図（ｂ）のよ
うに、フォトリソエッチングにより窒化シリコン薄膜４
２に窓４５を形成する。

【００１７】次に、同図（ｃ）のように湿式エッチング
によって窒化シリコン薄膜４２の下面に至るまでシリコ
ン基板４１の一部を除去した後、図示しない真空容器中
で金ターゲット上に高出力パルスレーザを集光すること
によりプラズマを発生させ、そのときに生じる飛散物質
である金クラスタ（例えば０．０５μｍ程度のサイズの
もの）４６を同図（ｄ）のように窒化シリコン薄膜４２
の表面に付着させる。その後、同図（ｅ）のようにエッ
チングにより窒化シリコン薄膜４４およびシリコン膜４
３を除去する。

【００１８】このような構成の窓枠材２１、２２および
薄膜２７、２８を用いた本実施例の試料容器を暗視野顕
微鏡で観察すれば、可視光の分解能以下のサイズの金の
クラスタ４６を暗いバックグラウンドの中で輝点として
検出することができるので、金のクラスタ４６より成る
識別構造２９、３０を狙って可視光で薄膜２７、２８の
夫々に焦点合わせすることができ、得られた２つの合焦
位置情報に基づいて、２つの合焦位置間に位置する試料
の合焦位置を推定することができる。よって、試料の焦
点合わせに軟Ｘ線を用いないので、試料が必要以上の軟
Ｘ線を被曝されることはなくなる。

【００１９】図５は上記試料容器を軟Ｘ線顕微鏡に組み
込んだシステムを示す図であり、ここでは説明の簡略化
のため、軟Ｘ線に関する部分の記入を省略し、可視光に
関する部分のみを記入している。図５では、試料容器５
１（第１実施例の構造でも第２実施例の構造でもよい）
を支持部材５２によって支持し、支持部材５２をピエゾ
素子５３に結合する。ピエゾ素子５３を真空容器５９の
外部に設置したピエゾ駆動回路５４に電気的に接続し、
制御用コンピュータ５５からの制御信号により、ピエゾ
駆動回路５４を介してピエゾ素子５３を光軸方向（図示
左右方向）に駆動制御する。このシステムの光学系、す
なわち可視顕微鏡の部分は、図示しない可視光照明系に
より可視光（平行光）を光軸上図示左方から試料容器５
１に集光し、試料容器内の試料を透過した可視光をミラ
ー６１で９０度折り曲げ、可視対物レンズ５６、真空窓
６０および可視接眼レンズ５７を介して検出器５８上に
結像させるように構成する。

【００２０】上記システムにおいて、制御用コンピュー
タ５５が実行する合焦制御は以下の通りである。すなわ
ち、制御用コンピュータ５５は、ピエゾ駆動回路５４に
制御信号を送信してピエゾ素子５３を光軸方向に電気的
に駆動することにより、図示しない可視光照明系光源か
ら試料容器５１上の２つの識別構造までの距離を調整
し、２つの識別構造の夫々に焦点合わせをしようとす
る。この間、検出器５８から２つの識別構造に関する情
報（識別構造の像）が制御用コンピュータ５５にフィー
ドバックされるので、制御用コンピュータ５５により２
つの識別構造の夫々に焦点合わせがなされたときの距
離、言い換えれば２つの識別構造の合焦位置を検出する
ことができ、このときの試料容器５１内の試料の合焦位
置は２つの合焦位置の間に存在すると容易に推定するこ
とができる。よって、両合焦位置の間に焦点合わせされ
るように試料容器５１を位置させるような制御信号が制
御用コンピュータ５５から自動的に送信されることによ
り、試料に対する焦点合わせがオートフォーカスでなさ
れる。

【００２１】このようにすることにより、オペレータが
焦点合わせの操作を行うことなく、試料に自動的に焦点
合わせすることができ、使い勝手のよい軟Ｘ線顕微鏡シ
ステムを構築することができる。

【００２２】本発明は上述した例のみに限定されるもの
ではなく、種々の変形または変更を加え得ること勿論で
ある。例えば、上記実施例では試料容器の薄膜に形成す
る識別構造を明視野可視顕微鏡で観察可能な構造として
いるが、代わりに、位相差顕微鏡、暗視野顕微鏡、蛍光
顕微鏡、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡等で観察可能な構
造としてもよい。また、両薄膜の合焦位置の間で複数回
の観察を行うようにすれば、夫々の試料の各断面におい
てベストフォーカス位置で観察することが可能になる。

【００２３】

【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、試
料が透明でかつ位相差がほとんど付かない上に極めて薄
いものであっても、また、図１（ｂ）、（ｃ）のように
薄膜が外方または内方に膨らんだ場合であっても、識別
構造に可視光によって焦点を合わせたときに検出した合
焦位置から合焦情報を得て、その合焦情報から試料の合
焦位置を推定することができるから、試料に焦点合わせ
するために軟Ｘ線を用いることはなく、試料が必要以上
の軟Ｘ線を被曝されることはない。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）〜（ｃ）は本発明の基本概念図である。

【図２】（ａ）〜（ｃ）は本発明の第１実施例の試料容
器の構成を示す断面図である。

【図３】（ａ）〜（ｅ）は上記第１実施例の試料容器の
窓枠材の作製方法を説明するための図である。

【図４】（ａ）〜（ｅ）は本発明の第２実施例の試料容
器の窓枠材の作製方法を説明するための図である。

【図５】第１実施連または第２実施例の試料容器を軟Ｘ
線顕微鏡に組み込んだシステムを示す図である。

【符号の説明】

１、２窓枠材３スペーサ５試料室６試料７、８薄膜９、１０識別構造

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一対の窓枠材に第１、第２の薄膜を設け
て窓材を構成し、該窓材をスペーサを介して所定距離離
間させるように対向配置して前記薄膜およびスペーサに
より形成される閉空間を試料室とした試料容器におい
て、前記第１、第２の薄膜に夫々、可視光で検出可能な識別
構造を設けたことを特徴とする試料容器。
【請求項２】請求項１記載の試料容器を軟Ｘ線顕微鏡
に装着し、前記各識別構造に可視光で焦点を合わせたと
きの合焦情報を夫々求め、得られた２つの合焦情報に基
づいて前記試料容器内に収容した試料に焦点を合わせる
ことを特徴とする、軟Ｘ線顕微法。