JPH07155199A - ベンジルアミン類の高感度定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ベンジルアミン等のベンジルアミン類を含有
する試料に、Ｌ−アラニン等のアミノ基供与体の存在下
でベンジルアミントランスアミナーゼ及びベンジルアミ
ン酸化酵素を作用させて酵素サイクリング反応を形成
し、該酵素サイクリング反応により増幅生成する過酸化
水素等の増幅反応生成物を測定することを特徴とするベ
ンジルアミン類の高感度定量方法である。 【効果】 本発明によるベンジルアミン類の定量方法
は、従来行われていたペーパークロマトグラフィー法の
低感度の考慮や煩雑な操作、高速液体クロマトグラフィ
ー法の煩雑な保守を行うことなくしかも高感度でベンジ
ルアミン類の定量を行うことができる。従って、日常の
作業としてベンジルアミン類の定量が簡便かつ短時間
に、しかも精度良く実施出来るようになった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は被検体中のベンジルアミ
ン類の高感度定量方法、詳しくは酵素サイクリング反応
によるベンジルアミン類の簡便かつ正確な高感度定量方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内等に存在するベンジルアミン類は
カテコールアミン類の代謝誘導体として位置付けられ
る。従って、ベンジルアミン類を測定することによっ
て、カテコールアミン類の代謝および生理学的作用の研
究上で重要な知見を得ることが出来る。

【０００３】ベンジルアミン類の定量方法としては、従
来からペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラ
フィーあるいは高速液体クロマトグラフィーによる方法
が一般的である。これらの方法の中で感度が高く、信頼
性の高いとされる定量法は高速液体クロマトグラフィー
法である。この方法では、ベンジルアミン類はアミノ酸
分析と全く同じ原理によって分離定量される。例えば、
充填剤としてイオン交換樹脂を使用する高速液体クロマ
トグラフィーの場合、樹脂に吸着されたベンジルアミン
類を展開液のイオン強度あるいはｐＨを変化させて分離
を行い、分離されたベンジルアミン類をニンヒドリン反
応による吸光度測定あるいはｏ−フタルアルデヒドとの
反応による蛍光測定などの方法で定量される。

【０００４】一方、これらのクロマトフラフィー法以外
の原理を使う方法として、ベンジルアミン類に対して作
用しベンズアルデヒド類と過酸化水素を生成せしめるア
グリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agr
ic. Biol. Chem.)、29巻、117頁 (1965年)に記載のかび
(Aspergillus niger)由来のアミン酸化酵素を使用する
酵素法によるベンジルアミン類の定量法が考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ベンジルアミン類を定
量する方法として従来から一般的に用いられていた高速
液体クロマトグラフィー法は、ペーパークロマトフラフ
ィー法あるいは薄層クロマトグラフィー法に比べれば感
度および精度が高い定量法であるが、分析精度は同時再
現性および日差再現性で2%以下にするのは困難である。
また高価な高速液体クロマトフラフィー装置本体が必要
であり、その充填カラムの保守・交換および展開液の高
いイオン強度による送液ポンプ付近の腐食等、多くの問
題点および課題をかかえている。

【０００６】一方、アグリカルチャラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.)、29巻、117頁
(1965年)に記載のかび(Aspergillus niger)由来のアミ
ン酸化酵素を使用する酵素法によるベンジルアミン類の
定量法は、上記課題を解決する定量法として期待された
が、アミン酸化酵素の酵素活性が塩素イオン等のアニオ
ン性物質により著しく阻害を受けることが判明し、実用
的な定量方法にはならないことが判明した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、かかる従
来の定量方法における課題を解決すべく簡便かつ精度の
高いベンジルアミン類の定量方法を鋭意研究した。その
結果、アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミスト
リー(Agric. Biol. Chem.)、29巻、117頁 (1965年)に記
載のかび(Aspergillus niger)由来のアミン酸化酵素に
よるベンジルアミン類定量系に、微生物由来のベンジル
アミントランスアミナーゼを基質と共に添加し作用させ
ることによって酵素サイクリングを形成し、測定対象で
ある過酸化水素、アンモニア及びα-ケト酸を増幅生成
させることができることを見いだして、本発明を完成さ
せるに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、被検体にベンジルア
ミントランスアミナーゼ、アミノ基供与体、及びベンジ
ルアミン酸化酵素を作用させて酵素サイクリング法によ
る増幅反応を行い、生じる増幅反応生成物を定量するこ
とを特徴とするベンジルアミン類の高感度定量方法であ
る。

【０００９】本発明における酵素サイクリングの反応機
構を次式に示す。

【００１０】

【化１】

【００１１】上式に従って酵素サイクリングの反応原理
を説明すると、被検体中のベンジルアミン類が先ずベン
ジルアミン酸化酵素によりベンズアルデヒド類に変換さ
れ同時に過酸化水素及びアンモニアが生成する。次いで
変換されたベンズアルデヒド類がアミノ基供与体の存在
下にベンジルアミントランスアミナーゼの触媒作用によ
り元のベンジルアミン類に変換され同時にα−ケト酸が
生成する。この一連の反応が繰り返されることにより、
過酸化水素、アンモニア、及びα−ケト酸が増幅生成し
蓄積される。

【００１２】これらの増幅反応生成物の少なくとも一つ
を定量することにより被検体中のベンジルアミン類量を
決定するのが本発明の特徴である。

【００１３】本発明でいう被検体とは、定量対象である
ベンジルアミン類を含む尿、血液、血清、血漿、培養
物、培養液、もしくは細胞内液等の液体またはそれらの
抽出液を言う。

【００１４】本発明の定量方法の対象とするベンジルア
ミン類とは、ベンジルアミンまたはベンジルアミンのフ
ェニル環に置換基を有するものを指す。

【００１５】置換基を有するベンジルアミンとしては、
メチル基、エチル基等のアルキル基；塩素原子、臭素原
子、フッ素原子等のハロゲン原子；メトキシ基等のアル
コキシ基；シアノ基；ニトロ基；ヒドロキシ基；あるい
はカルボキシ基等の置換基によって、オルト位、メタ
位、またはパラ位が置換されたｏ−、ｍ−、またはｐ−
置換ベンジルアミンが挙げられる。具体的に例示すれ
ば、ｐ−メチルベンジルアミン、ｐ−メトキシベンジル
アミン、ｐ−クロロベンジルアミン、ｐ−フルオロベン
ジルアミン、ｐ−カルボキシベンジルアミン等である。

【００１６】本発明におけるアミノ基供与体とは、用い
るベンジルアミントランスアミナーゼの基質特異性によ
り決定されるものであり、該酵素の作用によりα−ケト
酸に変換され同時にもう一方の基質であるベンズアルデ
ヒド類がベンジルアミン類に変換される。該アミノ基供
与体を具体的に例示すると、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタ
ミン酸、グリシン等である。

【００１７】本発明に使用するベンジルアミントランス
アミナーゼは、１モルのベンジルアミン類と１モルのα
-ケト酸に対して作用し、１モルのベンズアルデヒド類
と１モルのアミノ基供与体を生成するものであり、また
その逆反応として、１モルのベンズアルデヒド類と１モ
ルのアミノ基供与体に対して作用し、１モルのベンジル
アミン類と１モルのα-ケト酸を生成するものであれば
特に限定されず、かかる特性を有する酵素が制限なく使
用される。

【００１８】本発明においてはベンジルアミントランス
アミナーゼの上記逆反応を利用して酵素サイクリングを
形成させ定量に利用するものである。。

【００１９】このベンジルアミントランスアミナーゼの
作用を次式に示す。

【００２０】

【化２】

【００２１】このような酵素を例示すれば、エンテロバ
クター（Enterobacter）属、バチルス（Bacillus）属、
アグロバクテリウム（Agrobacterium ）属、コリネバク
テリウム（Corynebacterium）属、コマモナス（Comamon
as）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）属、ストレプトミセス
（Streptomyces）属、アクチノミセス（Actinomyces）
属、スピリロスポラ（Spirillospora）属、ペニシリウ
ム（Penicillium）属、あるいはネオコスモスポラ（Neo
cosmospora）属等由来の微生物起源のベンジルアミント
ランスアミナーゼが挙げられる。

【００２２】また、本発明に使用するベンジルアミント
ランスアミナーゼはベンジルアミン類に対して強く作用
し、β−アラニン、プトレッシン等生体に存在すると思
われるアミン類、ポリアミン類に対して作用しにくい性
質を有するものが望ましい。そのような基質特異性の面
でベンジルアミン類の定量に有利な性質を持つベンジル
アミントランスアミナーゼとしては、例えば特願平４−
３２７８２７号に記載のバチルス・ブレビス Ｂ−１７
５（Bacillus brevis B-175,微工研菌寄第１３３１２
号）由来のベンジルアミントランスアミナーゼが挙げら
れる。

【００２３】本発明において用いるベンジルアミン酸化
酵素は、１モルのベンジルアミン類を酸化して１モルの
ベンズアルデヒド類と１モルの過酸化水素及び１モルの
アンモニア生成する反応を触媒する酵素であれば特に限
定されず、かかる特性を有する酵素が制限なく使用され
る。

【００２４】上記ベンジルアミン酸化酵素はいかなる起
源のものでも良いが、例えばアスペルギルス（Aspergil
lus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、モナスカス
（Monascus）属、フサリウム（Fusarium）属、ムコア
（Mucor）属由来等の微生物起源のもの等が使用でき
る。

【００２５】また、本発明に使用するベンジルアミン酸
化酵素は、ベンジルアミン類に対して強く作用し、β−
アラニン、プトレッシン等生体に存在すると思われるア
ミン類、ポリアミン類に対して作用しにくい酵素が望ま
しい。このような基質特異性の面でベンジルアミン類の
定量に有利な性質を持つベンジルアミン酸化酵素として
は、例えばアグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Agric. Biol. Chem.)、29巻、117頁 (1965年)
に記載のアスペルギルス・ニガー(Aspergillusniger AT
CC 28325)由来のアミン酸化酵素が挙げられる。

【００２６】本発明におけるベンジルアミン酸化酵素と
ベンジルアミントランスアミナーゼによる酵素サイクリ
ングによる増幅反応生成物とは、前述の酵素サイクリン
グ反応によって増幅生成される化合物のことであり、過
酸化水素、アンモニア及びα−ケト酸を指す。

【００２７】酵素サイクリング反応によって増幅生成す
るα−ケト酸は、反応に用いるベンジルアミントランス
アミナーゼの基質特異性により決定されるアミノ酸供与
体に依存し、用いるアミノ基供与体のアミノ基がカルボ
ニル基に置換された構造を持つ化合物である。例示する
と、アミノ基供与体がＬ−アラニンの時はα−ケト酸と
してはピルビン酸が生成し、前者がグリシンの時は後者
はグリオキサル酸が、前者がＬ−グルタミン酸の時は後
者はα−ケトグルタル酸が各々生成する。

【００２８】被検体にベンジルアミントランスアミナー
ゼとベンジルアミン酸化酵素を作用させる条件として
は、従来から知られている酵素の作用条件から適宜選択
して採用すればよいが、一般には、使用するベンジルア
ミントランスアミナーゼとベンジルアミン酸化酵素の至
適ｐＨ、至適温度の付近で行い、酵素の活性が最大に発
現される条件が望ましい。

【００２９】反応液量は、通常０．１〜１０ｍｌの範囲
で行われる。

【００３０】ｐＨ条件としては、通常４．０〜１０．５
が採用されるが、好ましくは６．５〜８．０の範囲が好
適であり、これらの範囲のｐＨを維持するために通常緩
衝液を用いる。該緩衝液の種類は特に限定されず、リン
酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の公知
の緩衝液が用いられる。この緩衝液の濃度は特に限定さ
れないが、例えば２〜５００ｍＭが好適である。

【００３１】温度条件としては、１５〜６０℃の範囲が
一般的であるが、３０〜４０℃の範囲が好適である。

【００３２】また、本発明で定量に使用するベンジルア
ミントランスアミナーゼとベンジルアミン酸化酵素の量
は、酵素の活性、反応条件、測定対象となるベンジルア
ミン類の濃度等によって異なり、一概に限定できない
が、好ましくは設定されたベンジルアミン類濃度におい
て、増幅反応生成物が所定の時間内に増幅され、検出、
定量されるに充分な量が良い。そのようなベンジルアミ
ントランスアミナーゼ量及びベンジルアミン酸化酵素量
としては、通常各々０．１〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で使
用されるが、１〜５０Ｕ／ｍｌの範囲が好適である。

【００３３】この酵素サイクリング反応に用いるアミノ
基供与体の使用量は、使用するベンジルアミントランス
アミナーゼのＫｍ値の５〜２０倍の濃度が好適である。
具体的には０．１〜５００ｍＭの濃度範囲がよい。

【００３４】本発明による酵素サイクリング反応は、ア
ミノ基供与体、ベンジルアミン類、ベンジルアミントラ
ンスアミナーゼ、ベンジルアミン酸化酵素の４成分が同
時に存在してはじめて反応が逐次的に進行する。従っ
て、通常はこの４つの成分の内２または３成分を含んだ
溶液を調製し、反応設定した条件に達した後、残りの１
または２成分を加えることでサイクリング反応を開始さ
せ定量に供する手段が採用される。最後に加える成分は
限定されないが、酵素であるベンジルアミントランスア
ミナーゼまたはベンジルアミン酸化酵素、もしくは両酵
素を最後に加えるのが一般的である。

【００３５】ベンジルアミン類の定量を行う際の酵素サ
イクリング反応の反応時間は、反応条件、測定対象とな
るベンジルアミン類の濃度等によって異なり、一概に限
定できないが、好ましくは設定された条件において、酵
素サイクリング反応生成物が増幅され、その反応を確認
できるに充分な時間であることが望ましい。そのような
反応時間としては２分〜５時間の範囲が通常採用される
が、２分〜３０分の範囲が好適である。

【００３６】酵素サイクリング反応の停止は予定された
時間の後に反応停止試薬を添加することによって行われ
る。反応停止試薬としては、例えばベンジルアミン酸化
酵素の阻害剤である塩化ナトリウム等が用いられる。

【００３７】本発明によるベンジルアミン類の高感度定
量方法では、酵素サイクリング反応による増幅反応生成
物である過酸化水素、アンモニア及びα−ケト酸のうち
少なくともいずれか一つを検知、定量すれば良い。

【００３８】上記酵素サイクリングによる増幅反応生成
物はいずれも従来から知られている方法で定量すること
ができる。

【００３９】アンモニア並びにα−ケト酸がα−ケトグ
ルタル酸の場合はＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼと
ＮＡＤＨを用いる酵素法等で、α−ケト酸がピルビン酸
の場合はＬ−乳酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを用いる
酵素法等で、α−ケト酸がオキザロ酢酸の場合はオキザ
ロ酢酸デカルボキシラーゼを用いる酵素法等で定量する
ことができる。

【００４０】過酸化水素の定量は例えば、従来から知ら
れている４−アミノアンチピリン−ペルオキシダーゼ法
によって容易に行うことができる。過酸化水素の定量に
化学発光法を用いることで更に高感度な測定法とするこ
とも可能である。

【００４１】いずれの定量法を用いる場合でも、既知濃
度のベンジルアミン類溶液の希釈系列を作り、かかる希
釈系列の溶液に対してベンジルアミントランスアミナー
ゼとベンジルアミン酸化酵素を作用させ、増幅反応生成
物である過酸化水素、アンモニア及びα−ケト酸のいず
れか一つあるいは複数を上記の方法で定量し、ベンジル
アミン類量と増幅反応生成物量との検量線を作成する。
次いで、被検体について同様の方法で増幅生成物量を得
て、前に得られた検量線からその被検体中のベンジルア
ミン類量を求めることができる。

【００４２】また、被検体中のベンジルアミン類量が約
１ｍＭ以下であるときは、基質であるベンジルアミン類
量と酵素サイクリング反応による増幅反応生成物の生成
速度とが比例関係にあることから、増幅反応生成物生成
速度から被検体中のベンジルアミン類量を求めることが
できる。すなわち、既知濃度のベンジルアミン類溶液の
希釈系列を作り、かかる希釈系列の溶液に対してベンジ
ルアミントランスアミナーゼとベンジルアミン酸化酵素
を作用させ、増幅反応生成物である過酸化水素、アンモ
ニア及びα−ケト酸のいずれか一つあるいは複数の生成
速度を前記の方法で測定し、ベンジルアミン類量と増幅
反応生成物生成速度との検量線を作成する。次いで、被
検体について同様の方法で増幅生成物生成速度を得て、
前に得られた検量線からその被検体中のベンジルアミン
類量を求めることができる。

【００４３】

【作用】本発明に基づくベンジルアミン類の定量方法
は、基質となるベンジルアミン類をアミノ基供与体の存
在下にベンジルアミントランスアミナーゼ及びベンジル
アミン酸化酵素の作用を利用して酵素サイクリングを形
成し該酵素サイクリング反応の結果増幅生成される増幅
反応生成物を定量することを特徴とする。

【００４４】

【発明の効果】本発明によるベンジルアミン類の高感度
定量方法は、従来行われていたペーパークロマトグラフ
ィー法の低感度の考慮や煩雑な操作、高速液体クロマト
グラフィー法の煩雑な保守を行うことなくベンジルアミ
ン類の定量を行うことができる。 また、従来のベンジ
ルアミン酸化酵素を用いる測定法に比較して、酵素サイ
クリングを行うことで約１０倍の感度を得ることができ
る。従って、被検体中のベンジルアミン類量が非常に少
ない場合でも定量できる。この結果、日常の作業として
ベンジルアミン類の定量が簡便かつ短時間に、しかも精
度良く実施出来るようになった。

【００４５】

【実施例】以下実施例を上げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。

【００４６】製造例１ 1.0%グルコース、1.0%ポリペプトン、0.2%酵母エキス、
0.1%食塩、0.1%ベンジルアミン、及び0.02%消泡剤（エイノ
ール）、pH7.0からなる培地1,500mlを分注して滅菌（120
℃、20分間）した5,000mlの三角フラスコにバチルス・ブ
レビス Ｂ−１７５ 微工研菌寄第13312号）を植菌し
た。28℃で72時間振とう培養を行った後この培養液を、
あらかじめ上記と同様の組成を有する培地20lを仕込み
蒸気滅菌しておいたジャー・ファーメンターに加えて本
培養を行った。培養条件は28℃、攪拌回数150rpm、通気
速度20l/分で、70時間培養の後、培養液を遠心分離機に
かけて菌体を採取した。得られた菌体約150g（湿菌体重
量）を10mMリン酸緩衝液（pH7.5）500mlに懸濁し、その
懸濁液を超音波破砕機により菌体破砕を行った。その破
砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、上清液を得
た。この上清液中のベンジルアミントランスアミナーゼ
の総活性は5,100ユニット、比活性は0.14ユニット/mg-タンハ゜クであ
った。

【００４７】この上清液をあらかじめ20mMのリン酸緩衝
液（pH7.5）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（商品
名：ワットマン社製ＤＥ−５２）を充填したカラム（φ
7x40cm）に通して酵素を吸着させた。このカラムを10mM
の硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液（pH7.5）5,000
mlで洗浄後、硫酸アンモニウム濃度が10mMから230mMで
ある同様のリン酸緩衝液の直線濃度勾配（総容量:10l）
にて吸着されたタンパク質を溶出させ、ベンジルアミン
トランスアミナーゼ活性画分を回収した。本活性画分中
のベンジルアミントランスアミナーゼの総活性は1,400ユ
ニット、比活性は1.25ユニット/mg-タンハ゜クであった。

【００４８】この活性画分を限外濾過装置を用いて、脱
塩及び濃縮した後、あらかじめ0.2Mの硫酸アンモニウム
を含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したセファ
クリルＳ−４００（ファルマシア社製）を充填したカラ
ム（φ6.5x120cm）に通し、ゲル濾過を行い活性画分を
集めた。この活性画分中のベンジルアミントランスアミ
ナーゼの総活性は970ユニット、比活性は2.1ユニット/mg-タンハ゜ク
であった。

【００４９】上記精製酵素を10mMリン酸緩衝液(pH7.5)
にて適当に希釈して調製した酵素標品を用いて本酵素の
基質特異性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安
定性を調べた。

【００５０】（基質特異性）0.2Mリン酸緩衝液(pH7.5)
を0.74ml、50mMのピルビン酸溶液を0.1ml、5mMのピリド
キサールリン酸溶液を0.06ml、及び各種のアミノ基供与
体となるアミン類あるいはアミノ酸類の100mM溶液を0.0
5mlからなる反応液に、酵素標品0.05ml(0.05ユニット)を添
加し、30℃で30分間反応させた。反応液を沸騰した水浴
に30秒間浸して酵素を失活させた後、遠心分離により沈
澱物を除去し澄透溶液を得た。この澄透溶液を液体クロ
マトグラフィーにインジェクションしてＬ−アラニンを
定量分析した。これらのアミノ基供与体に対するベンジ
ルアミントランスアミナーゼの作用の強さを、ベンジル
アミンに対する作用を100%とした総体活性値で表示した
ものを表１に示す。このベンジルアミントランスアミナ
ーゼは、アミノ基受容体としてピルビン酸を使用した場
合、アミノ基供与体としてベンジルアミンに最も強く作
用を示し、β−アラニン、プトレッシンに対して作用し
ない酵素であることが判明した。

【００５１】

【表１】

【００５２】（至適ｐＨ）0.2M各種緩衝液(pH4.5〜6.5:
クエン酸緩衝液;pH6.0〜8.0:リン酸緩衝液;pH7.5〜9.0:
トリス−塩酸緩衝液;pH9.0〜11.5:グリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液)を0.5ml、5mMのピリドキサールリン酸
溶液を0.1ml、50mMのピルビン酸溶液を0.1ml、100mMの
ベンジルアミン溶液を0.05mlからなる反応液に酵素標品
0.1ml(0.05ユニット)を添加し、37℃で5分間反応させた。反
応液を沸騰した水浴に30秒間浸して酵素を失活させた
後、遠心分離により沈澱物を除去し澄透溶液を得た。こ
の澄透溶液を液体クロマトグラフィーにインジェクショ
ンしてＬ−アラニンを定量分析し、酵素活性を求めた。
最大の酵素活性値を100%とした相対活性値を算出して図
１を得た。図１より、本酵素の至適ｐＨは7.0〜9.0の範
囲にあることがわかる。

【００５３】（ｐＨ安定性）0.2M各種緩衝液(pH4.5〜6.
5:クエン酸緩衝液;pH6.5〜8.0:リン酸緩衝液;pH7.5〜9.
0:トリス−塩酸緩衝液;pH8.0〜10.5:グリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液)0.95mlに0.05mlの酵素標品(0.4ユニット)
を混合し、30℃で60分間放置した後、各溶液0.025mlを
0.2Mリン酸緩衝液(pH8.0)0.5ml、50mMピルビン酸溶液を
0.1ml、5mMピリドキサールリン酸溶液0.1ml、100mMのベ
ンジルアミン溶液0.05mlからなる活性測定溶液に分注混
和し、37℃で5分間反応させた。反応液を沸騰した水浴
に30秒間浸して酵素を失活させた後、遠心分離により沈
澱物を除去し澄透溶液を得た。この澄透溶液を液体クロ
マトグラフィーにインジェクションしてＬ−アラニンを
定量分析し、酵素活性を求めた。最大の酵素活性値を10
0%とした相対活性値を算出して図２を得た。図２から明
らかなように、本酵素はpH5.5〜8.5の範囲で安定であ
る。

【００５４】（至適温度）0.2Mリン酸緩衝液(pH8.0)0.5
ml、50mMのピルビン酸溶液0.1ml、5mMのピリドキサール
リン酸溶液0.1ml、100mMのベンジルアミン溶液0.05mlか
らなる活性測定溶液に酵素標品0.1ml(0.05ユニット)を添加
し、25,30,35,37,40,45,50,55,60,65,70,75,80℃で各温
度下において、5分間反応させた。反応液を沸騰した水
浴に30秒間浸して酵素を失活させた後、遠心分離により
沈澱物を除去し澄透溶液を得た。この澄透溶液を液体ク
ロマトグラフィーにインジェクションしてＬ−アラニン
を定量分析し、酵素活性を求めた。最大の酵素活性値を
100%とした相対活性値を算出して図３を得た。図３よ
り、本酵素の至適温度は45〜50℃の範囲であることがわ
かる。

【００５５】（温度安定性）10mMリン酸緩衝液(pH7.5)
で希釈した酵素標品0.2ml(0.04ユニット)を25,30,35,40,45,
50,55,60,65,70℃の各温度で10分間処理した。この酵素
溶液0.05mlを0.2Mリン酸緩衝液(pH8.0)0.5ml、50mMのピ
ルビン酸溶液0.1ml、5mMのピリドキサールリン酸溶液0.
1ml、100mMのベンジルアミン溶液0.05mlからなる活性測
定溶液に分注混和し、37℃で5分間反応させた。反応液
を沸騰した水浴に30秒間浸して酵素を失活させた後、遠
心分離により沈澱物を除去し澄透溶液を得た。この澄透
溶液を液体クロマトグラフィーにインジェクションして
Ｌ−アラニンを定量分析し、酵素活性を求めた。最大の
酵素活性値を100%とした相対活性値を算出して図４を得
た。図４より明らかなように、本酵素は50℃までの温度
において安定である。

【００５６】実施例１ 製造例１において得られた精製ベンジルアミントランス
アミナーゼを10mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて希釈し調
製した酵素標品と、アグリカルチャラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.)、29巻、117頁
(1965年)に記載のアスペルギルス・ニガー(Aspergillus
niger ATCC28325)より公知の方法にて調製したベンジ
ルアミン酸化酵素とを用いて、ベンジルアミン濃度と増
幅反応生成物の一つである過酸化水素の生成量との相関
を示す検量線を下記方法により作成した。

【００５７】光路幅1cmのキュベット中に200mMのＬ−ア
ラニン、0.3mMのピリドキサルリン酸、1mMのN-エチル-N
-(ー2ーヒドロキシー3ースルフォプロピル)-m-トルイジンナ
トリウム、1mMの4ーアミノアンチピリン、10U/mlのパー
オキシダーゼ、0,2,10,20,50μMの各ベンジルアミンを
含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）0.95mlを入れ、30℃下
で10分間インキュベイションを行った。これらのキュベ
ット各々に製造例１にて得られたベンジルアミントラン
スアミナーゼ2U/ml及びベンジルアミン酸化酵素0.5U/ml
0.05mlを混和し、30℃下で20分間反応させ、過酸化水素
の増加量に相当する555nmの吸光度を測定し、ベンジル
アミン濃度と吸光度との関係を示す検量線を得た（図
５）。比較例として、酵素サイクリングを行わない場合
をベンジルアミントランスアミナーゼを加えず他の条件
を同じにして吸光度を測定した（図５）。

【００５８】図５より、ベンジルアミンの検量線の直線
性がよく、本発明の方法がベンジルアミンの精度良い定
量に使用でき、酵素サイクリング反応を行わない時の約
１０倍の感度をもつことがわかる。

【００５９】実施例２ 製造例１において得られた精製ベンジルアミントランス
アミナーゼを10mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて希釈し調
製した酵素標品と、アグリカルチャラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.)、29巻、117頁
(1965年)に記載のアスペルギルス・ニガー(Aspergillus
niger ATCC 28325)より公知の方法にて調製したベンジ
ルアミン酸化酵素とを用いて、p-フルオロベンジルアミ
ン濃度と過酸化水素の生成量との相関を示す検量線を下
記方法により作成した。

【００６０】光路幅1cmのキュベット中に200mMのＬ−ア
ラニン、0.3mMのピリドキサルリン酸、1mMのN-エチル-N
-(ー2ーヒドロキシー3ースルフォプロピル)-m-トルイジンナ
トリウム、1mMの4ーアミノアンチピリン、10U/mlのパー
オキシダーゼ、0,2,10,20,50μMの各p-フルオロベンジ
ルアミンを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）0.95mlを入
れ、30℃下で10分間インキュベイションを行った。これ
らのキュベット各々に製造例１にて得られたベンジルア
ミントランスアミナーゼ2U/ml及びベンジルアミン酸化
酵素0.5U/ml0.05mlを混和し、30℃下で20分間反応さ
せ、過酸化水素の増加量に相当する555nmの吸光度を測
定し、ベンジルアミン濃度と吸光度との関係を示す検量
線を得た（図６）。比較例として、酵素サイクリングを
行わない場合をベンジルアミントランスアミナーゼを加
えず他の条件を同じにして吸光度を測定した（図６）。

【００６１】図６より、p-フルオロベンジルアミンの検
量線の直線性がよく、本発明の方法がp-フルオロベンジ
ルアミンの精度良い定量に使用でき、酵素サイクリング
反応を行わない時の約１０倍の感度をもつことがわか
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例で使用したベンジルアミントランスア
ミナーゼの至適ｐＨの図である。

【図２】 実施例で使用したベンジルアミントランスア
ミナーゼのｐＨ安定性の図である。

【図３】 実施例で使用したベンジルアミントランスア
ミナーゼの至適温度の図である。

【図４】 実施例で使用したベンジルアミントランスア
ミナーゼの温度安定性の図である。

【図５】 本発明に従って作成したベンジルアミン定量
用検量線と比較例として作成したベンジルアミン定量用
検量線である。

【図６】 本発明に従って作成したp-フルオロベンジル
アミン定量用検量線と比較例として作成したp-フルオロ
ベンジルアミン定量用検量線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検体にベンジルアミントランスアミナ
   ーゼ、アミノ基供与体、及びベンジルアミン酸化酵素を
   作用させて酵素サイクリング法による増幅反応を行い、
   生じる増幅反応生成物を定量することを特徴とするベン
   ジルアミン類の高感度定量方法。