JPH0716407B2 - 酵素の固定化方法及び固定化された酵素 - Google Patents
酵素の固定化方法及び固定化された酵素Info
- Publication number
- JPH0716407B2 JPH0716407B2 JP19640388A JP19640388A JPH0716407B2 JP H0716407 B2 JPH0716407 B2 JP H0716407B2 JP 19640388 A JP19640388 A JP 19640388A JP 19640388 A JP19640388 A JP 19640388A JP H0716407 B2 JPH0716407 B2 JP H0716407B2
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- enzyme
- water
- immobilized
- organic solvent
- polymer compound
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素の包括固定化法及び固定化された酵素に
関し、更に詳しくは、有機溶剤に溶解した高分子化合物
を用いる酵素の固定化方法に関する。
関し、更に詳しくは、有機溶剤に溶解した高分子化合物
を用いる酵素の固定化方法に関する。
（従来の技術） 従来からの酵素の固定化方法には、担体結合法・架橋法
・包括法の３つの方法がある。包括法のうち、格子法
は、各種モノマーやプレポリマー水溶液と重合開始剤や
ガンマー線・光・水等によって重合生成した担体高分子
化合物の立体格子中へ酵素や菌体を閉じ込める方法であ
り、主として水中での重合反応を要する。マイクロカプ
セル法は、酸素水溶液を有機溶剤中で乳化させ水−有機
溶剤の界面で重合等によりカプセルを形成し、カプセル
表面を低分子化合物は通すが、酵素は通さないようにす
る方法であり、主として乳化液中での重合反応を要す
る。
・包括法の３つの方法がある。包括法のうち、格子法
は、各種モノマーやプレポリマー水溶液と重合開始剤や
ガンマー線・光・水等によって重合生成した担体高分子
化合物の立体格子中へ酵素や菌体を閉じ込める方法であ
り、主として水中での重合反応を要する。マイクロカプ
セル法は、酸素水溶液を有機溶剤中で乳化させ水−有機
溶剤の界面で重合等によりカプセルを形成し、カプセル
表面を低分子化合物は通すが、酵素は通さないようにす
る方法であり、主として乳化液中での重合反応を要す
る。
（発明が解決しようとする問題点） 上記のごとく、包括法においては、酵素を包括する為に
重合反応によって立体格子を形成する必要があった。
重合反応によって立体格子を形成する必要があった。
一般に、酵素は有機溶剤中で、その活性を大幅にあるい
は完全に失い、水中でも不純物や阻害物質の存在によっ
て活性が低下する。従って、有機溶剤を大量に含む高分
子化合物や、高分子化合物あるいはモノマーの有機溶剤
溶液中に直接酵素を混入させることは活性を著しく損な
う結果を伴う。一方、有機溶剤と酵素の接触を避けて担
体の立体の格子を形成する方法として、水系による重合
反応や乳化系重合によるマイクロカプセル化があるが、
利用可能な高分子化合物が得られ、又、後者は煩雑な工
程を必要とする。
は完全に失い、水中でも不純物や阻害物質の存在によっ
て活性が低下する。従って、有機溶剤を大量に含む高分
子化合物や、高分子化合物あるいはモノマーの有機溶剤
溶液中に直接酵素を混入させることは活性を著しく損な
う結果を伴う。一方、有機溶剤と酵素の接触を避けて担
体の立体の格子を形成する方法として、水系による重合
反応や乳化系重合によるマイクロカプセル化があるが、
利用可能な高分子化合物が得られ、又、後者は煩雑な工
程を必要とする。
本発明は、有機溶剤に溶ける高分子化合物を担体とし
て、乳化や重合という工程を経ずに混合のみで、酵素の
包括固定化を実現しようとするものである。
て、乳化や重合という工程を経ずに混合のみで、酵素の
包括固定化を実現しようとするものである。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、酵素を有機溶剤を含む高分子化合物に混
合するとき、有機溶剤が直接酵素と接触しないようにす
る方法について研究の結果、吸水性高分子の利用が目的
達成の為、極めて有効であることを見出し本発明に到達
した。すなわち、本発明は、吸水性高分子の保持する水
の中に酵素を含有させ、次いで、水と相溶性の乏しい有
機溶剤に溶解した高分子化合物を用いて該吸水性高分子
体を包括することを特徴とする酵素の固定化方法、並び
に、そのようにして固定化された酵素、及び固定化担体
マトリックスがシート状または、ネット状支持体の表面
に固着形成されてなる固定化された酵素を要旨とするも
のである。
合するとき、有機溶剤が直接酵素と接触しないようにす
る方法について研究の結果、吸水性高分子の利用が目的
達成の為、極めて有効であることを見出し本発明に到達
した。すなわち、本発明は、吸水性高分子の保持する水
の中に酵素を含有させ、次いで、水と相溶性の乏しい有
機溶剤に溶解した高分子化合物を用いて該吸水性高分子
体を包括することを特徴とする酵素の固定化方法、並び
に、そのようにして固定化された酵素、及び固定化担体
マトリックスがシート状または、ネット状支持体の表面
に固着形成されてなる固定化された酵素を要旨とするも
のである。
吸水性高分子体としては、部分架橋されたアクリル酸ナ
トリウム重合物、アクリル酸ナトリウム・アクリルアミ
ド共重合物、アクリル酸・ビニルアルコール共重合物、
繊維素誘導体、その他の重合物、共重合物、グラフト共
重合物、化学変性された高分子化合物の中から適当なも
のを利用でき、形態は粉末、顆粒、鱗片、繊維、フィル
ム、あるいはそれらの成形品が適用できる。
トリウム重合物、アクリル酸ナトリウム・アクリルアミ
ド共重合物、アクリル酸・ビニルアルコール共重合物、
繊維素誘導体、その他の重合物、共重合物、グラフト共
重合物、化学変性された高分子化合物の中から適当なも
のを利用でき、形態は粉末、顆粒、鱗片、繊維、フィル
ム、あるいはそれらの成形品が適用できる。
酵素として、本発明の実施例では、グルコースオキシダ
ーゼ（以下GOD）、パーオキシダーゼ（POD）、及びウレ
アーゼを代表として用いたが、任意の酵素が使用できる
ことは当然である。
ーゼ（以下GOD）、パーオキシダーゼ（POD）、及びウレ
アーゼを代表として用いたが、任意の酵素が使用できる
ことは当然である。
酵素は、水に溶解、または分散させ、前記の吸水性高分
子体と接触、または混合することにより、水と共に吸水
性高分子体に吸収され、その内部に保持される。この吸
水性高分子体が水と相溶性の乏しい有機溶剤と接触して
も、有機溶剤は吸水性高分子体に吸収されている水の中
には、ほとんど浸透せず、従って、酵素の失活もほとん
ど起らない。
子体と接触、または混合することにより、水と共に吸水
性高分子体に吸収され、その内部に保持される。この吸
水性高分子体が水と相溶性の乏しい有機溶剤と接触して
も、有機溶剤は吸水性高分子体に吸収されている水の中
には、ほとんど浸透せず、従って、酵素の失活もほとん
ど起らない。
水と相溶性の乏しい有機溶剤は、担体マトリックスを形
成する高分子化合物を溶解し、且つ水よりも常温におけ
る蒸気圧の高い溶剤、例えば、トルエン、メチルエチル
ケトン（MEK）、酢酸エチル、及び、それらの混合物か
ら選ぶことができる。
成する高分子化合物を溶解し、且つ水よりも常温におけ
る蒸気圧の高い溶剤、例えば、トルエン、メチルエチル
ケトン（MEK）、酢酸エチル、及び、それらの混合物か
ら選ぶことができる。
担体マトリックスとして利用できる、水と相溶性の乏し
い有機溶剤に溶解する高分子化合物としては、例えばポ
リウレタン、並びにポリアクリル酸メチル、ポリメタク
リル酸メチル、ポリアクリル酸ブチル等のアクリル系重
合物、共重合物及び混合物が好適に使用できる。
い有機溶剤に溶解する高分子化合物としては、例えばポ
リウレタン、並びにポリアクリル酸メチル、ポリメタク
リル酸メチル、ポリアクリル酸ブチル等のアクリル系重
合物、共重合物及び混合物が好適に使用できる。
担体マトリックスを形成する高分子化合物の溶液と酵素
及び水を内部に保持する吸水性高分子体を混合し、シー
ト状、ネット状、その他所望の形態の支持体表面に塗布
した後、常温で乾燥して有機溶剤を揮発させ固定化を完
了する。
及び水を内部に保持する吸水性高分子体を混合し、シー
ト状、ネット状、その他所望の形態の支持体表面に塗布
した後、常温で乾燥して有機溶剤を揮発させ固定化を完
了する。
（作用） 本発明に係る方法の作用機構は、前項で述べたとおりで
あり、マイクロカプセル法における乳化現象の利用と似
ているが、吸水ポリマーの保水効果を有機溶剤を含む高
分子化合物との混合時における酵素の保護と、更に使用
時においては水分子を吸収し酵素反応の場をつくること
に利用している点で機構が異なり新規である。
あり、マイクロカプセル法における乳化現象の利用と似
ているが、吸水ポリマーの保水効果を有機溶剤を含む高
分子化合物との混合時における酵素の保護と、更に使用
時においては水分子を吸収し酵素反応の場をつくること
に利用している点で機構が異なり新規である。
又、担体マトリックスを形成する高分子化合物は、単に
酵素を含む吸水性高分子を担持する作用にとどまらず、
高分子化合物の種類や配合比を変えることにより吸水性
高分子体を包括する立体格子の大きさを制御することが
可能である。それにより、酵素の流出を防ぐとともに、
反応基質の格子内への流入、及び反応生成物の格子外へ
の流出に対して最適な担体マトリックスの設計が可能と
なり、他の包括固定法と比較しても設計の自由度が大き
いメリットがある。
酵素を含む吸水性高分子を担持する作用にとどまらず、
高分子化合物の種類や配合比を変えることにより吸水性
高分子体を包括する立体格子の大きさを制御することが
可能である。それにより、酵素の流出を防ぐとともに、
反応基質の格子内への流入、及び反応生成物の格子外へ
の流出に対して最適な担体マトリックスの設計が可能と
なり、他の包括固定法と比較しても設計の自由度が大き
いメリットがある。
以上の様な構成よりなる本発明によって、酵素の固定化
操作は、従来から行なわれている様な煩雑な技術を用い
ずに、簡便な混合と乾燥によって行われる。又、固定化
酵素を反応の触媒として使用する際にも、保存性、安定
性、反応効率において従来のものと変わらないものが得
られる。このように、従来の固定化方法に比べて固定化
方法が、簡便となることにより幅広い用途に使用でき
る。
操作は、従来から行なわれている様な煩雑な技術を用い
ずに、簡便な混合と乾燥によって行われる。又、固定化
酵素を反応の触媒として使用する際にも、保存性、安定
性、反応効率において従来のものと変わらないものが得
られる。このように、従来の固定化方法に比べて固定化
方法が、簡便となることにより幅広い用途に使用でき
る。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
（実施例１） 酵素GOD30mgを、水（イオン交換水）2gに溶解し、吸水
ポリマー（アクリル酸・ビニルアルコール共重合体の粉
末 住友化学工業製スミカゲルSP−520）9gと混ぜて十
分に吸水ポリマーを膨潤させる。
ポリマー（アクリル酸・ビニルアルコール共重合体の粉
末 住友化学工業製スミカゲルSP−520）9gと混ぜて十
分に吸水ポリマーを膨潤させる。
GODを含んだ吸水ポリマーを、ウレタン樹脂（日本特殊
色料製AD238）の45％酢酸エチル溶液50g・硬化剤（ポリ
イソシアネート系日本特殊色料製UA65）2g・トルエン15
gからなる高分子化合物溶液中に混合し、均一になるま
で十分撹拌して調製する。
色料製AD238）の45％酢酸エチル溶液50g・硬化剤（ポリ
イソシアネート系日本特殊色料製UA65）2g・トルエン15
gからなる高分子化合物溶液中に混合し、均一になるま
で十分撹拌して調製する。
この調製した液を支持体となるポリエステル布に両面コ
ーティングして、室温で乾燥しGODの固定化を完了す
る。
ーティングして、室温で乾燥しGODの固定化を完了す
る。
以上の操作によって、ポリエステル布上に固定化された
GODは、グルコース水溶液中に浸漬し、ブドウ糖の酸化
を測定することによって活性が確認された。
GODは、グルコース水溶液中に浸漬し、ブドウ糖の酸化
を測定することによって活性が確認された。
その結果、固定化されたGODの活性は、固定化しないGOD
の見かけの活性にくらべて40％であった。又、ポリエス
テル布に固定化されたGODは、５℃の乾燥状態で６箇月
間後でも活性は保持されており、又湿潤状態で２箇月間
後でも活性は保持されていた。
の見かけの活性にくらべて40％であった。又、ポリエス
テル布に固定化されたGODは、５℃の乾燥状態で６箇月
間後でも活性は保持されており、又湿潤状態で２箇月間
後でも活性は保持されていた。
（実施例２） 酸素にPODを使用し、上記と同様な調製法で、支持体に
ポリエステル布を使用して固定化を行なった。
ポリエステル布を使用して固定化を行なった。
その結果、固定化されたPODの活性は、固定化しないPOD
の見かけの活性に比べて45％であった。又、ポリエステ
ル布に固定化したPODは、実施例１と同様、乾燥状態で
６箇月間、湿潤状態で２箇月間後でも、活性は保持され
ていた。
の見かけの活性に比べて45％であった。又、ポリエステ
ル布に固定化したPODは、実施例１と同様、乾燥状態で
６箇月間、湿潤状態で２箇月間後でも、活性は保持され
ていた。
実施例１と実施例２より、GODを固定化したポリエステ
ル布とPODを固定化したポリエステル布を、別々のカラ
ムに詰め、これと指示薬としてオルトジアニシジン溶
液、分光光度計を組合せることによってGODの定量分析
が可能である。
ル布とPODを固定化したポリエステル布を、別々のカラ
ムに詰め、これと指示薬としてオルトジアニシジン溶
液、分光光度計を組合せることによってGODの定量分析
が可能である。
（実施例３） 実施例１で用いた酵素を実施例１と同様に調製を行な
い、支持体としてナイロンメッシュクロスを使用し固定
化を行なった。
い、支持体としてナイロンメッシュクロスを使用し固定
化を行なった。
実施例１で用いたグルコース水溶液を用いて固定化を確
認した。
認した。
その結果、固定化されたGODの活性は、固定化しないGOD
の見かけの活性に比べて40％であった。又、ナイロンメ
ッシュクロスに固定化したGODは、実施例１と同様に、
乾燥状態で６箇月間、湿潤状態で２箇月間後でも活性は
保持されていた。
の見かけの活性に比べて40％であった。又、ナイロンメ
ッシュクロスに固定化したGODは、実施例１と同様に、
乾燥状態で６箇月間、湿潤状態で２箇月間後でも活性は
保持されていた。
（実施例４） 酵素にウレアーゼを用いPH6〜７で実施例１と同様の調
製を行い支持体には、ポリエステル布を使用し固定化を
行なった。
製を行い支持体には、ポリエステル布を使用し固定化を
行なった。
酵素の活性は、尿素を分解させ生成したアンモニアを比
色法により測定することにより確認した。
色法により測定することにより確認した。
その結果、固定化されたウレアーゼの見かけの活性は、
固定化しないウレアーゼに比べて35％であった。又、ポ
リエステル布に固定化したウレアーゼは、実施例１と同
様に乾燥状態で６箇月間、湿潤状態で２箇月間後でも活
性は保持されていた。
固定化しないウレアーゼに比べて35％であった。又、ポ
リエステル布に固定化したウレアーゼは、実施例１と同
様に乾燥状態で６箇月間、湿潤状態で２箇月間後でも活
性は保持されていた。
（発明の効果） 本発明によれば、酵素を吸水性高分子の保持する水の中
に含有させ、水と相溶性の乏しい有機溶媒に溶解した高
分子化合物と混合して、吸水性高分子体を包括する担体
マトリックスを形成し、且つ、適当な支持体の表面に固
着、乾燥させることにより、従来、酵素の失活を避ける
ために行われてきた煩雑な方法によることなく、有機溶
剤に溶解した高分子化合物による簡便な固定化が可能と
なった。
に含有させ、水と相溶性の乏しい有機溶媒に溶解した高
分子化合物と混合して、吸水性高分子体を包括する担体
マトリックスを形成し、且つ、適当な支持体の表面に固
着、乾燥させることにより、従来、酵素の失活を避ける
ために行われてきた煩雑な方法によることなく、有機溶
剤に溶解した高分子化合物による簡便な固定化が可能と
なった。
しかも、酵素の保存性、安定性、反応効率の面でも従来
法と比較して同等ないしは優れた性能を有し広い用途に
適用できる。
法と比較して同等ないしは優れた性能を有し広い用途に
適用できる。
Claims (3)
- 【請求項１】吸水性高分子体の保持する水の中に酵素を
含有させ、次いで、水と相溶性の乏しい有機溶剤に溶解
した高分子化合物を用いて該吸水性高分子を包括するこ
とを特徴とする酵素の固定化方法。 - 【請求項２】酵素と水を含有する吸水性高分子体が，水
と相溶性の乏しい有機溶剤に可溶性の高分子化合物から
形成された担体マトリックス中に包括されてなることを
特徴とする固定化された酵素。 - 【請求項３】前記高分子化合物の担体マトリックスがシ
ート状、又はネット状支持体の表面に固着形成されてな
る請求項２記載の固定化された酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19640388A JPH0716407B2 (ja) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | 酵素の固定化方法及び固定化された酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19640388A JPH0716407B2 (ja) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | 酵素の固定化方法及び固定化された酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0246287A JPH0246287A (ja) | 1990-02-15 |
| JPH0716407B2 true JPH0716407B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=16357283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19640388A Expired - Fee Related JPH0716407B2 (ja) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | 酵素の固定化方法及び固定化された酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0716407B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9260306B2 (en) | 2008-11-28 | 2016-02-16 | Kyoto University | Hydrogen fluoride purification method |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2009300187B2 (en) * | 2008-09-30 | 2015-01-15 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Covalently immobilized enzyme and method to make the same |
-
1988
- 1988-08-05 JP JP19640388A patent/JPH0716407B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9260306B2 (en) | 2008-11-28 | 2016-02-16 | Kyoto University | Hydrogen fluoride purification method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0246287A (ja) | 1990-02-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |